Parte 2 Bio

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132 Capítulo 6: Como as Células Lêem o Genoma: Do DNA à Proteína
TABELA 6–4 Resumo das rodadas de seleção para uma ribozima com atividade de ligação de
RNA (Problema 6–98).
Condições de ligação
Propenso a erros Taxa de
Redondo PCR MgCl2 (mM) Tempo (horas) ligação (por hora)
0 0,000003
1 Não 60 16 <0,000004
2 Não 60 16 0,0008
3 Não 60 16 0,0094
4 Não 60 16 0,027
5 Sim 60 0,50 0,16
6 Sim 60 0,17 0,40
7 Sim 60 0,02 0,86
8 Não 4 0,12 3.2
9 Não 2.5 0,17 4.5
10 Não 2.5 0,17 8,0
mesmo, embora 11 dos 15 tenham sequências muito semelhantes. Seu orientador está
entusiasmado com seus resultados e pediu que você desse o próximo seminário
departamental. Você sabe, por suas conversas com outros alunos, que precisará preparar
explicações cuidadosas para as perguntas listadas abaixo.
A. Por que você usou PCR propensa a erros, que pode introduzir mutações, em
algumas das rodadas de amplificação?
B. Por que você reduziu o tempo e a concentração de Mg2+ - ambas as alterações aumentam
a dificuldade de ligação - em rodadas sucessivas de seleção?
C. Quanta melhoria na taxa de ligadura você encontrou em seus 10
rodadas de seleção e amplificação?
D. Por que ainda existe tanta diversidade entre as moléculas de RNA após 10 rodadas de
seleção e amplificação?
ESTILO MCAT
Passagem 1 (Questões 6–99 a 6–102)
Defeitos cardíacos congênitos estão presentes em 1 a 2% dos recém-nascidos e causam um número
significativo de natimortos. Eles também são uma das principais causas de doenças cardíacas em
adultos. Muitos defeitos cardíacos congênitos são causados por mutações em genes para fatores de
transcrição que controlam a expressão de genes necessários para o desenvolvimento normal do coração.
Por exemplo, mais de 30 mutações diferentes foram encontradas no gene do fator de transcrição
Tbx5 em pacientes com defeitos cardíacos congênitos. Para realizar suas funções, o Tbx5 deve se
ligar a outro fator de transcrição chamado Nkx2-5, que também desempenha um papel no
desenvolvimento do coração e sofre mutação em muitos indivíduos com defeitos cardíacos congênitos.
Imagine que você possa isolar células cardíacas em desenvolvimento com mutações Tbx5
homozigóticas e estudar os defeitos moleculares causados pelas mutações.
6–99 Em uma linha celular mutante, você descobre que o mRNA Tbx5 normal e maduro está presente
em seus níveis usuais, mas que a proteína Tbx5 completa não pode ser detectada. Que
tipo de mutação provavelmente é responsável por esse fenótipo?
A. Uma mutação que bloqueia a ligação de Tbx5 a Nkx2-5 B. Uma
mutação que causa um defeito de splicing C. Uma
mutação que interrompe o dobramento normal de Tbx5 D. Uma
mutação que introduz um códon de parada prematuro
ESTILO MCAT 133
6–100 Em outra linhagem de células mutantes, você descobre que os níveis do mRNA Tbx5
devidamente processado e maduro são bastante reduzidos. Que tipo de mutação poderia
explicar esse fenótipo?
I. Uma pequena exclusão na região de codificação que preserva o quadro de leitura II. Uma
pequena exclusão na região de codificação que interrompe o quadro de leitura III. Uma
mutação na região promotora do gene Tbx5
A. eu
B. I e II C. I
e III D. II e III
6–101 Em outra linha celular mutante, você descobre que o mRNA Tbx5 completo e a proteína estão
presentes em níveis normais, mas os indivíduos portadores dessa mutação apresentam
defeitos graves no desenvolvimento do coração. Que tipo de mutação poderia causar esse
fenótipo?
A. Uma mutação que bloqueia a associação do mRNA Tbx5 com o ribossomo B. Uma mutação
que bloqueia a exportação do mRNA Tbx5 do núcleo C. Uma mutação que causa um
defeito de splicing D. Uma mutação que interrompe a
ligação de Tbx5 com Nkx2-5
6–102 Qual dos seguintes é um mecanismo plausível pelo qual o Tbx5 poderia controlar o início da
transcrição?
A. Ativação de fatores de alongamento da transcrição B.
Recrutamento de RNA polimerase II para promotores C.
Recrutamento de fatores de splicing para RNA polimerase II D.
Regulação da formação de cap 5º
Uma descoberta importante na biologia celular veio do estudo de doenças autoimunes. Verificou-se
que os soros de pacientes com doenças autoimunes continham anticorpos que se ligam a proteínas
celulares. Para caracterizar ainda mais essas proteínas, os anticorpos foram usados para purificar as
proteínas que eles reconheceram. Em um caso, descobriu-se que os anticorpos se ligavam a pequenos
complexos nucleares de ribonucleoproteínas ou snRNPs (pronuncia-se “snurps”). Os RNAs dentro de
cada complexo eram snRNAs (pequenos RNAs nucleares). As funções desses snRNPs eram
inicialmente misteriosas, mas acabou descobrindo que eles são os principais componentes funcionais
do spliceossoma.
6–103 Qual das opções a seguir forneceria evidências importantes de que os snRNPs estão envolvidos
no splicing do pré-mRNA?
A. Associação de snRNPs com ribossomos B.
Pareamento de bases entre snRNAs e sítios de junção pré-mRNA C. Introns
dentro de snRNAs D. Estruturas
Lariat dentro de snRNAs
6–104 Anticorpos autoimunes de pacientes foram usados para determinar a localização de snRNPs
na célula. Qual das seguintes opções descreve melhor onde as partículas snRNP seriam
encontradas dentro da célula?
A. No citoplasma, próximo aos ribossomos B.
No citoplasma, próximo ao núcleo C. No núcleo,
próximo à RNA polimerase II D. No núcleo, próximo à
RNA polimerase III
6–105 Qual das seguintes proteínas pode ser encontrada em um

snRNP?
A. Uma DNA helicase
B. Uma ATPase
C. Uma proteína intensificadora
D. Uma ribonuclease de sítio específico
Regulação gênica pelo gradiente dorsal no

embrião de Drosophila.
Esta imagem impressionante mostra
seções transversais de um embrião de Drosophila
por volta do 14º ciclo de divisão nuclear após a
fertilização. A imagem à esquerda mostra o
gradiente da proteína Dorsal revelada por um
anticorpo uorescente e, à direita, o padrão
resultante de expressão de vários genes
detectados por hibridização in situ com sondas
uorescentes de ácido nucleico. Pelo menos 50
genes são controlados por Dorsal, alguns
ativados, outros reprimidos.
Legenda dos nomes dos

genes: dpp, decapentaplégico; ind,
neuroblastos intermediários defeituosos;
sog, gastrulação curta; sna, caracol; vnd,
neuroblastos ventrais defeituosos.
135 135
Capítulo 7
CAPÍTULO
Controle da Expressão Gênica 7

UMA VISÃO GERAL DO CONTROLE DE GENE NESTE CAPÍTULO
TERMOS PARA APRENDER UMA VISÃO GERAL DO CONTROLE DE GENE

controle de degradação de mRNA controle de transporte de RNA
controle de atividade de proteína controle transcricional controle CONTROLE DE TRANSCRIÇÃO POR
Controle de localização de RNA translacional SEQUÊNCIA ESPECÍFICA
controle de processamento de RNA PROTEÍNAS DE LIGAÇÃO AO DNA
DEFINIÇÕES REGULADORES DE TRANSCRIÇÃO

LIGAR E DESLIGAR GENES
Combine cada definição abaixo com seu termo na lista acima.
GENÉTICA MOLECULAR
7–1 Regula quais RNAs são exportados do núcleo.
MECANISMOS QUE CRIAM E
7–2 Regula quando e com que frequência uma determinada sequência de genes é transformada em RNA. MANTER CÉLULA ESPECIALIZADA
TIPOS
7–3 Regula quais moléculas de mRNA são seletivamente desestabilizadas no citoplasma.
MECANISMOS QUE REFORÇAM

7–4 Regula quais mRNAs são selecionados para serem usados na síntese de proteínas pelos MEMÓRIA CELULAR EM PLANTAS E
ribossomos.
ANIMAIS
7–5 Regula o splicing e a modificação dos transcritos de RNA.
PÓS-TRANSCRIÇÃO
VERDADEIRO FALSO CONTROLES
Decida se cada uma dessas afirmações é verdadeira ou falsa e explique por quê. REGULAÇÃO DO GENE
EXPRESSÃO POR NÃO CODIFICAÇÃO
7–6 Quando o núcleo de uma célula de cenoura totalmente diferenciada é injetado em um ovo de rã
RNAs
cujo núcleo foi removido, o núcleo doador injetado é capaz de programar o óvulo receptor
para produzir uma cenoura normal.
7–7 As diferenças nos padrões de proteínas produzidas em diferentes tipos de células

especializadas são refletidas com precisão nos padrões de mRNAs expressos.
maior
PROBLEMAS DE PENSAMENTO
7–8 Uma pequena porção de uma exibição bidimensional de proteínas do cérebro humano é mostrada
na Figura 7–1. Essas proteínas foram separadas com base no tamanho em uma dimensão
e na carga elétrica (ponto isoelétrico) na outra. Nem todos os pontos de proteína em tais
exibições são produtos de genes diferentes; alguns representam formas modificadas de uma
menor
proteína que migram para diferentes posições. Escolha alguns conjuntos de pontos que
podem representar proteínas que morrem pelo número de fosfatos que carregam. Explique ácido básico
a base para sua seleção. Figura 7–1 Separação bidimensional de

proteínas do cérebro humano (Problema
7–8). As proteínas foram exibidas usando
7–9 Em princípio, uma célula eucariótica pode regular a expressão gênica em qualquer etapa do eletroforese em gel bidimensional. Apenas uma
caminho do DNA à proteína ativa (Figura 7-2). pequena porção do espectro de proteínas é mostrada.
136 Capítulo 7: Controle da expressão gênica
NÚCLEO CITOSOL Figura 7-2 Seis etapas nas quais a via

para a expressão gênica eucariótica pode ser
proteína controlada (Problema 7-9).
modificada
DNA transcritos mRNA mRNA proteína
primários de RNA
aminoácidos
nucleotídeos
A. Coloque os tipos de controle listados abaixo em locais apropriados no diagrama da

Figura 7–2. 1. Controle
da degradação do mRNA 2.
Controle da atividade da
proteína 3. Controle do
processamento do RNA 4. Controle do transporte
e localização do RNA 5.
Controle da transcrição 6. Controle da tradução
B. Quais dos tipos de controle listados acima provavelmente não serão usados em bac
teria?
TRATAMENTO DE DADOS
7–10 Na clonagem original de ovelhas a partir de células somáticas, a taxa de sucesso foi muito
baixa. Por exemplo, apenas uma ovelha (Dolly) nasceu de 277 zigotos que foram
Figura 7-02
reconstruídos usando núcleos derivados de células da mama e óvulos não
fertilizados e nucleados. Outros experimentos usando núcleos de células
Problema
embrionárias ou fetais de cordeiro 7-10
tiveram uma taxa de sucesso maior, embora ainda baixa.
Dada a raridade de eventos bem-sucedidos, era fundamental eliminar o acasalamento
inadvertido — tanto do doador de ovócitos quanto da mãe substituta — como fonte
de cordeiros recém-nascidos. Para determinar se os animais clonados eram derivados
de núcleos doadores, os pesquisadores analisaram microssatélites de DNA
(sequências curtas e repetitivas de DNA) em quatro loci em mães substitutas e
células doadoras (Figura 7-3). Esses loci foram escolhidos porque muitos
comprimentos diferentes estão presentes nas populações de ovinos.
A. Os resultados na Figura 7-3 argumentam que os cordeiros foram derivados dos
núcleos transplantados ou de um acasalamento inadvertido? Explique sua resposta.
B. Como seriam os resultados para a alternativa que você não escolheu na questão A?
7–11 Um dos raros exemplos de rearranjos do genoma programados durante o desenvolvimento

em mamíferos ocorre durante a geração de diversidade de anticorpos no sistema
imunológico. Nas células B, que produzem anticorpos, os segmentos variável (V) e
constante (C) dos genes da imunoglobulina são aproximados pela deleção de um
longo segmento de DNA que fica
Figura 7–3 Análise de microssatélites de
sete mães de aluguel, os três diferentes
ORIGEM DO DOADOR DE NÚCLEOS DE CÉLULAS tipos de células doadoras nucleares e os
feto seios sete cordeiros que nasceram (Problema 7–10).
embrião
Quatro loci polimórficos foram usados na análise.
SUBSTITUTO
local
cordeiro
células de
cordeiro
células de
cordeiro
células de
As mães substitutas estão dispostas da
MÃES
esquerda para a direita na mesma ordem
1 dos cordeiros que deram à luz. As células
doadoras nucleares foram derivadas de
embrião, feto ou mama. Em cada um
2
dos quatro loci polimórficos, foram usados
iniciadores de reação em cadeia da polimerase
3
anking (PCR) para amplificar o DNA que incluía
um microssatélite específico.
4 Microssatélites com diferentes números de
repetições dão origem a diferentes comprimentos de produtos de PC
CONTROLE DE TRANSCRIÇÃO POR PROTEÍNAS DE LIGAÇÃO DE DNA DE SEQUÊNCIA ESPECÍFICA 137
LINHA GERMINA CÉLULAS B

entre eles. A digestão do DNA não rearranjado da linhagem germinativa com uma
nuclease de restrição que corta o DNA nos segmentos V e C gera duas bandas em SONDAR C EM cv
um Southern blot quando hibridizado com sondas radioativas específicas para os
slots de
segmentos V e C (Figura 7-4) . Você esperaria que as sondas dos segmentos V e C carregamento
hibridizassem com o mesmo ou com diferentes fragmentos de DNA após a digestão

do DNA da célula B com a mesma nuclease de restrição?
Esboce um possível padrão de hibridação com o DNA da célula B que seja
consistente com suas expectativas. Explique a base do seu padrão de hibridização.
(Sem muito mais informações, você não pode prever o padrão exato, portanto,
concentre-se nas características gerais do padrão.)
LINKS MÉDICOS
Figura 7–4 Southern blot de DNAs da linhagem
7–12 As comparações dos padrões dos níveis de mRNA em diferentes tipos de células germinativa e células B (Problema 7–11). O
DNA da linha germinal e o DNA da célula B foram
humanas mostram que o nível de expressão de quase todos os genes ativos é
digeridos com a mesma nuclease de restrição. Apenas
diferente. Os padrões de abundância de mRNA são tão característicos do tipo de a hibridação com o DNA da linhagem germinativa
célula que podem ser usados para determinar o tecido de origem das células é mostrada.
cancerígenas, mesmo que as células possam ter metástase em diferentes partes do
corpo. Por definição, no entanto, as células cancerígenas são diferentes de suas
células precursoras não cancerosas. Como você supõe, então, que os padrões de
expressão de mRNA possam ser usados para determinar a fonte tecidual de um câncer humano?
Figura 7-4
CONTROLE DE TRANSCRIÇÃO POR SEQUÊNCIA

Problema 7-12
PROTEÍNAS ESPECÍFICAS DE LIGAÇÃO AO DNA
TERMOS PARA APRENDER
sequência reguladora cis regulador de transcrição
DEFINIÇÕES
7–13 Uma proteína que se liga a uma sequência específica de DNA e influencia a taxa
em que um gene é transcrito.
7–14 Um segmento curto de DNA, com 5–10 pares de nucleotídeos de comprimento, na

vizinhança do promotor, que serve como um sítio de ligação para uma proteína que
modula a expressão gênica.
VERDADEIRO FALSO
Decida se cada uma dessas afirmações é verdadeira ou falsa e explique por quê.
7–15 Como os contatos individuais são fracos, as interações entre regu

as proteínas latórias e o DNA estão entre os mais fracos em biologia.
7-16 Em termos de como ele interage com o DNA, o motivo hélice-volta-hélice está mais
intimamente relacionado ao motivo zíper de leucina do que ao motivo hélice-volta-
hélice.
7–17 A Figura 7–5 mostra um trecho curto de uma hélice de DNA exibida como um modelo de
preenchimento de espaço. Indique os sulcos maiores e menores e forneça uma
escala de comprimento. É possível dizer a polaridade de cada um dos fios nesta figura?
7–18 Explique como as proteínas de ligação ao DNA podem fazer contatos específicos de
sequência com uma molécula de DNA de fita dupla sem quebrar as pontes de Figura 7–5 Um modelo de preenchimento espacial de um
hidrogênio que mantêm as bases unidas. Indique como, ao fazer tal duplex de DNA (Problema 7–17).
EVENTO ROJAM EVENTO ROJAM
H H
HH
H N H O H C O HN H
N H N
H N H N N H PEQUENO N
N N N N
O H N O H
H enineda
isotyc pt eninaug a maioria
ANTES DE RONIM ANTES DE RONIM
contatos, uma proteína pode distinguir um CG de um par de bases TA. Use a Figura 7–6 Pares de bases CG e TA
Figura 7-6 para indicar que tipos de ligações não covalentes (pontes de (Problema 7–18).
hidrogênio, atrações eletrostáticas ou interações hidrofóbicas) podem ser usadas

para discriminar entre CG e TA. (Você não precisa especificar nenhum
aminoácido em particular na proteína.)
7–19 Quais são os dois componentes fundamentais de uma mudança genética?
7–20 O núcleo de uma célula eucariótica é muito maior do que o de uma bactéria e
contém muito mais DNA. Como consequência, um regulador de transcrição em
uma célula eucariótica deve ser capaz de selecionar seu sítio de ligação específico
entre muitas outras sequências não relacionadas do que um regulador de
transcrição em uma bactéria. Isso apresenta algum problema especial para a
regulação de genes eucarióticos?
Considere a seguinte situação. Suponha que o núcleo eucariótico e a célula
bacteriana tenham cada um uma única cópia do mesmo sítio de ligação ao DNA.
Além disso, suponha que o núcleo tenha 500 vezes o volume da bactéria e tenha
500 vezes mais DNA. Se a concentração do regulador de transcrição que liga o
sítio fosse a mesma no núcleo e na bactéria, o regulador ocuparia seu sítio de
ligação tão bem no núcleo eucariótico quanto na bactéria? Explique a Figura 7-6
sua resposta.
7–21 Um tipo de motivo de dedo de zinco consiste emProblema 7-22

uma hélice e uma folha unidas por
um íon de zinco (Figura 7–7). Quando esse motivo se liga ao DNA, a hélice é
posicionada no sulco maior, onde faz contatos específicos com as bases. Esse
tipo de dedo de zinco é frequentemente encontrado em um aglomerado com
dedos de zinco adicionais, um arranjo que permite que interações DNA-proteína
fortes e específicas sejam construídas por meio de uma unidade estrutural
básica repetitiva. Por que você acha que esse motivo é pensado para desfrutar C
de uma vantagem particular sobre outros motivos de ligação ao DNA, quando a
H 24
força e a especificidade da interação DNA-proteína precisam ser ajustadas C7
durante a evolução?
Zn
H 20
7–22 Muitos reguladores da transcrição formam dímeros de C4
subunidades importantes no DNA. Sugira duas vantagens da dimerização.
7–23 Análises genéticas em bactérias na década de 1950 forneceram a primeira evidência

da existência de reguladores da transcrição. O repressor lambda, um desses
reguladores, é codificado pelo vírus bacteriano, o bacteriófago lambda. O N
repressor lambda se liga como um dímero a locais críticos no genoma do
bacteriófago lambda para manter os genes líticos desligados, o que permite que
o genoma do bacteriófago lambda seja mantido como um residente silencioso no
genoma bacteriano. Cada molécula do repressor consiste em um domínio N- Figura 7–7 Motivo de ligação do DNA do dedo de
zinco (Problema 7–21). O íon zinco interage com as
terminal de ligação ao DNA e um domínio C-terminal de dimerização (Figura 7-8).
cadeias laterais Cys (C) e His (H) de modo que a
Após a indução (por exemplo, por irradiação com luz ultravioleta), os genes para hélice é mantida firmemente em uma das extremidades da
crescimento lítico são expressos, bacteriófago lambda folha.
Figura 7-8 Domínios do repressor

C C C C C C local de
clivagem
lambda e a ligação dos dímeros do
+ repressor ao DNA (Problema 7-23).
N N N N N N
monômeros repressores dímero repressor local de ligação ao DNA
a progênie é produzida e a célula bacteriana sofre lise para liberar a progênie

viral. A indução é iniciada pela clivagem do repressor lambda em um local
entre o domínio de ligação ao DNA e o domínio de dimerização. Na ausência
do repressor ligado, a RNA polimerase inicia a transcrição dos genes líticos,
desencadeando o crescimento lítico. Dado que o número (concentração) de
domínios de ligação ao DNA permanece inalterado pela clivagem do
repressor, por que você supõe que sua clivagem resulta em sua remoção do DNA?
7–24 A diferenciação das células musculares dos somitos do embrião em

desenvolvimento é controlada pela miogenina, um membro da família MyoD
de reguladores da transcrição hélice-alça-hélice. A miogenina funciona como
um erodímero het com outro membro da família MyoD de proteínas hélice-
alça-hélice (Figura 7-9A). A atividade da miogenina deve ser cuidadosamente
controlada para não desencadear a expressão prematura do programa
Figura
que é necessário,
7-8 diferenciação muscular
mas a celular.
miogenina
momento
O gene da
é impedida
da
emmiogenina
de funcionar
é ativado
pelaantes
fosforilação
do
de seu domínio de ligação ao DNA e por sua forte ligação. que não possui
um domínio de ligação ao DNA (Figura 7-9B). Explique como a fosforilação
do domínio de ligação ao DNA e a dimerização com Id podem agir para
manter a miogenina não funcional.
CÁLCULOS
7–25 Um método para determinar os sítios de DNA ligados por um regulador de

transcrição é misturar sequências aleatórias de DNA com o regulador,
separar as sequências ligadas da mistura inicial, amplificar as sequências
ligadas por PCR e então repetir esse processo de ligação-liberação - ciclo de
amplificação até que surja uma sequência de consenso. Mas é razoável
esperar que todas as sequências possíveis de ligação ao sítio de consenso
estejam realmente presentes na amostra inicial de oligonucleotídeos?
(A) HETERODÍMERO MyoD-HLH (B) PHOSPHO-MyoD/Id

LIGADO AO DNA HETERODÍMERO
HLH MyoD Eu ia
MyoD
Figura 7–9 O regulador da transcrição miogenina (Problema 7–24). (A) Miogenina

como parte de um heterodímero ligado ao DNA. HLH significa helix-loop-helix. (B) Uma
forma inativa de miogenina fosforilada ligada a Id.
TABELA 7–1 Sequências de nucleotídeos de DNAs selecionados e amplificados

(Problema 7–25).
GAATTCGCCTCGAGCACATCATTGCCCATATATGGCACGACAGGATCC
GAATTCGCCTCTTCTAATGCCCATATATGGACTTGCTGCGACAGGATCC
GGATCCTGTCGGTCCTTTATGCCCATATATGGTCATTGAGGCGAATTC
GAATTCGCCTCATGCCCATATATGGCAATAGGTGTTTCGACAGGATCC
GAATTCGCCTCTATGCCCATATAAGGCGCCACTACCCCGACAGGATCC
GAATTCGCCTCGTTCCCAGTATGCCCATATATGGACACGACAGGATCC
GGATCCTGTCGACACCATGCCCATATTTGGTATGCTCGAGGCGAATTC
GAATTCGCCTCATTTATGAACATGCCCTTATAAGGACCGACAGGATCC
GAATTCGCCTCTAATACTGCAATGCCCAAATAAGGAGCGACAGGATCC
GAATTCGCCTCATGCCCAAATATGGTCATCACCTACACGACAGGATCC
As sequências sublinhadas correspondem aos locais de primer de PCR. As sequências foram

ordenadas de modo que os sítios de ligação estejam todos orientados na mesma direção
(para facilitar a identificação a olho nu da sequência de consenso).
Considere o seguinte exemplo específico. Você deseja testar todas as

possíveis sequências de consenso com 14 nucleotídeos de comprimento. Você
sintetiza uma população de oligonucleotídeos que transportam uma sequência
aleatória central de 26 nucleotídeos, cercada em ambos os lados por sequências
definidas de 25 nucleotídeos para servir como locais de iniciação para amplificação
de PCR. Você converte os oligonucleotídeos de fita simples em fita dupla, usando
um dos primers de PCR. Você inicia o primeiro ciclo de ligação com uma amostra
de 0,4 ng da população sintetizada de oligonucleotídeos de fita dupla.
A. Quantos oligonucleotídeos de fita dupla, com 76 pares de nucleotídeos de
comprimento, estão presentes na amostra de 0,4 ng com a qual você iniciou o
experimento? (A massa média de um par de nucleotídeos é de 660 daltons.)
B. Supondo que a população inicial de oligonucleotídeos fosse verdadeiramente
aleatória nos 26 nucleotídeos centrais, você esperaria encontrar todas as
sequências possíveis de 14 pares de bases representadas na amostra inicial?
C. As sequências de 10 clones individuais resultantes desse procedimento são
mostradas na Tabela 7–1. Qual é a sequência de consenso à qual o regulador de
transcrição se liga?
TRATAMENTO DE DADOS
7–26 Quando Jacob e Wollman tentaram verificar a ligação genética entre o gene Gal e um
genoma lambda de bacteriófago integrado (denominado profago lambda), eles
descobriram um fenômeno surpreendente ao qual se referiram como “indução destinatário
erótica” (que mais tarde foi chamada de indução zigótica para publicação). Em um lambda– lambda+
cruzamento bacteriano usado para determinar a ligação genética, uma porção do

não não
cromossomo é transferida através de um tubo estreito da bactéria doadora para a lambda–
lise lise
receptora. Jacob e Wollman descobriram que, se o cromossomo doado carregasse doador
um profago lambda, mas a célula receptora não, o crescimento lambda era induzido lise + não
lambda+
fago
na célula receptora, que então lisava, produzindo o fago lambda. Se a célula lambda
lise
receptora carregasse o profago lambda, no entanto, nenhuma lise foi observada.
Um resumo dos resultados de todos os acasalamentos é mostrado na Figura 7–10.
Figura 7–10 Resultados de acasalamentos entre
bactérias com e sem profagos lambda
A. Esses resultados são consistentes com a noção de que um regulador de transcrição (Problema 7–26). Lambda– indica a ausência
codificado pelo profago normalmente reprime os genes líticos do bacteriófago? Por de um profago; lambda+ indica sua presença.
que ou por que não?
B. Suponha que o profago impediu o crescimento lítico ao expressar um regulador de (A) CONFIGURAÇÃO EXPERIMENTAL
fluxo em massa de
transcrição que ativou um gene para uma proteína anti-lise. Os resultados dos
Moléculas de RNA
acasalamentos teriam sido iguais ou diferentes? explique seu polimerase
responder.
7–27 Os reguladores da transcrição geralmente encontram seus locais específicos muito mais alinhado
rapidamente do que seria antecipado pela simples difusão tridimensional. O repressor Lac , moléculas de DNA
por exemplo, associa-se ao operador Lac - seu local de ligação ao DNA - mais de 100
vezes mais rápido do que o esperado para a difusão tridimensional. Claramente, o
repressor deve encontrar o operador por meio de mecanismos que reduzam a
dimensionalidade ou o volume da busca para acelerar a aquisição do alvo. (B) MOLÉCULAS DE RNA POLIMERASE ÚNICAS
Várias técnicas têm sido utilizadas para investigar este problema. Uma das mais
elegantes moléculas de RNA polimerase uorescente usadas que podem ser seguidas
individualmente. Uma matriz de moléculas de DNA foi alinhada em paralelo por uma
técnica eletroforética e ancorada a uma lâmina de vidro.
Moléculas fluorescentes de RNA polimerase foram então deixadas fluir através delas em
um ângulo oblíquo (Figura 7-11A). Traços de polimerases de RNA individuais mostraram
que cerca de metade fluiu na mesma direção que o volume e cerca de metade se desviou
do fluxo de volume de uma maneira característica (Figura 7-11B). Se as moléculas de
Figura 7–11 Interações de moléculas individuais
RNA polimerase foram primeiro incubadas com pequenos fragmentos de DNA contendo de RNA polimerase com DNA (Problema 7–27).
um promotor forte, todos os vestígios seguiram o fluxo em massa. (A) Montagem experimental.
Moléculas de DNA são alinhadas e ancoradas a uma
A. Ofereça uma explicação para o motivo pelo qual algumas moléculas de RNA polimerase se lâmina de vidro em suas extremidades, e moléculas
altamente uorescentes de polimerase de RNA
desviaram do volume total, conforme mostrado na Figura 7-11B. Por que a incubação com podem fluir através delas.
fragmentos curtos de DNA contendo um promotor forte eliminou os traços que se desviaram (B) Traços de duas moléculas individuais
do volume? de polimerase de RNA. O da esquerda viajou
B. Esses resultados sugerem uma explicação de como os reguladores da transcrição com o fluxo de massa e o da direita se desviou
conseguem encontrar seus sites mais rapidamente do que o esperado pela difusão? dele.
A barra de escala é de 10 ÿm.
C. Com base em sua explicação, você esperaria que um regulador de transcrição encontrasse
seu sítio-alvo mais rapidamente em uma população de moléculas de DNA curtas ou em
uma população de moléculas de DNA longas? Assuma que a concentração de DNA é a
Figura 7-11
mesma em ambas as populações e que ambas as populações têm o mesmo número de
sítios-alvo.
Problema 7-32
7–28 A ligação de um regulador de transcrição a uma sequência de DNA pode fazer com que
o DNA se dobre para fazer contatos apropriados com grupos na superfície da proteína.
Essa curvatura de DNA induzida por proteína pode ser prontamente detectada pela forma
como os complexos proteína-DNA migram através de géis de poliacrilamida. A taxa de
migração do DNA dobrado depende da distância média entre suas extremidades à medida
que ele gira em solução: quanto mais dobrado o DNA, mais próximas as extremidades
ficam em média e mais lentamente ele migra. Se houver dois locais de dobra, a distância
ponta a ponta depende se as dobras estão na mesma direção (cis) ou oposta (trans)
(Figura 7-12A).
Você mostrou que a proteína ativadora de catabólitos (CAP) faz com que o DNA se
curve mais de 90° quando se liga ao seu sítio regulador. Você deseja saber os detalhes da
estrutura dobrada. Especificamente, o DNA no centro do sítio de ligação do CAP está
dobrado de modo que o sulco menor da hélice do DNA fique para dentro ou é dobrado
para que o sulco maior fique para dentro? Para responder a isso, você prepara dois tipos
de construções, conforme mostrado na Figura 7–12B. Em um, você coloca duas
sequências de ligação ao CAP em cada lado de um sítio central no qual você insere uma
série de segmentos de DNA que variam de 10 a 20 pares de nucleotídeos de comprimento.
No outro, você dobra o local de inserção com uma sequência de ligação CAP e uma
sequência (A5N5)4 , que é conhecida por dobrar com o sulco principal no interior.
Você mede a migração das construções ligadas ao CAP em relação ao DNA ligado ao
CAP correspondente sem inserção. Você então plota a migração relativa versus o número
de pares de nucleotídeos entre os centros de flexão (Figura 7-12C e D).
(A) DOBRA DE DNA PELO CAP (B) DOIS CONSTRUTOS DOBRADOS Figura 7–12 Flexão do DNA pela ligação do
CAP (Problema 7–28). (A) As configurações
BONÉ inserir BONÉ
cis e trans de um par de curvas.
cis
(B) Duas construções usadas para investigar
a curvatura do DNA pela ligação CAP.
centros de flexão (C) Migração relativa em função do número
de nucleotídeos entre os centros de flexão na
construção CAP-CAP. (D) Migração relativa
trans (A5N5)4 inserir BONÉ em função do número de nucleotídeos entre
os centros de flexão na construção (A5N5)4–
CAP .
centros de flexão
(C) CEP - CEP (D) (A5N5)4–CAP

1.2 1.2
1.1 1.1
noitargim
evitar
1,0 1,0
0,9 0,9
0,8 0,8
77 79 81 83 85 87 89 93 95 97 99 101 103 105
nucleotídeos entre os nucleotídeos entre os
centros de flexão centros de flexão
A. Supondo que haja 10,6 nucleotídeos por volta da hélice de DNA, estime o
número de voltas que separam os centros de curvatura dos dois locais de
ligação do CAP no ponto de migração relativa mínima. Quantas voltas
helicoidais separam os centros de flexão no ponto de migração relativa
máxima?
relação entre
assumindo quea migração
a configuração Figura
relativa
cis
CAP
emigra11-04
maisB.lentamente
a éseparação Ados centros
a esperada, dode
que
flexão
a configuração
dos sítios
trans (Figura 7-12C)? Explique sua resposta.
Problema 11-37
C. Quantas voltas helicoidais separam os centros de flexão no ponto de migração

mínima da construção com um sítio CAP e um (A5N5)4 sítio (Figura 7–12D)?
D. Qual sulco da hélice está voltado para dentro da dobra no centro de

flexão do site CAP?
7–29 Os oncogenes Fos e Jun codificam proteínas que formam um regulador

heterodimérico da transcrição. Os domínios de zíper de leucina em cada
proteína medeiam sua dimerização por meio de interações em espiral. A
justaposição de dimerização coloca os domínios de ligação ao DNA de cada
proteína, posicionando-os para interação com sítios regulatórios no DNA. A
dinâmica da interação Fos-Jun na presença e ausência de DNA AP-1 (a
sequência à qual o heterodímero Fos-Jun se liga) foi investigada por
transferência de energia por ressonância de fluorescência (FRET), que é
adequada para a medida rápida necessários em tais estudos.
Fos foi marcado com uoresceína (Fos–F) e Jun foi marcado com rodamina
(Jun–R), conforme mostrado na Figura 7–13A. A fluoresceína absorve luz em
490 nm e emite luz em 530 nm, enquanto a rodamina absorve luz em 530 nm
e emite luz em 603 nm. Quando Fos-F e Jun-R são aproximados por meio de
heterodimerização, a energia luminosa absorvida pela uoresceína a 490 nm é
eficientemente transferida para a mina de rhoda por transferência de energia
não radiativa e emitida pela rodamina a 603 nm. A dimerização, portanto,
diminui a uorescência pela uoresceína a 530 nm e aumenta a uorescência pela
rodamina a 603 nm, conforme mostrado na Figura 7-13B. Na presença do
DNA AP-1, o FRET é ainda mais eciente
(A) rodamina fluoresceína (B) ESPECTRO DE EMISSÃO (C) CINÉTICA DE TROCA
fluoresceína
+ ADN AP-1
530 nm 1,0
1,0 Fos-F
+ Fos
0,8
Jun-R Fos-F 0,8
fluorescência
relativa
0,6
0,6 Fos-F
+ Jun-R fluorescência
relativa
603
anm
rodamina 603
ADN AP-1 0,4
0,4 nm
Fos–F + Jun–R ÿ ADN AP-1
+ ADN AP-1 0,2
0,2
0
0 500 540 580 620 660 0 400200 600 800 1000
comprimento de onda (nm) tempo (segundos)
Figura 7–13 Dinâmica da heterodimerização de Fos–Jun na presença e ausência de DNA AP-1 (Problema 7–29).
(A) Arranjo de uoróforos em Fos–F e Jun–R. No dímero, a uoresceína excitada em Fos transfere energia para a rodamina em Jun. (B) Espectros
de emissão de Fos–F sozinho, Fos–F com Jun–R e Fos–F com Jun–R e DNA AP-1. Os espectros de emissão foram registrados entre 500 e
700 nm após excitação a 490 nm. (C) Análise da troca de Fos–F e Jun–R na presença e ausência de DNA AP-1. A fluorescência da rodamina
a 603 nm foi seguida ao longo do tempo após a excitação da fluoresceína a 490 nm. Um excesso de 10 vezes de Fos não marcado foi adicionado
no tempo indicado pela seta.
(Figura 7-13B), indicando que a ligação ao DNA aproxima ainda mais os dois uoróforos.
A FRET também foi usada para medir a capacidade dos dímeros Fos-Jun de trocar
subunidades com monômeros em solução na presença e ausência de DNA AP-1
(Figura 7-13C). Fos–F e Jun–R foram pré-incubados na ausência de DNA para
permitir a formação de heterodímeros livres, ou em sua presença para permitir a
formação de heterodímeros ligados a DNA. Um excesso de 10 vezes de Fos (sem
uoresceína) foi então adicionado a ambas as soluções, e a uorescência de rodamina
em 603 nm foi seguida após excitação em 490 nm (Figura 7-13C).
A. Os heterodímeros livres trocam subunidades com Fos não marcado adicionado?

Os heterodímeros ligados ao DNA trocam subunidades? Como você sabe?
Figura 7-13
Explique quaisquer diferenças significativas no comportamento de heterodímeros
livres e ligados ao DNA.
Problema 7-34
B. Na maioria das células, existem muitos reguladores distintos da transcrição do zíper de
leucina, vários dos quais podem interagir para formar uma variedade de heterodímeros.
Se os resultados da Figura 7-13C fossem típicos das proteínas do zíper de leucina, o
que eles implicariam sobre os heterodímeros do zíper de leucina nas células?
7–30 A ligação de uma proteína ao DNA pode protegê-la da clivagem química, que é a
base da técnica conhecida como pegada de DNA. Você usou pegada de DNA para
determinar o sítio de ligação de DNA de um regulador de transcrição após rotular uma
fita. Para verificar seus resultados, repita o experimento depois de rotular a outra fita
do duplex.
Você descobre que as pegadas estão ligeiramente afastadas umas das outras em
relação à sequência do DNA (Figura 7-14). Se a proteína se liga ao mesmo duplex em
ambos os casos, como as pegadas nas duas fitas podem ser diferentes?
Figura 7–14 pegadas de DNA (Problema 7–
30). As sequências do DNA das fitas superior
e inferior ao redor da pegada são mostradas.
As extremidades 5º dos fios superiores ou
inferiores foram marcadas com 32P. A clivagem
vertente superior sem proteína
química foi usada para introduzir quebras
5'-CTGTGTGTATGCTGGGAAGGACTT de DNA, que são distribuídas aleatoriamente,
vertente superior + proteína conforme mostrado pelas intensidades
aproximadamente iguais das bandas individuais.
vertente
Cada banda corresponde a um fragmento
inferior + proteína
de DNA que difere daqueles de cada lado por
GACACACATACGACCCTTCCTGAA–5' um nucleotídeo.
REGULADORES DE TRANSCRIÇÃO COMO INTERRUPTORES DE GENE

gene da sequência reguladora cis promotor da região de

controle do gene
DEFINIÇÕES
7–31 Sequência de nucleotídeos no DNA à qual a RNA polimerase se liga para iniciar
a transcrição.
7–32 toda extensão de DNA envolvida na regulação e iniciação da transcrição de

um gene.
7–33 O segmento de DNA que é transcrito em RNA.
VERDADEIRO FALSO
7–34 Muitos reguladores da transcrição em eucariotos podem agir mesmo quando estão
ligados ao DNA a milhares de pares de nucleotídeos de distância do promotor
que influenciam.
7–35 O arranjo compactado de genes bacterianos e interruptores genéticos pode ter

se desenvolvido a partir de formas mais extensas de interruptores em resposta à
pressão evolutiva para manter um genoma pequeno.
7–36 Os genes que codificam as enzimas para a biossíntese da arginina estão

localizados em várias posições ao redor do genoma da E. coli. O regulador de
transcrição ArgR coordena sua expressão. A atividade de ArgR é modulada pela
arginina. Ao se ligar à arginina, o ArgR muda drasticamente sua afinidade pelas
sequências reguladoras cis nos promotores dos genes para as enzimas
biossintéticas da arginina. Dado que ArgR é um repressor de transcrição, você
esperaria que ArgR se ligasse mais fortemente, ou menos fortemente, às
sequências regulatórias quando a arginina é abundante? Se ArgR funcionasse
como um ativador de transcrição, você esperaria que a ligação de argi nove
aumentasse ou diminuísse sua anidade por suas sequências reguladoras?
Explique suas respostas.
7–37 As células bacterianas podem captar o aminoácido triptofano de seus arredores ou,
se o suprimento externo for insuficiente, podem sintetizar triptofano a partir de
pequenas moléculas na célula. O repressor do triptofano inibe a transcrição dos
genes do operon triptofano, que codifica as enzimas biossintéticas do triptofano.
Após a ligação do triptofano, o repressor do triptofano se liga a um sítio no
promotor do operon.
A. Por que a ligação dependente de triptofano ao operon é uma propriedade útil para
o repressor de triptofano?
B. O que você esperaria que acontecesse com a regulação das enzimas biossintéticas
do triptofano em células que expressam uma forma mutante do repressor do
triptofano que (i) não pode se ligar ao DNA ou (ii) se liga ao DNA mesmo quando
nenhum triptofano está ligado a isto?
C. O que aconteceria nos cenários (i) e (ii) se a célula produzisse o repressor de
triptofano normal a partir de uma segunda cópia não mutada do gene?
7–38 Na Figura 7–15, a proteína ativadora bacteriana CAP e o repressor Lac foram
colocados em quatro combinações possíveis em sua ligação
REGULADORES DE TRANSCRIÇÃO COMO INTERRUPTORES DE GENE 145
ESOTCALESOCULG YTIVITCA NOREPO Figura 7-15 Disposição dos sítios de

ligação e as quatro combinações
possíveis de reguladores da transcrição
no promotor do operon Lac (Problema 7-38).
Lac repressor
BONÉ
Lac repressor
BONÉ RNA polimerase
LacZ
sítios no promotor para o operon Lac . Cada combinação de reguladores de transcrição

corresponde à ligação esperada em uma mistura particular de glicose e lactose. Para cada
uma das quatro combinações, indique no lado esquerdo da figura quais açúcares estão
presentes e, no lado direito, se o operon deve ser ativado ou desativado.
7–39 Imagine que você criou uma fusão entre o operon Trp , que codifica as enzimas para a biossíntese
do triptofano, e o operon Lac , que codifica as enzimas necessárias para a utilização da
lactose (Figura 7–16). Sob qual conjunto de condições (A–F abaixo) a -galactosidase será
expressa na cepa que carrega o operon fundido?
A. Somente quando a lactose e a glicose estão ausentes.

B. Somente quando a lactose e a glicose estão presentes.
C. Somente quando a lactose está ausente e a glicose está presente.
D. Somente quando a lactose está presente e a glicose está ausente.
E. Somente quando o triptofano está ausente.
F. Somente quando o triptofano está presente.
7–40 Quando se descobriu inicialmente que as sequências reguladoras cis influenciam a atividade em
promotores
distantes, dois modelos principais foram invocados para explicar essa ação à distância. No
modelo “DNA looping”, foram propostas interações diretas entre os reguladores da
Resposta 7-50
transcrição ligados às sequências reguladoras cis e os promotores distantes para estimular
a RNA polimerase. No modelo de “varredura”, a RNA polimerase (ou um regulador da
transcrição) foi proposta para se ligar na sequência regulatória e depois deslizar ao longo
do DNA até atingir o promotor. Esses dois modelos foram distinguidos usando uma
sequência reguladora cis em um pedaço de DNA e o gene da ÿ-globina com seu promotor
em um pedaço separado de DNA (Figura 7-17). O gene da ÿ-globina não foi expresso a
partir da mistura de peças. No entanto, quando os dois segmentos de DNA foram unidos
por meio de um ligante de proteína, o gene da ÿ-globina foi expresso. Figura 7–16 Operons Trp e Lac separados
(normais) e fundidos (Problema 7–39).
região operon trp região Lac operon

regulatória trp regulatória LAC
E D C B A Com
e a
codifica
ÿ-galactosidase
FUSÃO
região Operon de fusão Trp-Lac

regulatória trp
EDC Com
e a
codifica
ÿ-galactosidase
biotina Figura 7-17 Estimulação da expressão do

gene da ÿ-globina por uma sequência
reguladora cis ligada por meio de uma
sequência ÿ-globina
ponte de proteína (Problema 7-40). Cada
reguladora cis
+ avidina molécula de DNA carrega biotina ligada a
uma extremidade, como mostrado.
Na presença da proteína avidina, as duas
moléculas se ligam e ocorre a transcrição,
como mostra a seta acima do gene da ÿ-globina.
cis-regulatório ÿ-globina
seqüência
Como esse experimento distingue entre o loop de DNA

modelo e o modelo de escaneamento? Explique sua resposta.
7–41 Alguns reguladores da transcrição se ligam ao DNA e fazem com que a dupla hélice se
dobre em um ângulo agudo. Essas “proteínas de flexão” podem afetar o início da
transcrição sem entrar em contato diretamente com nenhuma outra proteína. Você
pode conceber uma explicação plausível de como essas proteínas podem funcionar
para modular a transcrição? Desenhe um diagrama que ilustre sua explicação.
7–42 O ativador de transcrição Gal4 de levedura compreende dois domínios: um

domínio de ligação ao DNA e um domínio de ativação. O domínio de ligação de DNA
permite que Gal4 se ligue a sequências de DNA apropriadas localizadas perto de
genes que são necessários para o metabolismo do açúcar galactose. O domínio de
ativação liga-se a componentes da maquinaria transcricional (incluindo a RNA
polimerase), atraindo-os para o promotor, para que os genes regulados possam ser
ativados. Na ausência de Gal4, os genes da galactose não podem ser ativados.
Quando Gal4 é expresso normalmente, os genes podem ser ativados ao máximo.
Quando Gal4 é massivamente superexpresso, no entanto, os genes da galactose
são desligados. Por que você acha que muito Gal4 inibe a expressão dos genes da
galactose?
Figura 7-19 7-43
Como as enzimas de modificação de histonas e os complexos de remodelação da cromatina
são recrutados para a cromatinaProblema
não modificada e como eles podem ajudar no
7-52 na
ativação da transcrição de genes previamente silenciosos?
7-44 Como é que as interações proteína-proteína que são muito fracas para fazer com que as
proteínas se agrupem em solução podem, no entanto, permitir que as mesmas
proteínas se agrupem em complexos no DNA?
7–45 Considere o seguinte argumento: “Se a expressão de cada gene depende de um conjunto
de reguladores de transcrição, então a expressão desses reguladores de transcrição
também deve depender da expressão de outros reguladores de transcrição, e sua
expressão deve depender da expressão de ainda outros reguladores de transcrição,
e assim por diante. As células, portanto, precisariam de um número infinito de genes,
a maioria dos quais codificaria os reguladores da transcrição”. Como a célula
sobrevive sem ter que alcançar o impossível?
TRATAMENTO DE DADOS
7–46 E. coli prolifera mais rapidamente no monossacarídeo glicose do que no dissacarídeo

lactose por dois motivos: (1) a lactose é absorvida mais lentamente do que a glicose
e (2) a lactose deve ser hidrolisada em glicose e galactose (pela -galactosidase )
antes de poder ser metabolizado.
Quando a E. coli cresce em um meio contendo uma mistura de glicose e lactose,
ela prolifera com cinética complexa (Figura 7-18, quadrados). As bactérias proliferam
mais rapidamente no início do que no final, e há um atraso entre essas duas fases
quando elas praticamente param de se dividir. Os ensaios das concentrações dos
dois açúcares no meio mostram
REGULADORES DE TRANSCRIÇÃO COMO INTERRUPTORES DE GENE 147
Figura 7–18 Proliferação de E. coli

ÿ-galactosidase em uma mistura de glicose e lactose
(Problema 7–46).
108 10
glicose
bactérias
mL
por
bactérias
107 5
galactosidase
concentração
arbitrárias)
(unidades
glicose
(mM)
de
ÿ-
106 0
0 100 200
tempo (minutos)
que a glicose cai para níveis muito baixos após algumas duplicações de células (Figura
7-18, círculos), mas a lactose permanece alta até perto do final do curso de tempo
experimental (não mostrado). Embora a concentração de lactose seja alta durante a maior
parte do experimento, a -galactosidase, que é regulada como parte do operon Lac , não é
induzida até que tenham passado mais de 100 minutos (Figura 7-18, triângulos).
A. Explique a cinética da proliferação bacteriana durante o experimento.

Considere a taxa inicial rápida, a taxa final mais lenta e o atraso no meio do experimento.
B. Explique por que o operon Lac não é induzido pela lactose durante o rápido
fase inicial da proliferação bacteriana.
7–47 A transcrição do gene bacteriano que codifica a enzima glutamina sintetase é regulada pela
disponibilidade de nitrogênio na célula. O principal regulador da transcrição da Figura 7-21
é a proteína NtrC, que estimula a transcrição quando é fosforilada. A transcrição do gene
para a sintetase do Problema 7-60 da glutamina pode ser obtida in vitro pela adição de
RNA polimerase, um fator sigma especial e NtrC fosforilado. Embora o NtrC se ligue
independentemente do seu estado de fosforilação e a RNA polimerase se ligue fortemente
ao promotor na ausência de NtrC, a transcrição é absolutamente dependente do NtrC (A) Sítios gene da glutamina sintetase
fosforilado. de ligação NtrC
A ativação da transcrição por NtrC foi caracterizada usando três modelos diferentes: o
gene normal com cinco sequências reguladoras, um gene com todos os sítios de ligação promotor
de NtrC deletados e um gene com três sítios de ligação de NtrC em sua extremidade 3º
( Figura 7-19 ). Para taxas de transcrição semi-máximas, o gene normal (Figura 7-19A) (B) gene da glutamina sintetase
exigiu 5 nM NtrC, o gene com 3 seg. NtrC-sítios de ligação (Figura 7-19C) exigiu 10 nM
NtrC e o gene sem sítios de ligação NtrC (Figura 7–19B) exigiu 50 nM NtrC.
promotor
A. Se a RNA polimerase pode se ligar ao promotor do gene da glutamina sintetase na ausência
de NtrC, por que você acha que NtrC é necessário para ativar a transcrição?
(C) gene da glutamina sintetase Sítios
de ligação NtrC
B. Se o NtrC pode se ligar a seus sítios de ligação independentemente de seu estado de
fosforilação, por que você acha que a fosforilação é necessária para a transcrição?
promotor
C. Se o NtrC pode ativar a transcrição mesmo quando seus sítios de ligação estão ausentes,
que papel os sítios de ligação desempenham?
Figura 7–19 Três modelos para estudar o
7–48 Os coativadores não se ligam ao DNA, mas servem como moléculas de ligação que ligam papel do NtrC na transcrição do gene da
os ativadores da transcrição aos fatores gerais de transcrição no promotor. O complexo glutamina sintetase (Problema 7–47).
SAGA na levedura é um grande complexo multiproteico necessário para a transcrição de (A) O gene normal com sequências
reguladoras upstream intactas. (B) Um
muitos genes. SAGA contém uma variedade de proteínas, incluindo uma histona acetil
gene com todos os locais de ligação de
transferase e um subconjunto de fatores associados à proteína de ligação a TATA (TAFs). NtrC excluídos. (C) Um gene com
Se o SAGA funciona como um três sítios de ligação NtrC na extremidade 3eg do gene.
(A) MAPA DO LOCUS Gal1-Gal10 Figura 7–20 Análise da

associação SAGA com o promotor
louco10 Gal1 Gal (Problema 7–48). (A) Organização
UAS
dos genes Gal10 e Gal1. Um UAS
comum atende a ambos os
A B C D E F G promotores, que são indicados por
caixas verdes. As posições dos
(B) PRODUTOS DE PCR A PARTIR DE IMUNOPRECIPITADOS DE CROMATINA fragmentos de PCR que foram usados
para quantificação são mostradas por A–
Spt3 Spt20
G abaixo. (B) Resultados da
6
imunoprecipitação da cromatina
8
usando anticorpos contra Spt3 ou
Spt20. As cepas foram cultivadas
4 6
em meio contendo rafnose (Raf) ou
galactose (Gal), sua cromatina foi
gal/
raf gal/
raf
4
fragmentada e imunoprecipitada, e o DNA
2
foi amplificado por PCR quantitativo. Os
2
produtos de PCR de cepas cultivadas em
rafnose foram carregados nos géis e
0 0
EM AB C F ED G EM AB C D E F G
executados por alguns minutos antes dos
produtos de PCR de cepas cultivadas em
Garota
galactose, para que os produtos
raf pudessem ser comparados nas
mesmas pistas. Finalmente, as quantidades
de produtos de PCR foram medidas,
normalizadas para a cromatina de
entrada antes da imunoprecipitação (IN),
e a razão (Gal/Raf) foi calculada. Cerca de
50 a 100 vezes menos cromatina de
coativador, ele deve estar fisicamente presente nos promotores que ele regula em
entrada (IN) foi carregada por pista do que a cromatina imunop
condições apropriadas.
Para testar essa ideia, você se concentra na regulação dos genes Gal1 e Gal10
pelo ativador Gal4, que se liga a sequências reguladoras cis (denominadas UAS)
adjacentes a seus promotores (Figura 7-20A, caixas verdes).
Quando as células crescem em galactose, os genes Gal1 e Gal10 são transcritos;
quando as células são cultivadas na ranose de açúcar, os genes não são transcritos.
Figura 7-27 Para
determinar se o complexo SAGA se associa com Gal4 no cromossomo, você usa a
técnica de imunoprecipitação da cromatina.
Problema 7-66 Você corta a cromatina em pequenos
pedaços e precipita aqueles que estão ligados ao complexo SAGA, usando anticorpos
contra dois componentes do complexo - Spt3 e Spt20. Você retira a cromatina
precipitada da proteína e analisa o DNA por PCR quantitativo para medir as quantidades
de segmentos específicos de DNA nos precipitados. A proporção de sequências de
DNA precipitadas de células cultivadas em galactose para aquelas de células cultivadas
em ranose (Gal/Raf) é mostrada para vários segmentos ao redor do promotor da
galactose na Figura 7-20B.
A. Qual dos fragmentos testados você esperaria que fosse enriquecido se o SAGA se
comportasse como um coativador? Explique sua resposta.
B. O SAGA atende aos critérios de um coativador? Está fisicamente presente no promotor
em condições apropriadas?
7–49 Os genes expressos no locus de tipo de acasalamento de levedura (Mat) no cromossomo III
determinam o tipo de acasalamento de uma célula de levedura haploide. Genes de
tipo de acasalamento idênticos também existem em dois outros loci - Hml e Hmr - no
mesmo cromossomo (Figura 7-21A). Nesses dois loci silenciosos, os genes do tipo de
acasalamento não são expressos, embora todos os sinais para expressão estejam presentes.
Cada locus do tipo de acasalamento silencioso é delimitado por duas sequências curtas
de DNA, designadas E e I, que ligam uma variedade de proteínas e servem para
estabelecer e manter a repressão de genes dentro de cada locus.
Para investigar a função desses elementos, você insere o gene Ura3 em locais
diferentes entre E e I e fora do locus Hml , conforme mostrado na Figura 7-21B. Você
então testa o crescimento dessas cepas em meio completo, na ausência de uracil (-
uracil) e na presença de ácido 5-uoroorótico (+FOA) (Figura 7-21B). essas condições
de crescimento
MECANISMOS GENÉTICOS MOLECULARES QUE CRIAM E MANTEM TIPOS DE CÉLULAS ESPECIALIZADOS 149
(A) LOCI DE TIPO DE ACOPLAMENTO SILENCIOSO DE LEVEDURAS
a2 a1 a2 a1
Centrômero
E Hml EU E Hmr EU
3 kb
(B) INSERÇÃO DE GENES Ura3 PERTO DE Hml
meio completo – uracilo + FOA

A B CDE F
0 E Hml EU
0
1 Ura3 1
2 Ura3 2
Ura3
3 3
4 Ura3 4
Ura3
5 5
6 Ura3 6
Ura3
7 7
8 Ura3 8
Ura3
9 9
10 Ura3 10
Figura 7–21 Efeitos dos elementos E e I em Hml na

teste para a atividade do gene Ura3 : em meio completo, a expressão da proteína Ura3 é
expressão do gene Ura3 inserido nas proximidades
irrelevante; na ausência de uracilo, a expressão de Ura3 é necessária para o crescimento; (Problema 7–49).
e na presença de FOA, a expressão de Ura3 é letal para a célula. (A) Disposição dos elementos E e I em torno de
Hml e Hmr. Os genes do tipo de acasalamento são
Esses elementos de controle reprimem especificamente os genes do tipo de mostrados como 1, 2, a1 e a2.
(B) Locais do gene Ura3 inserido ao redor do locus
acasalamento ou agem como isolantes que controlam a expressão de qualquer gene Hml. As orientações do gene Ura3 são indicadas
colocado entre eles? pela direção das letras. Os fenótipos de crescimento
de cada cepa são indicados no painel à direita. A cepa 0
é a cepa parental sem o gene Ura3; as cepas 1 a 10
MECANISMOS GENÉTICOS MOLECULARES QUE CRIAM têm o gene Ura3 inserido conforme indicado.
Figura 7-31
Diluições seriadas de cada cepa foram colocadas
E MANTER TIPOS DE CÉLULAS ESPECIALIZADOS em placas de ágar (com a maior concentração
à esquerda). O ágar continha meio completo, meio
TERMOS PARA APRENDER Problema 7-68
completo menos uracil (–uracil) ou meio completo
memória celular Célula-tronco pluripotente induzida (iPS) mais FOA (+FOA).
DEFINIÇÕES
As áreas brancas indicam crescimento.
7–50 Célula derivada de um broblasto, por expressão articial de reguladores específicos da

transcrição, que se parece e se comporta como uma célula-tronco embrionária.
7–51 A propriedade que permite que uma célula em proliferação mantenha sua identidade
através das divisões celulares subseqüentes.
VERDADEIRO FALSO
7–52 Na maioria dos organismos, as moléculas extracelulares que se ligam a receptores na superfície
celular comunicam as pistas posicionais que permitem que as células do embrião se
diferenciem em tipos apropriados de células.
7–53 Os broblastos que são convertidos em células musculares pela expressão do regulador
de transcrição MyoD provavelmente já acumularam vários reguladores de transcrição que
podem cooperar com MyoD para ativar genes específicos do músculo.
(A) ESTADO PROFÁGICO

7–54 Uma vez que as células tenham se diferenciado para suas formas especializadas finais, elas nunca
novamente alterar a expressão de seus genes.
gene cI gene cro
7–55 O bacteriófago lambda pode se replicar como um profago ou liticamente. No estado SEM GENE Cro
de profago, o DNA viral é integrado ao cromossomo bacteriano e é copiado uma TRANSCRIÇÃO
vez por divisão celular. No estado lítico, o DNA viral é liberado do cromossomo e (B) ESTADO LÍTICO
se replica várias vezes. O DNA viral produz proteínas de revestimento viral que
envolvem os genomas virais replicados para formar muitas novas partículas virais,
que são liberadas quando a célula bacteriana estoura.
gene cI gene cro
Esses dois estados são controlados pelos reguladores da transcrição cI e NÃO EXISTE GENE
Cro, que são codificados pelo vírus. No estado de profago, cI é expresso; no TRANSCRIÇÃO
estado lítico, o Cro é expresso. Além de regular a expressão de outros genes, cI

é um repressor da transcrição do gene que codifica Cro, e Cro é um repressor do
Figura 7–22 Regulação da replicação do
gene que codifica cI (Figura 7-22). bacteriófago lambda por cI e Cro (Problema
7–55). (A) O estado profago. (B) O
Quando bactérias contendo um profago lambda são brevemente irradiadas estado lítico.
com luz ultravioleta (UV), a proteína cI é degradada.
A. O que acontecerá a seguir?
B. A alteração em questão A será revertida quando a luz UV for trocada
o?
C. Como esse mecanismo é benéfico para o vírus?
7–56 Imagine as duas situações mostradas na Figura 7–23. Na célula 1, um sinal transitório
induz a síntese da proteína A, que é um ativador da transcrição que ativa muitos
genes, inclusive o seu próprio. Na célula 2, um sinal transiente induz a síntese
da proteína R, que é um repressor da transcrição que desativa muitos genes
inclusive o seu próprio. Em qual dessas situações, se for o caso, os descendentes
Figura 7-32
da célula original “lembrarão” que a célula progenitora experimentou o sinal
transiente? Explique seu raciocínio.
Problema 7-78
7–57 A Figura 7–24 mostra um esquema simples pelo qual três reguladores de transcrição
podem ser usados durante o desenvolvimento para criar oito tipos diferentes de
células. Quantos tipos de células você poderia criar, usando as mesmas regras,
com quatro reguladores de transcrição diferentes? MyoD é um regulador da
transcrição que pode desencadear todo o programa de diferenciação muscular
quando expresso em broblastos. Como você acomodaria essa observação no
esquema mostrado na Figura 7-24?
TRATAMENTO DE DADOS
7–58 A proteína codificada pelo gene Even-skipped (Eve) da Drosophila é um

regulador de transcrição necessário para a segmentação adequada no meio
(A) CÉLULA 1
A A
sinal
DESLIGADO
transiente A
A A A
ativador de transcrição ativa a transcrição do mRNA proteína ativadora

ativador ativa sua própria
transcrição
(B) CÉLULA 2
sinal
R R Figura 7–23 Circuitos reguladores de genes
DESLIGADO
transiente R
e memória celular (Problema 7–56). (A)
R R R Indução da síntese do ativador de
transcrição A por um sinal transiente. (B)
repressor de transcrição ativa a transcrição do mRNA proteína repressora
repressor desliga sua própria Indução da síntese do repressor de
transcrição transcrição R por um sinal transiente.
Figura 7–24 Uma ilustração do

controle combinatório de genes
para o desenvolvimento (Problema 7–
57). Nesse esquema simples e idealizado,
INDUZIR uma “decisão” de fazer um novo regulador
TRANSCRIÇÃO de transcrição (símbolos numerados)
REGULADOR 1 é feita após cada divisão celular. Nesse
esquema, a célula filha à direita é induzida
a produzir o novo regulador da transcrição.
ESQUERDA 1 CERTO Supõe-se que cada regulador da transcrição
continue a ser expresso após ser
INDUZIR induzido, permitindo assim que diferentes
TRANSCRIÇÃO combinações de proteínas reguladoras sejam
REGULADOR 2 construídas. Neste exemplo, oito tipos
diferentes de células foram criados.
1
2 1
2
INDUZIR
TRANSCRIÇÃO
REGULADOR 3
2 1
1 1
3 2 1 3
2 2
3 3
A B C D E F G H
do corpo. Aparece pela primeira vez cerca de 2 horas após a fertilização em um nível
uniforme em todos os núcleos embrionários. Não muito tempo depois, forma um padrão
de sete listras no embrião. Cada faixa está sob o controle de um módulo separado no
promotor de Eve , que fornece locais de ligação para repressores e ativadores da
transcrição de Eve . No caso da faixa 2, existem vários sítios de ligação sobrepostos
para ativadores e repressores (Figura 7-25). Dois ativadores de transcrição, Hunchback
(Hb) e Bicoid (Bcd), e dois repressores de transcrição, Giant (Gt) e Krüp pel (Kr), são
necessários para dar o padrão normal. e sítios de ligação para a Figura 7-34, essas
proteínas foram mapeadas no segmento de 670 nucleotídeos mostrado na Figura 7-25;
a deleção desse segmento a montante abole a expressão do Problema 7-81 de Eve na
faixa 2. Os padrões de expressão de Corcunda, Bicóide, Gigante e Krüppel no embrião
são mostrados na Figura 7-26. Parece que a expressão de Eve na faixa 2 ocorre
apenas na região do embrião que expressa ambos os ativadores da transcrição, mas
nenhum repressor da transcrição: uma regra bastante simples.
Para verificar se esta regra está correta, você constrói um gene repórter de ÿ-
galactosidase conduzido por um segmento upstream de 5 kb do promotor de Eve .
(este segmento também inclui os elementos de controle para faixas 3 e 7.) Além do
elemento upstream normal, você cria três versões mutantes nas quais vários dos
locais de ligação no segmento de controle Eve stripe 2 foram excluídos .
Construir 1. Exclusão de todos os sites de ligação Krüppel

Construir 2. Exclusão de todos os sites de ligação gigante
Construir 3. Deleção de dois sítios de ligação Bicoid (indicados por em
Figura 7-25)
Eve stripe 2
elemento
de controle
gene da ÿ-galactosidase
Figura 7-25 Sítios de ligação para repressores

de transcrição e ativadores da faixa 2 de
REPRESSORES Eve (Problema 7-58). O segmento de
NOK Kr Gt Gt NOK GT Kr Kr Kr
controle Eve stripe 2, com DNA adicional a
montante do promotor Eve, foi fundido ao
Bcd Bcd Bcd Hb Bcd D Hb Hb gene da ÿ-galactosidase, cujo produto pode
ATIVADORES D ser prontamente visualizado no embrião.
faixa
de véspera 2
Corcunda (Hb)
noisserpxe
slevel
Gigante aleijado
(Gt) (kr)
Bicóide (Bcd)
pólo polo
anterior posterior
Figura 7-26 Expressão dos repressores e ativadores da

transcrição de Eve stripe 2 no embrião de Drosophila
(Problema 7-58).
Você faz ies contendo essas novas construções genéticas integradas em seus
cromossomos e determina os padrões de expressão da -galactosidase em seus
embriões, que são mostrados na Figura 7-27.
A. Combine os embriões mutantes com as construções mutantes.
B. Você começou esses experimentos para testar a regra simples de que a expressão
de Eve na faixa 2 ocorre no embrião onde os dois ativadores da transcrição estão
presentes e os dois repressores da transcrição estão ausentes. Os resultados com
os embriões mutantes confirmam esta regra? Explique sua resposta.
C. Oferece uma explicação plausível para o motivo de não haver expressão de
-galactosidase no polo anterior do embrião mutante D na Figura 7-27.
D. No segmento de controle Eve stripe 2, os sítios de ligação para os dois ativadores de
transcrição não se sobrepõem, nem os sítios de ligação para os dois repressores de
transcrição; no entanto, é frequente que os locais de ligação dos ativadores se
sobreponham aos locais de ligação dos repressores. O que essa sobreposição
sugere sobre o modo de controle genético de Eve na faixa 2 e quais podem ser as
consequências para a morfologia da faixa?
7-59 Os receptores hormonais para glicocorticoides, após a ligação do hormônio, tornam-se

reguladores da
transcrição que ativam um conjunto específico de genes responsivos. Os sítios de
ligação do DNA e do hormônio ocupam regiões distintas da metade C-terminal do
receptor
glicocorticóide. A ligação hormonal degerar uma proteína funcional de ligação
poderia números de faixa
23 7
ao DNA, alterando a conformação do receptor para criar um domínio de ligação ao
(A) NORMAL
DNA ou alterando a conformação para descobrir um domínio de ligação ao DNA
preexistente. Essas possibilidades foram investigadas
comparando as atividades de uma série de deleções C-terminais (Figura
7-28). Segmentos do cDNA que codificam porções N-terminais do receptor foram
expressos em células, e sua capacidade de ativar um gene de cloranfenicol acetil (B) MUTANTE
transferase (Cat) - ligado a uma sequência cis-reguladora responsiva a glicocorticóides

- foi medida. Conforme mostrado na Figura 7-28, o receptor de comprimento total
(com seu terminal C na posição 0) exibiu atividade CAT apenas na presença do
glicocorticóide dexametasona. A maioria dos receptores mutantes falhou em ativar a (C) MUTANTE
expressão de CAT na presença ou ausência de dexametasona. Em contraste, os
quatro receptores mutantes sem os aminoácidos 190, 200, 239 e 270 C-terminal
ativaram a expressão de CAT na presença e ausência de dexametasona.
(D) MUTANTE
Como esses experimentos distinguem entre os modelos propostos para conversão

dependente de hormônio do receptor normal em uma forma de ligação ao DNA? A
ligação hormonal cria um sítio de ligação ao DNA ou revela um sítio preexistente? anterior posterior
Figura 7–27 Expressão embrionária de

7–60 Um dos principais reguladores da transcrição produzidos pelo locus do tipo mating da
-galactosidase de construções com
levedura é uma proteína repressora conhecida como 2. Em células haploides do tipo elementos de controle Eve stripe 2
mating, 2 é essencial para transformar um conjunto de genes que são específicos para o normais ou mutantes (Problema 7–58).
posição do terminal C em receptores mutantes Figura 7-28 Efeito das deleções C-terminal
na atividade do receptor de
331 287 270 239 200190 180 123 101 27 0 glicocorticoide (Problema 7-59). O diagrama
receptor de glicocorticóide esquemático na parte superior
ilustra a posição do sítio de ligação do
N-terminal DNA dexametasona
DNA (DNA) e o sítio de ligação do
glicocorticóide (dexametasona) no
receptor, bem como as posições das
RESULTADOS DO ENSAIO DE CAT
deleções do terminal C. O diagrama
3-acetilcloranfenicol 1- inferior mostra os resultados de
acetilcloranfenicol um ensaio CAT padrão. O ponto mais
baixo é o cloranfenicol não reagido;
cloranfenicol os pontos superiores mostram a ligação
de grupos acetil a uma ou outra das
dexametasona – + – + – + – + –+ –+ –+ –+ –+ –+ –+
331 287 270 239 200 190 180 123 101 27 0 duas posições no cloranfenicol. A
presença (+) ou ausência (–) de
aminoácidos C-terminais ausentes dexametasona é indicada abaixo das pistas apropriadas.
um tipo de acasalamento. Nas células diploides a/, o repressor 2 colabora com o

produto do gene a1 para transformar um conjunto de genes específicos de
haploides, além dos genes específicos do tipo de acasalamento. Dois tipos distintos,
mas relacionados, de sequências de DNA conservadas são encontrados a
montante desses dois conjuntos de genes regulados: um na frente dos genes a-
específicos e o outro na frente dos genes haploides-específicos. Dado o parentesco
dessas sequências upstream, é mais provável que 2 se ligue a ambos; no entanto,
suas propriedades de ligação devem ser modificadas de alguma forma pela proteína
a1 antes que ela possa reconhecer a sequência haploide específica. Você deseja
entender a natureza desta modificação. A1 catalisa a modificação covalente de 2
ou modifica 2 ligando-se a ele estequiometricamente?
Para estudar essas questões, você realiza três tipos de experimentos. No
primeiro, você mede a ligação de a1 e 2, sozinhos e juntos, aos dois tipos de sítios
de DNA reguladores upstream. Como mostrado na Figura 7-29, a Figura 7-25 a1
sozinha não se liga a fragmentos de DNA radiomarcados que contêm um ou outro
sítio regulador (Figura 7-29, pista 2), enquanto 2 se liga a um fragmento específico
Problema 7-64 mentos, mas não para fragmentos haploides específicos (pista 3). A
mistura de a1 e 2 liga-se a fragmentos a-específicos e haploides-específicos (pista 4).
No segundo conjunto de experimentos, você adiciona um grande excesso de
DNA não marcado contendo a sequência a-específica, juntamente com a mistura
de proteínas a1 e 2. Nessas condições, o fragmento específico do haploide ainda
está ligado (Figura 7-29, pista 5). Da mesma forma, se você adicionar um excesso
de DNA haplóide-específico não marcado, o fragmento a-específico ainda estará
ligado (pista 6).
No terceiro conjunto de experimentos, você varia a proporção de a1 em relação
a 2. Quando 2 está em excesso, a ligação ao fragmento haploide específico é
diminuída (Figura 7-29, pista 7); quando a1 está em excesso, a ligação ao fragmento
a-específico é diminuída (pista 8).
Figura 7-29 Ligação de reguladores de

a2 ÿ ÿ ++++ + + transcrição a fragmentos de DNA
contendo as sequências cis-reguladoras
a1 ÿ + ÿ +++ baixo alto a-específicas ou haploides
DNA a-específico não marcado ÿÿÿÿ+ÿÿÿ
específicas (Problema 7-60). Várias
DNA específico haploide não marcado ÿ ÿ ÿÿÿ + ÿ ÿ combinações de reguladores foram
incubadas com uma mistura de fragmentos
de DNA radioativo a-específico e
haploide-específico (mostrado na faixa 1).
haploide específico Ao final da incubação, as amostras foram
precipitadas com anticorpo contra as
especifico proteínas, e os fragmentos de DNA do
precipitado foram executados no gel. O gel
foi então colocado contra lm de raios-x
1 2 3456 7 8 para expor as posições dos fragmentos de DNA radioativ
A. Na presença de a1, 2 está presente em duas formas com diferentes especificidades

de ligação ou em uma forma que pode se ligar a ambas as sequências regulatórias?
Como seus experimentos distinguem essas alternativas?
B. Um repressor 2 com uma pequena deleção em seu domínio de ligação ao DNA não
se liga a fragmentos de DNA contendo a sequência haploide específica.
Quando essa proteína mutante é expressa em uma célula diploide junto com as
proteínas normais 2 e a1, os genes haploides específicos são ativados. (esses
genes são normalmente o em um diplóide.) À luz deste resultado e de seus outros
experimentos, você considera mais provável que a1 catalise uma modificação
covalente de 2, ou que a1 modifique 2 ligando-se a ele para formar um complexo
a1-2?
MECANISMOS QUE REFORÇAM A MEMÓRIA CELULAR

EM PLANTAS E ANIMAIS
ilha CG expressão gênica

DNA metilase monoalélica de impressão genômica
Herança epigenética X-inativação
da metilação do DNA Centro de inativação do X (XIC)
DEFINIÇÕES
7–61 Silenciamento transcricional da expressão gênica em um dos dois cromossomos

X nas células somáticas de fêmeas de mamíferos.
7–62 Adição de um grupo –CH3 a citosinas em sequências CG em vertebrados

DNA.
7–63 Diferença hereditária no fenótipo de uma célula ou organismo que não resulta de
alterações na sequência de nucleotídeos do DNA.
7–64 Expressão de apenas uma das duas cópias de um gene no diplóide

genoma.
7–65 Situação em que uma cópia de um gene é expressa ou não expressa no embrião,
dependendo de qual dos pais ela é herdada.
7–66 Longa região de DNA com uma densidade muito maior que a média de sequências CG,
que geralmente permanecem não metiladas.
VERDADEIRO FALSO
7–67 Como as sequências CG em uma fita são pareadas com as sequências GC na outra
fita, duas metiltransferases diferentes são necessárias para colocar grupos metil
nas duas fitas.
Acredita-se que as ilhas 7–68 CG tenham surgido durante a evolução porque estavam
associadas a porções do genoma que permaneceram não metiladas na linhagem
germinativa.
7-69 Na maioria dos tecidos diferenciados, as células-filhas retêm uma memória dos padrões
de expressão gênica que estavam presentes na célula-mãe por meio de
mecanismos que não envolvem mudanças na sequência de seu DNA genômico.
MECANISMOS QUE REFORÇAM A MEMÓRIA CELULAR EM PLANTAS E ANIMAIS 155
(A) Figura 7–30 Linhagens refletindo o imprinting

materno e paterno (Problema 7–71).
Em um pedigree, o gene é impresso
paternalmente; no outro, é impresso
maternalmente. Nas gerações 3 e 4,
apenas um dos dois pais nos acasalamentos
indicados é mostrado; o outro
progenitor é um indivíduo normal fora
deste pedigree. Os indivíduos afetados
são representados por círculos vermelhos
para mulheres e quadrados vermelhos
(B)
para homens. Os símbolos amarelos
pontilhados indicam indivíduos que carregam
a deleção, mas não exibem o fenótipo.
7–70 A metiltransferase de manutenção, as metiltransferases de DNA de novo e as enzimas

desmetilantes desempenham papéis cruciais nas mudanças nos padrões de
metilação durante o desenvolvimento. Começando com o ovo não fertilizado,
descreva de forma geral como essas enzimas provocam as mudanças observadas
na metilação do DNA genômico.
7–71 Examine os dois heredogramas mostrados na Figura 7–30. Um resulta da deleção da

um gene
gene autossômico
autossômico com Figura
impresso deleção7.35
imprinting de EmOambos
paternalmente.
dematerno.
um outro heredograma
os heredogramas,
resulta
os da
indivíduos afetados ( símbolos vermelhos) são heterozigotos para a deleção do
Problema 7-83. Esses indivíduos são afetados porque uma cópia do cromossomo
carrega um gene inativo impresso, enquanto a outra carrega uma deleção do
gene. Os símbolos amarelos pontilhados indicam indivíduos que carregam o
locus deletado, mas não exibem o fenótipo mutante. Qual pedigree é baseado no
imprinting paterno e qual no imprinting materno?
Explique sua resposta.
7-72 Imprinting ocorre apenas em mamíferos, e por que deveria existir é um mistério. Uma
ideia é que representa um ponto final evolucionário em um cabo de guerra entre
os sexos. Na maioria das espécies de mamíferos, uma fêmea pode acasalar com
vários machos, gerando múltiplos embriões com pais diferentes.
Se um pai pudesse causar um crescimento mais rápido de seu embrião, ele
prosperaria às custas dos outros embriões. Embora isso seja bom para os genes
do pai (em um sentido evolutivo), drenaria os recursos da mãe, potencialmente
colocando sua vida em risco (não é bom para seus genes). Assim, é do interesse
da mãe contrariar esses efeitos paternos com alterações maternas que limitam
o crescimento do embrião.
Com base nesse cenário, decida se o gene Igf2 , cujo produto - fator de
crescimento semelhante à insulina 2 - é necessário para o crescimento pré-natal,
tem maior probabilidade de sofrer imprinting no homem ou na mulher.
TRATAMENTO DE DADOS
7–73 Você está estudando o papel da metilação do DNA no controle da expressão gênica,
usando o gene da -globina humana como um sistema de teste (Figura 7–31). O
mRNA da globina pode ser detectado quando esse gene é integrado ao genoma
de broblastos de camundongos, embora seja expresso em níveis muito mais
baixos do que nos glóbulos vermelhos. Se o gene for metilado em todos os 27
sítios CG antes da integração, sua expressão é bloqueada completamente. Você
está usando este sistema para decidir se um único sítio crítico de metilação é
suficiente para determinar a expressão da globina.
éxons 1 e 2 exão 3
transcrição
detalhe detalhe
A 0
B 0
C 100
D 0
E 0
F 10
transcrição
11 12 13 14 15 16
Sequências CG em torno
do promotor
Figura 7-31 Efeitos da metilação na transcrição do gene da -globina (Problema 7-73).

Os segmentos metilados do gene são mostrados em azul; segmentos não metilados
são mostrados em vermelho. Os seis sítios CG ao redor do promotor são mostrados
com mais detalhes abaixo das construções. O nível de expressão do RNA da -globina
de cada construção é mostrado à direita como uma porcentagem da expressão de
uma construção totalmente não metilada.
Você cria várias construções de -globina diferentes que não são metiladas
em regiões específicas do gene. Essas construções são ilustradas na Figura 7–
31, com as regiões metiladas mostradas em azul. O arranjo de seis sítios de
metilação ao redor do promotor é mostrado abaixo das construções. Figura 7-40
Os locais 11, 12 e 13 são não metilados na construção E; os sítios 14, 15 e 16
são não metilados naProblema
construção D; e todos os seis locais são não metilados no
7-91
GENÓTIPO
construto F. Você integra esses construtos em broblastos de camundongos,
cultiva linhagens celulares contendo construtos individuais, verifica seus padrões
XX XY XO XX XXXXX XXXXY
XI Xa
de metilação e mede a síntese de RNA de -globina em relação a linhagens
celulares contendo o construto totalmente não metilado (Figura 7-31 ). cDNA
A transcrição da -globina associada às linhagens celulares contendo os
construtos (Figura 7-31) indica que um único local crítico de metilação determina C
se o gene é expresso? Como você sabe?
7–74 Em fêmeas de mamíferos, um cromossomo X em cada célula é escolhido

A
aleatoriamente para inativação no início do desenvolvimento. A inativação do X,
que envolve mais de 1.000 genes em humanos, é crucial para igualar a expressão
B
dos genes do cromossomo X em homens e mulheres. Uma pista crítica para o
mecanismo de inativação do X veio do isolamento de um grande número de
cDNAs para genes no cromossomo X humano. Seus padrões de expressão
foram caracterizados em células de machos e fêmeas normais, em células de células células células
normais anormais híbridas
indivíduos com números anormais de cromossomos X e em roedores: linhagens
celulares híbridas humanas que retiveram um cromossomo X humano inativo (Xi)
ou um cromossomo X humano ativo ( Xa). Entre todos esses cDNAs, havia três Figura 7–32 Análise Northern da expressão
gênica de células com diferentes
padrões de expressão, conforme ilustrado pelos cDNAs A, B e C na Figura 7-32. números e tipos de cromossomos X
(Problema 7–74). O RNA das células foi
A. Para cada padrão de expressão, decida se o gene é expresso a partir do X ativo, processado em géis, transferido para
do X inativo ou de ambos. Qual padrão você espera ser o mais comum? Qual nitrocelulose, sondado com uma mistura
de cDNAs A, B e C radioativos e
padrão é o mais surpreendente?
visualizado por autorradiografia. As
B. A partir dos resultados com células de indivíduos anormais, formule uma regra
posições das bandas de RNA que
sobre quantos cromossomos são inativados e quantos permanecem ativos correspondem aos genes A, B e C foram
durante a inativação do X. determinadas em um experimento separado.
Figura 7-42
CONTROLES PÓS-TRANSCRIÇÃO 157
CONTROLES PÓS-TRANSCRIÇÃO
controle pós-transcricional de transporte nuclear regulamentado

splicing alternativo de RNA interno do local edição de RNA
de entrada do ribossomo (IRES)
DEFINIÇÕES
7–75 Produção de um RNA funcional por inserção ou alteração de nucleotídeos individuais

em um transcrito de RNA depois de ter sido sintetizado.
7–76 Uma maneira de gerar diferentes proteínas a partir do mesmo gene, combinando
diferentes segmentos do transcrito de RNA inicial para produzir mRNAs distintos.
7–77 Termo geral para um evento regulatório que ocorre depois que a RNA polimerase
se ligou ao promotor do gene e iniciou a síntese de RNA.
7–78 Uma sequência no interior de um mRNA que se dobra em estruturas que se ligam
proteínas de iniciação da tradução.
VERDADEIRO FALSO
7–79 Se o local de clivagem do transcrito e adição de poli-A para um determinado RNA em

uma célula estiver a jusante do local usado para clivagem e adição de poli-A para
o mesmo RNA em uma segunda célula, a proteína produzida a partir da célula mais
longa O RNA poliadenilado conterá necessariamente aminoácidos adicionais em
seu C-terminal.
7–80 Em um caso extremo, um único gene em Drosophila – o gene Dscam – tem o potencial
de produzir mais de 38.000 proteínas diferentes por splicing alternativo; assim, a
complexidade desse único gene rivaliza com a complexidade de todo o genoma
humano.
7–81 A RNA polimerase II comumente termina a transcrição do genoma do HIV (o vírus

humano da AIDS) algumas centenas de nucleotídeos após seu início, a menos que
seja auxiliada por uma proteína codificada pelo vírus chamada Tat, que se liga a
uma estrutura específica em gancho no vírus viral nascente. ARN. Tat então recruta
uma coleção de proteínas, incluindo a proteína quinase Cdk9, que fosforila a RNA
polimerase, aumentando sua capacidade de continuar a transcrição. Flavopiridol é
o inibidor mais potente de Cdk9 já descoberto; bloqueia a fosforilação mediada por
Cdk9. Você esperaria que o avopiridol interferisse na transcrição do HIV? Por que
ou por que não?
7–82 Vários mecanismos distintos para a localização do mRNA foram descobertos.

Todos requerem sequências específicas no próprio mRNA, geralmente na região
não traduzida 3º (UTR). Briey descreve três mecanismos pelos quais os mRNAs
celulares podem se localizar na célula.
7–83 A regulação da tradução da ferritina é controlada pela interação entre uma estrutura em
grampo no mRNA, denominada elemento de resposta ao ferro (IRE) e a proteína de
resposta ao ferro (IRP) que se liga a ele. Quando o IRE está vinculado ao IRP, a
tradução é inibida. A localização do IRE no mRNA é crítica para sua função. Para
funcionar corretamente, ele deve ser posicionado perto da extremidade 5º do mRNA.
Se for movido mais de 60 nucleotídeos a jusante da estrutura cap, o IRE não inibe
mais a tradução.
Por que você acha que existe uma dependência de posição tão crítica para a
regulamentação da tradução pelo IRE e IRP?
7–84 Embora essencial para a célula, o ferro também é potencialmente tóxico. Ele é mantido em
níveis ótimos em células de mamíferos pela ação de três proteínas. A transferrina liga-
se aos íons de ferro extracelulares e os entrega às células; o receptor de transferrina se
liga à transferrina carregada de ferro e a traz para dentro da célula; e a ferritina se liga ao
ferro (até 4.500 átomos na cavidade interna de cada complexo) para fornecer um local
de armazenamento intracelular.
A regulação do receptor de transferrina, como a da ferritina (consulte o Problema
7-83), é realizada por IREs e IRPs e, em ambos os casos, a ligação do ferro aos IRPs
impede sua ligação aos IREs. No entanto, o mecanismo de regulação do receptor de
transferrina é bastante diferente daquele da ferritina. O mRNA do receptor de transferrina
contém cinco IREs que estão todos localizados na região não traduzida 3º do mRNA (em
vez da extremidade 5º , como no mRNA da ferritina). Além disso, a ligação de IRPs a
esses IREs aumenta a tradução do receptor de transferrina (em oposição a uma
diminuição da ferritina).
A. Essa regulação oposta da ferritina e do receptor de transferrina em resposta aos níveis de

ferro faz sentido biológico? Considere as consequências de altos e baixos níveis de
ferro.
B. Na presença de ferro, o mRNA do receptor de transferrina é rapidamente degradado; na
ausência de ferro, é estável. Você pode sugerir um mecanismo de como os níveis de
ferro podem estar ligados à estabilidade do mRNA do receptor de transferrina?
7–85 Vg1 mRNA codifica um membro da família TGF de fatores de crescimento, que é importante
para a indução do mesoderma. Em Xenopus, o mRNA de Vg1 está localizado no pólo
vegetal do oócito. A tradução do mRNA de Vg1 não ocorre até um estágio tardio, após a
conclusão da localização. A análise da região não traduzida do 3eg identificou dois
elementos: um elemento de localização e um elemento de controle de tradução rico em
UA. A regulação translacional demonstrou ser independente da cauda poli-A. Em
contraste, a repressão translacional foi abolida quando uma sequência de sítio interno de
entrada do ribossomo (IRES) foi inserida no mRNA a montante da sequência de
codificação.
Como você acha que a tradução do mRNA de Vg1 é controlada?
TRATAMENTO DE DADOS
7–86 Um elemento hexanucleotídico repetido, TGCATG, demonstrou regular o splicing específico

do tecido do éxon EIIIB alternativo da bronectina.
Você se pergunta se ele também pode regular o splicing alternativo no gene da calcitonina/
CGRP (Figura 7-33). Nas células da tireoide, um mRNA contendo os éxons 1, 2, 3 e 4
codifica a calcitonina. Nas células neuronais, um mRNA contendo os éxons 1, 2, 3, 5 e 6
codifica o peptídeo relacionado ao gene da calcitonina (CGRP).
Ao examinar o gene da calcitonina/CGRP, você encontra cinco cópias de uma
repetição relacionada, GCATG, dentro de 500 nucleotídeos do local de splicing do exon-4
(Figura 7-33). Para analisar seu papel potencial no splicing alternativo, você faz várias
construções de calcitonina/CGRP nas quais as repetições foram alteradas isoladamente
ou em combinação. Você transfecta as construções em células HeLa, que normalmente
fornecem o padrão de splicing da calcitonina, e em células F9, que normalmente fornecem
o padrão de splicing CGRP. Você descobre que nenhuma mutação isolada altera o
padrão observado no tipo selvagem (não mostrado); no entanto, várias combinações das
mutações têm efeitos dramáticos (Figura 7-33).
A. Por que você acha que as mudanças mais dramáticas foram observadas nas células HeLa
em vez de células F9?
B. Existe uma combinação particular de repetições GCATG que é crítica para a produção
adequada de mRNA de calcitonina em células HeLa? Se assim for, o que é?
7–87 Em humanos, duas formas intimamente relacionadas de apolipoproteína B (ApoB) são

encontradas no sangue como constituintes das lipoproteínas plasmáticas. ApoB48,
CONTROLES PÓS-TRANSCRIÇÃO 159
1 KB células Figura 7–33 Efeitos de mutações em

HeLa células F9 repetições GCATG no splicing alternativo de
pré-mRNA de calcitonina/CGRP (Problema 7–
CGRP
calcitonina poli 86). Nas células HeLa, o éxon 3 é unido ao
A poli A éxon 4 para formar o mRNA da calcitonina;
1 2 3 4 5 6
nas células F9, o exon 3 é unido ao exon 5
Todo F9
para produzir mRNA de CGRP. As posições
das repetições GCATG em torno do exão 4
GCATG repetir 1 234 5 CALC CGRP CALC CGRP
são indicadas. Nas várias construções, a
construção + + + + + ++++ ÿ ÿ
++++ presença de uma repetição GCATG é indicada

de tipo selvagem A ÿ ÿ ÿ ÿ ÿ ÿ
++++ ÿ
++++ por um sinal de mais e sua ausência por um sinal de menos.

construção B + ÿ ÿ ÿ
+ ++++ ÿ ÿ
++++ A produção de calcitonina- (CALC) e

construção C + ÿ ÿ ÿ ÿ ÿ
++++ ÿ
++++
RNA emendado específico de CGRP é
indicada em relação ao tipo selvagem da
construir D ÿ ÿ ÿ ÿ
+ + +++ ÿ
++++
seguinte forma: ++++ = 80–100%, +++ = 60–
construção E ÿ ÿ ÿ
+ + ÿ
++++ ÿ
++++
80%, ++ = 40–60%, + = 20–40% e – = 0–20%.
construir F + + + ÿ ÿ
++++ ÿ
++ ++
que tem uma massa molecular de 48 quilodaltons, é sintetizado pelo intestino e é

um componente chave dos quilomícrons, as grandes partículas de lipoproteínas
responsáveis pela entrega de triglicerídeos dietéticos ao tecido adiposo para
armazenamento. ApoB100, que tem uma massa molecular de 100 quilodaltons, é
sintetizado no fígado para a formação de partículas de lipoproteínas muito
menores e de densidade muito baixa usadas na distribuição de triglicerídeos para
atender às necessidades de energia. Um conjunto clássico de estudos definiu a
surpreendente relação entre essas duas proteínas.
Sequências de cópias clonadas de cDNA dos mRNAs desses dois tecidos
revelaram uma única diferença: os cDNAs das células intestinais tinham um T,
como parte de um códon de parada, em um ponto onde os cDNAs das células do
fígado tinham um C, como parte de um códon da glutamina (Figura 7-34). Para
verificar as diferenças nos mRNAs e procurar as diferenças correspondentes no
genoma, o RNA
Figura 7-47 e o DNA foram isolados de células intestinais e hepáticas e então
submetidos à amplificação por PCR, usando oligonucleotídeos que marcaram a
Problema 7-112
região de interesse. Os segmentos de DNA amplificados das quatro amostras
foram testados quanto à presença de T ou C por hibridação com oligonucleotídeos
contendo a sequência de cDNA do fígado (oligo-Q) ou a sequência de cDNA
intestinal (oligo-STOP). Os resultados são mostrados na Tabela 7–2.
As duas formas de ApoB são produzidas pelo controle transcricional de dois
genes diferentes, por um controle de processamento do transcrito de RNA de um
único gene ou pela clivagem diferencial do produto proteico de um único gene?
Explique seu raciocínio.
7–88 O nível de expressão do gene da ÿ-tubulina é estabelecido nas células por

uma via regulatória incomum, na qual a concentração intracelular de dímeros livres
de tubulina (compostos por uma subunidade de -tubulina e uma de -tubulina)
regula a taxa de síntese de nova -tubulina. As evidências iniciais dessa via
autorregulatória vieram de estudos com drogas que causam a montagem ou
desmontagem de toda a tubulina celular. Por exemplo, o tratamento de células fígado MIQFD
com colchicina, que causa a despolimerização de microtúbulos em cDNA ATGATACAATTTGAT
ApoB mRNA
TABELA 7–2 Hibridação de oligonucleotídeos específicos para os segmentos amplificados
do fígado e intestino RNA e DNA (Problema 7–87).
intestino ATGATAATAATTGAT
ARN DNA cDNA NÓS *
Intestino Fígado Intestino Fígado

Figura 7–34 Localização da diferença de
– sequência em clones de cDNA de ApoB
Oligo-Q + + +
RNA isolado do fígado e intestino
– + – – (Problema 7–87). As sequências de
Oligo-STOP
aminoácidos codificadas, no código de
A hibridização é indicada por +; a ausência de hibridização é indicada por –.
uma letra, são mostradas alinhadas com as sequências de
O asterisco indica um códon de parada.
Figura 7–35 Efeitos das mutações na regulação da estabilidade do mRNA da

ressonância magnética regulamento
-tubulina (Problema 7–88). A sequência de tipo selvagem para os
--ATGAGGGAAATC-- +
primeiros 12 nucleotídeos da porção de codificação do gene é mostrada na parte
-----T---------- -
superior, e os primeiros quatro aminoácidos começando com metionina (M) são
indicados acima dos códons. As mudanças de nucleotídeos nos 12 mutantes são -----C---------- +
mostradas abaixo; apenas os nucleotídeos alterados são indicados. A regulação ------C--------- -
da estabilidade do mRNA é mostrada à direita: + indica resposta de tipo
-------A-------- +
selvagem a mudanças na concentração de tubulina intracelular e – indica nenhuma resposta a mudanças.
--------C------- -
As linhas verticais marcam a posição do primeiro nucleotídeo em cada códon.
----------G------ -
----------G----- +
-----VOLTADO PARA--------- -
dímeros de tubulina, reprime a síntese de -tubulina 10 vezes. A autorregulação
da síntese de -tubulina por dímeros de tubulina é realizada no nível da -----CC-------- +
-----G--A------- -
estabilidade do mRNA de -tubulina. Os primeiros 12 nucleotídeos da porção
-
codificadora do mRNA continham o sítio responsável por esse controle -----G---T------
autorregulatório. -----CG----- +
Como o segmento crítico do mRNA envolve uma região codificadora, não

está claro se a regulação da estabilidade do mRNA resulta da interação dos
dímeros de tubulina com o RNA ou com a proteína nascente.
Qualquer interação pode desencadear plausivelmente uma nuclease que
destruiria o
mRNA. Essas duas possibilidades foram testadas mutagenizando a
região regulatória em uma versão clonada do gene. Os genes mutantes foram
então expressos em células, e a estabilidade de seus mRNAs foi testada na
presença de excesso de dímeros de tubulina livre. Os resultados de uma dúzia
de mutantes que afetam uma pequena região do mRNA são mostrados na Figura 7-35.
A regulação da estabilidade do mRNA da -tubulina resulta de uma interação
com o RNA ou de uma interação com a proteína codificada?
7–89 Em nematóides, a escolha entre espermatogênese e oogênese na linha germinal

hermafrodita depende da regulação translacional dos genes Tra2 e Fem3 ,
conforme mostrado na Figura 7–36. Quando são expressos, o Tra2 promove a
oogênese e o Fem3 promove a espermatogênese. A tradução do mRNA de
cada gene é regulada pela ligação de proteínas a elementos dentro de suas 3
regiões não traduzidas. Em cada caso, o mRNA ligado à proteína, embora
estável, não é traduzido de forma eficiente e tem uma cauda poli A curta. Em
cada caso, o mRNA em sua forma não ligada é translacionalmente ativo e
possui uma longa cauda poli-A. Como você acha que os comprimentos das Figura 7-49
caudas poli-A podem afetar a eficiência da tradução desses mRNAs?
7–90 Para investigar o mecanismo molecular pelo qual os elementos reguladores de Tra2 Problema 7-114
(TGEs) controlam a tradução, você injeta mRNAs de Tra2 em oócitos de xeno
pus e segue seu destino. Você mostrou que uma proteína do oócito se liga aos
TGEs e inibe a tradução do mRNA Tra2 injetado . Agora você deseja determinar
como os mRNAs com proteínas ligadas passam a ter caudas poli-A curtas. Para
investigar esta questão, você prepara dois tipos
(A) Tra2 mRNA (B) Fem3 mRNA

GLD1 GLD1
longo poli A
poli
Tra2 TGE TGE Fem3 PME
curto A
tradução DESLIGADA esperma tradução LIGADA esperma
longo poli A FBF1 NOS

poli
Tra2 TGE TGE Fem3 PME
curto A
tradução LIGADA ovos tradução DESLIGADA ovos
Figura 7-36 Controle translacional da escolha entre espermatogênese e oogênese (Problema 7-89). (A)
ARNm de Tra2. (B) ARNm de Fem3. Elementos de controle dentro das 3 regiões não traduzidas dos dois
genes são mostrados, juntamente com as proteínas específicas que se ligam a esses elementos.
REGULAÇÃO DA EXPRESSÃO GÊNICA POR RNAs NÃO CODIFICANTES 161
mRNA com TGEs mRNA sem TGEs Figura 7–37 Injeção de mRNAs
número radiomarcados com e sem TGEs em
de células 1 24 16 32 64 8 128256 51210241 24 8 16 32 64128 2565121024 embriões unicelulares de Xenopus
(Problema 7–90). Os comprimentos das
caudas poli-A são indicados à esquerda.
Número de células refere-se ao número
de células nos embriões quando eles foram colhidos.
65
comprimento
poli
do
A
de mRNA de Tra2 marcado radioativamente : um com o par normal de elementos

TGE e outro com esses elementos deletados (ver Figura 7-36A). Cada RNA tem uma
cauda de 65 nucleotídeos A. Você injeta esses mRNAs em embriões de Xenopus
unicelulares e depois isola novamente os mRNAs em vários estágios celulares. O
(A) mRNA LINEAR
RNA radiomarcado reisolado foi analisado por eletroforese em gel
e autorradiografia (Figura 7-37). UAA IRES AGO
A. Os TGEs alteram a estabilidade geral dos mRNAs? isto é, os mRNAs são destruídos
mais rapidamente na presença ou ausência dos TGEs? TRADUZIR
Como você sabe?
proteína de 20 kd
B. Os TGEs influenciam o comprimento das caudas poli-A? Como você sabe?
7–91 Você está cético quanto ao fato de os IRESs realmente permitirem a ligação direta da (B) mRNA CIRCULAR
maquinaria de tradução eucariótica ao interior de um mRNA. Como um teste crítico
IRES
dessa noção, você prepara um conjunto de moléculas de RNA lineares e circulares,
com e sem IRESs (Figura 7-38A e B). Você traduz esses vários RNAs em lisados de
reticulócitos de coelho e exibe os produtos da tradução Figura 7-53 por eletroforese UAA AGO
em gel de dodecil
sulfato de sódio (SDS) (Figura 7-38C). Esses resultados apóiam ou refutam a ideia
de que os IRESs permitem que os ribossomos iniciem a tradução dos mRNAs de
maneira independente do cap? expliqueProblema
seu 7-117 TRADUZIR
responder.
proteína de 23 kd
REGULAÇÃO DA EXPRESSÃO GÊNICA POR

(C) ENSAIO DE TRADUÇÃO
RNAs NÃO CODIFICANTES
linear +ÿÿ+ÿ
TERMOS PARA APRENDER circular ÿ+ÿÿ+
IRES ++ÿÿÿ
CRISPR piRNA (RNA de interação com piwi)
crRNAs kd
Interferência de RNA (RNAi)
RNA longo não codificante (lncRNA) RNA de pequena interferência (siRNA)
microRNA (miRNA)
DEFINIÇÕES
23
Combine cada definição abaixo com seu termo na lista acima. 20
7-92 Mecanismo de defesa natural em muitos organismos que é direcionado contra moléculas
estranhas de RNA, especialmente aquelas que ocorrem na forma de fita dupla.
Figura 7–38 Análise dos efeitos dos IRESs
na tradução (Problema 7–91). (A) mRNA
7–93 Uma classe de RNAs não codificantes curtos que regulam a expressão gênica; acredita- linear que contém um IRES. A
se que cerca de um terço dos genes humanos sejam regulados dessa maneira. estrutura do mRNA sem o IRES era a
mesma. (B) mRNA circular que a Figura
7–94 Pequenos RNAs que silenciam transcricionalmente genes transposônicos intactos e 7-55
IRES. A estrutura do mRNA sem o era acontém
IRES mesma.um
destroem qualquer mRNA produzido por eles.
Os RNAs circulares foram preparados
ligando as extremidades
7–95 Mecanismo de defesa em bactérias que lhes permite destruir invasores virais já vistos. do Problema 7-119 ; foram purificados
das moléculas iniciais lineares por
eletroforese em gel. (C) Exibição de produtos
7–96 Um RNA com mais de 200 nucleotídeos que não codifica uma proteína. de tradução de várias espécies de mRNA.
rato Figura 7–39 Conservação de aglomerados

cromossomo 17 de piRNA entre espécies de mamíferos
(Problema 7–101). A figura é uma
representação esquemática da distribuição de
piRNAs clonados de uma região conservada dos
cromossomo 20 de rato
genomas de camundongo, rato e humano.
Os segmentos que são transcritos da fita superior
do DNA são mostrados em azul; os segmentos
cromossomo humano 6 transcritos da fita inferior são mostrados em
vermelho. Os três genomas são alinhados
de acordo com esse padrão de transcrição.
VERDADEIRO FALSO
7–97 Como os siRNAs são tão difundidos entre as espécies, acredita-se que sejam a forma
mais antiga de interferência de RNA, sendo os miRNAs uma forma posterior
renovação
7–98 Embora as funções dos lncRNAs ainda sejam misteriosas, agora está claro que eles não
funcionam como sinalizadores para a ligação de grupos de proteínas. (A)
distribuição polissômica
7–99 piRNAs e crRNAs têm funções análogas; eles se defendem contra invasores estrangeiros. tipo selvagem
let7
Absorvância
254
nm
46
2
7–100 Liste e discuta brevemente três características que tornam os miRNAs reguladores
especialmente úteis da expressão gênica. (B)
distribuição de mRNA
20
Os piRNAs 7–101 têm várias características gerais: têm aproximadamente 29–30 nucleotídeos Daf12
de comprimento, têm uma forte tendência para U no primeiro nucleotídeo, ligam-se

10
à classe Piwi de proteínas Argonautas, são encontrados principalmente em células
germinativas e eles estão agrupados em regiões conservadas dos genomas de
0
camundongos, ratos e humanos (Figura 7-39). Essas características sugerem uma
função importante 20
Act1
na Figura 7.201, mas o papel de nenhum piRNA ainda foi definido. Por que você
(porcentagem
mRNA
total)
nível
do
de
acha que muitos biólogos estão convencidos de que os piRNAs desempenham uma
função crítica nos 10
organismos?
0
12108642 número da fração
7–102 Se você inserir um gene de ÿ-galactosidase sem sua própria região de controle de
transcrição em um grupo de genes de piRNA em Drosophila, descobrirá que a
expressão de -galactosidase de uma cópia normal em outro local do genoma é Figura 7–40 Distribuições polissomais de
fortemente inibida nas células germinativas de y. Se o gene inativo da ÿ-galactosidase mRNAs em extratos larvais com ou sem
for inserido fora do agrupamento de genes do piRNA, o gene normal é expresso Let7 miRNA (Problema 7–103).
(A) Distribuição polissômica. Os mRNAs com
adequadamente. O que você acha que é a base para esta observação?
ribossomos anexados (polirribossomos) foram
Como você testaria sua hipótese?
isolados de larvas de tipo selvagem e
mutantes Let7 e separados por centrifugação
de um gradiente
da Figura
de7-202
sacarose.
através
TRATAMENTO DE DADOS
As distribuições de todos os mRNAs
azul) e mutantes Let7 Problema 7-221 7–103 miRNAs foram descobertos em vermes em larvas normais (tipo selvagem;
nematóides, mas ainda não estão claros
(vermelho) são mostrados no painel superior. Os miRNAs reduzem a expressão da proteína causando monorribossomos deg de
mRNA rápidos são mostrados à esquerda da radação ou interferindo na tradução. e Let7 miRNA, por exemplo, a linha tracejada
e os polirribossomos reconhecem sítios na extremidade 33 do mRNA Daf12 , a proteína Daf12 redutora é mostrada à
numerados para indicar a síntese. Para investigar como Let7 miRNA controla a direita, com alguns picos individuais
síntese de proteínas de quantos ribossomos estão
presentes em cada Daf12 mRNA, você faz extratos de larvas de tipo selvagem em
um estágio em que o polissomo Let7 atinge
o pico. (B) distribuição de mRNA. Os níveis de miRNA são mais altos e também produzem extratos de larvas mutantes que não
produzem
EMBO
O RNA Journal
foi miRNA
extraído
(2009)
Let7
de 28:213-222
cada
no mesmo
frações,
não
fração
revelou
(ou
estágio.
econforme
aspolissomos)
linhas
quantidades
A análise
indicado
cinzas
emde
dos
significativas.
larvas
pelo
Daf12
polirribossomos
normais
diferiram,
e mutantes
nem
em 12
houve qualquer diferença na distribuição de um controle e os mRNAs de Act1 em(Figura
cada fração eram EmmRNA
quantificou.
7-40A). As do gene
contraste, Act1
distribuições
a distribuição
de
Daf12 de Daf12 mRNA mudaram significativamente na presença de Let7 miRNA mRNA e Act1 mRNA em normal e (Figura
7-40B).
As cepas mutantes Let7 são mostradas abaixo.

REGULAÇÃO DA EXPRESSÃO GÊNICA POR RNAs NÃO CODIFICANTES 163
B AAB AB AB AB AB Figura 7–41 Análise da expressão

células ES de alelos específicos do cromossomo
mutantes indiferenciadas X em células ES indiferenciadas e
diferenciadas (Problema 7–104). A
análise dos alelos A e B de células
B AAB AB AB AB AB
células ES
individuais é indicada pelos colchetes.
normais diferenciadas
B AAB AB AB AB AB
células ES
mutantes diferenciadas
A. O Let7 miRNA causa a degradação do Daf12 mRNA? Como você sabe?

B. Como o miRNA de Let7 altera a distribuição do mRNA de Daf12 ? O mRNA Daf12
está em polissomos menores ou maiores na presença do miRNA Let7 ?
C. Propor um mecanismo pelo qual o miRNA Let7 reduz a síntese de Daf12
proteína.
7–104 Para determinar se o gene Xist , que codifica o Xist lncRNA, é necessário para a
inativação do X em camundongos, os cientistas deletaram o gene Xist em um
cromossomo X. Usando células-tronco embrionárias femininas (ES) nas quais
os genes nos dois cromossomos X podem ser distinguidos devido a
polimorfismos, eles seguiram a inativação do X durante a diferenciação das
células ES em cultura. As células ES normalmente mantêm ambos os
cromossomos X no estado ativo; no entanto, quando são induzidos a se
diferenciar, eles
geralmente inativam um. Os cientistas consideraram três hipóteses. (1)
As células ES mutantes para um gene Xist não conseguiriam registrar a presença
de dois cromossomos X e, portanto, não passariam pela inativação do X. (2) O
nocaute Xist impediria a inativação do cromossomo X alvo, predispondo assim o
cromossomo X normal à inativação preferencial do X. (3) A mutação Figura 7-43
efeito na inativação do X. não teria nenhum
Usando sondas oligonucleotídicas específicas para o alelo (específico para
o cromossomo X), eles foram capazes de determinar qual alelo de um gene do
Problema 7-94 do cromossomo X foi expresso em células individuais. Conforme
mostrado na Figura 7-41, eles examinaram células ES mutantes que não eram
diferenciadas e células ES mutantes e não mutantes que sofreram diferenciação.
Apenas algumas células foram examinadas na Figura 7-41, mas a análise de
muitas outras confirmou os padrões mostrados. e Um alelo marca o cromossomo
X cujo gene Xist está intacto nas células ES mutantes; o alelo B marca o
cromossomo X do qual o gene Xist foi deletado.
Qual das três hipóteses esses resultados suportam? Explique seu raciocínio.
7–105 Usando sondas específicas de transcrição no centro de inativação do X, um

segundo gene foi transcrito na direção oposta a Xist e foi denominado Tsix para
indicar sua orientação antisense. O transcrito Tsix , como o transcrito Xist , não
possui quadro de leitura aberto significativo e é considerado um lncRNA
funcional. Conforme mostrado na Figura 7-42, o transcrito Tsix se estende por
todo o gene Xist . Para determinar se o Tsix desempenha um papel na contagem
dos cromossomos X, na escolha de qual inativar ou no silenciamento do X
inativo, foram geradas células-tronco embrionárias femininas (ES) nas quais o
promotor do Tsix foi deletado de um cromossomo X. Quando essas células ES
foram permitidas
Tsix
Xista promotor
Figura 7-42 Disposição dos transcritos
Xist e Tsix no centro de inativação
do X (Problema 7-105). As caixas indicam
Suspirar
os éxons de Xist; exons para Tsix não
0 10 20 30 40 50 KB
são mostrados. A deleção do promotor no
mutante Tsix é indicada.
diferenciados em fêmeas, descobriu-se que o cromossomo X com a deleção Tsix estava

sempre inativado.
A. O Tsix é importante para a contagem, escolha ou silenciamento dos cromossomos X?
B. Antes da inativação do X, Tsix é expresso por ambos os alelos, assim como Xist. No início
da inativação de X, a expressão de Tsix torna-se limitada ao futuro X ativo, enquanto a
expressão de Xist é restrita ao futuro X inativo. Você pode sugerir algumas maneiras
possíveis pelas quais Tsix pode regular Xist?
ESTILO MCAT
Passagem 1 (Perguntas 7–106 a 7–108)
As células-tronco embrionárias se diferenciam em diversos tipos de células, uma vez que recebem
os sinais apropriados. Até então eles são mantidos em estado indiferenciado pela ação de três
reguladores da transcrição chamados Oct4, Sox2 e Nanog. Um alvo importante de Oct4 e Sox2 é
o gene FGF4 . A análise do mecanismo pelo qual Oct4 e Sox2 promovem a transcrição de FGF4
forneceu pistas iniciais de como eles funcionam. Ao analisar as deleções das regiões de DNA ao
redor do gene FGF4 , os cientistas identificaram um elemento de DNA necessário para a
capacidade de Oct4 e Sox2 de promover a transcrição de FGF4. O elemento foi localizado além da
sequência de codificação na extremidade 3 do gene. A análise do elemento de DNA revelou que
continha sítios de ligação para Oct4 e Sox2 que estavam separados por três nucleotídeos. Quando
o elemento foi mutado para aumentar o espaçamento entre os sítios de ligação em 3 ou mais
nucleotídeos, Oct4 e Sox2 não puderam mais estimular a transcrição de FGF4.
O nível de expressão de Oct4 tem fortes efeitos na diferenciação de células-tronco.

Quando expresso em níveis normais, Oct4 ajuda a manter o estado indiferenciado.
A superexpressão de Oct4 em apenas 1,5 vezes, no entanto, faz com que as células-tronco se
diferenciem em mesoderme.
7–106 Qual termo descreve melhor o elemento de DNA necessário para Oct4 e
Sox2 para promover a transcrição do FGF4 ?
A. Potenciador
B. Mediador C.
Promotor D.
Caixa TATA
7–107 Qual hipótese explica melhor a observação de que o aumento do espaçamento entre os
locais de ligação de Oct4 e Sox2 impediu a estimulação da transcrição de FGF4 ?
A. Oct4 e Sox2 bloqueiam a propagação da cromatina repressiva na extremidade 3' do gene

FGF4 .
B. Oct4 e Sox2 devem estar adequadamente posicionados para interagir com o complexo
RNA polimerase II.
C. O posicionamento preciso dos sítios de ligação promove a ligação cooperativa de Oct4 e
Sox2.
D. A posição de Oct4 e Sox2 influencia o espaçamento dos nucleossomos sobre o gene
FGF4 .
7–108 Qual das seguintes ações explica melhor como uma pequena alteração nos níveis de Oct4
pode levar a uma grande alteração no estado de diferenciação das células?
A. Modificação da cromatina B.
Ligação cooperativa C.
Dimerização D.
Feedback negativo

O tratamento de células broblásticas de camundongos com 5-azacitidina faz com que algumas das
células se diferenciem em células musculares. Uma busca por proteínas que são responsáveis por
ESTILO MCAT 165
(A)
essa diferenciação identificou um regulador de transcrição chamado MyoD. A transfecção
de células com um vetor que expressa MyoD de um promotor induzível causou
diferenciação eficiente de células broblásticas em células musculares quando a expressão MyoD genes precoces genes tardios
de MyoD foi ativada. Além disso, quando a expressão de MyoD do vetor foi posteriormente
desligada, as células permaneceram diferenciadas como células musculares. MyoD
controla a transcrição de numerosos genes. Alguns desses genes são ativados no início (B)
do processo de diferenciação, enquanto outros são ativados tardiamente. Curiosamente,

MyoD se liga aos promotores dos genes tardios imediatamente após a expressão de MyoD genes precoces genes tardios
MyoD ser ativada pela primeira vez, mas a expressão desses genes não ocorre até mais tarde.
7–109 Qual dos seguintes possíveis efeitos da 5-azacitidina melhor explicaria sua
(C)
capacidade de fazer com que broblastos se diferenciem em células musculares?
A. Ativação do complexo mediador B. MyoD genes precoces genes tardios
Inibição de uma DNA demetilase C.

Inibição de um riboswitch específico D.
Inibição da modificação de histonas (D)
7–110 Qual dos seguintes mecanismos explica melhor como as células permanecem
MyoD genes precoces genes tardios
diferenciadas como células musculares, mesmo após o pulso original da
expressão de MyoD ter sido desativado?
A. Ligação cooperativa B.
Feedback negativo C. Figura 7–43 Quatro circuitos
Feedback positivo D. regulatórios MyoD potenciais (Problema 7–111).
Ativação transcricional sinérgica
7–111 Qual dos circuitos reguladores na Figura 7–43 melhor explica todas as observações
sobre o papel do MyoD na indução da diferenciação das células musculares?
MCAT 7.306
Um tubo Eppendorf de 1,5 mL.

Um tubo Eppendorf contendo 10
microlitros de solução. A maioria das reações
de biologia molecular é realizada nesses
minúsculos tubos de plástico, que foram
inventados em 1961 nos laboratórios
do hospital Eppendorf, nos subúrbios de
Hamburgo, na Alemanha, como parte de um
sistema para lidar com volumes muito pequenos de amostras clínica
Esses tubos são inertes, robustos e
baratos.
Capítulo 8 167
CAPÍTULO
Análise de Células,
Moléculas e Sistemas 8
NESTE CAPÍTULO
ISOLANDO CÉLULAS E CULTIVANDO-AS EM CULTURA
CÉLULAS DE ISOLAMENTO E
hibridoma anticorpo monoclonal CULTIVANDO-OS NA CULTURA
DEFINIÇÕES PROTEÍNAS PURIFICANTES
Combine cada definição abaixo com seu termo na lista acima. ANÁLISE DE PROTEÍNAS
8–1 Anticorpo secretado por uma linha celular de hibridoma. ANÁLISE E MANIPULAÇÃO
8–2 DNA
Linhagem celular utilizada na produção de anticorpos monoclonais; obtido pela fusão de
células B secretoras de anticorpos com células de um tumor de linfócitos.
ESTUDANDO A EXPRESSÃO GÊNICA
E FUNCIONA
VERDADEIRO FALSO
ANALISE MATEMÁTICA
DAS FUNÇÕES DAS CÉLULAS
8–3 A microdissecção por captura a laser permite o isolamento de células individuais de uma
amostra de tecido.
8–4 Como um anticorpo monoclonal reconhece um sítio antigênico específico (epítopo), ele se
liga apenas à proteína específica contra a qual foi produzido.
8–5 Uma etapa comum no isolamento de células de uma amostra de tecido animal é tratá-la com
tripsina, colagenase e EDTA. Por que tal tratamento é necessário, e o que cada componente
realiza? Por que esse tratamento não mata as células?
8–6 Isolamento de células de tecidos, seleção de células ativadas por uorescência e

microdissecção por captura a laser são apenas algumas das maneiras de gerar populações
de células homogêneas. Por que você acha que é importante ter uma população de células
homogênea para muitos experimentos?
8–7 Diferencie os termos “cultura primária”, “cultura secundária” e “linha celular”.
8–8 Considere as duas afirmações a seguir. “A vantagem mais importante da técnica do hibridoma
é que os anticorpos monoclonais podem ser produzidos contra moléculas que constituem
apenas um componente menor de uma mistura complexa.” “A vantagem mais importante da
técnica do hibridoma é que os anticorpos que podem estar presentes apenas como
componentes menores no antisoro convencional podem ser produzidos em quantidade na
forma pura como anticorpos monoclonais.” Essas duas afirmações são equivalentes? Por
168 Capítulo 8: Analisando Células, Moléculas e Sistemas
8–9 Você acha que seria possível criar um anticorpo contra outro anticorpo? Explique sua resposta. 12345678 9 10
CÁLCULOS
p3
8–10 Você deseja isolar células raras que estão presentes em uma população com uma
frequência de 1 em 105 células e precisa de 10 dessas células para fazer um
experimento. Se seu classificador de células ativado por uorescência puder classificar
células a uma taxa de 1.000 por segundo, quanto tempo levaria para coletar células
p2
raras suficientes para seu experimento?
p1
TRATAMENTO DE DADOS
q1
8–11 Painéis de células híbridas de humanos e roedores que retêm um ou alguns
cromossomos humanos, partes de cromossomos humanos ou fragmentos de
cromossomos humanos induzidos por radiação provaram ser extremamente úteis no q2
mapeamento de genes para locais definidos. Agora que o genoma humano foi
sequenciado, é uma questão trivial saber a localização de um gene se você tiver um
pouco da sequência do gene. No entanto, há muitos casos em que esses painéis de
células ainda são inestimáveis; por exemplo, quando você conhece um fenótipo, mas q3
não a identidade do gene responsável por ele, como no caso a seguir.

q4
Você deseja mapear a localização do receptor do vírus da leucemia felina tipo C
(FeLV-C), que infecta células humanas, mas não células de roedores. Usando um painel
de células híbridas que carregam cromossomos inteiros, você mostrou que o FeLV-C
Figura 8–1 Mapeamento do gene para o
infecta apenas os híbridos que carregam o cromossomo humano 1.
receptor FeLV-C usando linhagens de células
Usando um segundo painel contendo porções do cromossomo 1, você mostra que o híbridas humano-roedor que carregam
FeLV-C infecta várias das linhagens de células híbridas. Os segmentos de cromo 1 porções do cromossomo humano 1 (Problema 8–11).
que estão presentes nas linhagens de células híbridas infectáveis são mostrados na As linhas de células híbridas que podem
Figura 8-1. Onde no cromossomo 1 está localizado o gene do receptor FeLV-C? ser infectadas por FeLV-C são mostradas,
com as porções do cromossomo 1 humano
retidas nas linhas de células híbridas
individuais indicadas como linhas
azuis. As designações p e q referem-se a uma
PROTEÍNAS PURIFICANTES convenção padrão (a nomenclatura de Paris)
para descrever as posições dos cromossomos.
TERMOS PARA APRENDER Os locais dos braços curtos são rotulados
como p (pequeno) e os braços longos q (fila).
proteína de fusão de líquido de alto desempenho Cada braço do cromossomo p8.01/8.01
é dividido em regiões rotuladas p1, p2,
cromatografia em coluna cromatografia (HPLC) p3, q1, q2, q3, etc., contando para fora do
sistema sem células purificado centrômero. As regiões são delimitadas por
marcos específicos, que são características
morfológicas distintas, incluindo o
DEFINIÇÕES
centrômero e certas bandas proeminentes. As
Combine cada definição abaixo com seu termo na lista acima. regiões são divididas em bandas rotuladas
p11 (uma uma, não onze), p12, etc. As sub-
bandas são designadas p11.1, p11.2, etc., e
8–12 Termo geral para técnica de purificação na qual uma mistura de proteínas é
as sub-sub-bandas são designadas p11.11,
passou por um cilindro contendo uma matriz sólida porosa. p11.12, etc. Em todos os casos, os números
aumentam do centrômero em direção ao
8–13 Tipo de cromatografia que utiliza colunas empacotadas com resinas cromatográficas telômero.
especiais compostas por minúsculas esferas que atingem alto grau de resolução,
mesmo com vazões muito rápidas.
8-14 Produto artificial gerado pela ligação das sequências de codificação para duas proteínas
diferentes, ou segmentos de proteína, e expressando o gene híbrido nas células.
VERDADEIRO FALSO
8–15 É possível sedimentar a hemoglobina por centrifugação em temperatura suficientemente alta

velocidade.
PROTEÍNAS PURIFICANTES 169
Figura 8–2 Modelos de esqueleto

de tropomiosina e hemoglobina
(Problema 8–19).
hemoglobina tropomiosina
8–16 Se os grânulos usados na cromatografia de filtração em gel tivessem poros de tamanho

uniforme, as proteínas seriam excluídas dos poros ou incluídas neles, mas não seriam mais
fracionadas.
8–17 Descreva como você usaria a centrifugação preparativa para purificar mito
côndrias a partir de um homogeneizado
celular. Problemas p8.02/8.02
8–18 Diferencie entre sedimentação de velocidade e sedimentação de equilíbrio. Para qual propósito
geral cada técnica é usada? Qual você acha que seria mais adequado para separar duas
proteínas de tamanhos diferentes?
8–19 A tropomiosina, a 93 kd, sedimenta a 2,6S, enquanto a proteína de 65 kd, a hemoglobina,

sedimenta a 4,3S. (O coeficiente de sedimentação S é uma medida linear da taxa de
sedimentação: ambos aumentam ou diminuem em paralelo.) Essas proteínas são
desenhadas em escala na Figura 8-2. Como é que a proteína maior sedimenta mais
lentamente do que a menor? Você consegue pensar em uma analogia da experiência
cotidiana que possa ajudá-lo com esse problema?
8–20 Diferencie entre cromatografia de troca iônica, cromatografia hidrofóbica, cromatografia de

filtração em gel e cromatografia de anidade em termos do material da coluna e a base para
a separação de uma mistura de proteínas.
CÁLCULOS
8–21 A purificação de uma proteína geralmente requer várias etapas e geralmente envolve
vários tipos de cromatografia em coluna. Um componente chave de qualquer purificação é
um ensaio para a proteína desejada. O ensaio pode ser uma banda em um gel, uma
estrutura no microscópio eletrônico, a capacidade de se ligar a outra molécula ou a atividade
enzimática. A purificação de uma enzima é particularmente instrutiva porque o ensaio
permite quantificar a extensão da purificação em cada etapa. Considere a purificação da
enzima mostrada na Tabela 8-1. O volume total, a proteína total e a atividade enzimática
total são mostrados em cada etapa.
A. Para cada etapa do procedimento de purificação, calcule a atividade específica da enzima

(unidades de atividade por mg de proteína). Como você pode dizer que a purificação ocorreu
em cada etapa?
B. Qual das etapas de purificação foi mais eficaz? qual foi menos eec
tivo?
C. Se você realizasse a purificação através de etapas adicionais, como a atividade específica
mudaria? Como você poderia dizer, a partir de medidas específicas de atividade, que a
enzima era pura? Como você pode verificar essa conclusão?
TABELA 8–1 Purificação de uma enzima (Problema 8–21).
Procedimento Volume total (mL) Proteína total (mg) Atividade total (unidades) Atividade específica
(unidades/mg)
1. Extrato bruto 2000 15.000 150.000
2. Precipitação de sulfato de amônio 320 4000 140.000
3. Cromatografia de troca iônica 100 550 125.000
4. Cromatografia de filtração em gel 85 120 105.000
5. Cromatografia de afinidade 8 5 75.000
D. Se a enzima é pura no final do esquema de purificação na Tabela 8-1, que proporção

da proteína na célula inicial ela representa?
TRATAMENTO DE DADOS
8–22 No artigo clássico que demonstrou a replicação semiconservativa do DNA, Meselson e

Stahl começaram mostrando que o próprio DNA formará uma banda quando
submetido à sedimentação em equilíbrio. Eles misturaram DNA de E. coli
fragmentado aleatoriamente com uma solução de CsCl de modo que a solução
final tivesse uma densidade de 1,71 g/mL. Conforme mostrado na Figura 8–3,
com o aumento do comprimento da centrifugação a 70.000 vezes a gravidade, o
DNA, que estava inicialmente disperso pelo tubo da centrífuga, tornou-se
concentrado ao longo do tempo em uma banda discreta no meio.
A. Descreva o que está acontecendo com o tempo e explique por que o DNA forma um
banda discreta.
B. Qual é a densidade flutuante do DNA? (A densidade da solução na qual o DNA
“flutua” em equilíbrio define a “densidade flutuante” do DNA.)
horas campo centrífugo
C. Mesmo que o DNA tenha sido centrifugado pelo dobro do tempo — ou até mais —, 0
a largura da banda permanece mais ou menos o que é mostrado na parte inferior
2.1
da Figura 8-3. Por que a banda não fica ainda mais comprimida? Sugira algumas
possíveis razões para explicar a espessura da banda de DNA no equilíbrio. 4.3
6.4
8–23 O resultado da cromatografia de filtração em gel de seis proteínas 8.5

aproximadamente esféricas é mostrado na Figura 8-4. As identidades das
10.7
proteínas, suas massas moleculares e seus volumes de eluição são indicados na
Tabela 8-2. (o volume de eluição identifica quando cada proteína saiu da coluna.) 12.8
14.9
17.1
TABELA 8–2 Proteínas separadas por cromatografia de filtração em gel (Problema 19.2
8–23).
21.3
Proteína Massa Massa Volume de eluição
23,5
molecular (kd) molecular (log) (mL)
36,5
Ribonuclease A 13 4.11 250
43,5
quimotripsinogênio 25 4,40 228
Ovalbumina 43 4.63 199 Figura 8–3 Fotografias de absorção

ultravioleta (UV) mostrando estágios
Albumina de soro bovino 67 4,83 176
sucessivos no bandeamento do DNA de
E. coli (Problema 8–22). O DNA, que
aldolase 158 5.20 146
absorve a luz ultravioleta, aparece como
Catalase 232 5.37 123 regiões escuras nas fotografias. A parte
inferior do tubo da centrífuga está à direita.
Problemas p8.03/8.03
PROTEÍNAS PURIFICANTES 171
Figura 8–4 Perfil de eluição para

0,4
228 proteínas fracionadas por cromatografia
199
de filtração em gel (Problema 8–23). A
176 absorbância a 280 nm é uma medida da
0,3 146 250
concentração de proteína. Cada um dos picos é
123
identificado pelo seu volume de eluição.
Absorvância
280
nm
a
0,2
0,1
0
0 50 100 150 200 250 300
volume de eluição (mL)
A. Por que as proteínas menores saem da coluna depois das maiores?

proteínas?
B. Faça um gráfico de massa molecular versus volume de eluição. Agora plote o logaritmo da
massa molecular versus o volume de eluição. Qual gráfico dá uma linha reta? O que você
acha que é a base para esse resultado?
8–24 Em estudos preliminares, você determinou que sua proteína parcialmente purificada é estável
(retém atividade) entre pH 5,0 e pH 7,5. Em ambos os lados dessa faixa de pH, a proteína
não está mais ativa. Seu orientador agora deseja que você faça um experimento rápido
para determinar as condições da cromatografia de troca iônica. Ele deixou instruções para
você. Primeiro, você deve misturar um pouco da preparação bruta com uma pequena
quantidade da resina de troca iônica DEAE-Sepharose™ em uma série de soluções tampão
com pH entre 5,0 e 7,5. Em seguida, você deve sedimentar a resina e analisar o
sobrenadante quanto à presença de sua proteína. Finalmente, ele diz para você usar esta
informação para escolher o pH
adequado para fazer a cromatografia de troca iônica. Você concluiu as duas primeiras
etapas e obteve os resultados mostrados na Figura 8–5. Mas você está um pouco incerto
sobre como usar as informações para escolher o pH para a cromatografia.
A. Em qual extremidade da faixa de pH a carga de sua proteína é mais positiva e em qual

extremidade ela é mais negativa? [Ao longo desta faixa de pH, os grupos amina carregados
positivamente nas esferas DEAE-Sepharose (Figura 8-5A) não são afetados.]
B. Para a cromatografia, você deve escolher um pH no qual a proteína se liga aos grânulos (pH
6,5 a 7,5) ou um pH em que não se liga (pH 5,0 a 6,0)?
Explique sua escolha.
C. Você deve escolher um pH próximo ao limite (isto é, pH 6,0 ou 6,5) ou distante do limite (isto
é, pH 5,0 ou pH 7,5)? Explique seu raciocínio.
D. Como você realizará a cromatografia de troca iônica de sua proteína?

Quais são as várias etapas que você usará para realizar a separação de sua proteína de
outras por meio de cromatografia de troca iônica?
Figura 8–5 Teste preliminar para

(A) ESTRUTURA DE DEAE-SEPHAROSE (B) TESTE DE CONDIÇÕES determinar as condições para cromatografia
de troca iônica (Problema 8–24).
proteína no sobrenadante após a mistura
(A) Estrutura dos grupos de amina
+++ ÿÿÿ carregados ligados aos grânulos de Sepharose.
(B) Resultados da mistura de sua proteína
C2H5 com grânulos de DEAE-Sepharose. Amostras
solução da proteína foram misturadas com grânulos de
O CH2 CH2 PEQUENO
de proteína DEAE-Sepharose em tampões em uma faixa de
C2H5 valores de pH e, em seguida, as misturas
DEAE foram centrifugadas para sedimentar os
Sepharose grânulos. A presença da proteína no
pH 5,0 5,5 6,0 6,5 7,0 7,5 sobrenadante é indicada por um +; sua ausência é indicada po
ANÁLISE DE PROTEÍNAS
biologia química eletroforese em gel bidimensional

ressonância magnética nuclear Western blotting (imunoblotting)
(NMR) espectroscopia cristalografia de raios-x
Eletroforese em gel de
poliacrilamida SDS (SDS-PAGE)
DEFINIÇÕES
8–25 Análise da liberação de radiação eletromagnética por núcleos atômicos em um campo

magnético, devido ao desvio da orientação de seus momentos de dipolo magnético.
8–26 Técnica para separação de proteínas na qual a mistura de proteínas é executada primeiro
em uma direção e depois em uma direção perpendicular à primeira.
8–27 Técnica na qual uma mistura de proteínas é separada passando-a por um gel contendo
um detergente que se liga e desdobra as proteínas.
8–28 A principal técnica que tem sido usada para descobrir a estrutura tridimensional
de moléculas, incluindo proteínas, em resolução atômica.
8–29 Técnica pela qual as proteínas são separadas por eletroforese, imobilizadas em uma
folha de papel e então analisadas, geralmente por meio de um anticorpo marcado.
VERDADEIRO FALSO
Decida se a afirmação é verdadeira ou falsa e explique por quê.
8-30 Dada a marcha inexorável da tecnologia, parece inevitável que a sensibilidade da

detecção de moléculas seja finalmente empurrada para além do nível de yoctomole
(10-24 moles).
8-31 Como é que moléculas menores se movem através de uma coluna de filtração de gel
mais lentamente do que moléculas maiores, enquanto na eletroforese em gel de
poliacrilamida SDS (SDS-PAGE) o oposto é verdadeiro: moléculas maiores se
movem mais lentamente do que moléculas pequenas?
8–32 Você está pronto para executar sua primeira eletroforese em gel de poliacrilamida SDS.
Você ferveu suas amostras de proteína em SDS na presença de mercap toetanol e
as carregou nos poços de um gel de poliacrilamida. Agora você está pronto para
conectar os eletrodos. Uh oh, o eletrodo positivo (o ânodo) fica no topo do gel, onde
você carregou suas proteínas, ou no fundo do gel?
8–33 Você odeia o cheiro de mercaptoetanol. Como as ligações dissulfeto em proteínas

intracelulares são muito raras (consulte o Problema 3-37), você se convenceu de
que não é necessário tratar um homogeneizado citoplasmático com mercaptoetanol
antes do SDS-PAGE. Você aquece uma amostra de seu homogêneo em SDS e a
submete a eletroforese. Para sua surpresa, seu gel parece horrível; é uma mancha
feia! Você mostra seu resultado a uma colega com formação em química e ela
sugere que você trate sua amostra com N-etilmaleimida (NEM), que reage com
sulfidrilas livres. Você processa outra amostra de seu homogeneizado após tratá-la
com NEM e SDS. Agora o gel parece perfeito!
ANÁLISE DE PROTEÍNAS 173
Se a grande maioria das proteínas intracelulares não tem pontes dissulfeto - e

não tem - por que seu esquema original não funcionou? E como o tratamento com
NEM corrige o problema?
8–34 Para a separação de proteínas por eletroforese bidimensional em gel de poliacrilamida,

quais são os dois tipos de eletroforese usados em cada dimensão? Você acha que
faz alguma diferença qual método eletroforético é aplicado primeiro? Por que ou
por que não?
8–35 Discuta a seguinte afirmação: “Com os bancos de dados cada vez maiores de
sequências e estruturas de proteínas, em breve será possível inserir uma
sequência de aminoácidos de uma proteína desconhecida e, por analogia com
proteínas conhecidas, determinar sua estrutura e função. nós, não demorará muito
para que os bioquímicos fiquem sem trabalho.”
8–36 A tecnologia de hibridoma permite gerar anticorpos monoclonais para praticamente

qualquer proteína. Por que, então, a marcação genética de proteínas com epítopos
é uma técnica tão comumente usada, especialmente porque uma etiqueta de
epítopo tem o potencial de interferir na função da proteína?
8-37 A atividade específica refere-se à quantidade de radioatividade por unidade de

quantidade de substância, mais comumente em biologia expressa em uma base
molar, por exemplo, como Ci/mmol. [Um curie (Ci), que é a unidade padrão de
decaimento radioativo, corresponde a 2,22 × 1012 desintegrações por minuto
(dpm).] Se você examinar a Tabela 8–3, verá que parece haver uma relação
inversa entre o máximo atividade específica e meia-vida. Você acha que isso é
apenas uma coincidência ou há uma razão subjacente?
8–38 Você acabou de revelar uma autorradiografia após uma exposição de duas semanas.
Você incubou sua proteína com uma quinase do ciclo celular na presença de 32P-
ATP na esperança de demonstrar que era de fato um substrato para a quinase.
Você vê a sugestão de uma banda no gel na posição certa, mas é muito fraca para
ser convincente. Você mostra seu resultado ao seu orientador e diz a ele que
colocou o borrão em uma nova folha de filme, que planeja expor por um período
de tempo mais longo. Ele olha de soslaio para você e diz para você repetir o
experimento e usar mais radioatividade.
O que há de errado com seu plano de reexpor o borrão por mais tempo?
CÁLCULOS
8–39 Quantas cópias de uma proteína precisam estar presentes em uma célula para que ela
seja visível como uma banda em um gel SDS? Suponha que você pode carregar
100 ÿg de extrato celular em um gel e que você pode detectar 10 ng em uma única
banda por coloração de prata. A concentração de proteína nas células é de cerca
de 200 mg/mL, e uma célula típica de mamífero tem um volume de cerca de 1000
ÿm3 e uma bactéria típica um volume de cerca de 1 ÿm3. Dados esses parâmetros,
TABELA 8–3 Isótopos radioativos e algumas de suas propriedades (Problema 8–37).
isótopo Emissão Meia-vida Atividade específica

radioativo máxima (Ci/mmol)
14C partícula 5730 anos 0,062
3H partícula 12,3 anos 29
35s partícula 87,4 dias 1490
32P partícula 14,3 dias 9120

calcule o número de cópias de uma proteína de 120 kd que precisaria estar

presente em uma célula de mamífero e em uma bactéria para fornecer uma
banda detectável em um gel. Você pode tentar uma estimativa de ordem de
grandeza antes de fazer os cálculos.
8–40 Quantas moléculas de sua proteína marcada são necessárias para detecção por
autorradiografia? Você adicionou 1 ÿL contendo 10 ÿCi de -32P-ATP (uma
quantidade insignificante de ATP) a 9 ÿL de extrato celular que tinha uma
concentração de ATP de 1 mM. Você incubou a mistura para permitir a
transferência de fosfato para as proteínas do extrato. Você então submeteu 1
ÿL da mistura a SDS-PAGE, secou o gel e o colocou contra uma folha de filme
de raio-x. Após uma exposição durante a noite, você viu uma banda quase
imperceptível no local de sua proteína. Você sabe por experiência anterior que
uma proteína marcada em 1 contagem por minuto por banda (1 cpm equivale
a 1 desintegração por minuto, dpm, para 32P) formará tal banda após uma
exposição noturna. Quantas moléculas de proteína marcada estão na banda,
se você assumir 1 fosfato por molécula? (Alguns fatores de conversão úteis
para radioatividade são mostrados na Tabela 3 na página 964.)
8–41 Você deseja saber a sensibilidade para detecção de imunoblotting (Western

blotting), usando um segundo anticorpo ligado a enzima para detectar o
anticorpo direcionado contra sua proteína (Figura 8–6A). Você está usando o
anticorpo monoclonal de camundongo 4G10, que é específico para resíduos
de fosfotirosina, para detectar proteínas fosforiladas. Você primeiro fosforila a
proteína básica da mielina in vitro usando uma proteína tirosina quinase que
adiciona um fosfato por molécula. Você então prepara uma série de diluições
da proteína fosforilada e submete as amostras a SDS-PAGE. Em seguida, a
proteína é transferida (transferida) para um filtro de nitrocelulose, incubada
com o anticorpo 4G10 e lavada para remover o anticorpo não ligado. O blot é
então incubado com um segundo anticorpo anti-camundongo de cabra que
carrega a peroxidase de rábano silvestre (HRP) conjugada a ele, e qualquer
excesso de anticorpo não ligado é novamente lavado. Você coloca o blot em
um saco plástico fino, adiciona reagentes que quimioluminescem quando
reagem com o HRP (Figura 8-6A) e coloca o saco contra uma folha de filme de
raios X. Quando o filme é desenvolvido, você vê a imagem mostrada na Figura 8-6B.
A. Dadas as quantidades de proteína básica de mielina fosforilada indicadas em
cada pista na Figura 8-6B, calcule o limite de detecção desse método em
termos de moléculas de proteína por banda.
B. Supondo que você esteja usando anticorpos monoclonais para detectar
proteínas, você esperaria que o limite de detecção dependesse da massa
molecular da proteína? Por que ou por que não?
(A) DIAGRAMA ESQUEMÁTICO (B) IMUNOBLOT
proteína básica da mielina (fmol)

40 20 10 5 2,5 1,2 0,6
luz
NH2O _ NH2O _
Figura 8–6 Sensibilidade de detecção
de immunoblotting (Problema 8–41).
NH Oÿ
(A) Diagrama esquemático do experimento.
NH H2O2 Oÿ MBP significa proteína básica de mielina.
Na presença de peróxido de hidrogênio,
O HRP O
luminol a peroxidase de rábano (HRP) converte o
luminol em uma molécula quimioluminescente
que emite luz, que é detectada pela
segundo anticorpo
exposição de um filme de raios-x. (B)
MBP Filme exposto de um immunoblot. O
primeiro anticorpo
número de femtomoles de proteína básica
membrana de nitrocelulose de mielina em cada banda é indicado.
ANÁLISE DE PROTEÍNAS 175
TRATAMENTO DE DADOS kd
8–42 A Figura 8–7 mostra uma autorradiografia de uma separação SDS-PAGE de proteínas 116
radiomarcadas em um extrato livre de células de ovos de ouriço-do-mar. Ao lado são 97
mostrados um conjunto de proteínas marcadoras radiomarcadas de massa molecular
67
definida. Duas bandas que contêm proteínas conhecidas - a pequena subunidade da
rib onnucleotídeo redutase e ciclina B - são indicadas. 56 ciclina B
A. O conjunto padrão de proteínas migra a uma taxa inversamente proporcional às suas
ribonucleotídeo
massas moleculares? Ou seja, você esperaria que uma proteína de 35 kd, por exemplo, redutase
40
migrasse duas vezes mais para baixo no gel do que uma proteína de 70 kd? Você acha
que um gráfico de log massa molecular versus migração daria uma relação mais linear? 35
B. Como você usaria o conjunto padrão de proteínas para estimar as massas moleculares
da ribonucleotídeo redutase e da ciclina B? O que você estimaria como sendo as massas
moleculares dessas duas proteínas? Figura 8–7 Autorradiografia de
C. As sequências dos genes para essas duas proteínas fornecem massas moleculares proteínas radiomarcadas separadas por
de 44 kd para a ribonucleotídeo redutase e 46 kd para a ciclina B. Você pode oferecer SDS-PAGE (Problema 8–42). Um
algumas possíveis razões pelas quais a estimativa SDS-PAGE para a massa molecular conjunto de proteínas marcadoras radiomarcadas
com massas moleculares conhecidas é
da ciclina B é tão distante?
mostrado na faixa da esquerda, juntamente
com suas massas moleculares em
8–43 Você isolou as proteínas de dois pontos adjacentes após a eletroforese bidimensional em kilodaltons. Problemas radiomarcados
As proteínas p8.08/8.07 de um extrato de
gel de poliacrilamida e as digeriu com tripsina. Quando as massas dos peptídeos foram
ovo de ouriço-do-mar são mostradas na faixa
medidas por espectrometria de massa MALDI-TOF, descobriu-se que os peptídeos das da direita. As setas marcam as bandas que
duas proteínas eram idênticos, exceto por um (Figura 8-8). Para este peptídeo, os correspondem à ciclina B e à pequena
valores de massa para carga (m/z) diferiram em 80, um valor que não corresponde a subunidade da ribonucleotídeo redutase.
uma diferença na sequência de aminoácidos. (Por exemplo, ácido glutâmico em vez de

valina em uma posição daria uma diferença m/z de cerca de 30.) Você pode sugerir
uma possível diferença entre os dois peptídeos que pode explicar a diferença m/z
observada ?
8–44 Você criou quatro anticorpos monoclonais diferentes para Xenopus Orc1, que é um
componente do complexo de reconhecimento da origem da replicação do DNA (ORC)
encontrado em eucariotos. Você quer usar os anticorpos para imunopurificar outros
membros do ORC. Para decidir qual dos seus anticorpos monoclonais - TK1, TK15, TK1 TK15TK37TK47
mAb423
TK37 ou TK47 - é mais adequado para esse propósito, você os liga covalentemente a
contas, incuba-os com um extrato de ovo de Xenopus, gira as contas e lava-as
cuidadosamente e depois solubilizar as proteínas ligadas com SDS. Você usa SDS-
PAGE para separar as proteínas solubilizadas e corá-las, conforme mostrado na Figura kd
8–9. 116
A. A partir desses resultados, quais bandas você acha que surgem das proteínas que estão 97
presentes no ORC?
B. Por que você acha que os vários anticorpos monoclonais fornecem tais 66
resultados?
C. Qual anticorpo você acha que é o melhor para usar em futuros estudos deste tipo? Por
que? 45
D. Como você pode determinar qual banda neste gel é Orc1?
29
3706
abundância
20
18
3786
Figura 8–9 Purificação imunológica de
Xenopus ORC (Problema 8–44). O
anticorpo monoclonal mAb423 é específico
m/ z (relação massa-carga) para um antígeno não encontrado em
extratos de Xenopus e, portanto, serve como
Figura 8–8 Massas de peptídeos medidas por espectrometria de controle. As posições das proteínas
massa MALDI-TOF (Problema 8–43). Apenas os picos marcadoras são mostradas à esquerda com
numerados diferem entre as duas amostras de proteína. suas massas indicadas em kilodaltons.
Problemas 8.09/8.08
Domínio de ligação ao
domínio de ativação VP16 Figura 8–10 Ativação da transcrição por um
DNA LexA VP16 regulador de transcrição híbrido (Problema
transcrição 8–45).
gene LacZ gene LacZ

Site de ligação LexA
8–45 O sistema de dois híbridos de levedura depende dos próprios mecanismos da

célula para revelar interações proteína-proteína. Este método tira vantagem da
natureza modular de muitos reguladores da transcrição, que possuem um domínio
que se liga ao DNA e outro domínio que ativa a transcrição. Os domínios podem
ser trocados por métodos de DNA recombinante, permitindo a construção de
reguladores de transcrição híbridos. Assim, o domínio de ligação ao DNA do
repressor LexA de E. coli pode ser combinado com o poderoso domínio de
ativação VP16 do herpesvírus para ativar a transcrição de genes a jusante de um
sítio de ligação ao DNA LexA (Figura 8-10).
Se os dois domínios do regulador da transcrição puderem ser aproximados
por interações proteína-proteína, eles ativarão a transcrição. Esta é a principal
característica do sistema de dois híbridos. Assim, se um membro de um par de
proteínas em interação for fundido ao domínio de ligação ao DNA de LexA (para
formar a “isca”) e o outro for fundido ao domínio de ativação VP16 (para formar
a “presa”), a transcrição será ativada quando as duas proteínas híbridas
interagirem dentro de uma célula de levedura. É possível projetar telas poderosas
para interações proteína-proteína, se o gene cuja transcrição é ativada for
essencial para o crescimento ou puder dar origem a um produto colorido.
Para verificar a capacidade do sistema em encontrar proteínas com as quais

Ras interage, foram construídos genes híbridos que continham o domínio de
ligação LexA ao DNA, um fundido a Ras (LexA–Ras) e outro fundido a lamina
nuclear (LexA–lamin). Um segundo par de construtos continha o domínio de
ativação VP16 sozinho (VP16) ou fundido ao gene p8.11/8.10 da adenilil ciclase
(VP16–CYR). A adenilil ciclase é conhecida por interagir com Ras e serve como
um controle positivo; laminas nucleares não interagem com Ras e servem como
controle negativo. Essas construções de plasmídeo foram introduzidas em uma
cepa de levedura contendo cópias do gene His3 e do gene LacZ , ambos com
sítios de ligação LexA posicionados imediatamente a montante.
As colônias transformadas individuais foram testadas quanto à capacidade de
crescer em uma placa sem histidina, o que requer a expressão do gene His3 .
Além disso, eles foram testados quanto à capacidade de formar colônias azuis
(em comparação com as colônias brancas normais) quando cultivados na
presença de um substrato apropriado (XGAL) para -galactosidase. A configuração
para o experimento é descrita na Tabela 8–4.
TABELA 8–4 Experimentos para testar o sistema de dois híbridos (Problema 8–45).
Construções de plasmídeo
Isca Presa Crescimento em placas sem histidina Cor em placas com XGAL
lexA-Ras
LexA-lamin
VP16
VP16–CYR
LexA–Ras VP16
LexA–Ras VP16–CYR
LexA-lamin VP16
LexA-lamin VP16–CYR
ANÁLISE E MANIPULAÇÃO DO DNA 177
A. Preencha a Tabela 8–4 com suas expectativas. Use um sinal de mais para indicar
crescimento em placas sem histidina e um sinal de menos para indicar nenhum crescimento.
Escreva “azul” ou “branco” para indicar a cor das colônias cultivadas na presença de XGAL.
B. Para qualquer combinação de isca e presa na tabela que você espera que confira
crescimento na ausência de histidina e forme colônias azuis com XGAL, esboce a estrutura
do regulador de transcrição ativo no gene LacZ .
C. Se você deseja que duas proteínas sejam expressas em uma única cadeia polipeptídica, o
que você deve ter cuidado ao fundir os dois genes?
ANÁLISE E MANIPULAÇÃO DO DNA
cromossomo artificial bacteriano (BAC) anotação do genoma clone de cDNA biblioteca genômica
hibridização da biblioteca de cDNA sequenciamento profundo de RNA (RNA-seq) quadro
de leitura aberta (ORF) sequenciamento didesoxi (sequenciamento do vetor plasmídeo
de Sanger) reação em cadeia da polimerase (PCR) tecnologia de DNA recombinante nuclease de restrição
clonagem de DNA
biblioteca de DNA
DEFINIÇÕES
8–46 Molécula pequena e circular de DNA que se replica independentemente do genoma e pode
ser usada para clonagem de DNA.
8–47 Uma coleção de clones que contém uma variedade de segmentos de DNA do genoma de um
organismo.
8–48 O processo de marcar todos os genes em um genoma e atribuir uma função biológica
a cada um.
8–49 Uma de um grande número de enzimas que podem clivar uma molécula de DNA em qualquer
local onde ocorre uma sequência curta específica de nucleotídeos.
8–50 Um clone de DNA de uma cópia de DNA de uma molécula de mRNA.
8–51 Técnica para geração de cópias múltiplas de regiões específicas de DNA pelo uso de primers
específicos de sequência e ciclos múltiplos de síntese de DNA.
8–52 e sequenciamento de todo o repertório de RNA de uma célula ou tecido.
8–53 Vetor de clonagem procariótica que pode acomodar grandes pedaços de DNA de até 1 milhão
de pares de bases.
8–54 Processo pelo qual duas cadeias complementares de ácidos nucleicos formam uma
dupla hélice.
VERDADEIRO FALSO
8–55 Bactérias que produzem uma nuclease de restrição específica para defesa contra vírus evoluíram
de tal forma que seu próprio genoma não contém a sequência de reconhecimento dessa
nuclease.
8–56 A eletroforese em gel de campo pulsado usa um forte campo elétrico para separar moléculas de
DNA muito longas, estendendo-as de modo que percorram primeiro a extremidade através
do gel a uma taxa que depende de seu comprimento.
8–57 De longe, a vantagem mais importante dos clones de cDNA sobre os clones genômicos é que
eles podem conter a sequência de codificação completa de um gene.
8–58 Se cada ciclo de PCR dobrar a quantidade de DNA sintetizado no ciclo anterior, então 10 ciclos
darão uma amplificação de 103 vezes, 20 ciclos darão uma amplificação de 106 vezes e 30
ciclos darão uma amplificação de 109 vezes . amplificador
ção.
8–59 A Figura 8–11 mostra uma imagem de fragmentos de DNA que foram separados por eletroforese
em gel e depois corados por brometo de etídio, uma molécula que uoresce intensamente
Figura 8-11 Fragmentos de DNA
sob luz ultravioleta de longo comprimento de onda quando está ligada ao DNA. Esses géis separados por eletroforese em gel e
são uma maneira padrão de detectar os produtos de clivagem por nucleases de restrição. corados com brometo de etídio (Problema 8-59).
Para o fragmento de DNA mostrado na Figura 8–12, decida se ele será cortado pelas Cada uma das bandas laranja no gel
representa um local onde os fragmentos
nucleases de restrição EcoRI (5ÿeg-GAATTC), AluI (5ÿÿ-AGCT) e PstI (5ÿÿ-CTGCAG). Para
de DNA migraram durante a eletroforese.
aqueles que cortam o DNA, quantos produtos serão produzidos?
O etídio se intercala entre os pares de bases no DNA de
fita dupla. A remoção do etídio do ambiente aquoso
e a fixação de sua orientação no ambiente apolar do
DNA aumentam drasticamente sua uorescência.
5'-AAGAATTGCGGAATTCGAGCTTAAGGGCCGCGCCGGAAGCTTTAAA-3' comprimento
Quando
uma cor
de onda
irradiado
laranja
longo,
brilhante.
comeleluz
adquire
ultravioleta de
3'-TTCTTAACGCCTTAAGCTCGAATTCCCGGCGCGGCTTCGAAATTT-5'
Figura 8–12 Um segmento de DNA de fita dupla (Problema 8–59).
8–60 As nucleases de restrição BamHI e PstI cortam suas sequências de reconhecimento

conforme mostrado na Figura 8–13.
A. Indique as extremidades 5 e 3 das moléculas de DNA cortadas.
B. Como as extremidades seriam modificadas se você incubasse as moléculas cortadas com os
DNA polimerase na presençaProblemas p8.15/8.12
de todos os C. Após a
quatro dNTPs?
reação na parte B, você ainda poderia unir as extremidades BamHI por incubação com T4 DNA
ligase? Você ainda poderia se juntar às extremidades do PstI? (T4 DNA ligase unirá as
extremidades cegas, bem como as extremidades coesivas.)
D. A junção das extremidades na parte C regenerará o local BamHI? Será que vai regenerar
rar o site PstI?
8–61 A nuclease de restrição EcoRI reconhece a sequência 5eg-GAATTC e faz a clivagem

entre G e A para deixar as fitas simples salientes de 5eg (como BamHI, consulte a Figura
8-13A). PstI, por outro lado, reconhece a sequência 5ÿ-CTGCAG e cliva entre A e G para
deixar 3ÿ protuberantes filamentos únicos (consulte a Figura 8-13B). Esses dois locais de
reconhecimento são exibidos nas representações helicoidais do DNA na Figura 8-14.
A. Para cada sítio de restrição, indique a posição de clivagem em cada fita

do ADN.
(A) CLIVAGEM BamHI (B) CLIVAGEM PstI
5' 3' 5' 3'

-- GGATCC -- -- CTGCAG --
-- CCTAGG -- 3ÿ 5ÿ -- GACGTC -- 3ÿ 5ÿ
Figura 8–13 Clivagem de DNA por

BamHI PstI
nuclease de restrição (Problema 8–60).
(A) clivagem BamHI. (B) clivagem PstI.
-- G GATCC -- -- CTGCA G -- Apenas os nucleotídeos que formam os
-- CCTAG G -- -- G ACGTC -- locais de reconhecimento são mostrados.
B. A partir das posições dos locais de clivagem, decida para cada nuclease de restrição 3'
se você espera que ela se aproxime do local de reconhecimento pelo lado do sulco
EcoRI
maior ou pelo lado do sulco menor.
5'
8–62 Qual das nucleases de restrição listadas na Tabela 8–5 , se houver, clivará definitivamente
um segmento de cDNA que codifica o peptídeo KIGPACF?
G
(Veja as Tabelas 7 e 8, página 966, para o código genético.)
A
8–63 Você deseja fazer um mapa de restrição de um fragmento de restrição BamHI de 3,0 kb. A
menor
Você digere três amostras do fragmento com EcoRI, HpaII e uma mistura de EcoRI sulco
T
e HpaII. Em seguida, você separa os fragmentos por eletroforese em gel e visualiza T
as bandas de DNA por coloração com brometo de etídio (Figura 8-15). A partir C
desses resultados, desenhe um mapa de restrição que mostre as posições relativas

dos sítios de reconhecimento EcoRI e HpaII e as distâncias em kilobases (kb) entre
eles. 5'
8–64 Se você adicionar DNA a poços no topo de um gel, deve colocar o eletrodo positivo
(ânodo) no topo ou no fundo do gel? Explique sua escolha. 3'
8–65 Você deseja clonar um fragmento de DNA com extremidades KpnI em um vetor com 3'
extremidades BamHI. O problema é que as extremidades BamHI e KpnI não são
PstI
compatíveis: BamHI deixa uma saliência de 5eg e KpnI deixa uma saliência de 3m
(Figura 8–16). Um amigo sugere que você tente ligá-los com uma “tala” de
5'
oligonucleotídeo, conforme mostrado na Figura 8-16. Não está imediatamente claro
para você que tal esquema funcionará porque a ligação requer um fosfato adjacente C
de 5ÿ e 3ÿ hidroxila. Embora as moléculas que são clivadas com nucleases de T
restrição tenham extremidades apropriadas, os oligonucleotídeos são tipicamente G
sintetizados com grupos hidroxila em ambas as extremidades. Além disso, embora a sulco
C
principal
junção mostrada na Figura 8.16 seja BamHI–KpnI, a outra junção é KpnI–BamHI, e A
você está cético de que o mesmo oligonucleotídeo possa bloquear ambas as junções. G
A. Faça um desenho da junção KpnI-BamHI e da tala oligonucleotídica que seria

necessária. Este oligonucleotídeo é o mesmo ou diferente daquele mostrado na 5'
Figura 8-16?
B. Faça um desenho da molécula após o tratamento com DNA ligase. Indicar
que se algum dos nicks será ligado. 3'
C. O esquema do seu amigo funcionará?
Figura 8–14 Sítios de restrição no DNA
8–66 Como uma reação de sequenciamento de DNA seria afetada se a proporção de helicoidal (Problema 8–61).
dideoxinucleosídeos trifosfatos (ddNTPs) para desoxinucleosídeos trifosfatos (dNTPs)
fosse aumentada? Quais seriam as consequências se a proporção fosse diminuída?
8–67 O sequenciamento de DNA de seus próprios dois genes -globina (um de cada uma de
suas duas cópias do cromossomo 11) revela uma mutação em um dos genes.
EcoRI
+
EcoRI HPII HPII
TABELA 8–5 Um conjunto de restrições

nucleases e suas sequências de
reconhecimento (Problema 8-62).
1,7 KB
Nuclease de Sequência de 1,6 kb
restrição reconhecimento 1,4 kb
1,2 kb
0,9 KB 0,9 kb
AluI AGCT
depois de 96 eu GGNCC
0,5 KB Figura 8-15 Tamanhos das bandas de
0,4 KB 0,4 KB
DNA produzidas pela digestão de um
hindi III AAGCTT
fragmento de 3,0 kb por EcoRI, HpaII e uma
mistura dos dois (Problema 8-63). Os
N representa qualquer nucleotídeo.
tamanhos dos fragmentos são mostrados em kilobases.
DNA de vetor de corte BamHI DNA a ser amplificado
5'-GACCTGTGGAAGC CATACGGGATGA-3'
3'-CTGGACACCTTCG GTATGCCCTAACT-5'
3' 5'
G GATCC
CCTAG G
5' 3ÿ primers
5' 3' (1) 5'-GACCTGTGGAAGC-3' (5) 5'-CATACGGGATTGA-3'

C GGTAC
CATGG (2) 5'-CTGGACACCTTCG-3' (6) 5'-GTATGCCCCTAACT-3'
3' C 5'
(3) 5'-CGAAGGTGTCCAG-3' (7) 5'-TGTTAGGGCATAC-3'
Fragmento de corte KpnI
(4) 5'-GCTTCCACAGGTC-3' (8) 5'-TCAATCCCGTATG-3'
oligonucleotídeo “splint” 5' 3'

Figura 8–16 Esquema para usar uma Figura 8–17 DNA a ser amplificado e potenciais primers de PCR (Problema 8–
“tala” oligonucleotídica para ligar 68).
GATCGTAC
3' 5' extremidades de restrição
G C incompatíveis (Problema 8–65).
CCTAG CATGG
5' 3'
BamHI KpnI Problemas p8.21/8.17
Considerando apenas essas informações, quanto você deve se preocupar em ser

portador de uma doença hereditária que pode ser transmitida aos seus filhos?
Que outras informações você gostaria de ter para avaliar seu risco?
8–68 Você deseja amplificar o DNA entre os dois trechos de sequência mostrados na Figura
8–17. Dos primers listados, escolha o par que permitirá amplificar o DNA por PCR.
8–69 Logo na primeira rodada de PCR usando DNA genômico, a síntese dos primers de DNA
inicia a síntese que termina apenas quando o ciclo termina (ou quando um final
aleatório do DNA é encontrado). No entanto, ao final de 20 a 30 ciclos - uma
amplificação típica - o único produto visível é definido precisamente pelas
extremidades dos primers de DNA (Figura 8-18). Em que ciclo um fragmento de fita
dupla do tamanho correto é gerado pela primeira vez?
8–70 Você deseja expressar uma proteína humana rara em bactérias para poder produzir
grandes quantidades dela. Para ajudar na sua purificação, você decide adicionar um
trecho de seis histidinas ao N-terminal ou ao C-terminal da proteína. Essas proteínas
marcadas com histidina ligam-se fortemente a colunas de Ni2+ , mas podem ser
prontamente eluídas com uma solução de EDTA ou imidazol. Este procedimento
permite uma enorme purificação em uma única etapa.
A sequência de nucleotídeos que codifica sua proteína é mostrada na Figura
8-19. Desenhe um par de primers de PCR, cada um com 18 nucleotídeos de
homologia com o gene, que irão amplificar a sequência de codificação e adicionar
um códon de iniciação seguido por seis códons de histidina ao N-terminal.
Projete um par de primers que irão adicionar seis códons de histidina seguidos por
um códon de parada ao C-terminal.
PRIMEIRO CICLO DE PCR
5'
3'
5'
3'
20 CICLOS
Figura 8–18 Produtos de PCR após 1 e 20 ciclos

(Problema 8–69).
N-terminal H H H H
5' GGT CGT ATG GCT ACT CGT CGC GCT GCT
matraa CC CC
+ H
HN N H HN N
C C
CTT GCT GCA AGT CTC TCT TAG AAG TGT 3'
DURAR* H H
C-terminal
Figura 8–19 Sequência de nucleotídeos ao redor dos terminais N e C da Figura 8–20 Estrutura do imidazol (Problema 8–71).
proteína que você deseja modificar (Problema 8–70). A sequência de
aminoácidos codificada é indicada abaixo de cada códon usando o código de uma letra.
O asterisco (*) indica o códon de parada. Apenas a fita superior do
DNA de fita dupla é mostrada.
GATC
8–71 Agora você clonou em um vetor de expressão ambas as versões da proteína marcada com
tidine que você criou no Problema
8–70. Nenhuma das construções se expressa particularmente fortemente em bactérias,
mas o produto é solúvel. Você passa o extrato bruto por uma coluna de Ni2+ anidade, que
se liga especificamente às proteínas marcadas com histidina. Depois de lavar a coluna
extensivamente, você elui sua proteína da coluna usando uma solução contendo imidazol
100
(Figura 8-20), que libera sua proteína.
Quando você submete a proteína eluída a eletroforese e cora o gel para proteína, fica Problemas p8.24/8.20
satisfeito ao encontrar bandas no eluato que não estão presentes quando as bactérias de
controle são tratadas de maneira semelhante. Mas você fica intrigado ao ver que a
construção marcada no terminal N fornece uma escada de proteínas mais curtas abaixo
da proteína de comprimento total, enquanto a construção marcada no terminal C produz
exclusivamente a proteína de comprimento total. A quantidade de proteína completa é
aproximadamente a mesma para cada construto.
A. Por que uma solução de imidazol libera uma proteína marcada com histidina de
a coluna de Ni2+ ?
B. Oferecer uma explicação para a diferença nos produtos gerados pelos dois constructos.
8–72 Um exemplo de um gel de sequenciamento didesoxi é mostrado na Figura 8–21. Tente lê-lo.
Conforme lido da parte inferior do gel para o topo, a sequência cor responde ao mRNA
de uma proteína. Você consegue encontrar o quadro de leitura aberto nesta sequência?
Para qual proteína ele codifica? 50
CÁLCULOS
8–73 A nuclease de restrição Sau3A reconhece a sequência 5eg-GATC e cliva no lado 5eg
(à esquerda) do G. (Uma vez que as cadeias superior e inferior da maioria dos locais de
restrição são lidas da mesma forma na direção de 5ÿ-3º , apenas uma As extremidades
de fita simples produzidas pela clivagem Sau3A são idênticas àquelas produzidas pela
clivagem BamHI (ver Figura 8-13), permitindo que os dois tipos de extremidades sejam
unidas por incubação com DNA ligase. (Você pode achar útil extrair o produto dessa
ligação para se convencer de que é verdade.)
A. Que fração de sítios BamHI (5hibition-GGATCC) pode ser cortada com Sau3A? Que fração
de locais Sau3A pode ser cortada com BamHI?
B. Se duas extremidades BamHI forem ligadas, o local resultante pode ser novamente clivado
por BamHI. O mesmo vale para duas pontas Sau3A. Suponha que você ligue uma
extremidade Sau3A a uma extremidade BamHI. O site híbrido pode ser cortado com
Sau3A? Pode ser cortado com BamHI?
C. Qual você supõe ser o tamanho médio dos fragmentos de DNA produzidos pela digestão
do DNA cromossômico com Sau3A? Qual é o tamanho médio com BamHI?
Figura 8–21 Um gel de sequenciamento didesoxi de um segmento clonado

de DNA (Problema 8–72). As pistas são rotuladas como G, A, T e C para
indicar qual ddNTP foi incluído na reação. 1
seqüência de proteína Figura 8-22 Uma sonda oligonucleotídica degenerada para o gene do EcoRI BamHI
Fator VIII com base em um trecho de aminoácidos da proteína

MQKFN (Problema 8-75). Como mais de um tripleto de DNA pode codificar cada 4 KB
AATT aminoácido, várias sequências de nucleotídeos diferentes são
ATGC AA TT AA inserir
GGCC possíveis para cada sequência de aminoácidos. Durante a síntese,
uma mistura de nucleotídeos é incluída em cada posição ambígua
oligonucleotídeo degenerado (por exemplo, A mais G na posição 6). Como resultado, a mistura
de oligonucleotídeos sintetizados contém todas as sequências possíveis vetor
que podem codificar o segmento específico de aminoácidos.

Embora apenas uma dessas sequências no DNA genômico realmente
codifique a proteína, é impossível dizer com antecedência qual é. A Figura 8–23 Plasmídeo recombinante
mistura das sequências possíveis - chamada de sonda oligonucleotídica contendo um segmento de DNA clonado
degenerada - é usada para pesquisar o gene em uma biblioteca genômica. (Problema 8–76).
8–74 Para preparar uma biblioteca genômica, é necessário fragmentar o genoma para que possa ser
clonado em um vetor. Um método comum é usar uma nuclease de restrição.
A. Quantos fragmentos diferentes de DNA você esperaria obter se clivasse o DNA genômico
humano com Sau3A (5eg-GATC)? (Lembre-se de que existem 3,2 × 109 pares de bases no
genoma humano haploide.) Quantos você esperaria obter com o EcoRI (5ÿ-GAATTC)?
B. As bibliotecas genômicas humanas são frequentemente feitas de fragmentos obtidos pela

clivagem do DNA humano com Sau3A de forma que o DNA seja apenas parcialmente digerido;
isto é, de modo que nem todos os sítios Sau3A tenham sido clivados.
Qual é a possível razão para fazer isso?
8–75 Um conjunto degenerado de sondas oligonucleotídicas para o gene do Fator VIII para os Problemas
p8.27/8.22 de coagulação do
sangue é mostrado na Figura 8–22. Cada uma dessas sondas tem apenas 15 nucleotídeos de
comprimento. Em média, quantas correspondências exatas para qualquer sequência única de
15 nucleotídeos você esperaria encontrar no genoma humano (3,2 × 109 pares de bases)? Problemas p8.31/8.23
Quantas correspondências para a coleção de sequências na sonda oligonucleotídica
degenerada você esperaria encontrar? Como você pode determinar que uma correspondência
corresponde ao gene do Fator VIII?
TRATAMENTO DE DADOS
marcadores
8–76 Você clonou um segmento de 4 kb de um gene em um vetor plasmidial (Figura 8–23) e agora deseja
preparar um mapa de restrição do gene em preparação para outras manipulações de DNA. kb
Sua orientadora deixou instruções sobre como fazer isso, mas agora ela está de férias, então
você está por conta própria. Você segue as instruções dela, conforme descrito abaixo. 4,8
4,3
3,7
1. Corte o plasmídeo com EcoRI.
2. Adicione um rótulo radioativo às extremidades do EcoRI.
2.3
3. Corte o DNA marcado com BamHI. 1.9
4. Purifique a inserção para longe do vetor.

1,4
5. Digerir o inserto marcado brevemente com uma nuclease de restrição para que em 1,3
média cada molécula marcada é cortada cerca de uma vez.

6. Repita a etapa 5 para várias nucleases de restrição diferentes.
0,7
7. Execute as amostras parcialmente digeridas lado a lado em um gel de agarose.
8. Coloque o gel contra o lm de raios-x para que os fragmentos com uma extremidade radioativa
possam expor o lm para produzir uma autorradiografia.
9. Desenhe o mapa de restrição.
Seu maior problema até agora foi o passo 5; porém, diminuindo as quantidades de nuclease
0,2
e baixando a temperatura, você conseguiu encontrar condições para a digestão parcial. Agora
você concluiu a etapa 8 e sua autorradiografia é mostrada na Figura 8–24.
Infelizmente, seu orientador não foi explícito sobre como construir um mapa a partir dos Figura 8–24 Autorradiografia mostrando a
separação eletroforética dos fragmentos
dados da autorradiografia. Ela deve voltar amanhã. Você descobrirá a tempo?
marcados após a digestão parcial com as três
nucleases de restrição representadas pelos
símbolos (Problema 8–76). Os números à
8–77 O DNA de certos vírus animais pode se integrar ao DNA de uma célula, conforme mostrado esquerda indicam os tamanhos de um conjunto
esquematicamente na Figura 8-25. Você quer saber o de fragmentos de marcadores em kilobases.
Figura 8–25 Integração do DNA viral no DNA (A) MAPA DO DNA VIRAL
DNA viral celular (Problema 8–77).

EcoRI
DNA celular HPII e

a
d
b BglI
c
DNA viral HPII
BglI
integrado
estrutura do genoma viral tal como existe no estado integrado. Você digere (B) DIGES DE RESTRIÇÃO
amostras de DNA viral e DNA de células que contêm o vírus integrado com EcoRI célula
nucleases de restrição que cortam o DNA viral em locais conhecidos (Figura célula de vírus do vírus HpaII célula do vírus BglI
8-26A). Posteriormente, você separa os fragmentos por eletroforese em géis
de agarose e visualiza as bandas que contêm DNA viral por hibridização com
uma sonda de DNA viral. Você obtém os padrões mostrados na Figura 8–26B.
A partir dessas informações, decida em qual dos cinco segmentos do

genoma viral (rotulado de a a e na Figura 8-26A) ocorreu o evento de integração.
LINKS MÉDICOS
8–78 Muitas mutações que causam doenças genéticas humanas envolvem a

substituição de um nucleotídeo por outro, como é o caso da anemia falciforme Figura 8-26 DNA viral e celular digerido com
várias nucleases de restrição e hibridizado com
(Figura 8–27A). Um ensaio baseado na ligação de oligonucleotídeos fornece
uma sonda de DNA viral (Problema 8-77). (A)
uma maneira rápida de detectar tais diferenças específicas de um único
Sítios de restrição no genoma viral. Os
nucleotídeo. Este ensaio usa pares de oligonucleotídeos: para cada par, um segmentos de DNA definidos por esses locais são
oligonucleotídeo é marcado com biotina e o outro com um marcador radioativo indicados pelas letras de a a e. (B) Digestões de
(ou fluorescente). No ensaio mostrado na Figura 8-27B para a detecção da restrição de DNA viral e DNA celular. Os géis de
mutação responsável
Problemas pela anemia falciforme, dois pares de oligonucleotídeos
p8.34/8.25 agarose separam os fragmentos de DNA com base
no tamanho – quanto menor o fragmento, mais ele
são hibridizados com o DNA de um indivíduo e incubados na presença da
se move em direção ao fundo do gel.
DNA ligase. Os oligonucleotídeos biotinilados são então ligados à estreptavidina
em um suporte sólido e qualquer radioatividade associada é visualizada por
auto-radiografia, conforme mostrado na Figura 8-27C.
A. Você espera que os oligonucleotídeos A e S hibridizem com o DNA A e S ? Problemas p8.35/8.26
B. Como este ensaio distingue entre A e S DNA?
(A) SEQUÊNCIA DE ÿ-GLOBINA

sequência normal (ÿA)
A
ATGGTGCACCTGACTCCTG GGAGAAGGTCTGCCGTTACTG
T
Sequência do mutante falciforme (ÿS)
(B) OLIGONUCLEOTÍDEOS
ÿA oligo
1 biotina-ATGGTGCACCTGACTCCTGA
oligo radioativo
Figura 8–27 Ensaio de ligação de
32P-GGAGAAGGTCTGCCGTTACTG 3 oligonucleotídeos (Problema 8–78). (A)
ÿS oligo Sequência do gene da -globina ao redor do local
2 biotina-ATGGTGCACCTGACTCCTGT da mutação falciforme (S) . A sequência A normal
carrega um A na posição central; a sequência
S do mutante falciforme tem um T em seu
(C) ENSAIO oligos oligos lugar. (B) Oligonucleótidos específicos para
1+3 2+3 ensaio de ligação.
(C) Ensaios para detectar a diferença de um único
nucleotídeo entre as sequências A e S.
ÿAÿA homozigoto
Após a hibridização com o DNA do paciente, os
oligonucleotídeos biotinilados foram coletados em
ÿAÿS heterozigoto
um ponto em uma folha de papel de filtro e
ÿSÿS homozigoto expostos a lm de raios-x para detectar a
radioatividade, que torna o lm preto.
a bcde
Figura 8–28 Análise de PCR multiplex de
(A) GENE DMD fgh locais amplificados
por PCR
seis pacientes com DMD (Problema 8–79).
(A) O gene DMD com os nove sítios
amplificados por PCR indicados por setas.
Os tamanhos dos produtos de PCR são tão
0 0,5 1,0 1,5 2,0 (MB) pequenos nesta escala que sua localização é
simplesmente indicada. (B) exibição de gel de
(B) ANÁLISE MULTIPLEX PCR agarose de produtos de PCR amplificados.
pacientes com DMD “Normal” indica um homem normal. A pista
normal ABCDE F 0 marcada com “0” mostra um controle
negativo sem DNA adicionado.
gh
e
de
novo
c
f
8–79 A distrofia muscular de Duchenne (DMD) está entre as doenças genéticas humanas mais
comuns, afetando aproximadamente 1 em 3.500 nascimentos masculinos.
Um terço de todos os novos casos surgem por meio de novas mutações. O gene
DMD, localizado no cromossomo X, tem mais de 2 milhões de pares de bases e
contém pelo menos 70 éxons. Grandes deleções respondem por cerca de 60% de
todos os casos da doença e tendem a se concentrar em torno de duas regiões do
gene. O tamanho muito grande
do gene DMD complica a
análise das mutações. Uma abordagem rápida, que pode detectar cerca de
80% de todas as deleções, é denominada PCR multiplex. Ele usa vários pares de
primers de PCR para amplificar nove segmentos diferentes do gene nas duas regiões
mais comuns para deleções (Figura 8-28A). Ao organizar os primers de PCR de
modo que cada par forneça um produto de tamanho diferente, é possível amplificar
e analisar todos os nove segmentos em uma reação de PCR. Um exemplo de análise
de PCR multiplex de seis homens DMD não relacionados é mostrado na Figura
8-28B.
A. Descreva a extensão das exclusões, se houver, em cada um dos seis DMD
pacientes.
B. Que controle adicional você pode sugerir para confirmar sua análise de
paciente F?
ESTUDANDO A EXPRESSÃO E FUNÇÃO DE GENE

alelo proteína fluorescente verde (GFP) cromatina imunoprecipitação

haplótipo bloqueio teste de complementação fenótipo
mutação condicional polimorfismo
DNA microarray quantitativo RT-PCR análise de epistasia

genética reversa triagem genética polimorfismo de
nucleotídeo único (SNP) genética transgene genótipo organismo transgênico
DEFINIÇÕES
8–80 Uma busca em uma grande coleção de mutantes por um mutante com um par
fenótipo articulado.
8–81 Uma das várias variantes de sequência comuns que coexistem no popu
lação.
ESTUDANDO A EXPRESSÃO E FUNÇÃO DE GENE 185
8–82 Uma de um conjunto de formas alternativas de um gene.
8–83 O caráter observável de uma célula ou organismo.
8–84 Comparando os fenótipos de diferentes combinações de mutações para determinar a ordem

em que os genes agem.
8–85 Segmento do cromossomo ancestral que foi herdado com pouco rearranjo genético ao longo
das gerações.
8–86 Animal ou planta que foi permanentemente modificado por deleção de gene,
inserção de genes ou substituição de genes.
8–87 A constituição genética de uma célula ou organismo individual.
VERDADEIRO FALSO
8–88 Em um organismo cujo genoma foi sequenciado, identificar o gene mutante responsável por
um fenótipo interessante é tão fácil para mutações induzidas por mutagênese química
quanto para aquelas geradas por mutagênese insercional.
8-89 As mutações de perda de função são geralmente recessivas.
8–90 Se duas mutações tiverem um fenótipo sintético, isso geralmente significa que as mutações
estão em genes cujos produtos operam na mesma via.
8–91 Diferencie os seguintes termos genéticos: A. Locus e alelo

B. Homozigoto e
heterozigoto C. Genótipo e fenótipo D.
Dominante e recessivo
8–92 Explique a diferença entre uma mutação de ganho de função e uma mutação dominante
negativa. Por que esses dois tipos de mutação são geralmente dominantes?
8–93 Discuta a seguinte declaração: “Hoje não faríamos ideia da importância da insulina como
hormônio regulador se sua ausência não estivesse associada à doença humana diabetes.
São as consequências dramáticas de sua ausência que concentraram os primeiros
esforços na identificação da insulina e no estudo de seu papel normal na fisiologia”.
8–94 O que são polimorfismos de nucleotídeo único (SNPs) e como eles podem ser
usado para localizar um gene mutante?
8–95 A ácido graxo sintase em células de mamíferos é codificada por um único gene. Essa proteína
notável realiza sete reações bioquímicas distintas. O gene da ácido graxo sintase de
mamífero é homólogo a sete diferentes genes de E. coli , cada um dos quais codifica
uma das funções da proteína de mamífero. Você acha que é provável que as proteínas
em E. coli funcionem juntas como um complexo? Por que ou por que não?
8–96 Como a genética reversa difere da genética padrão?
8–97 As células de um animal individual contêm genomas quase idênticos. Em um

experimento, um tecido composto por vários tipos de células é fixado e submetido à
hibridização in situ com uma sonda de DNA para um determinado gene. Para sua
surpresa, o sinal de hibridização é muito mais forte em algumas células do que em outras.
Explique esse resultado.
(A) Figura 8–29 Mutagênese dirigida ao local

LRDPQGGVI (Problema 8–98). (A) Sequência de DNA e
5 -CTTAGAGACCCCGCAGGGCGGCGTCATC- 3'
ÿ
a proteína codificada. (B) Conversão do
gene normal em um gene mutante.
(B)
seu gene
CAG
G CC
mutante
oligo
DNA POLIMERASE,
DNA LIGASE
CAG
G CC
INTRODUZIR DNA NAS CÉLULAS

E CLONAR VÍRUS RESULTANTES
CAG C GG
GTC GCC
gene do tipo selvagem gene mutante (Q ÿ R)
8–98 Com base em trabalhos anteriores, você suspeita que a glutamina (Q) no
segmento de proteína da Figura 8–29A desempenha um papel importante
no sítio ativo. Seu orientador deseja que você altere a proteína de três
maneiras: troque a glutamina por arginina (R), troque a glutamina por
glicina (G) e exclua a glutamina da proteína. Você planeja realizar essas
alterações mutacionais em uma versão do seu gene que é clonada no DNA viral M13.
Você deseja hibridar um oligonucleotídeo apropriado com o DNA viral M13,
de modo que, quando a DNA polimerase estender o oligonucleotídeo ao
redor do círculo M13 de fita simples, ele completará uma fita que codifica
da proteína
Desenhe três
mutanteo desejada.
complemento
oligonucleotídeos p8.37/8.29
longos de 20 nucleotídeos que possam
ser hibridizados com o gene clonado no DNA viral M13 de fita simples
como o primeiro passo para efetuar as alterações mutacionais (Figura
8-29B).
8–99 Você acabou de receber os resultados de uma análise de RNA-seq do mRNA

do fígado. Você previu a contagem do número de leituras de cada mRNA
para determinar a abundância relativa de diferentes mRNAs. Mas você
está confuso porque muitos dos mRNAs lhe deram resultados como os
mostrados na Figura 8-30. Como diferentes partes de um mRNA podem
ser representadas em diferentes níveis?
Figura 8–30 Leituras de RNA-seq para um

lê mRNA de fígado (Problema 8–99). A estrutura do
éxon do mRNA é indicada, com os segmentos
de codificação de proteínas indicados em azul
claro e as regiões não traduzidas em azul escuro.
mRNA Os números de leituras de sequenciamento
são indicados pelas alturas das linhas
éxons 1 2 3 4 5 verticais acima do mRNA.
tijolo vermelho branco
TRATAMENTO DE DADOS Figura 8–31 Drosophila com olhos de cores

diferentes (Problema 8–100). Ias de tipo
selvagem com olhos vermelho-tijolo são
8–100 Os primeiros estudos genéticos em Drosophila estabeleceram as bases para nossa
mostradas à esquerda e as de olhos brancos são
compreensão atual dos genes. Os geneticistas da Drosophila foram capazes de gerar ies
mostradas à direita. Moscas com cores de
mutantes com uma variedade de alterações fenotípicas facilmente observáveis. olhos entre vermelho e branco são mostradas no meio.
Alterações na cor normal dos olhos vermelho-tijolo do y têm uma história venerável porque
o primeiro mutante encontrado por omas Hunt Morgan era um y de olhos brancos (Figura
8-31). Desde aquela época, um grande número de ies mutantes com cores de olhos
intermediárias foram isolados e receberam nomes que desafiam seu senso de cor:
granada, rubi, vermelhão, cereja, coral, damasco, bu e cravo. As mutações responsáveis
por esses fenótipos de cor dos olhos são recessivas. Para determinar se as mutações
afetaram os mesmos genes ou genes diferentes, ie homozigotos para cada mutação
foram cruzados entre si em pares e as cores dos olhos de sua progênie foram anotadas.
Na Tabela 8–6, olhos de tipo selvagem vermelho-tijolo são mostrados como (+) e outras
cores são indicadas como (–).
A. Como é que as moscas com duas cores de olhos diferentes - rubi e branco, por exemplo -
dão origem a uma descendência em que todos têm olhos vermelho-tijolo?
B. Quais mutações afetam diferentes genes e quais mutações são alelos
do mesmo gene?
C. Como os alelos do mesmo gene podem dar cores de olhos diferentes? Ou seja, por que
todas as mutações no mesmo gene não dão o mesmo fenótipo?
8–101 Você projetou e construiu um microarranjo de DNA que carrega 20.000 oligonucleotídeos
específicos de alelos (ASOs). Esses ASOs correspondem aos alelos selvagens e mutantes
associados a 1.000 doenças humanas. Você projetou o microarranjo para que o ASO que
hibridiza com o alelo mutante esteja localizado logo abaixo do ASO que hibridiza com o
mesmo local na sequência do tipo selvagem. Este arranjo é ilustrado na Figura 8-32 para
ASOs que são específicos para o alelo falciforme (S) e o correspondente
TABELA 8–6 Análise de complementação das mutações da cor dos olhos da Drosophila (Problema 8–100).
MUTAÇÃO branco granada rubi vermelhão cereja coral damasco buff cravo
Branco –++ + ––– – +

Granada –+ + +++ + +
– + +++ + +
Rubi
vermelho – +++ + +
Cereja ––– –
+
Coral –– –
+
– – +
Damasco
buff – +
Cravo –
Olhos vermelho-tijolo são indicados como (+). Outras cores são indicadas como (–).
(A) ALELOS ÿ-GLOBINA (B) MICROARRAIO DE DNA Figura 8–32 Microarranjo de DNA para detecção
de alelos de doenças (Problema 8–101).
ASOÿA (A) Os alelos -globina. O gene da -globina
ÿA de tipo selvagem (A) e o alelo da célula
ASOÿS falciforme (S) são mostrados. A posição da
ÿS mutação falciforme é mostrada por uma linha
vertical. Os ASOs são mostrados como linhas
mutação vermelhas curtas dispostas acima dos
falciforme ASOÿA locais no gene com os quais eles se hibridizam.
ASOÿS
Como os ASOs estão localizados em posições
correspondentes, cada um é específico para
seu alelo: o ASO de tipo selvagem não
hibridizará com o alelo falciforme, nem o ASO
no alelo do tipo selvagem (A). ASOS hibridiza com a mutação falciforme e falciforme hibridizará com o alelo de tipo selvagem.
ASOA hibridiza com a posição correspondente no alelo do tipo selvagem. (B) Microarranjo de DNA. Uma pequena
seção do microarray é ampliada para ilustrar as
Como teste do seu microarray, você realiza hibridações de DNA isolado de
localizações dos ASOs de tipo selvagem e
indivíduos homozigotos para o alelo selvagem, homozigotos para o alelo falciforme.
falciforme ou heterozigotos para os alelos selvagem e falciforme. Para cada
amostra de DNA, desenhe os padrões esperados Problema p8.40/8.32 de
hibridação com os ASOs de
globina em seu microarray.
8–102 Agora que as notícias sobre o microarranjo de DNA específico para a sua doença
se espalharam, você está sendo inundado com pedidos para analisar várias
amostras. Só hoje você recebeu pedidos de quatro médicos para ajudar no
diagnóstico pré-natal da mesma doença. Cada uma das mães grávidas tem
uma história familiar desta doença. Você incluiu em sua matriz os cinco alelos
conhecidos por causar esta doença (Figura 8-33). Cada um desses alelos é
recessivo. Você concorda em ajudar. Você prepara amostras de DNA fetal
obtidas por amniocentese e as hibridiza com seus microarrays. Seus dados
são mostrados na Figura 8–33C. Supondo que os cinco alelos da doença
mostrados na Figura 8-33A sejam os únicos na população humana, decida
para cada amostra de DNA se o indivíduo terá a doença ou não.
8–103 Você já ouviu falar sobre essa técnica interessante para recombinação
direcionada em células-tronco embrionárias (ES) que permite criar um alelo
nulo ou um alelo condicional mais ou menos ao mesmo tempo. Como seu
amigo explicou a você, primeiro você realiza o direcionamento de genes
padrão em células ES por recombinação homóloga, conforme mostrado na
Figura 8-34. O gene Neo , que codifica a resistência ao antibiótico neomicina,
permite a seleção de células ES que incorporaram o vetor. Essas células
podem então ser rastreadas por Southern blotting para aquelas que sofreram
um evento direcionado. A parte realmente legal é ancorar o gene Neo e um ou dois éxons adjacentes
(A) ALELOS DA DOENÇA (B) MICROARRAIO DE DNA
12345
tipo selvagem Figura 8–33 Análise de DNA microarray de

m1 alelos presentes em amostras pré-natais
mutante 1 (Problema 8–102). (A) Alelos de tipo
m2 selvagem e de doença. As linhas verticais
mutante 2 indicam os locais das mutações nos alelos
m3
causadores da doença. Os ASOs específicos
mutante 3 para as mutações da doença são mostrados
m4 1234 5 ASOs de tipo selvagem
como linhas vermelhas e rotulados como m1,
mutante 4 m1 m2 m3 m4 m5 ASOs mutantes
m2, etc. Os ASOs correspondentes que hibridam
m5
com o gene do tipo selvagem em locais que
mutante 5
correspondem à posição das mutações
são rotulados como 1, 2, etc. ( B) Microarranjo de
DNA. O arranjo de ASOs de tipo selvagem
(C) DADOS DE HIBRIDAÇÃO
e mutante é indicado. (C) Dados de hibridação.
TW
Amostras de DNA fetal foram hibridizadas
JC namorado Hong Kong
com matrizes de DNA. Os pontos escuros

indicam os locais onde ocorreu a hibridação.
Letras identificam os pacientes.
salmão defumado salmão defumado salmão defumado

Figura 8–34 Modificação direcionada de um gene
2 3 neo 4 em células ES de camundongo (Problema 8–103).
Os éxons são mostrados como caixas; o promotor
+
é identificado pela seta horizontal. O vetor de
direcionamento é totalmente homólogo ao gene,
1 2 3 4 5 exceto pela presença dos três sítios lox e do gene
Neo, todos em íntrons. A recombinase Cre, que
HOMÓLOGO pode ser introduzida por transfecção de um vetor
RECOMBINAÇÃO de expressão Cre, catalisa um evento de
recombinação específica de local entre um par
de locais lox em cerca de 20% das células
salmão defumado salmão defumado salmão defumado transfectadas.
1 2 3 neo 4 5
Cre RECOMBINASE
lox. as células Essa técnica é comumente chamada de “oxing”. Uma vez com sites
ES modificadas foram identificadas, elas podem ser expostas à recombinase Cre, que
promove a recombinação específica do local entre pares de locais lox. Uma vantagem é
que ele permite que você se livre do gene Neo e de quaisquer segmentos de DNA
bacteriano, que às vezes podem influenciar o fenótipo.
A. Que produtos possíveis você pode obter da expressão de Cre em células ES modificadas
que carregam três sítios lox, conforme indicado na Figura 8-34?
B. Quais produtos seriam um alelo nulo?
C. Quais produtos teriam um par de sites lox, mas não seriam
alelo mal?
D. Se você tivesse um camundongo que expressasse Cre sob o controle de um promotor
específico de tecido, você poderia usar o alelo na parte C (depois de colocá-lo na
linhagem germinativa de um camundongo) como um alelo condicional; isto é, aquele cujo
defeito se expressa apenas em um determinado tecido?
8–104 Os complexos de RNA guiados por CRISPR/Cas9 são uma grande promessa como auxiliares
para a engenharia genômica em plantas e animais. O sistema CRISPR é quase bom
demais para ser verdade. Você quer testar o quão específicos são os complexos de RNA
guia Cas9; isto é, se eles realmente reconhecem locais individuais no genoma, que é a
base para suas ações anunciadas. Você percebe que pode testar sua especificidade
usando o ensaio de “cortina de DNA” que desenvolveu. Você faz a cortina de DNA
amarrando moléculas individuais de DNA lambda do bacteriófago (cerca de 50.000
nucleotídeos) em uma extremidade e, em seguida, esticando-as na mesma direção por
meio da lâmina. Você incuba a cortina de DNA com uma versão altamente fluorescente
de Cas9 — carregada com o RNA guia ou livre — e visualiza a distribuição da Cas9 por
microscopia de fluorescência sensível, conforme mostrado na Figura 8–35 .
A. O DNA do fago lambda tem um único local que corresponde perfeitamente ao RNA guia.
Seu experimento suporta a existência de um único local que é reconhecido pelo complexo
Cas9-guia de RNA? Explique sua resposta.
(A)
Cas9 carregado com RNA
l2
5 ÿm
Figura 8–35 Ensaio de cortina de DNA para ligação

ao alvo por RNA guia Cas9 (Problema 8–104).
(B) (A) cortina de DNA incubada com RNA guia de
Cas9 livre de RNA
Cas9 que corresponde a um local no genoma
lambda. Pontos rosa indicam os locais onde o RNA
guia Cas9 está localizado. (B) cortinas de
5 ÿm DNA incubadas com Cas9 na ausência de RNA
guia.
B. Uma das principais preocupações ao usar o sistema CRISPR é que o RNA guia Cas9 se
ligará a outros locais relacionados ao alvo pretendido (os chamados efeitos o-target).
Existe alguma evidência de ligação o-target em seu experimento? Você acha que os
resultados seriam diferentes se você tivesse uma cortina de DNA feita a partir do
cromossomo humano 1 (cerca de 250 milhões de nucleotídeos)?
ANÁLISE MATEMÁTICA DAS FUNÇÕES DAS CÉLULAS
robustez
estocástica
DEFINIÇÕES
8–105 A capacidade dos sistemas reguladores biológicos de funcionar normalmente diante

de variações frequentes e às vezes extremas nas condições externas ou nas concentrações
ou atividades de componentes-chave.
8–106 Descreve as variações aleatórias no conteúdo de proteína do resultado de células individuais

em variações nos fenótipos celulares.
VERDADEIRO FALSO
8-107 Para julgar a importância biológica de uma interação entre a proteína A e a proteína B,
precisamos conhecer detalhes quantitativos sobre suas concentrações, anidades e
comportamentos cinéticos.
8–108 A constante de associação, Ka, é igual a 1 menos a constante de dissociação, Kd;

isto é, Ka = 1 – Kd.
8–109 A taxa de mudança na concentração de qualquer espécie molecular X é dada pelo

equilíbrio entre sua taxa de aparecimento e sua taxa de desaparecimento.
8–110 Após um aumento súbito na transcrição, uma proteína com uma taxa de degradação lenta
atingirá um novo nível de estado estacionário mais rapidamente do que uma proteína com
uma taxa de degradação rápida.
8–111 O operon Lac , que é ativado por um ativador de transcrição e desativado por um
repressor de transcrição, é um exemplo clássico de porta lógica AND NOT.
8–112 Considere os dois motivos de rede ilustrados na Figura 8–36. Ambos contêm apenas
regulação negativa por repressores e, no entanto, um é um feedback negativo
(A) (B)
ATIVANDO ATIVANDO
ENTRADA ENTRADA
GENE X GENE Y GENE X GENE Y GENE Z

Figura 8–36 Dois motivos de rede
x x E compostos por repressores transcricionais
E COM
(Problema 8–112). (A) Uma rede de dois genes.

(B) Uma rede de três genes.
ANÁLISE MATEMÁTICA DAS FUNÇÕES DAS CÉLULAS 191
(A) (B) (C) (D)

ATIVANDO ATIVANDO ATIVANDO ATIVANDO
ENTRADA ENTRADA ENTRADA ENTRADA
GENE X GENE X GENE X GENE X
x x x x
GENE Y GENE Y GENE Y GENE Y
E E E E
GENE Z GENE Z GENE Z GENE Z
COM COM COM COM
loop e o outro é um loop de feedback positivo. Qual é o negativo e qual é o Figura 8–37 Motivos de rede compostos de
ativadores e repressores de transcrição
ciclo de feedback positivo? Explique como as redes formadas por elementos
(Problema 8–113).
reguladores negativos podem diferir em seu comportamento.
8–113 Examine os motivos de rede na Figura 8–37. Decida quais são loops de
feedback negativo e quais são positivos. Explique seu raciocínio.
8–114 Imagine que uma perturbação aleatória posicione um sistema biestável

precisamente no limite entre dois estados estáveis (no ponto laranja na Figura
8–38). Como o sistema responderia?
8–115 Para o motivo de rede mostrado na Figura 8–39A, decida se o pulso de saída da
proteína X (Figura 8–39B) requer que a constante de equilíbrio para a ligação
do ativador de transcrição A (KA) seja muito maior ou muito menor que a
constante de equilíbrio para a ligação do repressor de transcrição R (KR).
(A) REPENTINO (B)

ATIVANDO
1 ENTRADA
2
A A
inativo
concentração
de
Y
33
Figura 8-403
proteínas
síntese
taxa
de
A
Problema 8-310 entrada proteína X
de ativação
ativação A R repressão repentina
genética rápida gênica lenta
concentração de X
GENE X
tempo
Figura 8–38 Perturbações de um sistema
biestável (Problema 8–114). Conforme x
mostrado pelas linhas verdes, após a
perturbação 1, o sistema retorna ao seu estado
estável original (ponto verde à esquerda) e,
após a perturbação 2, o sistema se move para Figura 8–39 Motivo de rede que gera um pulso de proteína X (Problema 8–
outro estado estável (ponto verde à direita). A 115). (A) Regulação do gene X por um ativador da transcrição (círculo verde) e um
perturbação 3 move o sistema para o limite preciso repressor da transcrição (círculo vermelho). (B) Pulso de proteína X em resposta a
entre os dois estados estáveis (ponto laranja). uma entrada de ativação.
CÁLCULOS
8–116 Considere a situação em que um regulador de transcrição (R) se liga ao promotor (pX)
para o gene X. Se a concentração de um regulador de transcrição for 100 vezes 1/
K, onde K é a constante de equilíbrio para a ligação de do regulador ao promotor,
que porcentagem dos promotores em uma população de células será ocupada? Que
porcentagem de promotores estarão ligados se [R] for igual a 1/ K? Se [R] for 100
vezes menor que 1/ K? (a equação para a fração ligada é [R:pX]/[pX T] = K[R]/(1 +
K[R]), onde [R:pX] é o complexo do regulador com o promotor e [ pX T] é a
concentração total de promotores.)
8–117 Qual é a concentração molar de uma sequência do promotor que está presente em uma
cópia por E. coli? Suponha que E. coli seja um bastão com 0,8 ÿm de diâmetro e 3
ÿm de comprimento. (a equação para o volume de um cilindro é r2h.)
8–118 Se a concentração de um repressor de transcrição é de 100 moléculas por E. coli e tem

um único sítio de ligação no genoma bacteriano, qual deve ser a constante de
equilíbrio para que o sítio de ligação esteja 99% ocupado?
8–119 O repressor Lac regula a expressão de um conjunto de genes para o metabolismo

da lactose, adjacentes ao seu sítio de ligação no cromossomo bacteriano. Na
ausência de lactose no meio, a ligação do repressor desliga os genes. Quando a
lactose é adicionada, é gerado um indutor que se liga ao repressor e o impede de
se ligar ao seu alvo de DNA, ativando assim a expressão gênica.
Dentro da E. coli existem cerca de 10 moléculas do repressor Lac (10–8 M) e 1

sítio de ligação (10–9 M) no genoma bacteriano. A constante de equilíbrio, K, para a
ligação do repressor ao seu sítio de ligação é 1013 M–1. Na presença de lactose,
quando um indutor da expressão gênica se liga ao repressor, K para a ligação do
repressor aos seus sítios de ligação ao DNA diminui para 1010 M-1.
A. Em uma população de bactérias crescendo na ausência de lactose, que fração dos

sítios de ligação você esperaria que fosse ligada pelo repressor?
B. Em bactérias crescendo na presença de lactose, que fração de sítios de ligação você
esperaria que fosse ligada pelo repressor?
C. Dadas as informações neste problema, você esperaria que o indutor
ativar a expressão gênica? Por que ou por que
D. não? O repressor Lac se liga não especificamente a qualquer sequência de DNA
com um K de cerca de 106 M-1, que é uma anidade muito baixa. Você pode sugerir
de forma qualitativa como essa ligação não específica e de baixa anidade pode
alterar os cálculos nas partes A e B e sua conclusão na parte C?
8–120 A diálise de equilíbrio fornece um método simples para determinar a constante de

equilíbrio para a ligação de um ligante (L) por uma proteína (Pr). A proteína é
confinada dentro de um saco de diálise, formado por uma membrana artificial com
poros muito pequenos para a proteína entrar, mas que o ligante bem menor pode
permear livremente. O ligante, geralmente radiomarcado, é adicionado à solução
que envolve o saco de diálise; após o equilíbrio ter sido estabelecido, a concentração
do ligante é medida em ambos os compartimentos. A concentração no compartimento
externo é a concentração do ligante livre (não ligado) e a concentração no saco de
diálise é a soma do ligado (Pr–L) mais o ligante livre. Medindo esses valores após
várias concentrações iniciais de ligantes, o valor da constante de equilíbrio pode ser
determinado. Por convenção, o equilíbrio é geralmente considerado para a reação
de dissociação (Pr–L Pr + L), ao invés da reação de associação (Pr + L Pr–L), e
assim a constante de equilíbrio neste caso é chamada de constante de dissociação ,
Kd.
É útil observar a transformação da relação de equilíbrio padrão na forma

comumente usada para analisar os dados. Em equilíbrio,
ANÁLISE MATEMÁTICA DAS FUNÇÕES DAS CÉLULAS 193
= [Pr] [L]
Kd
[Pr–L] 1,0
Dado que a concentração total de proteína, [Pr]TOT, é a soma da concentração de

proteína ligada [Pr–L] e proteína livre [Pr], podemos substituir [Pr]TOT – [Pr–L] por [ Pr] e
reorganize para dar
0,5
vinculado/
livre
[Pr]TOT[L] A B
[Pr–L] =
Kd + [L] é
uma equação para uma hipérbole retangular. Ele pode ser reorganizado para dar uma
0
forma linear, como foi feito pela primeira vez por George Scatchard em 1947 (portanto, 2 4 6
gráficos de tais dados são comumente conhecidos como gráficos de Scatchard): Limite de IPTG (× 10–7 M)
Figura 8–40 Gráfico de Scatchard dos dados

[Pr–L] = – [Pr–L] [Pr]TOT
+ de diálise de equilíbrio para a ligação do
[EU] Kd Kd IPTG ao repressor Lac (Problema 8–120).
Em concentração de proteína constante e uma variedade de concentrações de ligantes,

um gráfico de ligante ligado sobre livre ([Pr–L]/[L]) contra ligante ligado ([Pr–L]) fornece
uma linha com inclinação igual a –1/ Kd e uma interceptação x igual a [Pr]TOT, que é a
concentração total de sítios de ligação.
No início dos anos 1960, quando a natureza dos repressores geneticamente
identificados da expressão gênica bacteriana não havia sido definida, Walter Gilbert e
Benno Müller-Hill usaram diálise de equilíbrio para medir a ligação de um indutor de
expressão gênica (IPTG) à proteína repressora Lac . Eles usaram IPTG radiomarcado e
duas preparações parcialmente purificadas da proteína repressora Lac : uma de células
selvagens e outra de células mutantes nas quais a indução do operon lactose ocorreu em
concentrações mais baixas de IPTG. Assumiu-se que as células mutantes carregavam um
repressor Lac que se ligava mais firmemente ao IPTG. Seus dados são mostrados como
um gráfico de Scatchard na Figura 8–40.
A. Quais são os valores de Kd para as duas linhas mostradas na figura?

B. Qual linha corresponde ao repressor Lac de tipo selvagem e qual ao
repressor mutante (ligação IPTG mais forte)?
TRATAMENTO DE DADOS
8–121 A análise detalhada da região regulatória do operon Lac revelou uma complexidade
Figura 3-101
surpreendente. Em vez de um único sítio de ligação para o repressor Lac , como seria de
se esperar, existem três sítios denominados operadores: O1, O2 e O3, dispostos ao longo
Problema 3-26
do DNA, conforme mostrado na Figura 8-41. Para sondar as funções desses três sites,
você faz uma série de construções nas quais várias combinações de sites de operador
estão presentes. Você examina seus
92 pb 401 pb 2-mer 4-mer
1 O3 O1 O2 110 6700
2 O3 O1 90 3900
3 O1 O2 80 1400
4 O1 60 140
Figura 8-41 Repressão de
-galactosidase por regiões promotoras que
5 O3 O2 1 5 contêm diferentes combinações de sítios
de ligação do repressor Lac (Problema 8-121).
6 O3 1 2 A separação do par de bases (pb) dos
três sites do operador é mostrada. Os
números à direita referem-se ao nível de
7 O2 1 1
repressão, com números mais altos
indicando repressão mais eficaz por
8 1 1 repressores diméricos (2-mer) ou tetraméricos (4-mer).
capacidade de reprimir a expressão de -galactosidase, usando formas tetraméricas

(tipo selvagem) ou diméricas (mutantes) do repressor Lac . A forma dimérica do
repressor pode se ligar a um único operador (com a mesma anidade do tetrâmero) com
cada monômero se ligando a metade do sítio. O tetrâmero, a forma normalmente
expressa nas células, pode se ligar a dois sítios simultaneamente. Ao medir a
repressão da expressão de -galactosidase, você encontra os resultados mostrados na
Figura 8–41, com números mais altos indicando repressão mais eficaz.
A. Qual site de operador único é o mais importante para a repressão? Como pode
você diz?
B. As combinações de sítios operadores (Figura 8-41, construções 1, 2, 3 e 5) aumentam
substancialmente a repressão pelo repressor dimérico? As combinações de sítios
operadores aumentam substancialmente a repressão pelo repressor tetramérico? Se
os dois repressores se comportarem de maneira diferente, dê uma explicação para a
diferença.
C. O repressor de tipo selvagem liga-se muito fracamente ao O3 quando está sozinho
em um segmento de DNA. No entanto, se o O1 estiver incluído no mesmo segmento
de DNA, o repressor liga-se muito bem ao O3 . Como pode ser?
ESTILO MCAT
O câncer é causado por versões aberrantes de nossos próprios genes. A leucemia mielóide
crônica, por exemplo, é causada por um cromossomo híbrido - o cromossomo Filadélfia - formado
pela fusão de segmentos quebrados dos cromossomos 9 e 22. Por acaso, essa fusão liga o gene
Bcr do cromossomo 22 ao gene Abl do cromossomo 9. O gene de fusão Bcr-Abl produz uma
proteína quimérica que combina a atividade da proteína quinase de Abl com um segmento ativador
de Bcr para produzir uma proteína de fusão Bcr-Abl hiperativa que leva as células do sistema
imunológico a proliferar excessivamente .
Drogas que inibem especificamente essas quinases hiperativas estão revolucionando o

tratamento do câncer. O primeiro exemplo desse tipo de medicamento — imatinibe — foi
descoberto pela pesquisa de compostos que se ligam e inibem a proteína quinase Bcr-Abl . Ima
tinib causou rápido desaparecimento de células cancerígenas com efeitos colaterais mínimos.
Normalmente, porém, após alguns meses ou anos, o câncer retorna, desta vez em uma forma
resistente à droga. O aparecimento de cânceres resistentes a medicamentos é um grande desafio
para muitas terapias baseadas em inibidores.
8–122 Qual das seguintes técnicas serviria melhor como base para um exame de sangue rápido
e altamente sensível para detectar células cancerígenas circulantes que carregam o
gene Bcr-Abl ?
A. Sequenciamento de
DNA B. Citometria de
fluxo C. Análise de
PCR D. Western blotting
8–123 Você levanta a hipótese de que a resistência aos medicamentos é causada por mutações
no gene de fusão que bloqueia a ligação do imatinibe à proteína Bcr-Abl. Qual seria seu
primeiro passo para testar essa hipótese?
A. Amplifique o gene Bcr-Abl por PCR e sequencie-o para procurar mutações em
o gene.
B. Modifique quimicamente o imatinibe para procurar novos medicamentos que matarão o
células resistentes.
C. Determinar se as células cancerígenas resistentes carregam o Philadelphia
cromossoma.
D. Purificar a proteína Bcr-Abl de células cancerígenas resistentes e testar se ela se liga ao
imatinibe.
8–124 Para testar se o imatinibe inibe a atividade das quinases Bcr-Abl das células cancerígenas
resistentes ao imatinibe de pacientes, você precisará de muito do
ESTILO MCAT 195
Proteína Bcr-Abl. Qual seria a maneira mais rápida e direta de obter uma grande quantidade
da proteína?
A. Clone o gene Bcr -Abl de uma biblioteca de DNA genômico em um vetor de expressão e purifique
a proteína após a expressão em bactérias.
B. Crescer grandes quantidades de células cancerígenas resistentes a drogas em cultura e isolar a
proteína após eletroforese em gel de poliacrilamida SDS.
C. Crescer grandes quantidades de células cancerígenas resistentes a drogas em cultura e purificar
a proteína Bcr-Abl por cromatografia em coluna.
D. Usar PCR para amplificar o gene Bcr -Abl do cDNA, cloná-lo em um vetor de expressão,
expressar a proteína em bactérias e depois purificá-la.
8–125 Como hipótese alternativa, você considera que a resistência ao imatinibe surge de mutações fora
da região de codificação do gene Bcr -Abl que fazem com que o gene seja expresso em níveis
anormalmente altos, reduzindo assim a eficácia do imatinibe. Qual das seguintes técnicas você
usaria para testar essa hipótese mais rapidamente?
A. Análise da biblioteca de cDNA

B. Hibridização in situ C. RT-
PCR quantitativo D. Western
blotting
8–126 Se você descobrir que não há mutações na região codificadora de Bcr -Abl e que o gene não está
superexpresso, o que você faria em seguida para definir a base da resistência ao imatinibe?
A. Procure por mutações em regiões vizinhas ao gene Bcr -Abl .

B. Sequencie o DNA genômico das células resistentes ao imatinibe.
C. Use a análise genética para identificar os genes responsáveis pela resistência.
D. Usar estudos de associação do genoma para identificar genes de resistência.
A proteólise altamente regulada de proteínas citoplasmáticas desempenha um papel importante em muitos

eventos celulares. A análise bioquímica revelou a maquinaria molecular responsável pela proteólise
regulada. Estudos iniciais estabeleceram que proteínas danificadas adicionadas a lisados celulares eram
rapidamente destruídas de maneira dependente de ATP.
Posteriormente, foi demonstrado que uma pequena proteína chamada ubiquitina se ligava covalentemente
a proteínas antes de serem destruídas. A cromatografia em coluna foi usada para purificar as proteínas
que ligam a ubiquitina a outras proteínas. Esses estudos levaram à descoberta de uma via bioquímica na
qual a ubiquitina é ativada pela primeira vez por meio da formação de uma ligação tioéster de alta energia
com uma proteína chamada E1. E1 então passa a ubiquitina para outra proteína chamada E2. Finalmente,
a ubiquitina é ligada covalentemente à proteína alvo. Um complexo multiproteico chamado E3 se liga tanto
ao E2 quanto à proteína alvo, o que garante que a ubiquitina seja ligada ao alvo correto.
Os componentes da maquinaria da ubiquitina foram identificados independentemente em telas

genéticas para genes que regulam o ciclo celular. Essas triagens foram baseadas na hipótese de que
mutações em genes necessários para etapas específicas do ciclo celular deveriam causar a parada das
células antes da conclusão dessas etapas. Assim, uma mutação em um gene necessário para a segregação
cromossômica deve fazer com que as células parem na mitose antes que os cromossomos se separem.
Células de levedura mutagenizadas foram rastreadas para mutações que causam a parada das células em
pontos específicos do ciclo celular, o que levou a uma coleção de mutantes de controle da divisão celular
(Cdc) . Alguns desses mutantes - Cdc16, Cdc23 e Cdc27 - pararam na mitose antes da segregação
cromossômica.
Trabalhos subseqüentes descobriram que os produtos proteicos desses genes eram necessários para a
destruição proteolítica de proteínas específicas, o que desencadeia a segregação cromossômica.
8–127 Como um primeiro passo para a identificação de proteínas que desempenham um papel na
destruição proteolítica dependente de ATP, os extratos celulares foram passados por uma
coluna de troca iônica. A coluna de troca iônica foi então lavada com tampão e eluída com alto
teor de sal. resulta em duas frações: proteínas que se ligam à coluna (fração ligada) e proteínas
que
através da coluna (fração não ligada). Nenhuma atividade proteolítica pôde ser
detectada em nenhuma dessas frações, embora o extrato inicial tivesse atividade
robusta. O que você deve fazer a seguir?
A. Realize etapas adicionais de purificação e teste de atividade.
B. Combine as frações ligadas e não ligadas e teste a atividade.
C. Melhorar a sensibilidade do ensaio usado para detectar proteólise.
D. Use uma coluna de filtração em gel em vez de uma coluna de troca iônica.
E. Desista e vá para casa.
8–128 A análise da fração não ligada identificou a pequena proteína ubiquitina como um fator
chave. Os pesquisadores então procuraram descobrir proteínas adicionais nos
lisados celulares que funcionam com a ubiquitina na via proteolítica.
Qual das seguintes técnicas você acha que eles aplicaram?
A. Uma pesquisa
BLAST B. Cromatografia de
anidade C. Cromatografia de filtração
em gel D. Eletroforese em gel SDS
8–129 Para isolar mutantes de levedura que não conseguem atravessar o ciclo de divisão
celular, que tipo de mutação os investigadores precisaram obter?
A. Mutação condicional B.
Mutação de ganho de função C.
Mutação de perda de função D.
Mutação nula
8–130 Os mutantes Cdc16, Cdc23 e Cdc27 apresentaram fenótipos idênticos, o que

sugere que as proteínas codificadas trabalham juntas para executar funções
comuns. Os investigadores levantaram a hipótese de que eles existem em um
complexo multiproteico. Que técnica você usaria para testar essa hipótese mais
rapidamente?
A. Co-imunoprecipitação B.
Cromatografia de troca iônica C.
Ressonância magnética nuclear D.
Direção de raios X
8–131 Cdc16, Cdc23 e Cdc27 foram encontrados como componentes do complexo promotor
da anáfase (APC). A APC é um complexo E3 que tem como alvo proteínas
específicas para destruição durante a mitose. Os investigadores levantaram a
hipótese de que o APC desencadeia a segregação cromossômica destruindo uma
proteína chamada securina, que inibe a segregação cromossômica. Para testar
essa hipótese, eles prenderam células de levedura na fase G1 para sincronizar a população de células.
Ao liberar as células da parada G1 , eles puderam estudar uma população de
células passando pelo ciclo celular em sincronia. Começando com as células
sincronizadas, qual das seguintes técnicas seria mais útil para testar se a securina
é destruída proteoliticamente durante o ciclo celular?
A. Hibridação B.
Imunoprecipitação C.
Espectrometria de massa
D. Western blotting
Capítulo 9 197
CAPÍTULO
Visualizando Células 9
NESTE CAPÍTULO
OBSERVANDO AS CÉLULAS NO MICROSCÓPIO DE LUZ
TERMOS PARA APRENDER OBSERVANDO AS CÉLULAS NO
microscópio de campo claro proteína verde fluorescente (GFP) MICROSCÓPIO ÓPTICO
doutrina celular processamento de
microscópio confocal imagem indicador sensível OBSERVANDO AS CÉLULAS E
microscópio de campo ao íon microscópio MOLÉCULAS NO ELETRÔ

escuro microscópio de interferência de luz limite de MICROSCÓPIO
diferencial- resolução
contraste microscópio de microeletrodo microscópio de
fluorescência recuperação de contraste de fase
fluorescência após fotoativação superresolução
fotobranqueamento (FRAP) transferência
de energia de ressonância de fluorescência (FRET)
DEFINIÇÕES
9–1 Proteína fluorescente (de uma água-viva) amplamente utilizada como marcador para
monitorar os movimentos de proteínas em células vivas.
9–2 A separação mínima entre dois objetos em que eles aparecem distintos.
9–3 Microscópio de luz normal em que a imagem é obtida por simples transmissão de luz
através do objeto que está sendo visto.
9–4 Tratamento computadorizado de imagens obtidas por microscopia que revela informações
não imediatamente visíveis a olho nu.
9–5 Semelhante a um microscópio de luz, mas a luz que ilumina é passada por um conjunto de
filtros antes da amostra, para selecionar os comprimentos de onda que excitam o corante, e
por outro conjunto de filtros antes de atingir o olho, para selecionar apenas os comprimentos
de onda emitidos quando o corante uoresces.
9–6 Tipo de microscópio de luz que produz uma imagem clara de um determinado plano dentro
de um objeto sólido. Ele usa um feixe de laser como uma fonte pontual de iluminação e
varre o plano para produzir uma seção óptica bidimensional.
9–7 Técnica para monitorar a proximidade de duas moléculas marcadas com fluorescência (e,
portanto, sua interação) nas células.
9–8 Pedaço de tubo de vidro fino, puxado para uma ponta mais nivelada, que é usado para
injetar corrente elétrica nas células.
198 Capítulo 9: Visualizando Células
VERDADEIRO FALSO G
Decida se cada uma dessas afirmações é verdadeira ou falsa e explique por quê. F
9–9 Como a dupla hélice do DNA tem apenas 2 nm de largura – bem abaixo do limite de
E
resolução do microscópio de luz – é impossível ver cromossomos em células vivas
sem corantes especiais.
9–10 Os anticorpos monoclonais são superiores à mistura de anticorpos em antissoros padrão

criados contra a mesma proteína porque são absolutamente específicos para essa
proteína.
9–11 Moléculas enjauladas podem ser introduzidas em uma célula e então ativadas por um forte
pulso de luz laser no momento preciso e na localização celular escolhida pelo
experimentador.
9–12 As técnicas de superresolução permitem que moléculas marcadas com fluorescência sejam D
visualizadas com precisão de uma ordem de magnitude abaixo do limite de direção

clássico para resolução. C
9–13 Examine o diagrama do microscópio de luz na Figura 9–1. Identifique e rotule a ocular, o
condensador, a fonte de luz, a objetiva e a amostra. Em que dois pontos no caminho
A
da luz a imagem do espécime é ampliada?
9–14 Por que é importante manter poeira, impressões digitais e outras manchas fora do Figura 9–1 Diagrama esquemático de um
lentes de um microscópio de luz? microscópio de luz (Problema 9–13).
9–15 Quando a luz entra em um meio com densidade óptica diferente, ela se curva em uma
direção que depende dos índices de refração dos dois meios. O ar e o vidro, por
exemplo, têm índices de refração de 1,00 e 1,51, respectivamente. Quando a luz
entra no vidro - o meio com o índice de refração mais alto - ela se curva em direção a Problemas p9.01/9.01
uma linha traçada normal à superfície (Figura 9-2A).
Por outro lado, quando a luz sai do vidro para o ar, ela se afasta da linha normal
(Figura 9-2B). Usando esses princípios, desenhe as trajetórias de dois raios de luz
paralelos que passam pela lente de vidro hemisférica mostrada na Figura 9–2C. Os
dois raios irão convergir ou divergir? O resultado seria diferente se a lente de vidro
fosse inclinada de modo que a luz entrasse na superfície plana?
9–16 Os diagramas na Figura 9–3 mostram os caminhos dos raios de luz passando por
uma amostra com uma lente seca e com uma lente de imersão em óleo. Oer an
(A) normal (B) normal
vidro de ar
ar de
LENTE SECA LENTE DE IMERSÃO EM ÓLEO
vidro
(C)
ar de lentes
objetivas
vidro
ar óleo
Figura 9–2 Refração da luz nas interfaces ar- slide de lamela
vidro (Problema 9–15). (A) Um raio de luz

passando do ar para o vidro. (B) Um raio de luz
passando do vidro para o ar. (C) Dois raios de luz Figura 9–3 Caminhos dos raios de luz através de lentes secas e de imersão em óleo
paralelos entrando em uma lente de vidro. (Problema 9–16). O círculo vermelho na origem dos raios de luz é o espécime.
OBSERVANDO AS CÉLULAS NO MICROSCÓPIO DE LUZ 199
Figura 9–4 Diagrama do olho humano (Problema

íris
9–17).
humor
VITREO retina
córnea
lente
humor
aquoso
explicação de por que as lentes de imersão em óleo devem fornecer uma resolução melhor.
Ar, vidro e óleo têm índices de refração de 1,00, 1,51 e 1,51, respectivamente.
9–17 A Figura 9–4 mostra um diagrama do olho humano. Os índices de refração dos componentes
no caminho da luz são: córnea 1,38, humor aquoso 1,33, cristalino 1,41 e humor vítreo
1,38. Onde ocorre a refração principal — o foco principal? Que papel você acha que a
lente desempenha?
9–18 Por que os humanos enxergam tão mal debaixo d'água? E por que os óculos ajudam?
9–19 A leitura através de um béquer cheio de esferas de vidro transparente é impossível (Figura
9–5). Você acha que ajudaria encher o béquer com água?
Com óleo de imersão? Explique seu raciocínio.
Figura 9–5 Visualizando um gráfico de olho através
9–20 Examine as quatro fotomicrografias da mesma célula na Figura 9–6. de um béquer cheio de bolas de vidro
transparente (Problema 9–19).
Combine cada imagem com a técnica listada abaixo.
1. Microscopia de campo claro
2. Microscopia de campo Problemas p9.05/9.05
escuro 3. Microscopia de contraste de interferência diferencial Nomarski
4. Microscopia de contraste de fase
9–21 Explique a diferença entre resolução e ampliação.
9–22 Muitos corantes fluorescentes que coram o DNA requerem excitação por luz ultravioleta.
Hoechst 33342, por exemplo, liga-se ao DNA e absorve luz em 352 nm e emite em 461
nm. Se você deseja usar esse corante permeável à membrana em células vivas, precisa
se preocupar com os danos causados pela luz ultravioleta ao DNA, que absorve a luz Figura 9–6 Quatro fotomicrografias da mesma célula
no máximo em cerca de 260 nm? Por que ou por que não? (Problema 9–20).
(A) (B)
(C) (D)
50 µm
(A)
(B)
+
CH3NHN_ _ +
NH
1,5 +
filtro de
filtro de N NH
barreira H
barreira
N
H
1,0
absorção
emissão
ou
OCH2CH3
luz
fonte
0,5
divisor de feixe
absorção emissão
0 320280 360 400 440 480 520 560 600

comprimento de onda (nm)
Figura 9–7 Microscopia de fluorescência (Problema 9–24). (A) O caminho da luz através de um microscópio de uorescência. (B)
Espectros de absorção e emissão de uorescência de Hoechst 33342 ligado ao DNA. A estrutura de Hoechst 33342 é mostrada acima
dos espectros.
9–23 Por que você acha que uma molécula fluorescente, tendo absorvido um único fóton de luz em um
comprimento de onda, sempre emite um fóton em um comprimento de onda maior?
9–24 O microscópio de auorescência, que é mostrado esquematicamente na Figura 9–7A, usa dois filtros e
um espelho de divisão de feixe (dicróico) para excitar a amostra e capturar a luz fluorescente
emitida. Imagine que você deseja visualizar a uorescência de uma amostra que foi corada com
Hoechst 33342, um corante comum para DNA. Os espectros de absorção e emissão de
uorescência para Hoechst 33342 são mostrados na Figura 9–7B.
A. Qual dos seguintes filtros de barreira disponíveis comercialmente você selecionaria para colocar
entre a fonte de luz e a amostra? Qual deles você colocaria entre a amostra e a ocular?
1. Um ltro que passa comprimentos de onda entre 300 nm e 380 nm.

2. Um ltro que passa todos os comprimentos de onda acima de 420 nm.
B. Como você projetaria seu espelho divisor de feixe? Quais comprimentos de onda seriam refletidos
e quais seriam transmitidos?
9–25 Anticorpos que se ligam a proteínas específicas são ferramentas importantes para definir a localização
de moléculas nas células. A sensibilidade do anticorpo primário – o anticorpo que reage com a
molécula-alvo – é frequentemente aumentada pelo uso de anticorpos secundários marcados que
se ligam a ele. Quais são as vantagens e desvantagens de usar anticorpos secundários que
carregam marcadores fluorescentes versus aqueles que carregam enzimas ligadas?
9–26 A proteína fluorescente verde (GFP) foi isolada como um cDNA de uma espécie de medusa
que brilha em verde. Quando o cDNA para GFP foi introduzido em bactérias, as colônias
formadas brilharam em verde pálido sob luz ultravioleta. Nesses estudos iniciais, as seguintes
observações pertinentes forneceram informações importantes sobre como o GFP se torna
fluorescente.
1. Quando as bactérias são cultivadas anaerobicamente, elas expressam quantidades normais de
GFP, mas não é fluorescente.
2. A GFP desnaturada encontrada em agregados de proteínas insolúveis (corpos de inclusão)
em bactérias não é fluorescente. A taxa de
3. aparecimento de uorescência segue a cinética de primeira ordem, com um
constante de tempo independente da concentração de GFP.
Figura 9–8 Um arco-íris de cores produzido

por GFPs modificados (Problema 9–27).
4. Mutações aleatórias introduzidas no cDNA que codifica para GFP produziram algumas
proteínas com uorescência apreciavelmente mais brilhante e algumas com cores diferentes.
Comente o que cada uma dessas observações diz sobre GFP uores Problemas p9.08/9.08
cência.
9–27 A Figura 9–8 mostra uma série de GFPs modificados que emitem luz em uma variedade de
cores. Como você acha que exatamente o mesmo cromóforo pode uorescer em tantos
comprimentos de onda diferentes?
CÁLCULOS
9–28 O poder de resolução de um microscópio de luz depende da largura do cone de luz que
ilumina o espécime, do comprimento de onda da luz utilizada e do índice de refração do
meio que separa o espécime das lentes objetiva e condensadora, de acordo com a fórmula
resolução = 0,61
não sem
onde é igual ao comprimento de onda da luz usada, n é o índice de refração e é metade da

largura angular do cone de raios coletados pela lente objetiva. Considerando uma largura
angular de 120° ( = 60°), calcule as várias resoluções que você esperaria se a amostra
fosse iluminada com luz violeta ( = 0,4 ÿm) ou luz vermelha ( = 0,7 ÿm) em um meio refrativo
de ar (n = 1,00) ou óleo (n = 1,51). Qual dessas condições lhe daria a melhor resolução?
9–29 Em um determinado ângulo crítico, que depende dos índices de refração dos dois meios, a luz
do meio opticamente mais denso será curvada o suficiente para não escapar e será
refletida de volta para o meio mais denso. A fórmula que descreve a refração é
ni sin i = nt sin t
onde ni e nt são os índices de refração do meio incidente e transmissor, respectivamente,

e i e t são os ângulos incidente e transmitido, respectivamente, conforme mostrado na
Figura 9–9A. Para uma interface vidro-ar, calcule o ângulo de incidência para um raio de
luz que é dobrado de modo que fique paralelo à superfície (Figura 9-9B). Os índices de
refração do ar e do vidro são 1,00 e 1,51, respectivamente.
(A) (B)
ÿt
ÿt
nt ar Figura 9–9 Refração na interface entre
meios com diferentes índices de refração
n vidro
eu
(Problema 9–29). (A) A relação
entre ângulos incidentes e transmitidos
ÿi
ÿi
para materiais com diferentes índices de
refração tais que ni > nt. (B) O ângulo
de incidência para uma interface vidro-
ar de modo que o raio transmitido
(curvado) seja paralelo à interface.
TABELA 9–1 Propriedades de excitação de alguns fluoróforos

biológicos comuns (Problema 9–30).
Fluoróforo Máximo de Máximo de Máximo

absorção de Opea (nm)absorção Tpeb (nm) de emissão (nm)
DAPI 358 685 461
Rastreador ER 374 728 575
Mito-Tracker 579 1133 599
Alexa Fluor 488 491 985 515
FITC-IgG 490 947 525
aExcitação de um fóton; bExcitação de dois fótons.
TRATAMENTO DE DADOS
9–30 Moléculas fluorescentes podem ser excitadas por um único fóton de alta energia ou por
múltiplos fótons de baixa energia. Uma lista de uoróforos biológicos comumente
usados é fornecida na Tabela 9–1. Por que você supõe que o máximo de absorção
para a excitação de dois fótons é aproximadamente o dobro do máximo para a
excitação de um fóton?
9–31 Você deseja anexar tags fluorescentes a duas proteínas diferentes para poder segui-las
independentemente. Os espectros de excitação e emissão para proteínas
fluorescentes ciano, verde e amarelo (CFP, GFP e YFP) são mostrados na Figura
9–10. Você consegue escolher qualquer par dessas proteínas? Ou alguns pares são
melhores que outros? Explique sua resposta.
9–32 Considere um detector fluorescente projetado para relatar a localização celular de

proteínas tirosina quinases ativas. Uma proteína fluorescente azul (ciano) (CFP) e
uma proteína fluorescente amarela (YFP) foram fundidas em cada extremidade de um híbrido
EXCITAÇÃO
CFP YFPGFP
máximo
cento
por
do
EMISSÃO
CFP YFPGFP
máximo
cento
por
do
Figura 9–10 Excitação e espectros de

400 450 500 550 600 emissão para CFP, GFP e YFP
comprimento de onda (nm) (Problema 9–31).
(UM REPÓRTER (B) FRETE Figura 9-11 Proteína repórter

434 milhas náuticas fluorescente projetada para detectar a
+ fosfatase
476 milhas náuticas
1.3 fosforilação da tirosina (Problema 9-32).
CFP (A) Estrutura do domínio da proteína repórter.
Abl + ATP
Quatro domínios são indicados: CFP, YFP,
1.2 peptídeo de substrato de tirosina quinase e
peptídeo YFP/
CFP
um domínio de ligação de fosfotirosina.
substrato (B) ensaio FRET. YFP/CFP é normalizado
1.1 para 1,0 no tempo zero. O repórter foi
incubado na presença (ou ausência) de Abl
YFP omitir Abl ou ATP
e ATP pelos tempos indicados.
proteína de ligação 1,0 A seta indica o tempo de adição de uma
de fosfotirosina 0 5 10 15 20 25 30 tirosina fosfatase.
tempo (horas)
domínio de proteína. O segmento de proteína híbrida consistia em um peptídeo

substrato reconhecido pela proteína tirosina quinase Abl e um domínio de
ligação a fosfotirosina (Figura 9-11A). A estimulação do domínio CFP não
causa emissão pelo domínio YFP quando os domínios são separados. Quando
os domínios CFP e YFP são aproximados, a transferência de energia de
ressonância de uorescência (FRET) permite a excitação de CFP para estimular
a emissão por YFP. FRET
aparece experimentalmente como um aumento na razão de emissão em 526
nm versus 476 nm (YFP/CFP) quando CFP é excitado por luz de 434 nm.
A incubação da proteína repórter com a proteína tirosina quinase Abl na

presença de ATP deu um aumento na emissão de YFP/CFP (Figura 9-11B).
Na ausência de ATP ou da proteína Abl, não ocorreu FRET.
A FRET também foi eliminada pela adição de uma tirosina fosfatase (Figura
9-11B). Descreva da melhor forma possível como a proteína repórter detecta a
proteína tirosina quinase Abl ativa.
9–33 As células ativam a proteína tirosina quinase Abl em resposta ao fator de crescimento
derivado de plaquetas (PDGF). PDGF se liga ao receptor PDGF, que ativa Src,
que então ativa Abl. Não está claro onde a Abl está ativa na célula, mas uma
das consequências da estimulação do PDGF é o aparecimento de rugas na
membrana. Para investigar essa questão, a construção do repórter descrita no
Problema 9–32 foi transfectada em células, que foram então estimuladas pela
adição de PDGF. Usando microscopia de uorescência, a emissão de YFP em
resposta à excitação de CFP (FRET) foi seguida em diferentes partes da célula,
com os resultados mostrados na Figura 9–12. O que você pode inferir sobre a
distribuição celular da proteína tirosina quinase Abl ativa em resposta ao PDGF?
9–34 Você está usando um indicador cameleon para medir as concentrações

intracelulares de Ca2+. O indicador é composto por um domínio central de
calmodulina, que se converte de uma forma estendida para uma forma muito
mais compacta após a ligação do cálcio, e duas proteínas fluorescentes anking, com CFP
2.3
babados
2.2
2.1 citoplasma
YFP/
CFP
2.0
Figura 9–12 Curso de tempo de FRET
1.9
em várias partes da célula após a adição
núcleo de PDGF (Problema 9–33). O FRET foi
medido como o aumento na proporção de
1.8
emissão em 526 nm para 476 nm (YFP/
0 10 20 30 40 50 60 CFP) quando o CFP foi excitado por luz
tempo após adicionar PDGF (minutos) de 434 nm.
Tempo (milissegundos) Figura 9–13 Microscopia TIRF de células

0 300 600 900 1200 1500 que expressam clatrina–GFP (Problema 9–35).
Cada quadro neste curso de tempo representa
300 ms. A seta amarela indica um ponto que
desaparece durante o período de observação
de 1,5 seg. Pontos verdes aparecem brancos
nesta imagem.
anexado em uma extremidade e YFP anexado na outra. Você expressou esse indicador nas
células e agora deseja medir as alterações intracelulares na concentração de Ca2+ em resposta
ao processo biológico que está estudando. As instruções dizem para excitar o cameleon a 440
nm e medir a emissão a 535 nm. Como você acha que o indicador cameleon funciona?
9–35 A formação de vesículas revestidas de clatrina é iniciada pela montagem de uma estrutura
semelhante a uma cesta de clatrina na parte inferior da membrana celular, que distorce a
membrana em um poço raso. Esses poços revestidos de clatrina finalmente se comprimem
para formar vesículas revestidas de clatrina. Você quer entender como os poços são convertidos
em vesículas e projetou uma linhagem celular Problems p9.201/9.13 que expressa clatrina-GFP.
da membrana, você usa microscopia dePara focar em eventos
uorescência nainterna
de reexão superfície
total (TIRF) para
examinar a membrana celular e uma fatia fina do citosol adjacente. Você fica animado ao
descobrir que as amostras mostram muitos pontos verdes sob o microscópio e que alguns
pontos desaparecem com o tempo (Figura 9–13).
A. Por que você acha que alguns pontos permanecem inalterados, enquanto outros desaparecem?
pera?
B. Você está preocupado que os pontos verdes possam não ser montagens funcionais, mas algum
tipo de artefato. Um colega sugere que você teste se os pontos verdes realmente representam
estruturas revestidas de clatrina incubando as células com transferrina marcada com um
uoróforo vermelho. A transferrina, que transporta íons de ferro, liga-se a seus receptores na
superfície celular e é levada para dentro da célula em vesículas revestidas por clatrina. O que
você esperaria ver se realizasse esse experimento?
OBSERVANDO CÉLULAS E MOLÉCULAS NO

MICROSCÓPIO ELETRÔNICO
microscopia crioeletrônica microscopia eletrônica de

coloração negativa (EM) microscopia eletrônica de varredura (SEM) microscopia
eletrônica tomografia de reconstrução de partícula única imunomicroscopia
eletrônica de ouro
DEFINIÇÕES
9–36 Uma técnica de aumento de contraste para o microscópio eletrônico na qual um sal de metal pesado
é usado para criar uma imagem reversa ou negativa do objeto.
9–37 Tipo de microscópio que usa um feixe de elétrons para criar uma imagem.
9–38 Técnica de microscopia eletrônica na qual os objetos a serem visualizados, como macromoléculas e
vírus, são rapidamente congelados.
9–39 Tipo de microscópio eletrônico que produz uma imagem da superfície de um

objeto.
OBSERVANDO CÉLULAS E MOLÉCULAS NO MICROSCÓPIO ELETRÔNICO 205
9–40 Técnica de microscopia eletrônica na qual estruturas celulares ou moléculas de interesse são
marcadas com anticorpos marcados com partículas de ouro densas em elétrons, que aparecem
como manchas pretas na imagem.
VERDADEIRO FALSO
Decida se essa afirmação é verdadeira ou falsa e explique por quê.
9–41 A microscopia eletrônica de transmissão (TEM) e a cópia de microscopia eletrônica de varredura

(SEM) podem ser usadas para examinar uma estrutura no interior de uma seção fina; O TEM
fornece uma visão de projeção, enquanto o SEM captura elétrons espalhados pela estrutura
e oferece uma visão mais tridimensional.
9–42 Um grande desafio para os microscopistas eletrônicos desde o início foi convencer os outros de que
o que eles observaram nas micrografias realmente refletia estruturas que estavam originalmente
presentes na célula viva. Descreva uma abordagem atual para esse problema.
9–43 A técnica de coloração negativa utiliza metais pesados como o urânio para fornecer
contraste. Se os metais pesados não se ligam a estruturas biológicas definidas (o que não
acontece), como podem ajudar a tornar essas estruturas visíveis?
9–44 Os metais pesados podem ser usados para realçar as características da superfície de uma amostra.
Na técnica chamada sombreamento de metal, um metal pesado, como a platina, é evaporado
em um ângulo raso sobre a amostra, de modo a depositar um filme fino. A espessura do filme
depende das características da superfície da amostra e de sua orientação em relação à fonte
de platina. Ao estabilizar o filme de metal e eliminar o espécime original, é possível obter a
imagem da réplica de metal da amostra por microscopia eletrônica de transmissão, conforme
mostrado nas micrografias da Figura 9-14.
Às vezes é difícil distinguir saliências de depressões em tais micrografias apenas

observando o padrão de sombras, conforme ilustrado na Figura 9-14 para um conjunto de
círculos sombreados. Na Figura 9-14A, os círculos parecem saliências; no entanto, quando a
imagem é simplesmente virada de cabeça para baixo (Figura 9-14B), os círculos parecem
buracos. Esta é uma ilusão clássica. A mesma ilusão está presente no sombreamento do
metal, conforme mostrado nas Figuras 9-14C e D. Em uma micrografia, a membrana parece
estar coberta de protuberâncias, enquanto na mesma micrografia, virada de cabeça para
baixo, a membrana parece fortemente esburacada. É possível para um microscopista
eletrônico ter certeza de que uma visão está correta ou é tudo arbitrário? Explique seu
raciocínio.
(A) (B) (C) (D)
Figura 9–14 Saliências e cavidades (Problema 9–44). (A) Círculos sombreados que parecem saliências. (B) Círculos sombreados que
parecem poços. (C) Uma micrografia eletrônica orientada de modo que pareça estar coberta de protuberâncias. (D) A mesma micrografia
eletrônica orientada de modo que pareça estar coberta de depressões.
9-45 Complexos de poros nucleares, que são grandes conjuntos de mais de 30 proteínas
diferentes, medeiam a troca de macromoléculas entre o núcleo e o citoplasma. Você
isolou cuidadosamente núcleos de Dic tyostelium discoideum e os congelou em gelo
vítreo para exame por tomografia crioeletrônica. Você obtém um tomograma de um
núcleo e combina as imagens de 267 complexos de poros nucleares. Você espera que
os núcleos individuais tenham sido presos em diferentes estados de transporte porque
os núcleos isolados demonstraram ser competentes para o transporte.
Assumindo que partes da estrutura se expandem e se movem durante o processo de

transporte, como você supõe que a média de estruturas em diferentes estados afetará
sua imagem final? Você consegue pensar em uma maneira de melhorar a qualidade
da imagem que obteria desse conjunto de dados?
CÁLCULOS
9–46 O poder de resolução prático dos microscópios eletrônicos modernos é de cerca de

0,1 nm. A principal razão para esta restrição é a pequena abertura numérica (n sen ),
que é limitada por (metade da largura angular dos raios coletados na lente objetiva).
Supondo que o comprimento de onda () do elétron seja 0,004 nm e que o índice de
refração (n) seja 1,0, calcule o valor de . Como esse valor se compara com um de 60°,
que é típico para microscópios de luz?
resolução = 0,61 n
sen
TRATAMENTO DE DADOS
9–47 Você está estudando duas proteínas que acredita serem componentes de junções
comunicantes, que são estruturas em membranas que permitem que células adjacentes
troquem pequenas moléculas. Quando as células são congeladas muito rapidamente
e, em seguida, quebradas com uma lâmina de faca, as células muitas vezes se
fraturam ao longo das superfícies da membrana. Quando as células fraturadas por
congelamento são vistas no microscópio eletrônico, as junções comunicantes
aparecem claramente como áreas especializadas densamente povoadas com partículas
de membrana. Para decidir se suas proteínas são componentes de junções
comunicantes, você preparou anticorpos contra cada uma delas. A um anticorpo você
anexou partículas de ouro de 15 nm; para o outro, partículas de ouro de 10 nm. Você
prepara células liofilizadas para microscopia eletrônica e depois as incuba com seus
anticorpos marcados com ouro, com os resultados mostrados na Figura 9-15. Esses
resultados indicam que ambas as proteínas fazem parte de junções comunicantes? Por que ou por que não?
Figura 9–15 Uma micrografia eletrônica de

fratura por congelamento de uma junção
comunicante (Problema 9–47). A área central
densamente compactada contornada em branco
é a junção comunicante. As duas folhas da
membrana plasmática são indicadas como
EF (face externa) e PF (face protoplásmica).
200 milhas náuticas Partículas de ouro aparecem como pontos pretos.
OBSERVANDO CÉLULAS E MOLÉCULAS NO MICROSCÓPIO ELETRÔNICO 207
9–48 Os canais de água das aquaporinas, que se sabe estarem localizados na membrana plasmática,
desempenham um papel importante no metabolismo da água e na osmorregulação em
muitas células, incluindo células nervosas do cérebro e da medula espinhal. Para
determinar sua organização estrutural na membrana, você preparou um anticorpo
altamente específico contra a proteína AQP4, que forma os canais de água nos astrócitos
do cérebro. Você prepara uma amostra liofilizada do cérebro, incuba-a com anticorpos
marcados com ouro contra AQP4 e examina-a por microscopia eletrônica (Figura 9-16).
A. As partículas de ouro (pontos pretos) estão consistentemente associadas a qualquer par

estrutura articulada?
B. Existem exemplos de pontos pretos que não estão associados a essas estruturas? Existem
exemplos de estruturas que não possuem pontos pretos? Como suas respostas a essas
perguntas afetam sua confiança de que a estrutura que você identificou é o canal de água
da aquaporina?
ESTILO MCAT
Passagem (Questões 9–49 a 9–51)

Muitos avanços importantes na biologia celular dependiam de avanços técnicos na microscopia. Isso
foi particularmente verdadeiro no caso do citoesqueleto, a rede dinâmica de fibras citoplasmáticas
responsável pela motilidade celular e pelo movimento dos cromossomos durante a mitose. Os dois
componentes principais do citoesqueleto — lamentos de actina e microtúbulos — são montados pela
polimerização de subunidades individuais. 100 nm
Lamentos de actina e microtúbulos foram vistos pela primeira vez por microscopia eletrônica, que Figura 9–16 Micrografia de fratura por
mostrou que eles têm diâmetros de 7 nm e 25 nm, respectivamente, e podem formar polímeros muito congelamento de uma membrana de astrócitos
longos. O desenvolvimento posterior de técnicas de microscopia de luz para obter imagens de marcada com anticorpos marcados com ouro
contra AQP4 (Problema 9–48).
microtúbulos individuais e lamentos de actina em condições naturais revolucionou o campo.
9–49 Imagine que você está desenvolvendo técnicas para visualizar lamentos individuais de actina
por microscopia de luz pela primeira vez. Qual das seguintes abordagens você escolheria?
I. Reúna lamentos de actina a partir de subunidades e imagens marcadas fluorescentemente

com um microscópio de uorescência.
II. Visualize lamentos de actina usando contraste de interferência diferencial
microscopia.
III. Combine técnicas padrão de microscopia de luz com imagens digitais profissionais
cessando para melhorar a resolução dos lamentos de actina.
A. eu
B.II
C. III
D. I, II e III
9–50 Qual seria o diâmetro aparente dos lamentos de actina fotografados usando
a abordagem ou abordagens que você selecionou na pergunta anterior?
A. 7 nm
B. 50 nm
C. 100 nm
D. 200 nm
9–51 A microscopia também desempenhou um papel fundamental na resposta a questões

mecanísticas sobre como as enzimas funcionam. Considere, por exemplo, a ATP sintase,
a notável enzima multisubunidade responsável pela síntese de ATP na membrana
mitocondrial interna. A estrutura da ATP sintase revelou uma haste central rodeada por
outras subunidades que formam um anel de 10 nm de diâmetro. Foi levantada a hipótese
de que a rotação do pedúnculo em relação às subunidades do anel - alimentada pelo fluxo
de prótons através da membrana interna - gerava energia mecânica suficiente para forçar
as mudanças conformacionais necessárias para conduzir a síntese de ATP. Você gostaria
de testar esta hipótese por
visualizando diretamente a rotação da haste em relação ao anel. Qual das seguintes ideias
você acha que seria a melhor abordagem para detectar a rotação do caule?
A. Anexe um lamento de actina de 2 ÿm de comprimento montado a partir de subunidades

uorescentes ao pedúnculo e visualize sua rotação por microscopia de uorescência.
B. Anexe a proteína fluorescente verde (GFP) às proteínas no anel e use a microscopia de
fluorescência para observar a rotação do anel ao redor do pedúnculo.
C. Anexe GFP ao pedúnculo e RFP (proteína uorescente vermelha) ao anel e observe sua
rotação relativa por microscopia de uorescência.
D. Anexe múltiplos anticorpos marcados com fluorescência ao pedúnculo e, em seguida, observe
a rotação do pedúnculo por microscopia de fluorescência.
Capítulo 10 209
CAPÍTULO
Estrutura da Membrana 10
A BILAMADA LIPÍDICA NESTE CAPÍTULO
TERMOS PARA APRENDER A BILAMADA LIPÍDICA
colesterol jangada lipídica lipossoma PROTEÍNAS DE MEMBRANA

anfifílico de gota lipídica fosfoglicerídeo
gangliosídeo de bicamada fosfolipídeo
glicolipídio lipídica hidrofóbica membrana plasmática
hidrofílico
DEFINIÇÕES
Combine a definição abaixo com seu termo na lista acima.
10–1 Vesícula de bicamada fosfolipídica artificial formada a partir de uma suspensão aquosa de
moléculas de fosfolipídios.
10–2 Pequena região da membrana plasmática enriquecida em esfingolipídios e colesterol.
10–3 Qualquer glicolipídeo que possua um ou mais resíduos de ácido siálico em sua estrutura;
especialmente abundante nas membranas plasmáticas das células nervosas.
10–4 Com regiões hidrofóbicas e hidrofílicas, como em um fosfolipídeo ou uma molécula de detergente.
10–5 O principal tipo de fosfolipídio nas membranas das células animais, com dois ácidos
graxos e um grupo de cabeça polar ligado a um esqueleto de glicerol de três carbonos.
10–6 Molécula lipídica com uma estrutura esteróide característica de quatro anéis que é um
componente importante das membranas plasmáticas de células animais.
VERDADEIRO FALSO
10–7 Embora as moléculas lipídicas estejam livres para diusar no plano da bicamada, elas não podem
operar através da bicamada, a menos que catalisadores enzimáticos chamados
translocadores de fosfolipídeos estejam presentes na membrana.
10-8 Todos os fosfolipídios comuns - fosfatidilcolina, fosfatidiletanolamina, fosfatidilserina e

esfingomielina - carregam uma porção carregada positivamente em seu grupo de cabeça,
mas nenhum carrega uma carga líquida positiva.
10–9 Os glicolipídeos nunca são encontrados na face citoplasmática das membranas das células
vivas.
210 Capítulo 10: Estrutura da Membrana
Figura 10-1 Gaiola semelhante ao gelo com

HH
CH3
moléculas de água em torno de um soluto hidrofóbico
O
C H (Problema 10-10).
H H H
H
H3C _ OO
CH3 OO
H
O H
2-metil propano O
H
H
O O
d_ _
H H H H
O O
HH d+ d+ H H
água 2-metil propano em água
10–10 Solutos hidrofóbicos são ditos “forçar as moléculas de água adjacentes a se

reorganizarem em gaiolas semelhantes ao gelo” (Figura 10–1). Esta afirmação
parece paradoxal porque as moléculas de água não interagem com solutos
hidrofóbicos. Como as moléculas de água poderiam “saber” sobre a presença de
um soluto hidrofóbico e mudar seu comportamento para interagir diferentemente
umas com as outras? Discuta esse aparente paradoxo e desenvolva um conceito
claro do que significa uma gaiola “semelhante ao gelo”. Como ele se compara ao
gelo? Por que uma estrutura semelhante a uma gaiola seria energeticamente
desfavorável em relação à água pura?
10–11 Quando uma bicamada lipídica é rasgada, por que ela não se fecha formando uma
capa “hemi Problems p10.01/10.01
micelle” nas bordas, conforme mostrado na Figura 10–2?
10–12 Cinco alunos de sua classe sempre se sentam juntos na primeira fila. Isso pode ser
porque (1) eles realmente gostam um do outro ou (2) ninguém mais em sua classe
quer se sentar ao lado deles. Qual explicação vale para a montagem de uma
bicamada lipídica? Explique sua resposta. Se a bicamada lipídica fosse montada
pelo motivo oposto, como suas propriedades mudariam?
10–13 Preveja as propriedades de uma bicamada lipídica na qual todas as cadeias de

hidrocarbonetos estão saturadas. Quais seriam as propriedades se todas as
cadeias de hidrocarbonetos fossem insaturadas?
10–14 O que significa o termo “uido bidimensional”?
10–15 A margarina é feita de óleo vegetal por um processo químico. Você acha que esse
processo converte ácidos graxos saturados em insaturados ou vice-versa? Explique
sua resposta.
10–16 Qual dos fosfolipídios listados abaixo está presente em

quantidades nas membranas plasmáticas de células de mamíferos?
A. Fosfatidilcolina B.
Fosfatidiletanolamina C.
Fosfatidilinositol D.
Fosfatidilserina E.
Esfingomielina
rasgo em bicamada
selo com tampa hemi-micela
Figura 10–2 Uma bicamada lipídica rasgada selada

com uma cápsula hipotética de “hemimicela” (Problema
10–11).
A BILAMADA LIPÍDICA 211
10–17 Muitos venenos de cobra contêm enzimas que causam a lise dos glóbulos vermelhos.
Imagine que você purificou tal enzima. Ao adicionar a enzima purificada aos glóbulos vermelhos,
você descobre que, além da lise celular, é liberada colina com um grupo fosfato ligado a ela, assim
como diacilglicerol (glicerol com duas cadeias de ácidos graxos ligadas). Que molécula é clivada
pela enzima para causar a lise celular?
10–18 Preveja qual dos seguintes organismos terá a maior porcentagem de cadeias de ácidos graxos
insaturados em suas membranas. explique seu
responder.
A. Peixe antártico B.
Iguana do deserto C.
Ser humano D. Urso
polar E. Bactéria
ermofílica
10–19 Se as jangadas lipídicas se formam porque os componentes da membrana, como esfingolipídios e

moléculas de colesterol, associam-se preferencialmente uns aos outros, por que você acha que elas
se agregam em várias jangadas minúsculas em vez de em uma única grande?
10–20 As bicamadas lipídicas encontradas nas células são fluidas, porém assimétricas na composição
localização das monocamadas. Isso é um paradoxo? Explique sua resposta.
10–21 A fosfatidilserina, que normalmente está ligada à monocamada citoplasmática da bicamada lipídica da
membrana plasmática, é redistribuída para a monocamada externa durante a apoptose. Como essa
redistribuição é realizada?
CÁLCULOS
10–22 Se uma balsa lipídica tem tipicamente 70 nm de diâmetro e cada molécula lipídica tem um diâmetro de
0,5 nm, aproximadamente quantas moléculas lipídicas haveria em uma balsa lipídica composta
inteiramente de lipídeos? Em uma proporção de 50 moléculas de lipídios por molécula de proteína
(50% de proteína em massa), quantas proteínas existiriam em uma jangada típica? (Despreze a
O
perda de lipídios da jangada que seria necessária para acomodar a proteína.)
H
NH
H
H
TRATAMENTO DE DADOS
radical nitróxido
10–23 Um artigo clássico estudou o comportamento dos lipídios nas duas monocamadas de uma membrana
marcando moléculas individuais com grupos nitróxido, que são radicais livres estáveis (Figura 10–
3). Esses lipídios marcados com spin podem ser detectados por espectroscopia de ressonância de O
spin eletrônico (ESR), uma técnica que não prejudica as células vivas. Os lipídios marcados com
N H
H
H
spin são introduzidos em pequenas vesículas lipídicas, que são então fundidas com as células,
transferindo assim os lipídios marcados para a membrana plasmática.
fosfolipídio 1
Os dois fosfolipídios marcados com spin mostrados na Figura 10-3 foram incorporados em
membranas intactas de glóbulos vermelhos humanos dessa maneira. Para determinar se eles
foram introduzidos igualmente nas duas monocamadas da bicamada, ácido ascórbico (vitamina C),
que é um agente redutor solúvel em água que não atravessa as membranas, foi adicionado ao
meio para destruir quaisquer radicais nitróxido expostos na superfície. fora da célula. O sinal ESR
foi seguido em função do tempo na presença e ausência de ácido ascórbico, conforme indicado na H
fosfolipídio 2
Figura 10-4A e B.
O NH
H H
A. Ignorando por enquanto a diferença na extensão da perda do sinal de VHS, oferece uma explicação
de por que o fosfolipídio 1 (Figura 10-4A) reage mais rapidamente com o ascorbato do que o Figura 10–3 Estruturas de dois lipídios
marcados com nitróxido (Problema
fosfolipídio 2 (Figura 10-4B). Observe que o fosfolipídio 1 atinge um platô em cerca de 15 minutos,
10–23). O radical nitróxido é mostrado
enquanto o fosfolipídio 2 leva quase uma hora. na parte superior e sua posição de
ligação aos fosfolipídios é mostrada abaixo.
(A) FOSFOLIPÍDEO 1 – GLÓBULOS VERMELHOS (B) FOSFOLIPÍDEO 2 - GLÓBULOS VERMELHOS

Figura 10–4 Diminuição na intensidade do
sinal VHS em função do tempo em hemácias e
O
fantasmas de hemácias na presença e ausência

H
NH
H
H
O NH
H
de ascorbato (Problema 10–23).
H H
- ascorbato (A e B) Fosfolipídio 1 e fosfolipídio 2
100 100 em hemácias. (C e D)
Fosfolipídio 1 e fosfolipídio 2 em fantasmas de
intensidade
sinal
(%)
do
75 75 glóbulos vermelhos.
ÿ ascorbato
+ ascorbato
50 50
25 25
+ ascorbato
0 0
0 10 20 30 0 1 2 3
(C) FOSFOLIPÍDEO 1 – FANTASMAS (D) FOSFOLIPÍDEO 2 – FANTASMAS
ÿ ascorbato ÿ ascorbato
100 100
intensidade
sinal
(%)
do
75 75
+ ascorbato + ascorbato
50 50
25 25
0 0
0 10 20 30 0 1 2 3
tempo (minutos) tempo (horas)
B. Para investigar a diferença na extensão da perda do sinal ESR com os dois

fosfolipídios, os experimentos foram repetidos usando fantasmas de hemácias que
foram selados novamente para torná-los impermeáveis ao ascorbato (Figura
10-4C e D). Fantasmas de glóbulos vermelhos selados não possuem todo o seu
citoplasma, mas têm uma membrana plasmática intacta. Nestas experiências, a
perda de sinal ESR para ambos os fosfolípidos foi insignificante na ausência de
ascorbato e atingiu um patamar de 50% na presença de ascorbato. O que você
acha que pode explicar a diferença na extensão da perda do sinal VHS em
experimentos com fantasmas de hemácias (Figura 10-4C e D) versus aqueles
com hemácias normais (Figura 10-4A e B).
C. Os fosfolipídios marcados com spin foram introduzidos igualmente nos dois
monocamadas da membrana da hemácia?
10–24 A transferência de energia de ressonância de fluorescência (FRET) tem sido usada

para investigar a existência de jangadas lipídicas em células vivas. Para testar a
presença de jangadas lipídicas por FRET, você usa duas linhagens celulares
diferentes: uma que expressa o Problema A10-08 uma forma ancorada ao
glicosilfosfatidilinositol (GPI) do receptor de folato e outra que expressa a forma
ancorada transmembrana. Os receptores de folato podem ser tornados
fluorescentes pela adição de um análogo de folato fluorescente. Células marcadas
desta forma mostram variação na intensidade de uorescência sobre sua superfície
devido a variações casuais na densidade de receptores marcados. Isso permite
que diferentes densidades de receptores sejam analisadas pelo exame de
diferentes locais na mesma célula. A proximidade dos receptores marcados pode
ser determinada pelo FRET, que depende da distância entre os receptores. A
proporção de FRET para fluorescência direta fornece expectativas diferentes
para receptores dispersos versus receptores agrupados, conforme ilustrado na Figura 10-5.
A. Explique a base para a diferença entre os gráficos dessas expectativas
ções.
A BILAMADA LIPÍDICA 213
(A) DISTRIBUIÇÃO ALEATÓRIA
alta densidade densidade baixa
densidade
FRET/total
(B) DISTRIBUIÇÃO NÃO ALEATÓRIA
alta densidade densidade baixa
densidade
FRET/total
Figura 10-5 Expectativas de FRET entre receptores de folato marcados em diferentes densidades
de receptores (Problema 10-24). (A) Receptores distribuídos aleatoriamente. Os pontos
vermelhos na caixa representam receptores fluorescentes. (B) Receptores agrupados em
microdomínios. Os círculos representam microdomínios, como jangadas lipídicas. Os pontos
vermelhos representam receptores fluorescentes.
B. reaisProblemas
expectativas mostradas
experimentos p10.06/10.05
transmembrana
mostraram
na Figura
que10-5A,
os
seguiram Os
receptores
enquanto
as deos
folato
receptores
ancorados
de folato
ancorados por GPI seguiram os da Figura 10-5B. Esses experimentos fornecem
evidências da existência de jangadas lipídicas na membrana plasmática? Por
10–25 A distribuição assimétrica de fosfolipídios nas duas monocamadas da

membrana plasmática implica que ocorre muito pouco ip-op espontâneo ou,
alternativamente, que qualquer ip-op espontâneo é rapidamente corrigido por
translocadores de fosfolipídios que retornam os fosfolipídios à sua monocamada
apropriada. A taxa de ip-op de fosfolipídios na membrana plasmática de glóbulos
vermelhos intactos foi medida para decidir entre essas alternativas.
Uma medição experimental usou os mesmos dois fosfolipídios marcados com

spin descritos no Problema 10-23 (veja a Figura 10-3). Para medir a taxa de ip-
op da monocamada citoplasmática para a monocamada externa, células
vermelhas com fosfolipídios marcados com spin exclusivamente na monocamada
citoplasmática foram incubadas várias vezes na presença de ascorbato e a perda
do sinal ESR foi acompanhada. Para medir a taxa de ip-op da monocamada
externa para a citoplasmática, células vermelhas com fosfolipídios marcados com
spin exclusivamente na monocamada externa foram incubadas várias vezes na
fora
ausência de ascorbato e a perda do sinal ESR foi seguida. Os resultados desses 100
experimentos são ilustrados na Figura 10-6.
A. A partir dos resultados da Figura 10–6, estime a taxa de ip-op da citoplasmática dentro
50
para a monocamada externa e da externa para a monocamada citoplasmática.
Uma maneira conveniente de expressar essas taxas é como o tempo médio de intensidade
sinal
(%)
do
ip-op - ou seja, o tempo que leva para metade dos fosfolipídios ir de uma
monocamada para a outra.
B. A partir do que você aprendeu sobre o comportamento dos dois fosfolipídios
10
marcados com spin no Problema 10–23, deduza qual foi usado para rotular a 0 1 2 3 4 5 tempo (horas) 6 7
monocamada citoplasmática dos glóbulos vermelhos intactos e qual foi usado

para rotular a monocamada externa . Figura 10-6 Diminuição na intensidade do
sinal VHS de hemácias contendo fosfolipídios
C. Usando as informações deste problema, proponha um método para gerar
marcados com spin na monocamada externa
hemácias intactas que contenham fosfolipídios marcados com spin exclusivamente (externa) e monocamada citoplasmática
na monocamada citoplasmática e um método para gerar células marcadas com (interna) da membrana plasmática
spin exclusivamente na monocamada externa. (Problema 10-25).
PROTEÍNAS DE MEMBRANA
bacteriorodopsina proteína associada à membrana

camada de carboidratos proteína de curvatura da membrana
proteína de membrana
detergente proteína transmembrana de passagem
do córtex glicosilfosfatidilinositol única proteína transmembrana de passagem
(GPI) ancorar única
lúmen espectrina proteína transmembrana
de lectina
DEFINIÇÕES
10–26 Proteína que se liga firmemente a um açúcar específico.
10–27 O revestimento externo de uma célula eucariótica, composto por oligossacarídeos

ligados a glicoproteínas e glicolipídios intrínsecos da membrana plasmática, bem como
proteínas que foram secretadas e reabsorvidas na superfície celular.
10–28 Proteína abundante associada ao lado citosólico da membrana plasmática nas hemácias,
formando uma rede rígida que sustenta a membrana.
10–29 Proteína cuja cadeia polipeptídica atravessa a bicamada lipídica mais de

uma vez.
10–30 Proteína pigmentada encontrada na membrana plasmática do Halobacterium halobium,

onde bombeia prótons para fora da célula em resposta à luz.
10–31 A complicada rede do citoesqueleto no citosol logo abaixo da membrana plasmática.
10–32 Tipo de ligação lipídica, formada quando as proteínas passam pelo retículo endoplasmático,
por meio da qual algumas proteínas se ligam à superfície não citosólica da membrana.
VERDADEIRO FALSO
10–33 Enquanto todos os carboidratos na membrana plasmática estão voltados para fora na
superfície externa da célula, todos os carboidratos nas membranas internas estão
voltados para o citosol.
10–34 Os glóbulos vermelhos humanos não contêm membranas internas além da

membrana nuclear.
10–35 Embora os domínios de membrana com diferentes composições de proteínas sejam bem
conhecidos, não há, no momento, exemplos de domínios de membrana que diferem na
composição lipídica.
10–36 Qual dos arranjos de proteínas associadas à membrana indicada

na Figura 10-7 foram encontrados em membranas biológicas?
10–37 Qual das seguintes afirmações descreve corretamente a razão de massa

de lipídios a proteínas nas membranas?
PROTEÍNAS DE MEMBRANA 215
3 6
NH2
COOH
P P
bicamada lipídica
CITOSOL
COOH
1 2 5 8
Figura 10-7 Uma variedade de

4 possíveis associações de proteínas com uma
membrana (Problema 10-36).
A. A massa de lipídios excede em muito a massa de proteínas.

B. A massa de proteínas excede em muito a massa de lipídios. As
C. massas de lipídios e proteínas são aproximadamente iguais.
D. A proporção de massa de lipídios para proteínas varia amplamente em diferentes membranas.
10–38 Cite os três tipos gerais de âncoras lipídicas usadas para fixar proteínas às
membranas.
10–39 Proteínas monoméricas transmembrana de passagem única abrangem uma
membrana com uma única hélice que possui propriedades químicas características
na região da bicamada. Qual das três sequências de 20 aminoácidos listadas
abaixo é a candidata mais provável para tal segmento transmembranar? Explique
os motivos de sua escolha. (Consulte a Tabela 8, página 966, para o código de
aminoácidos de uma letra; FAMILY VW é um mnemônico conveniente para
aminoácidos hidrofóbicos.)
A. ITLIYFGVMAGVIGTILLIS
B. ITPIYFGPMAGVIGTPLLIS C. ITEIYFGRMAGVIGTDLLIS
10–40 Considere um complexo proteico transmembranar que forma um poro hidrofílico

através da membrana plasmática de uma célula eucariótica. O poro é feito de
cinco subunidades de proteínas semelhantes, cada uma das quais contribui
com uma hélice que abrange a membrana para formar o poro. Cada hélice CH3
CH3 C
possui cadeias laterais de aminoácidos hidrofílicos em um lado da hélice e CH3
cadeias laterais de aminoácidos hidrofóbicos no lado oposto. Proponha um CH2

CH3
possível arranjo dessas cinco hélices na membrana. CH3 C CH3
CH2
H H
CH2
10–41 Por que os segmentos de proteínas transmembranas são quase sempre hélices CH2
ou barris, mas nunca cadeias desordenadas? CH2 H H
CH2 O
10–42 Você está estudando a ligação de proteínas à face citoplasmática de células de CH2 CH2
neuroblastoma cultivadas e encontrou um método que fornece um bom CH2 CH2
rendimento de vesículas de dentro para fora da membrana plasmática. CH2 O
Infelizmente, suas preparações estão contaminadas com quantidades variáveis CH2 CH2
CH2 CH2
de vesículas do lado direito. Nada do que você tentou evita esse problema. Um
CH2 O
amigo sugere que você passe suas vesículas sobre uma coluna de anidade feita O
9–10
CH2
de lectina acoplada a contas sólidas. Qual é o objetivo da sugestão do seu amigo? OS O CH2
O– Na+ OH
10–43 Detergentes são pequenas moléculas anfifílicas – uma extremidade hidrofóbica e a
outra hidrofílica – que tendem a formar micelas em água. Examine as estruturas
do dodecil sulfato de sódio (SDS) e do Triton X-100 na Figura 10-8 e explique sódio (Na+) Triton X-100
dodecil
por que as porções pretas são hidrofílicas e as seções azuis são hidrofóbicas. sulfato (SDS)
Figura 10–8 As estruturas de SDS e Triton

10–44 Por que a membrana das hemácias precisa de proteínas? X-100 (Problema 10–43).
(A) (B) (C) (D)

CITOSOL
EXTRACELULAR
ESPAÇO
saliência
10–45 A glicoforina, uma proteína na membrana plasmática da hemácia, normalmente existe como Figura 10–9 Curvatura da membrana
plasmática por proteínas citosólicas (Problema 10–
um homodímero que é mantido unido inteiramente por interações entre seus domínios
47). (A) Inserção de uma proteína “nger” na folha
transmembranares. Uma vez que os domínios transmembrana são hidrofóbicos, como é
citosólica da membrana.
que eles podem se associar uns aos outros de forma tão específica? (B) Ligação de lipídios à superfície curva
de uma proteína de ligação à membrana.
(C) Ligação de proteínas de membrana a
10–46 Descreva os diferentes métodos que as células usam para restringir as proteínas a regiões lipídios de membrana com grandes grupos de cabeça.
específicas da membrana plasmática. Uma membrana (D) Um segmento da membrana plasmática
ainda écom muitas proteínas ancoradas
fluida?
mostrando uma saliência.
10–47 Os três mecanismos pelos quais as proteínas de ligação à membrana dobram uma
membrana são ilustrados na Figura 10-9A-C. Conforme mostrado, cada uma dessas
proteínas de curvatura da membrana citosólica induziria uma invaginação da membrana
plasmática. Poderiam tipos semelhantes de proteínas citosólicas induzir uma protrusão da
membrana plasmática (Figura 10-9D)? Quais?
Explique como eles podem funcionar.
CÁLCULOS
10-48 Na membrana de um glóbulo vermelho humano, a proporção da massa de proteína (peso

molecular médio de 50.000) para fosfolipídio (peso molecular médio de 800) e colesterol
(peso molecular de 386) é de cerca de 2:1:1 .
Quantas moléculas lipídicas (fosfolipídeos + colesterol) existem para cada molécula de
proteína?
10-49 As estimativas do número de proteínas associadas à membrana por célula e a fração da

membrana plasmática ocupada por tais proteínas fornecem uma base quantitativa útil para
a compreensão da estrutura da membrana plasmática. Esses cálculos são diretos para
proteínas na membrana plasmática de uma hemácia porque as hemácias são facilmente
isoladas do sangue e não contêm membranas internas para confundir a questão. As
membranas plasmáticas são preparadas, as proteínas associadas à membrana são
separadas por eletroforese em gel de poliacrilamida SDS e, em seguida, são coradas com
um corante (Coomassie Blue). Como a intensidade da cor é aproximadamente proporcional
à massa de proteína presente em uma banda, estimativas quantitativas podem ser feitas
conforme mostrado na Tabela 10-1.
A. A partir das informações da Tabela 10–1, calcule o número de moléculas de espectrina,

trocador de ânions (AE1) e glicoforina em uma hemácia individual. Suponha que 1 mL de
fantasmas de hemácias contenha 1010 células e 5 mg de proteína total de membrana.
TABELA 10–1 Proporção de coloração associada a três proteínas associadas à membrana

(Problema 10–49).
Proteína Peso molecular Porcentagem de mancha
Espectrina 250.000 25
AE1 100.000 30
Glicoforina 30.000 2.3

PROTEÍNAS DE MEMBRANA 217
Figura 10–10 Diagrama esquemático de AE1,

representado como um cilindro, na membrana
plasmática (Problema 10–49). AE1 foi
originalmente identificada como uma banda
proeminente (“banda 3”) depois que as proteínas
bicamada lipídica de membrana dos fantasmas de hemácias foram
separadas por eletroforese em gel de poliacrilamida
SDS; é muitas vezes referido como banda 3 na
literatura.
6 nm
AE1
B. Calcule a fração da membrana plasmática ocupada por AE1.

Suponha que AE1 seja um cilindro de 3 nm de raio e 10 nm de altura e esteja orientado
na membrana conforme mostrado na Figura 10-10. A área total da superfície de uma
hemácia é de 108 nm2.
TRATAMENTO DE DADOS
10–50 Observe cuidadosamente o trocador de ânions transmembrana (AE1) na Figura 10–11A.

Imagine que você poderia marcar todas as proteínas AE1 especificamente com um
grupo uorescente e medir sua mobilidade pela recuperação de uorescência após
fotobranqueamento (FRAP). Você fotobranqueia um pequeno ponto na membrana e
então mede o aumento na uorescência naquele ponto à medida que moléculas
fluorescentes de AE1 se difundem para ele a partir de regiões vizinhas da membrana.
Esboce a curva de recuperação que você esperaria ver com o tempo (Figura 10-11B).
LINKS MÉDICOS
10–51 Pitágoras proibiu seus seguidores de comer favas. Para além das implicações políticas (os
gregos votavam com feijão), acaba por haver uma base racional para esta proibição. Na
população do Oriente Médio, formas defeituosas do gene que codifica a glicose 6-fosfato
desidrogenase (G6PD) são comuns. Essas formas mutantes do gene normalmente (A)
AE1
reduzem a atividade de G6PD para cerca de 10% do normal. Eles foram selecionados
no Oriente Médio e em outras áreas do mundo onde a malária é comum, porque
oferecem proteção contra o parasita da malária. G6PD controla o primeiro passo na via
para a produção de NADPH. Um nível abaixo do normal de NADPH nos glóbulos
vermelhos cria um ambiente desfavorável para o crescimento do protista Plasmodium
falciparum, que causa a malária.
AE1 100 nm
Embora um tanto protegidos contra a malária, os indivíduos deficientes em G6PD

ocasionalmente apresentam outros problemas. O NADPH é o principal agente necessário (B)
para manter o citosol das hemácias em um estado adequadamente reduzido,
ÁGUA SANITÁRIA
convertendo constantemente ligações dissulfeto transitórias (–S–S–) de volta a sulfidrilas
(–SH HS–). Quando um indivíduo deficiente em G6PD come favas cruas ou mal cozidas,
uma substância oxidante no feijão supera a capacidade redutora dos glóbulos
? RECUPERAÇÃO
vermelhos, levando a uma anemia hemolítica grave - às vezes com risco de vida. Como fluorescência
você acha que comer favas leva à anemia?
ESTILO MCAT tempo
Passagem 1 (Questões 10–52 a 10–56) Figura 10-11 Mobilidade das proteínas de

membrana (Problema 10-50). (A) Modelo de
O colesterol é transportado na corrente sanguínea em partículas de lipoproteínas. Existem várias
membrana de glóbulos vermelhos. (B) Recuperação
classes de partículas de lipoproteínas, mas uma das classes mais importantes é chamada de da uorescência após fotobranqueamento de uma
partículas de lipoproteínas de baixa densidade (LDL). As partículas de LDL são compostas por membrana plasmática de glóbulos vermelhos
uma única molécula de uma grande proteína chamada apolipoproteína, além de milhares de contendo a proteína AE1 marcada com um grupo uorescente.
moléculas de colesterol e fosfolipídios. Parte da apolipoproteína forma a superfície da partícula e se volta

para a fase aquosa, enquanto outras partes se voltam para o interior hidrofóbico da partícula onde interagem
com o colesterol e as caudas hidrofóbicas dos fosfolipídios. Quando as células precisam de colesterol
adicional, elas produzem uma proteína receptora na superfície de sua membrana plasmática que se liga à
apolipoproteína e inicia a absorção de partículas de LDL na célula por meio de um processo chamado
endocitose.
10–52 Qual é a razão mais provável pela qual as partículas de LDL são usadas para transportar o colesterol
na corrente sanguínea?
A. O colesterol nas partículas de LDL se insere facilmente nas bicamadas lipídicas.
B. O colesterol é amplamente insolúvel em soluções aquosas.
C. O colesterol é sintetizado nas partículas de LDL.
D. As partículas de LDL podem formar jangadas lipídicas na bicamada lipídica.
10–53 O que melhor descreve a classe de proteína à qual pertence a apolipoproteína?

A. Proteínas anfifílicas B.
Receptores de superfície celular
C. Proteínas associadas à membrana D.
Proteínas transmembrana multipassagem
10–54 Qual é a localização mais provável dos fosfolipídios nas partículas de LDL?
A. Ligado a domínios hidrofílicos da apolipoproteína B. Na bicamada
lipídica que envolve as partículas de LDL C. Na superfície,
interagindo com o ambiente aquoso D. Dentro do núcleo hidrofóbico da partícula
10–55 Que tipo de molécula na superfície de uma célula seria mais provável
servir como um receptor para partículas de LDL?
A. Uma proteína de ligação ao colesterol B.
Um glicolípido C.
Um fosfolípido D. Uma
proteína transmembranar
10–56 Quais condições provavelmente desencadeariam aumento da captação de partículas de LDL pelas
células?
A. Aumento da síntese de glicolipídios B.
Aumento do crescimento da membrana plasmática
C. Aumento da secreção de proteínas D.
Aumento da síntese de proteínas
Capítulo 11 219
Transporte por Membrana de Pequenos

CAPÍTULO
Moléculas e Eletricidade
Propriedades das Membranas 11
NESTE CAPÍTULO
PRINCÍPIOS DE TRANSPORTE DE MEMBRANA
TERMOS PARA APRENDER PRINCÍPIOS DA MEMBRANA
gradiente transporte de membrana proteína TRANSPORTE

de transporte passivo
TRANSPORTADORES E ATIVOS
eletroquímico do canal de transporte ativo transportador
MEMBRANA DE TRANSPORTE
DEFINIÇÕES CANAIS E OS
Combine cada definição abaixo com seu termo na lista acima. PROPRIEDADES ELÉTRICAS DE
MEMBRANAS
11–1 Um poro aquoso em uma membrana lipídica, com paredes feitas de proteína, através do qual
podem passar íons ou moléculas selecionadas.
11–2 movimento de uma pequena molécula ou íon através de uma membrana devido a uma
diferença de concentração ou carga elétrica.
11–3 Termo geral para uma proteína incorporada à membrana que serve como transportadora
de íons ou pequenas moléculas de um lado da membrana para o outro.
11–4 Movimento de uma molécula através de uma membrana que é impulsionado pela hidrólise de
ATP ou outra forma de energia metabólica.
11–5 Força motriz para o movimento de íons devido a diferenças na concentração de íons e carga
elétrica em ambos os lados da membrana.
VERDADEIRO FALSO
11–6 A membrana plasmática é altamente impermeável a todas as moléculas carregadas.
11–7 O transporte por transportadores pode ser ativo ou passivo, enquanto trans
porta por canais é sempre passiva.
11–8 Ordene as moléculas na lista a seguir de acordo com sua capacidade de se difundir através de
uma bicamada lipídica, começando com aquela que atravessa a bicamada mais
prontamente. Explique seu pedido.
1. Ca2+
2. CO2 3.
Etanol 4.
Glicose 5. RNA
6. H2O
11–9 Por que as taxas máximas de transporte por transportadores e canais são consideradas tão
diferentes?
220 Capítulo 11: Transporte de Pequenas Moléculas por Membrana e as Propriedades Elétricas de Membranas
11–10 Uma reação enzimática simples pode ser representada pela equação
E + S ES E + P
onde E é a enzima, S é o substrato, P é o produto e ES é o complexo enzima-substrato.
A. Escreva uma equação correspondente descrevendo um transportador (T) que medeia o

transporte de um soluto (S) a favor de seu gradiente de concentração.
B. A equação de Michaelis-Menten para a reação enzimática simples acima é
[S]
taxa = Vmáx
[S] + Km
onde “taxa” é a taxa inicial da reação, Vmax é a taxa máxima da reação catalisada por
enzima, [S] é a concentração do substrato e Km é a constante de Michaelis. Escreva a
equação de Michaelis-Menten correspondente para o processo de transporte de soluto por
um transportador.
O que taxa, Vmax e Km significam na equação para transporte?
C. Essas equações forneceriam uma descrição apropriada para os canais?
Por que ou por que não?
11–11 Suponha que uma membrana contenha um único transportador passivo com um Km de 0,1 mM
para seu soluto. Quão eficiente seria o transportador em igualar as concentrações de soluto
através da membrana se as concentrações iniciais fossem 0,01 mM no interior e 0,05 mM no
exterior? E se as concentrações fossem 100 mM dentro e 500 mM fora?
11–12 Como é possível que algumas moléculas estejam em equilíbrio através de uma membrana
biológica e ainda não estejam na mesma concentração em ambos os lados?
CÁLCULOS
11–13 As células cerebrais, que dependem da glicose para obter energia, usam o transportador de
glicose GLUT3, que tem um Km de 1,5 mM. As células hepáticas, que armazenam glicose
(na forma de glicogênio) após uma refeição e liberam glicose entre as refeições, usam o
transportador de glicose GLUT2, que tem um Km de 15 mM.
A. Calcule a taxa (como uma porcentagem de Vmax) de absorção de glicose nas células cerebrais
e nas células do fígado em concentrações circulantes de glicose de 3 mM (condições de
fome), 5 mM (níveis normais) e 7 mM (após uma ingestão de carboidratos -refeição rica).
Rearranjando a equação de Michaelis-Menten dá
avaliar [S]
=
Vmáx [S] + Km
B. Embora a concentração de glicose na circulação geral normalmente não suba muito acima de
7 mM, o fígado é exposto a concentrações muito mais altas após uma refeição. O intestino
entrega glicose na circulação portal, que vai diretamente para o fígado. Na circulação portal,
a concentração de glicose pode chegar a 15 mM. Em que fração da taxa máxima (Vmax) as
células hepáticas importam glicose nessa concentração?
C. Faça esses cálculos com as funções fisiológicas do cérebro e

células do fígado? Por que ou por que não?
11–14 As células usam transportadores para mover quase todos os metabólitos através das membranas.
Mas quanto mais rápido é um transportador do que a simples difusão? Há informações
suficientes disponíveis para os transportadores de glicose para fazer uma comparação. A
concentração circulante normal de glicose em humanos é de 5 mM, enquanto a concentração
intracelular é geralmente muito baixa. (Para este problema, suponha que a concentração
interna de glicose seja 0 mM.)
A. A que taxa (moléculas/s) a glicose se difundiria em uma célula se não houvesse transportador?
O coeficiente de permeabilidade da glicose é
PRINCÍPIOS DE TRANSPORTE DE MEMBRANA 221
3 × 10–8 cm/seg. Suponha que uma célula é uma esfera com um diâmetro de
20 ÿm. A taxa de difusão é igual à diferença de concentração multiplicada pelo
coeficiente de permeabilidade e pela área de superfície total da célula (área de
superfície = 4r2). (Lembre-se de converter tudo em unidades compatíveis para
que a taxa seja moléculas/seg.)
B. Se na mesma célula houver 105 moléculas de GLUT3 (Km = 1,5 mM) na
membrana plasmática, cada uma das quais pode transportar glicose a uma taxa
máxima de 104 moléculas por segundo, a que taxa (moléculas/s) a glicose entrar
na cela? Quão mais rápida é a captação de glicose mediada por transportador
do que a entrada por simples difusão?
TRATAMENTO DE DADOS
11–15 A citocalasina B, que é frequentemente usada como um inibidor de sistemas de

motilidade baseados em actina, também é um inibidor competitivo muito potente
da captação de d-glicose em células de mamíferos. Quando fantasmas de
glóbulos vermelhos (glóbulos vermelhos, esvaziados de seu citoplasma) são
incubados com 3H-citocalasina B e então irradiados com luz ultravioleta, a
citocalasina torna-se reticulada com o transportador de glicose, GLUT1. A
citocalasina não é reticulada com o transportador se um excesso de d-glicose
estiver presente durante a reação de rotulagem; entretanto, um excesso de L-
glicose (que não é transportada) não interfere na marcação. Por que um excesso
de d-glicose, mas não de L-glicose, impede a ligação cruzada da citocalasina com o GLUT1?
11–16 A insulina é um pequeno hormônio protéico que se liga a receptores nas membranas
plasmáticas de muitas células. Nas células adiposas, essa ligação aumenta
drasticamente a taxa de absorção de glicose nas células. O aumento ocorre em
minutos e não é bloqueado por inibidores da síntese protéica ou da glicosilação.
Esses resultados sugerem que a insulina aumenta a atividade do transportador
de glicose, GLUT4, na membrana plasmática, sem aumentar o número total de
moléculas de GLUT4 na célula. Os dois experimentos
descritos a seguir sugerem um possível mecanismo para esse efeito da
insulina. No primeiro experimento, foi medida a taxa inicial de absorção de
glicose em células de controle e tratadas com insulina, com os resultados
mostrados na Figura 11-1. No segundo experimento, a concentração de GLUT4
em membranas fracionadas de células de controle e tratadas com insulina foi
medida, usando a ligação da citocalasina B radioativa como ensaio (consulte o
Problema 11–15), conforme mostrado na Tabela 11–1 .
A. Deduza o mecanismo pelo qual o transporte de glicose através do GLUT4
aumenta em células tratadas com insulina.
B. A estimulação com insulina altera o Km ou o Vmáx do GLUT4? Como você pode
dizer a partir desses dados?
30
+ insulina
TABELA 11–1 Quantidade de GLUT4 associada à membrana plasmática e às membranas 20

internas na presença e ausência de insulina (Problema 11–16). arbitrárias)
(unidades
captação
glicose
taxa
de
10
3H-citocalasina B ligada (cpm/mg de proteína) – insulina
Células não tratadas Células tratadas

0
fração de membrana (– insulina) (+ insulina) 0 10 20
glicose (mM)
Membrana de plasma 890 4480
Figura 11-1 Taxa de captação de glicose
Membranas internas 4070 80 nas células na presença e ausência de
insulina (Problema 11-16).
TRANSPORTADORES E MEMBRANA ATIVA

TRANSPORTE
ABC transportador Bomba tipo P

antiportador simportador
Ca2+-bomba (Ca2+ ATPase) transporte transcelular
proteína de resistência a múltiplas drogas (MDR) uniportador
Bomba de Na+-K+ (Na+-K+ ATPase) bomba tipo V
DEFINIÇÕES
11–17 Grande superfamília de proteínas de transporte de membrana que usam a energia da

hidrólise de ATP para transferir peptídeos e uma variedade de pequenas moléculas
através das membranas.
11–18 Tipo de proteína transportadora ABC que pode bombear drogas hidrofóbicas (como
algumas drogas anticancerígenas) para fora do citoplasma de células eucarióticas.
11-19 Proteína transportadora de membrana que transporta dois íons diferentes ou pequenas
moléculas através de uma membrana em direções opostas, simultaneamente ou
em sequência.
11–20 Transporte de solutos através de um epitélio, por meio de membrana trans

proteínas porta nas superfícies apicais e basais das células epiteliais.
11–21 Proteína transportadora que transporta dois tipos de soluto através da membrana na
mesma direção.
VERDADEIRO FALSO
11–22 Um simportador funcionaria como um antiportador se sua orientação na membrana

fosse invertida; isto é, se a porção da proteína normalmente exposta ao citosol
estivesse voltada para o lado de fora da célula.
11–23 O cotransporte de Na+ e um soluto para uma célula, que aproveita o

energia no gradiente de Na+, é um exemplo de transporte ativo primário.
11–24 Em resposta à despolarização da membrana plasmática da célula muscular, as bombas

de Ca2+ no retículo sarcoplasmático (RS) usam a energia da hidrólise do ATP para
mover o Ca2+ do lúmen do RS para o citosol para iniciar a contração muscular.
11–25 Qual dos íons listados na Tabela 11–2 poderia ser usado para conduzir um transporte
acoplado eletricamente neutro de um soluto através da membrana plasmática?
Indique a direção do movimento dos íons listados (para dentro ou para fora) e indique
que tipo de íon seria co-transportado para preservar a neutralidade elétrica.
Incidentalmente, há uma flagrante deficiência intracelular de ânions em relação

aos cátions na Tabela 11-2, mas as células são eletricamente neutras. Quais ânions
você acha que estão faltando nesta tabela?
11–26 Uma proteína transmembranar tem as seguintes propriedades: tem dois sítios de
ligação, um para o soluto A e outro para o soluto B. A proteína pode sofrer uma
alteração conformacional para alternar entre dois estados: ambos os sítios de ligação
são expostos exclusivamente em um lado da membrana, ou ambos são
TRANSPORTADORES E TRANSPORTE DE MEMBRANA ATIVA 223
TABELA 11–2 Uma comparação das concentrações de íons dentro e fora de uma célula
típica de mamífero (Problema 11–25).
Componente Concentração intracelular (mM) Concentração extracelular (mM)
cátions
Na+ 5–15 145
K+ 140 5
Mg2+ 0,5 1–2
Ca2+ 10–4 1–2
H+ 7 × 10–5 (10–7,2 M ou pH 7,2) 4 × 10–5 (10–7,4 M ou pH 7,4)
Ânions
Cl- 5–15 110
exposto exclusivamente no outro lado da membrana. A proteína pode alternar entre os

dois estados conformacionais somente se ambos os sítios de ligação estiverem ocupados
ou se ambos os sítios de ligação estiverem vazios, mas não pode alternar se apenas um
sítio de ligação estiver ocupado.
A. Que tipo de transportador essas propriedades definem?
B. Você precisa especificar alguma propriedade adicional para transformar essa proteína em
um transportador que acopla o movimento do soluto A subindo seu gradiente de
concentração ao movimento do soluto B descendo seu gradiente eletroquímico?
C. Escreva um conjunto de regras como as do corpo deste problema que defina o
propriedades de um antiportador.
11–27 Um modelo para um uniportador que poderia mediar o transporte passivo de glicose a favor
de seu gradiente de concentração é mostrado na Figura 11–2. Como você precisaria
alterar o diagrama para converter o transportador em uma bomba que transporta glicose
em seu gradiente de concentração hidrolisando o ATP?
Explique a necessidade de cada uma das etapas em sua nova ilustração.
Figura 11–2 Modelo hipotético

mostrando como uma mudança
conformacional em um transportador poderia
mediar o transporte passivo de glicose
(Problema 11–27). A transição entre os dois
gradiente estados conformacionais é proposta para
de glicose ocorrer aleatoriamente e ser completamente
reversível, independentemente da ocupação do sítio de ligaç
11–28 Os transportadores de íons estão “ligados” – não fisicamente, mas como consequência de
suas ações. Por exemplo, as células podem elevar seu pH intracelular, quando se torna
muito ácido, trocando Na+ externo por H+ interno, usando um antiportador Na+–H+ . A
mudança
bomba Na+-K+
no Na+. interno é então corrigida pelos Problemas p11.03/11.02 usando a
A. Esses dois transportadores, operando juntos, podem normalizar tanto o H+

e as concentrações de Na+ dentro da célula?
B. A ação vinculada dessas duas bombas causa desequilíbrios em
a concentração de K+ ou o potencial de membrana?
Figura 11–3 A bomba de Na+-K+ (Problema

ADP Na+
11–29).
ATP
Na+
K+
K+
11–29 Você preparou vesículas lipídicas (bicamadas lipídicas esféricas) que contêm bombas de
Na+-K+ como única proteína de membrana. Suponha, para simplificar, que cada bomba
transporta um Na+ para um lado e um K+ para o outro em cada ciclo de bombeamento,
conforme ilustrado na Figura 11-3. Em todos os Problemas p11.05/11.03, as bombas
Na+-K+ são orientadas
de modo que a porção da molécula que normalmente está voltada para o citosol esteja
voltada para o exterior da vesícula. Preveja o que aconteceria em cada uma das seguintes
condições.
A. A solução dentro e fora das vesículas contém Na+ e K+
íons, mas sem ATP.
B. A solução dentro das vesículas contém íons Na+ e K+ ; a solução externa também
contém ambos os íons, assim como o ATP. A solução dentro
C. contém Na+; a solução externa contém Na+ e ATP.
D. A solução é como em B, mas as moléculas da bomba de Na+-K+ são aleatoriamente

orientados, alguns voltados para uma direção, outros para outra.
CÁLCULOS
11–30 As microvilosidades aumentam a área de superfície das células intestinais, proporcionando

uma absorção mais eficiente dos nutrientes. As microvilosidades são mostradas em perfil
e seção transversal na Figura 11-4. A partir das dimensões fornecidas na figura, estime
o aumento da área de superfície que as microvilosidades fornecem (para a porção da
membrana plasmática em contato com o lúmen do intestino) em relação à superfície
correspondente de uma célula com uma membrana plasmática “at”.
Figura 11–4 Microvilosidades das

células epiteliais intestinais em perfil e
1 µm 0,1 µm corte transversal (Problema 11–30).
TRANSPORTADORES E TRANSPORTE DE MEMBRANA ATIVA 225
11–31 Quanta energia é necessária para bombear substâncias através das membranas?
Ou, colocando de outra forma, uma vez que o transporte ativo geralmente é conduzido
direta ou indiretamente pelo ATP, quão íngreme é o gradiente que a hidrólise do ATP
pode manter para um determinado soluto? Para o transporte para dentro da célula, a
mudança de energia livre (Gin) por mol de soluto movido através da membrana plasmática é
Co ÿGin = –2.3RT log + zFV Ci
onde R = a constante do gás, 8,3 × 10–3 kJ/K mol

T = a temperatura absoluta em K (37°C = 310 K)
Co = concentração de soluto fora da célula
Ci = concentração de soluto dentro da célula z =
a valência (carga) no soluto
F = Constante de Faraday, 96 kJ/V mol
V = o potencial de membrana em volts (V)
Como Gin = –Gout, a variação de energia livre para transporte para fora da célula é
Co – zFV
ÿGout = 2,3RT log Ci
No equilíbrio, onde G = 0, as equações podem ser rearranjadas para a forma mais familiar
conhecida como equação de Nernst.
RT
2,3 log zF Ci CoV =
Para as questões abaixo, suponha que a hidrólise de ATP em ADP e Pi ocorra com
FORA DENTRO
um G de –50 kJ/mol; ou seja, a hidrólise de ATP pode conduzir o transporte ativo com um CÉLULA CÉLULA
G de +50 kJ/mol. Suponha que V seja –60 mV.

+
A. Qual é o gradiente máximo de concentração que pode ser alcançado pelo transporte ativo
+ K+
conduzido por ATP para dentro da célula de uma molécula não carregada, como a glicose,
supondo que 1 ATP seja hidrolisado para cada molécula de soluto que é transportada? +
+
B. Qual é o gradiente máximo de concentração que pode ser alcançado pelo transporte ativo
+
de Ca2+ de dentro para fora da célula? Como esse máximo se compara com o gradiente
de concentração real observado em células de mamíferos (ver Tabela 11-2)? +
+
K+
C. Calcule quanta energia é necessária para acionar a bomba de Na+-K+ . Esse notável
+
dispositivo molecular transporta cinco íons para cada molécula de ATP que é hidrolisada: Na+
+
3 Na+ para fora da célula e 2 K+ para dentro da célula. A bomba normalmente mantém o
Na+ interno em 10 mM, o Na+ externo em 145 mM, o K+ interno em 140 mM e o K+ +
externo em 5 mM. Conforme mostrado na Figura 11-5, o Na+ é transportado contra o +

potencial de membrana, enquanto o K+ é transportado com ele. (e G para a reação
+
global é igual à soma dos valores G para o transporte dos íons individuais.)
+
D. Quão eficiente é a bomba de Na+-K+ ? Ou seja, que fração da energia disponível da +

hidrólise do ATP é usada para conduzir o transporte? Na+
+
TRATAMENTO DE DADOS
membrana de plasma
11–32 Se você já usou a sonda padrão em um medidor de pH, pode se perguntar como o pH poderia
Figura 11-5 Gradientes de Na+ e K+ e direção
ser medido nos pequenos volumes dentro dos compartimentos celulares. O desenvolvimento do bombeamento através da membrana
recente de uoróforos sensíveis ao pH simplificou imensamente essa difícil tarefa. Um plasmática (Problema 11-31). Letras grandes
desses indicadores fluorescentes é um éster hidrofóbico de SNARF-1, que pode entrar simbolizam altas concentrações e letras pequenas
simbolizam baixas concentrações.
nas células por difusão passiva e, em seguida, é aprisionado em seu interior após enzimas
Tanto Na+ quanto K+ são bombeados contra
intracelulares hidrolisarem as ligações éster para liberar SNARF-1 (Figura 11-6) . SNARF-1
gradientes de concentração química; no
absorve luz em 488 nm e emite luz fluorescente com picos em 580 nm e 640 nm. Os entanto, o Na+ é bombeado para cima no
espectros de emissão para SNARF-1 em pH 6,0 e pH 9,0 são gradiente elétrico, enquanto o K+ é bombeado
para baixo no gradiente elétrico.
OU OH O– O
O O O O
(CH3) 2N (CH3) 2N (CH3) 2N (CH3) 2n
HIDRÓLISE pK = 7,5
O O O
O–
C O C O C O C
O
RO C –O C –O C –O C
O éster SNARF-1 O SNARF-1 (HA) O SNARF-1 (A- ) O SNARF-1 (A- )
estrutura de ressonância dominante
Figura 11–6 Estrutura do éster e formas livres de SNARF-1 (Problema 11–32). Os grupos éster bloqueadores são mostrados como R.
As formas ácida (HA) e sal (A–) de SNARF-1 são indicadas. As duas estruturas de ressonância diferentes para a forma de sal de
SNARF-1 são mostradas entre parênteses.
mostrado na Figura 11–7. O pKa do SNARF-1 é 7,5.

A. Explique por que o éster de SNARF-1 se difunde através das membranas, enquanto a
forma clivada permanece dentro das células.
B. Por que você acha que existem dois picos de uorescência (em 580 nm e em 640 nm) que
mudam tão dramaticamente em intensidade com uma mudança no pH (veja a Figura
11-7)? Quais recursos do SNARF-1 podem ser importantes nisso?
C. Que formas de SNARF-1 estão presentes em pH 6,0 e quais são suas proporções
relativas? Em pH 9,0? A equação de Henderson–Hasselbalch que descreve a
dissociação de um ácido fraco é pH = pK + log ([sal]/[ácido]).
D. Esboce uma curva aproximada para o espectro de emissão SNARF-1 dentro de uma
célula em pH 7,2. (Todas essas curvas passam pelo ponto onde as duas curvas na
Figura 11-7 se cruzam.)
E. Por que você acha que indicadores como o SNARF-1, que têm espectros de emissão
com dois picos, são preferidos aos que têm um único pico?
LINKS MÉDICOS
11–33 O CO2 é removido do corpo por meio dos pulmões em um processo mediado pelos glóbulos
vermelhos, conforme resumido na Figura 11–8. O transporte de CO2 está acoplado ao
transporte de O2 através da hemoglobina. Com a liberação de O2 nos tecidos, a
hemoglobina sofre uma alteração conformacional que eleva o pKa de uma cadeia lateral
de histidina, permitindo que ela se ligue a um H+, que é gerado durante a hidratação do
CO2 pela ação da enzima anidrase carbônica. Esse processo ocorre ao contrário nos
pulmões quando o O2 se liga à hemoglobina.
A. Até que ponto o pH intracelular da hemácia varia durante seu movimento dos tecidos para pH 6,0 pH 9,0
os pulmões e vice-versa, e por que isso ocorre?

B. De que forma e onde está o CO2 durante seu movimento dos tecidos
para os pulmões?
C. Como é que o trocador Cl––HCO3– opera em uma direção no fluorescência
tecidos e na direção oposta nos pulmões?
11–34 Um aumento na concentração intracelular de Ca2+ causa a contração das células

musculares. Além de uma bomba de Ca2+ movida a ATP, as células do músculo
cardíaco, que se contraem rápida e regularmente, possuem um antiportador que troca
550 600 650 700 750
Ca2+ por Na+ extracelular através da membrana plasmática. Esse antiportador bombeia
comprimento de onda (nm)
rapidamente a maioria dos íons Ca2+ que entram de volta para fora da célula, permitindo
que a célula relaxe. A ouabaína e o digitálico, drogas usadas no tratamento de pacientes Figura 11–7 Espectros de emissão
com doenças cardíacas, fazem o coração se contrair mais fortemente. Ambas as drogas de SNARF-1 em pH 6,0 e pH 9,0 (Problema
funcionam inibindo parcialmente a bomba de Na+-K+ na membrana da célula do músculo 11–32). O SNARF-1 em solução a pH 6,0
ou pH 9,0 foi excitado por luz a 488 nm e a
cardíaco. Você pode propor uma explicação para os efeitos dessas drogas nos
intensidade da uorescência foi determinada
pacientes? O que acontecerá se tomar muito de qualquer um dos medicamentos? em comprimentos de onda de 550 nm a 750
nm.
CANAIS E PROPRIEDADES ELÉTRICAS DAS MEMBRANAS 227
EM TECIDOS NOS PULMÕES

CO2 O2 CO2 O2
baixo O2, alto CO2 alto O2, baixo CO2
H+
N N
+ _
CO2H2O HCO3 - + H+ +
CO2H2O _ HCO +3– H+
N N
HCO3 – Cl – HCO3 – Cl –
Figura 11-8 Transporte de CO2 mediado

CANAIS E PROPRIEDADES ELÉTRICAS por glóbulos vermelhos dos tecidos para os
DE MEMBRANAS pulmões (Problema 11-33). Baixo e alto O2
e CO2 referem-se às suas concentrações,
TERMOS PARA APRENDER ou pressões parciais.
Adaptação do potencial de receptor metabotrópico

ação do receptor bainha de mielina
de acetilcolina equação de Nernst
Aquaporina do junção neuromuscular
receptor AMPA (canal de água) neurônio (célula
axônio nervosa)
neurotransmissor Problemas
Canal de K + ativado por Ca2+ p11.04/11.08
canalrodopsina canal receptor NMDA
de K+ retardado oligodendrócitos
optogenética registro patch-
despolarização clamp potencial de membrana em
de dendrito neurotransmissor repouso rapidamente inativando canal
excitatório de K+ seletividade
célula glial neurotransmissor das células de
inibitório segmento Schwann
inicial canal iônico filtro sinapse
Canal de vazamento plasticidade sináptica canal iônico
de K+ depressão de longo prazo controlado por transmissor controlado
(LDP) potencialização de longo por voltagem canal catiônico
prazo (LTP) potencial de canal de K+ dependente de voltagem canal de Na+ dependente de voltagem
membrana do canal mecanossensível
DEFINIÇÕES
11–35 Ajuste na sensibilidade de uma célula ou organismo após estimulação repetida que
permite uma resposta mesmo quando há um alto nível de estimulação de fundo.
11–36 O aumento duradouro (dias a semanas) na sensibilidade de certas sinapses no

hipocampo que é induzido por uma curta explosão de anel repetitivo nos neurônios pré-
sinápticos.
11–37 Sinal elétrico rápido, transitório e autopropagado na membrana plasmática de uma célula,
como um neurônio ou célula muscular: um impulso nervoso.
11–38 Expressão quantitativa que relaciona a proporção de equilíbrio das concentrações de um

íon em ambos os lados de uma membrana permeável à diferença de voltagem através
da membrana.
11–39 Um canal iônico fotossensível que se abre em resposta à luz.
11–40 Diferença de tensão através de uma membrana devido ao ligeiro excesso de íons positivos
de um lado e de íons negativos do outro (normalmente –60 mV, negativo interno, para
uma célula animal).
11–41 Termo geral para uma proteína de membrana que permite seletivamente que cátions como
o Na+ atravessem a membrana em resposta a mudanças no potencial de membrana.
11–42 na parte de uma estrutura de canal iônico que determina quais íons ele pode
transportar.
11–43 Camada isolante de membrana celular especializada envolvendo os axônios dos

vertebrados.
11–44 Um canal iônico de transporte de K+ na membrana plasmática de células animais que

permanece aberto mesmo em uma célula “em repouso”.
11–45 Processo longo e fino de células nervosas capaz de conduzir rapidamente impulsos
nervosos por longas distâncias para enviar sinais a outras células.
11–46 Complexo proteico transmembrana que forma um canal cheio de água através da bicamada
lipídica através do qual íons inorgânicos específicos podem difundir em seus gradientes
eletroquímicos.
11-47 Junção especializada entre uma célula nervosa e outra célula, através da qual o impulso
nervoso é transferido, geralmente por um neurotransmissor, que é secretado pela célula
nervosa e difundido para a célula-alvo.
11–48 Molécula sinalizadora pequena, como acetilcolina, glutamato, GABA ou glicina, secretada
por uma célula nervosa em uma sinapse química para sinalizar para a célula pós-
sináptica.
11–49 Técnica na qual a ponta de um pequeno eletrodo de vidro é selada em uma área da
membrana celular, tornando assim possível registrar o fluxo de corrente através de
canais iônicos individuais.
VERDADEIRO FALSO
11–50 Os transportadores saturam em altas concentrações da molécula transportada quando

todos os seus sítios de ligação estão ocupados; os canais, por outro lado, não ligam os
íons que transportam e, portanto, o fluxo de íons através de um canal não satura.
11–51 O potencial de membrana surge de movimentos de carga que deixam as

concentrações de íons praticamente inalteradas, causando apenas uma discrepância
muito pequena no número de íons positivos e negativos nos dois lados da membrana.
11–52 A corrente agregada que atravessa a membrana de uma célula inteira indica o grau
em que os canais individuais estão abertos.
11–53 Canais iônicos controlados por transmissores se abrem em resposta a neurotransmissores

específicos em seu ambiente, mas são insensíveis ao potencial de membrana; portanto,
eles não podem por si mesmos (na ausência do ligante) gerar um potencial de ação.
11–54 Quando um potencial de ação despolariza a membrana da célula muscular, a bomba de

Ca2+ é responsável por bombear Ca2+ do retículo sarcoplasmático para o citosol para
iniciar a contração muscular.
11–55 De acordo com as leis do movimento de Newton, um íon exposto a um campo elétrico no
vácuo experimentaria uma aceleração constante da força motriz elétrica, assim como
um corpo em queda no vácuo acelera constantemente devido à gravidade. Na água, no
entanto, um íon se move a uma velocidade constante em um campo elétrico. Por que
você acha que é isso?
11–56 Quais são as duas propriedades que distinguem um canal iônico de um canal aquoso simples? H+
poro?
11–57 Você preparou vesículas lipídicas que contêm moléculas do canal de vazamento de K+ , todas
orientadas de modo que sua superfície citosólica fique voltada para fora da vesícula. Preveja
como os íons K+ se moverão nas seguintes condições e que tipo de potencial de membrana
se desenvolverá.
A. Concentrações iguais de íons K+ estão presentes dentro e fora da vesícula.
B. Os íons K+ estão presentes apenas dentro da vesícula.
C. Os íons K+ estão presentes apenas fora da vesícula.
11–58 Se um ovo de rã e um glóbulo vermelho forem colocados em água pura, o glóbulo vermelho irá
inchar e estourar, mas o ovo de rã permanecerá intacto. Embora um ovo de rã seja cerca de
um milhão de vezes maior que um glóbulo vermelho, ambos têm concentrações internas de
íons quase idênticas, de modo que as mesmas forças osmóticas atuam em cada um. Por
que você acha que os glóbulos vermelhos estouram na água, enquanto os ovos de rã não?
H+
11–59 As aquaporinas permitem que a água se mova através de uma membrana, mas impedem a
Figura 11-9 Rápida difusão de íons H+
passagem de íons. Como a estrutura do poro através do qual as moléculas de água se
por um sistema de retransmissão
movem impede a passagem de íons como K+, Na+, Ca+ e Cl–? Os íons H+ apresentam um molecular envolvendo a formação e
problema diferente porque se movem por retransmissão ao longo de uma cadeia de quebra de ligações
p11.10/11.09 de hidrogênio
entre moléculas de água
moléculas de água ligadas por pontes de hidrogênio (Figura 11-9). Como o poro impede a adjacentes (Problema 11-59).
passagem de íons H+ através da membrana?
11–60 Explique em 100 palavras ou menos como um potencial de ação é transmitido ao longo de um
axon.
11–61 O neurotransmissor acetilcolina é produzido no citosol e depois transportado para as

vesículas sinápticas, onde sua concentração é mais de 100 vezes maior do que no citosol.
Vesículas sinápticas isoladas de neurônios podem absorver acetilcolina adicional se esta
for adicionada à solução em que estão suspensas, mas apenas na presença de ATP. Os
íons Na+ não são necessários para a captação de acetilcolina, mas, curiosamente, elevar o
pH da solução na qual as vesículas sinápticas estão suspensas aumenta a captação de
acetilcolina. Além disso, o transporte é inibido na presença de fármacos que tornam a
membrana permeável aos íons H+ . Sugira um mecanismo que seja consistente com todas
essas observações.
11-62 Os neurotransmissores excitatórios abrem os canais de Na+ , enquanto os neurotransmissores

inibitórios abrem os canais de Cl– ou K+ . Racionalize essa observação em termos dos
efeitos desses íons no anel de um potencial de ação.
11–63 Os canais de cátions controlados pela acetilcolina não discriminam entre os íons Na+, K+ e
Ca2+ , permitindo que todos passem livremente. Como é, então, que quando os receptores
de acetilcolina nas células musculares se abrem, ocorre um grande influxo líquido
principalmente de Na+?
CÁLCULOS
11–64 Em um subconjunto de canais de K+ dependentes de voltagem, o N-terminal de cada subunidade

age como uma bola amarrada que oclui a extremidade citoplasmática do poro logo após sua
abertura, inativando assim o canal . Este modelo de “bola e corrente” para a inativação
rápida de canais de K+ dependentes de voltagem foi elegantemente suportado pelo canal
de K+ shaker da Drosoph ila melanogaster. (o canal agitador de K+ em Drosophila recebe
o nome de uma forma mutante que causa comportamento excitável - até mesmo os animais
anestesiados continuam se contorcendo.) A deleção dos aminoácidos N-terminais do canal
agitador normal dá origem a um canal que se abre em resposta à membrana despolarização,
mas permanece aberto (Figura 11-10A; 0 ÿM) em vez de fechar rapidamente como o canal
normal faz. Um peptídeo (MAAVAGL YGLGEDRQHRKKQ) que corresponde ao N-terminal
deletado pode inativar parcialmente o canal aberto a 50 ÿM e inativá-lo completamente a
100 ÿM (Figura 11-10A).
(A) (B)
0 µM 21,4 nm
50 µM
100 pA
10 ms 100 µM
A concentração de peptídeo livre (100 ÿM) é necessária para inativar o canal K+ Figura 11–10 Inativação dos canais de K+
dependentes de voltagem (Problema 11–64).
defeituoso em qualquer lugar perto da concentração local da bola amarrada em um canal
(A) Gravação de patch-clamp de um canal shaker
normal? Suponha que a bola presa possa explorar um hemisfério [volume = (2/3)r3] com
K+ defeituoso na ausência e presença de
um raio de 21,4 nm, que é o comprimento da “cadeia” polipeptídica (Figura 11-10B). peptídeo inativador. A corrente através do canal é
Calcule a concentração de uma bola neste hemisfério. Como esse valor se compara com indicada em picoamps (pA). (B) Uma
a concentração de peptídeo livre necessária para inativar o canal? “bola” amarrada por uma “corrente” a um canal
normal.
11–65 Se o potencial de repouso da membrana de uma célula é de –70 mV e a espessura da

bicamada lipídica é de 4,5 nm, qual é a intensidade do campo elétrico através da
membrana em V/cm? O que você acha que aconteceria se aplicasse essa tensão a dois
eletrodos de metal separados por um espaço de ar de 1 cm?
11–66 O axônio gigante da lula ocupa uma posição única na história de nossa compreensão
dos potenciais da membrana celular e da ação nervosa. Seu grande tamanho (0,2–1,0
mm de diâmetro e 5–10 cm de comprimento) permitiu que eletrodos, grandes para os
padrões modernos, fossem inseridos para que voltagens intracelulares pudessem ser
medidas. Quando um eletrodo é inserido em um axônio gigante intacto, o potencial de
membrana registra –70 mV. Quando o axônio, suspenso em um banho de água do mar, é
estimulado a conduzir um impulso nervoso, o potencial da membrana muda
transitoriamente de –70 mV para +40 mV.
A equação de Nernst relaciona as concentrações iônicas de equilíbrio com o
potencial de membrana.
RT Co log V
2,3 zF =
Ci
Para íons univalentes e a 20°C (293 K),
companhia
V = 58 mV × log
Lá
A. Usando esta equação, calcule o potencial através da membrana em repouso (1) supondo
que seja devido exclusivamente ao K+ e (2) assumindo que seja devido exclusivamente
ao Na+. (As concentrações de Na+ e K+ no citosol do axônio e na água do mar são
fornecidas na Tabela 11–3.) Qual cálculo está mais próximo do potencial de repouso
medido? Qual cálculo está mais próximo do potencial de ação medido? Explique por que
essas suposições aproximam os potenciais medidos de repouso e de ação.
B. Se a solução que banha o axônio gigante da lula for alterada de água do mar para água do
mar artificial na qual o NaCl é substituído por cloreto de colina, não há efeito no potencial
de repouso, mas o nervo não gera mais um potencial de ação após estimulação. O que
você prediz que aconteceria com a magnitude do potencial de ação se a concentração
de Na+
TABELA 11–3 Composição iônica da água do mar e do citosol no axônio

da lula gigante (Problema 11–66).
Íon Citosol água do mar
Na+ 65mM 430 mM

K+ 344 mM 9mM
no meio externo foram reduzidos à metade ou um quarto do seu valor normal, usando
cloreto de colina para manter o equilíbrio osmótico?
11–67 O número de íons Na+ que entram no axônio gigante da lula durante um potencial de
ação pode ser calculado a partir da teoria. Como a membrana celular separa cargas
positivas e negativas, ela se comporta como um capacitor. A partir da capacitância
conhecida das membranas biológicas, pode-se calcular o número de íons que entram
durante um potencial de ação. Partindo de um potencial de repouso de -70 mV, pode-se
mostrar que 1,1 × 10-12 moles de Na+ devem entrar na célula por cm2 de membrana
durante um potencial de ação.
Para determinar experimentalmente o número de entrada de íons Na+ durante um
potencial de ação, um axônio gigante de lula (1 mm de diâmetro e 5 cm de comprimento)
foi suspenso em uma solução contendo Na+ radioativo ( atividade específica = 2 × 1014
cpm/mol) e um potencial de ação único foi propagado ao longo de seu comprimento.
Quando o citoplasma foi analisado quanto à radioatividade, um total de 340 cpm foi
encontrado para entrar no axônio.
A. Quão bem a medição experimental corresponde ao cálculo teórico
culação?
B. Quantos moles de K+ devem atravessar a membrana do axônio, e em que direção, para
restabelecer o potencial de repouso após o término do potencial de ação?
C. Dado que a concentração de Na+ dentro do axônio é de 65 mM, calcule a fração de aumento
na concentração interna de Na+ que resulta da passagem de um único potencial de ação
pelo axônio.
D. No outro extremo do espectro de tamanhos de nervos estão pequenos dendritos com cerca
de 0,1 ÿm de diâmetro. Considerando o mesmo comprimento (5 cm), a mesma concentração
interna de Na+ (65 mM) e os mesmos potenciais de repouso e de ação do axônio do
gigante lula, calcule a fração de aumento na concentração interna de Na+ que resultaria da
passagem de um único potencial de ação em um dendrito.
E. A bomba de Na+-K+ é mais importante para o desempenho contínuo de um

axônio gigante, ou de um dendrito?
11-68 Os canais de cátions controlados pela acetilcolina na junção neuromuscular se abrem em

resposta à acetilcolina liberada pelo terminal nervoso e permitem que os íons Na+ entrem
na célula muscular, o que causa a despolarização da membrana e, por fim, leva à
contração muscular.
A. Medições de patch-clamp mostram que os músculos de ratos jovens têm canais catiônicos
que respondem à acetilcolina (Figura 11-11). Quantos tipos de canal existem? Como você
sabe?
B. Para cada tipo de canal, calcule o número de íons que entram em um milissegundo. (Um
ampère é uma corrente de um coulomb por segundo; um pA é igual a 10–12 ampere. Um
íon com uma única carga, como Na+ , carrega uma carga de 1,6 × 10–19 coulomb.)
Figura 11-11 Medições de patch-clamp de

canais catiônicos controlados por acetilcolina
2 pA em músculo de rato jovem (Problema 11-68).
40 mseg
TRATAMENTO DE DADOS
11–69 O canal agitador de K+ em Drosophila se abre em resposta à despolarização da

membrana e então se inativa rapidamente por meio de um mecanismo de esfera e
corrente. O canal de K+ do shaker é montado como um tetrâmero composto de quatro
subunidades, cada uma com sua própria esfera e corrente. Várias bolas no canal
tetramérico atuam juntas para inativar o canal ou uma bola é suficiente?
(A) MISTURA DE CANAIS DE K+ (B) GRAVAÇÕES DE PATCH-CLAMP Figura 11–12 Análise da inativação do canal
shaker K+ (Problema 11–69).
(A) Mistura de subunidades normais com bolas
sensível a toxina 1,0 - toxina + toxina (brancas) e subunidades resistentes a
toxinas sem bolas (vermelhas). Se as duas
subunidades fossem expressas em quantidades
corrente
(µA)
0,5 iguais, as diferentes formas do canal de K+
estariam presentes na proporção 1:4:6:4:1; no
entanto, níveis mais altos de mRNA de
0 subunidade resistente a toxina foram usados,
0 50 100 0 50 100 distorcendo significativamente as proporções
tempo (mseg) tempo (mseg) em favor de canais com subunidades
resistentes a toxina. (B) Registros de patch-
clamp na presença e ausência de toxina de escorpião.
Essa pergunta foi respondida pela mistura de subunidades de duas formas
diferentes do canal de K+ : as subunidades normais com esferas e as subunidades
resistentes à toxina de escorpião sem esferas (Figura 11-12A). A toxina do
escorpião impede a abertura dos canais de K+ normais (sensíveis à toxina) , mas
não dos canais compostos inteiramente por subunidades resistentes à toxina. Além
disso, os canais híbridos contendo até mesmo uma única subunidade sensível à
toxina falham em abrir na presença da toxina.
Canais mistos de K+ foram criados pela injeção de uma mistura de mRNAs
para os dois tipos de subunidade em oócitos de rã. Após a expressão, manchas de
As membranas contendo várias centenas de canais foram estudadas por registro
de patch clamp após submeter as membranas à despolarização na ausência ou
presença da toxina do escorpião (Figura 11-12B).
A. Esboce os registros de patch-clamp esperados, na presença e ausência de toxina,
para uma população pura de canais de K+ composta inteiramente de subunidades
resistentes a toxina sem bolas.
B. Esboce os registros de patch-clamp esperados, na presença e ausência de toxina,
para uma população pura de canais de K+ composta inteiramente de subunidades
normais (sensíveis a toxina) com bolas.
C. Esboce os registros de patch-clamp esperados, na presença e ausência de toxina,
para uma população mista de canais de K+ , 50% composta inteiramente de
subunidades normais (sensíveis a toxinas) com bolas e 50% composta inteiramente
de resistente a toxina subunidades sem bolas. A principal
D. observação na Figura 11-12B é que os valores do platô final das correntes na
ausência e presença de toxina são os mesmos. Essa observação argumenta que
uma única bola pode fechar um canal ou que várias bolas devem agir em conjunto?
(escreva como seriam as curvas se uma, duas, três ou quatro bolas fossem
necessárias para fechar um canal.)
11–70 Um registro de um pedaço de membrana (Figura 11–13A) mediu a corrente através

dos canais iônicos controlados pela acetilcolina, que se abrem quando a acetilcolina
é ligada (Figura 11–13B). Para obter o registro, acetilcolina foi adicionada à solução
na micropipeta (Figura 11-13A). Descreva o que você pode aprender sobre os
canais desta gravação. Como o registro seria diferente se a acetilcolina fosse (a)
omitida ou (b) adicionada apenas à solução fora da micropipeta?
11–71 Um parâmetro importante para a compreensão de qualquer processo particular de

transporte de membrana é saber o número de cópias da proteína de transporte
específica presente na membrana celular. Para medir o número de
(A) (B)
micropipeta
2 pA
canais iônicos Figura 11-13 Análise dos canais iônicos
controlados pela acetilcolina (Problema 11-70). (A)
Uma micropipeta com um pedaço de membrana.
10 ms
(B) Registro patch-clamp da corrente através
CITOSOL dos canais iônicos controlados pela acetilcolina.
canais de Na+ controlados por voltagem no nervo vago do coelho, você usa uma 200
- toxina não marcada
toxina potente, a saxitoxina, um veneno de concha que inativa especificamente
os canais de Na+ controlados por voltagem nessas células nervosas. Assumindo 150
que cada canal se liga a uma molécula de toxina, o número de canais de Na+ em
um segmento do nervo vago será igual ao número máximo de moléculas de 100
toxina ligadas.
Você incuba segmentos idênticos de nervo por 8 horas com quantidades nixot dnuob
úmido)
lomp(
peso
g/
+ toxina não marcada
50
crescentes de toxina marcada com 125I. Em seguida, você lava os segmentos
para remover a toxina não ligada e mede a radioatividade associada aos
segmentos nervosos para determinar a curva de ligação da toxina (Figura 11-14, 0
0 20 40 60 80
curva superior). Você está intrigado porque esperava ver a ligação atingir um
125I-toxina (nM)
máximo (saturar) em altas concentrações de toxina; no entanto, nenhum ponto
final distinto foi alcançado, mesmo em concentrações mais altas de toxina do que Figura 11-14 Curvas de ligação de
as mostradas na figura. Após uma reflexão cuidadosa, você projeta um toxina na presença e ausência de
problemas não rotulados
experimento de controle no qual a ligação da toxina marcada é medida na p11.15/11.14 saxitoxina (Problema 11-71).
presença de um grande excesso molar de toxina não marcada. Os resultados
desse experimento, mostrados na curva inferior da Figura 11-14, esclarecem tudo
e permitem calcular o número de canais de Na+ na membrana do axônio do
nervo vago.
A. Por que a ligação da toxina marcada não satura? Qual é o objetivo do experimento
de controle e como ele funciona?
B. Dado que 1 grama de nervo vago tem uma área de membrana axonal de 6.000
cm2 e assumindo que o canal de Na+ é um cilindro com um diâmetro de 6 nm,
calcule o número de canais de Na+ por micrômetro quadrado de membrana
axonal e a fração do superfície celular ocupada pelo canal. (Use 100 pmol como
a quantidade de toxina especificamente ligada ao receptor.)
LINKS MÉDICOS
11–72 Para produzir anticorpos contra o receptor de acetilcolina a partir do órgão elétrico
das enguias elétricas, você injeta o receptor purificado em camundongos. Você
nota uma correlação interessante: camundongos com altos níveis de anticorpos
contra o receptor parecem fracos e lentos; aqueles com níveis baixos são animados.
Você suspeita que os anticorpos contra os receptores de acetilcolina da enguia
estão reagindo com os receptores de acetilcolina do camundongo, fazendo com
que muitos dos receptores sejam destruídos. Uma vez que uma redução no
número de receptores de acetilcolina também é a base para a doença autoimune
humana miastenia gravis, você se pergunta se uma injeção da droga neostigmina
em camundongos pode dar a eles uma restauração temporária de força, como
acontece com pacientes miastênicos. . A neostigmina inibe a acetilcolinesterase,
enzima responsável pela hidrólise da acetilcolina na fenda sináptica. Com certeza,
quando você injeta seus ratos com mina neostig, eles imediatamente se tornam
muito ativos. Proponha uma explicação de como a neostigmina restaura a função
temporária de uma sinapse neuromuscular com um número reduzido de
receptores de acetilcolina.
11–73 Os canais iônicos para neurotransmissores como acetilcolina, serotonina,

GABA e glicina têm estruturas gerais semelhantes. Cada classe compreende um
conjunto extremamente diversificado de subtipos de canal, com diferentes
propriedades de ligantes, diferentes condutâncias de canal e diferentes taxas de
abertura e fechamento. Por que essa diversidade extrema é uma coisa boa do
ponto de vista da indústria farmacêutica?
ESTILO MCAT

Numerosas drogas e toxinas interessantes atuam em canais e transportadores. Uma dessas
drogas é a escopolamina, que é usada para tratar vertigem, enjôo e
espasmos musculares lisos. A escopolamina foi isolada pela primeira vez de Jimson Weed, que
produz uma bela flor branca - frequentemente pintada por Georgia O'Keee. Jimson Weed também é
chamado de Sacred Datura, e foi usado pelos nativos americanos para fins religiosos porque pode
produzir alucinações e distorções do tempo. Imagine que você é o primeiro a purificar a escopolamina
e está tentando determinar como ela funciona. Você descobre que, se incubar células musculares
isoladas com escopolamina, a adição subsequente de acetilcolina não causa mais despolarização da
membrana e contração celular, como ocorre na ausência de escopolamina.
11–74 Qual das seguintes afirmações explica melhor como a escopolamina pode exercer seus efeitos?
A. Liga-se ao canal de Na+ controlado pela acetilcolina e inibe sua abertura.

B. Inibe a abertura do canal de Ca2+ no retículo sarcoplasmático.
C. Inibe transportadores que importam Na+ durante um potencial de ação.
D. Inibe os canais de K+ dependentes de voltagem durante um potencial de ação.
11-75 A toxina do escorpião, um componente do veneno do escorpião, prolonga dramaticamente a

mudança no potencial de membrana durante o anel de um impulso nervoso (Figura 11-15).
Qual das seguintes hipóteses explica melhor como a toxina exerce seus efeitos?
A. Acelera a abertura de canais de K+ dependentes de voltagem .

B. Ele abre o canal de Na+ dependente de voltagem em uma voltagem mais baixa.
C. Promove a abertura de um canal de Na+ controlado por ligante.
D. Retarda a inativação do canal de Na+ dependente de voltagem.
(A) CONTROLE (B) + TOXINA Figura 11-15 Efeitos da toxina do escorpião

+45 na duração de um potencial de ação
(Problema 11-75).
0
mV
–75
1 mseg segundos
11–76 Extratos da planta africana Stropthantus gratus já foram usados para fazer pontas de flechas
venenosas para a caça. O composto ativo no extrato da Figura 11-301 é extremamente
tóxico; quando
concentrado e colocado na ponta de uma flecha, pode matar um hipopótamo. Imagine
que você trate as células com o composto do Problema MCAT 11-01 e observe que elas
começam a inchar e
eventualmente estourar.
Qual das seguintes ações explicaria melhor os efeitos do composto tóxico?
A. Fechamento dos canais de vazamento de K+ .

B. Fechamento dos canais de Na+.
C. Inibição dos transportadores de glicose.
D. Inibição da bomba Na+-K+ .

A diarreia grave associada a doenças como cólera e disenteria foi a principal causa de mortalidade
infantil em todo o mundo antes de 1980. A diarreia grave produz uma perda tão rápida de líquido que
o indivíduo fica tão desidratado que os órgãos falham. Quando invade o intestino, o Vibrio cholerae, a
bactéria responsável pela cólera, produz uma toxina que hiperativa o regulador transmembrana da
brose cística (CFTR). A hiperativação do CFTR aumenta o movimento dos íons Cl- no lúmen do
intestino, o que cria um desequilíbrio iônico. Como resultado, a água dos tecidos circundantes corre
para o intestino, causando diarreia e
ESTILO MCAT 235
rápida perda de água. As mutações que inativam o CFTR causam brose cística. Nesse caso, a diminuição do
fluxo de Cl- para o revestimento dos pulmões leva a um desequilíbrio iônico que desidrata o muco, que obstrui
as passagens de ar.
11–77 A análise do CFTR levou a algumas surpresas. Embora o CFTR seja homólogo aos transportadores
ABC, que usam a hidrólise de ATP para bombear solutos para dentro ou para fora da célula, ele
apresenta um comportamento incomum. Qual das seguintes afirmações sugere que o CFTR não
é um membro típico da família de transportadores do ABC?
A. CFTR liga-se a Cl – para mover os íons através das membranas.

B. CFTR pode mover Cl – contra um gradiente de concentração.
C. CFTR produz uma corrente Cl– robusta através das membranas. através de
D. CFTR requer ATP para mover C - membranas.
11–78 A perda de líquidos na diarreia grave pode ser tratada com eficácia pela terapia de reidratação
oral, considerada um dos maiores avanços médicos do século XX, porque reduz drasticamente as
mortes causadas pela desidratação. A terapia de reidratação oral é simples e barata: os indivíduos
afetados bebem uma solução de 90 mM de NaCl e 110 mM de glicose. Qual das seguintes
afirmações descreve melhor como funciona a terapia de reidratação oral?
A. O co-transporte de Na + e glicose através de um simportador aumenta osmolar -

e absorção de água.
B. A glicose alimenta a bomba de Na +-K +, que bombeia Na para aumentar a + na cela para
osmolaridade celular.
C. No intestino, a solução de reidratação de baixa osmolaridade conduz a água para dentro das células
que revestem o intestino.
D. O sal e a glicose na solução de reidratação matam o Vibrio cholerae, nem -
malizando a osmolaridade celular.
Lamelas anuladas em um ovócito humano.

Esses verticilos citoplasmáticos de
membranas duplas perfurados por
complexos de poros nucleares são
encontrados em muitos oócitos e outras
células, mas seu significado e possíveis
funções ainda são muito misteriosos. Eles
representam estoques de membranas
nucleares? As bolhas escuras no centro
estão armazenadas no mRNA materno?
Eles são difíceis de purificar e estudar
bioquimicamente e, em comparação com outras
estruturas membranosas intracelulares,
receberam pouca atenção dos biólogos celulares.
Capítulo 12 237
CAPÍTULO
Compartimentos Intracelulares e
Separação de Proteínas 12
A COMPARTMENTALIZAÇÃO DAS CÉLULAS NESTE CAPÍTULO
TERMOS PARA APRENDER A COMPARTIMENTAÇÃO

citoplasma sinal de classificação da DE CÉLULAS
lúmen de translocação de proteína de sequência do sinal
transporte dependente organela sinal transporte vesicular do sinal O TRANSPORTE DE
do citosol de peptidase MOLÉCULAS ENTRE OS
NÚCLEO E O CITOSOLO
DEFINIÇÕES
O TRANSPORTE DE PROTEÍNAS
Combine a definição abaixo com seu termo na lista acima. DENTRO DAS MITOCÔNDRIAS E
CLOROPLASTIOS
12–1 Conteúdo de uma célula que está contido dentro de sua membrana plasmática, mas, no
caso de células eucarióticas, fora do núcleo.
PEROXISOMAS
12–2 Sinal de separação de proteínas que consiste em uma estrutura tridimensional específica
RETÍCULO ENDOPLASMÁTICO
disposição dos átomos na superfície da proteína dobrada.
12–3 Conteúdo do compartimento principal da célula, excluindo o núcleo e os compartimentos

delimitados por membrana, como o retículo endoplasmático e as mitocôndrias.
12–4 Movimento de proteínas através de complexos de poros nucleares entre o citosol e o núcleo.
12–5 Compartimento envolto por membrana em uma célula eucariótica que possui uma
estrutura, composição macromolecular e função.
12–6 Sinal de seleção de proteínas que consiste em uma sequência curta e contínua de aminoácidos.
VERDADEIRO FALSO
12–7 As membranas biológicas que dividem a célula em compartimentos funcionalmente

distintos são impermeáveis.
12–8 Como o lúmen do retículo endoplasmático (RE), o interior do

núcleo é topologicamente equivalente ao exterior da célula.
12-9 Ribossomos livres e ligados ao RE, que são estrutural e funcionalmente idênticos, diferem apenas
nas proteínas que estão produzindo em um determinado momento.
12–10 Cada sequência de sinal especifica um destino específico na célula.
12–11 Discuta a seguinte afirmação: “a membrana plasmática é apenas uma

componente da maioria das células eucarióticas”.
238 Capítulo 12: Compartimentos Intracelulares e Separação de Proteínas
12–12 É realmente verdade que todas as células humanas contêm o mesmo conjunto básico de
organelas envolvidas por membranas? Você conhece algum exemplo de célula humana
que não tenha um conjunto completo de organelas?
12–13 Quando as células são tratadas com drogas que despolimerizam os microtúbulos, o
aparelho de Golgi é fragmentado em pequenas vesículas e disperso por cada célula.
Quando tais drogas são removidas, as células geralmente se recuperam e crescem
normalmente. Se as células que se recuperaram desse tratamento forem examinadas
por microscopia eletrônica, descobre-se que elas contêm um aparelho de Golgi de
aparência perfeitamente normal. Isso significa que o aparelho de Golgi foi sintetizado
do zero? Se não, como você acha que isso pode ter acontecido?
12–14 Por que as células eucarióticas requerem um núcleo como um compartimento separado
quando as células procarióticas se saem perfeitamente bem sem?
12–15 Qual é o destino de uma proteína sem sinal de classificação?
12-16 A síntese de proteínas em uma célula hepática ocorre quase exclusivamente em ribossomos
livres no citosol e em ribossomos que estão ligados à membrana do RE. (Uma pequena
fração da síntese proteica total é dirigida pelo genoma mitocondrial e ocorre nos
ribossomos da matriz mitocondrial.) Que tipo de síntese proteica - no citosol ou no RE -
você acha que é responsável pela maior parte da síntese proteica no uma célula do
fígado? Suponha que a densidade média e o tempo de vida das proteínas sejam
aproximadamente os mesmos em todos os compartimentos. Explique a base de sua
resposta. Sua resposta mudaria se você levasse em conta que algumas proteínas são
secretadas pelas células do fígado?
12–17 Liste as organelas em uma célula animal que obtêm suas proteínas por meio de transporte
fechado, transporte transmembrana ou transporte vesicular.
12–18 Imagine que você projetou um conjunto de genes, cada um codificando uma proteína com
um par de sequências de sinais conflitantes que especificam diferentes compartimentos.
Se os genes fossem expressos em uma célula, preveja qual sinal venceria nas seguintes
combinações. Explique seu raciocínio.
A. Sinais para importar para o núcleo e importar para o RE.
B. Sinais para importação em peroxissomos e importação em ER.
C. Sinais para importação na mitocôndria e retenção no ER.
D. Sinais de importação para o núcleo e exportação do núcleo.
12–19 Se você pensar na proteína como um viajante, que tipo de veículo melhor descreveria o
receptor de classificação: um carro particular, um táxi ou um ônibus? Explique sua
escolha.
CÁLCULOS
12–20 Diz-se que uma célula animal típica contém cerca de 10 bilhões de moléculas de proteína
que precisam ser classificadas em seus compartimentos apropriados. São muitas
proteínas. 10 bilhões de moléculas de proteína podem se encaixar em uma célula?
Uma proteína média codificada pelo genoma humano tem 450 aminoácidos de
comprimento, e a massa média de um aminoácido em uma proteína é de 110 daltons.
Dado que a densidade média de uma proteína é de 1,4 g/cm3, que fração do volume
de uma célula ocuparia 10 bilhões de moléculas médias de proteína? Considere uma
célula hepática, que tem um volume de cerca de 5.000 ÿm3, e uma célula pancreática
exócrina, que tem um volume de cerca de 1.000 ÿm3.
12–21 A bicamada lipídica, com 5 nm de espessura, ocupa cerca de 60% do volume de

uma membrana celular típica. (Os lipídios e as proteínas contribuem igualmente com
base na massa, mas os lipídios são menos densos e, portanto, representam mais
volume.) Para as células hepáticas e células exócrinas pancreáticas, a área total de
todas as membranas celulares é estimada em cerca de 110.000 ÿm2 e 13.000 ÿm2 ,
A TALIZAÇÃO COMPARA TMEN DAS CÉLULAS 239
respectivamente. Que fração dos volumes totais dessas células é representada por
bicamadas lipídicas? e volumes de células hepáticas e pancreáticas exócrinas 3 e
células têm cerca de 5000 ÿm
1000 ÿ m 3, respectivamente. as
12–22 O RE rugoso é o local de síntese de muitas classes de proteínas de membrana.

Algumas dessas proteínas permanecem no RE, enquanto outras são classificadas
em compartimentos como o aparelho de Golgi, lisossomos e a membrana plasmática.
Uma medida da dificuldade do problema de classificação é o grau de “purificação”
que deve ser alcançado durante o transporte do pronto-socorro para os outros
compartimentos. Por exemplo, se as proteínas de membrana ligadas à membrana
plasmática representassem 90% de todas as proteínas no RE, então apenas um
pequeno grau de purificação seria necessário (e o problema de classificação
pareceria relativamente fácil). Por outro lado, se as proteínas da membrana
plasmática representassem apenas 0,01% das proteínas no RE, um grau muito
grande de purificação seria necessário (e o problema de classificação pareceria
correspondentemente mais difícil).
Qual é a magnitude do problema de ordenação? Que fração das proteínas de
membrana no RE são destinadas a outros compartimentos? Algumas considerações
simples permitem responder a essas perguntas. Suponha que todas as proteínas a
caminho de outros compartimentos permaneçam no RE por 30 minutos em média
antes de sair, e que a proporção de proteínas para lipídios nas membranas de todos
os compartimentos seja a mesma.
A. Em uma célula em crescimento típica que se divide uma vez a cada 24 horas, o
equivalente a uma nova membrana plasmática deve transitar pelo RE todos os dias.
Se a membrana do RE tem 20 vezes a área de uma membrana plasmática, qual é
a razão entre as proteínas da membrana plasmática e outras proteínas da membrana
no RE?
B. Se na mesma célula a membrana de Golgi tem três vezes a área da membrana
plasmática, qual é a razão entre as proteínas da membrana de Golgi e outras
proteínas de membrana no RE?
C. Se as membranas de todos os outros compartimentos (lisossomos, endossomos,
membrana nuclear interna e vesículas secretoras) que recebem proteínas de
membrana do RE são iguais em área total à área da membrana plasmática, que
fração das proteínas de membrana no RE ER desta célula são residentes
permanentes da membrana ER?
TRATAMENTO DE DADOS
12–23 Embora a grande maioria das proteínas transmembrana se insira nas membranas com
a ajuda de máquinas de translocação de proteínas dedicadas, algumas proteínas
podem se inserir nas membranas por conta própria. Essas proteínas podem fornecer
uma janela para como a inserção da membrana ocorreu nos dias anteriores à
evolução dos translocadores complexos.
Você está estudando uma proteína que se insere na membrana bacteriana
independente da maquinaria normal de translocação. Essa proteína tem um
segmento hidrofílico de 18 aminoácidos N-terminal que está localizado na parte
externa da membrana, um segmento transmembrânico hidrofóbico de 19 aminoácidos
cercado por aminoácidos carregados negativamente e positivamente e um segmento
C-terminal domínio que reside dentro da célula (Figura 12-1A). Se a proteína for
inserida corretamente na membrana, o segmento N-terminal é exposto externamente
onde pode ser cortado por uma protease, permitindo que você quantifique a inserção.
Para examinar as funções do segmento hidrofóbico e suas cargas anking, você

constrói um conjunto de genes modificados que expressam proteínas mutantes com
cargas alteradas no segmento N-terminal, comprimentos alterados do segmento
hidrofóbico e combinações dos dois ( Figura 12-1B).
Para cada gene você mede a fração da proteína total que é clivada pela protease,
que é a fração que foi inserida corretamente (Figura 12-1B). Para avaliar a
contribuição do potencial de membrana normal (externo positivo, interno negativo),
repita as medições no
presença de CCCP, um ionóforo que elimina a carga na membrana (Figura 12-1B). (A)
N
–
A. Qual das duas cargas N-terminais negativas é a mais importante para a inserção da FORA +
proteína na presença do potencial de membrana normal (menos CCCP)? Explique seu

–
raciocínio.
B. Na presença do potencial de membrana (menos CCCP), o segmento hidrofóbico ou a
carga N-terminal é mais importante para a inserção da proteína na membrana? Explique
seu raciocínio. DENTRO + –
C. Na ausência do potencial de membrana (mais CCCP), o segmento hidrofóbico ou a

carga N-terminal é mais importante para a inserção da proteína na membrana? Explique
seu raciocínio. C
O TRANSPORTE DE MOLÉCULAS ENTRE OS

(B) por cento inserido
NÚCLEO E O CITOSOLO construir – CCCP + CCCP
––
TERMOS PARA APRENDER +
1. 99 99
membrana nuclear interna lâmina nuclear receptor de transporte
+
envelope nuclear lâmina nuclear nuclear
2. 98 98
receptor de exportação localização nuclear nucleoporina
nuclear sinal de sinal membrana ––
+
nuclear externa 3. 93 54
exportação nuclear receptor de importação
complexo
nuclear
de poro nuclear
(NPC) Corrido ––
+
4. 65 0
DEFINIÇÕES
–
+
Combine a definição abaixo com seu termo na lista acima. 5. 58 0
–
+
12–24 Sinal de classificação contido na estrutura de macromoléculas e complexos que são
6. 0 0
transportados do núcleo para o citosol através de complexos de poros nucleares.
+
7. 0 0
12–25 Grande estrutura multiproteica formando um canal através do envelope nuclear que permite
que moléculas selecionadas se movam entre o núcleo e o citoplasma.
Figura 12-1 Inserção de uma pequena proteína
na membrana bacteriana (Problema 12-23).
12–26 GTPase monomérica presente tanto no citosol quanto no núcleo, necessária para o (A) Orientação normal da proteína na
transporte ativo de macromoléculas para dentro e para fora do núcleo através de membrana. (B) Proteínas mutantes usadas
complexos de poros nucleares. para investigar as contribuições das
cargas N-terminais negativas e o comprimento
12–27 Malha fibrosa de proteínas na superfície interna da membrana nuclear interna. do segmento hidrofóbico para a inserção
da membrana. A presença de cargas negativas
é indicada por –; os cilindros verdes indicam
os problemas
comprimento dosp12.01/12.01
transmembrana segmentos odeleções
helicoidais;hidrofóbicos
12-28 Proteína que liga sinais de localização nuclear e facilita o transporte de proteínas com
dos segmentos hidrofóbicos são mostradas
esses sinais do citosol para o núcleo através de complexos de poros nucleares. como lacunas.
A percentagem inserida refere-se à
proporção da proteína total cujos terminais
12–29 Sinal de classificação encontrado em proteínas destinadas ao núcleo e que permitem seu N são sensíveis à digestão por protease.
transporte seletivo para o núcleo a partir do citosol através dos complexos dos poros
nucleares.
12–30 A porção do envelope nuclear que é contínua com o retículo endoplasmático e é

cravejada de ribossomos em sua superfície citosólica.
VERDADEIRO FALSO
12–31 A membrana nuclear é livremente permeável a íons e outras pequenas moléculas

abaixo de 5.000 daltons.
12–32 Para evitar as inevitáveis colisões que ocorreriam se fosse permitido o trajeto bidirecional
através de um único poro, os complexos de poros nucleares são especializados de
modo que alguns medeiam a importação enquanto outros medeiam a exportação.
O TRANSPORTE DE MOLÉCULAS ENTRE O NÚCLEO E O CITOSOL 241
nuclear Figura 12–2 Corte transversal através de um

CITOSOL
poro complexo de poros nucleares, mostrando a
continuidade das membranas nucleares interna
envelope
e externa (Problema 12–35).
nuclear
NÚCLEO
12–33 Algumas proteínas são mantidas fora do núcleo, até que sejam necessárias, pela inativação
de seus sinais de localização nuclear por fosforilação.
12–34 Todas as proteínas citosólicas têm sinais de exportação nuclear que permitem que sejam
removido do núcleo quando ele se reagrupa após a mitose.
12–35 Conforme mostrado na Figura 12–2, as membranas nucleares interna e externa formam
uma folha contínua, conectando-se através dos poros nucleares. A continuidade
implica que as proteínas da membrana podem se mover livremente entre as duas
membranas nucleares por difusão através da bicamada nos poros nucleares.
No entanto, as membranas nucleares interna e externa têm diferentes composições
de proteínas, assim como suas diferentes funções. Como você acha que esse aparente
paradoxo é reconciliado?
12–36 Como é que um único complexo de poro nuclear pode transportar eficientemente proteínas
que possuem diferentes tipos de sinal de localização nuclear?
12–37 Como você supõe que as proteínas com um sinal de exportação nuclear entram no núcleo?
12–38 Seu orientador está explicando seus resultados mais recentes em sua reunião semanal de laboratório.
Ao fundir sua proteína de interesse à proteína fluorescente verde (GFP), ele mostrou
que ela está localizada inteiramente no núcleo. Mas ele se pergunta se é uma verdadeira
proteína nuclear ou uma proteína de transporte que passa a maior parte do tempo no
núcleo. Ele não tem certeza de como resolver esse problema. Tendo acabado de ler
um artigo sobre como um problema semelhante foi resolvido, você sugere que ele faça
um heterocário fundindo células que expressam sua proteína marcada com um excesso
de células que não a expressam. Você diz a ele que, na presença de um inibidor da
síntese de proteínas para bloquear a nova síntese da proteína marcada, ele pode
resolver o problema examinando células fundidas com dois núcleos. Ele lhe dá um olhar
perplexo e pergunta: "Como isso ajuda?"
Você diz a ele o que ele sempre disse a você: "tinta sobre isso".
A. Como o exame dos dois núcleos em um heterocário responderia à pergunta? Que
resultados você esperaria se a proteína fosse uma proteína nuclear verdadeira? O que (A) NES-BSA
você esperaria se fosse uma proteína de vaivém?

B. Por que você sugeriu que um inibidor da síntese de proteínas seria necessário neste
+ citoplasma
experimento? + GTP
12–39 Os sinais de localização nuclear não são clivados após o transporte para o núcleo, enquanto
as sequências de sinal para importação para outras organelas são frequentemente
(B)
removidas após a importação. Por que você acha que é crítico que os sinais de
localização nuclear permaneçam ligados às suas proteínas?
+ Crm1
12–40 Para testar a hipótese de que a direcionalidade do transporte através da membrana nuclear + RanQ69L-GTP
é determinada principalmente pelo gradiente de Ran GDP fora do núcleo e Ran-GTP
dentro do núcleo, você decide inverter o gradiente para ver se consegue forçar o
importação de uma proteína que normalmente é exportada do núcleo. Você adiciona
um substrato de exportação nuclear bem definido, BSA fluorescente acoplado a um Figura 12–3 Direcionalidade do transporte
nuclear (Problema 12–40). (A) Exclusão de NES-
sinal de exportação nuclear (NES-BSA), ao ensaio de células permeabilizadas padrão. BSA fluorescente do núcleo em um ensaio de
Com certeza, ele é excluído dos núcleos (Figura 12-3A). Agora você adiciona Crm1, o importação padrão. (B) Importação de NES-BSA
receptor de exportação nuclear que reconhece o sinal de exportação, e RanQ69L-GTP, fluorescente na presença de Crm1 e RanQ69L-
um GTP.
forma mutante de Ran que não pode hidrolisar GTP. Com essas adições, o BSA
marcado agora entra nos núcleos (Figura 12-3B). Ao contrário da importação
nuclear convencional, que concentra as proteínas importadas no núcleo, a
concentração de NES-BSA no núcleo no ensaio de importação não é maior do que
no citoplasma circundante.
A. Por que o NES-BSA não se acumula em uma concentração maior no núcleo do que
no citoplasma nesses experimentos?
B. Em um ensaio padrão de importação nuclear com adição de citoplasma e GTP, as
proteínas com um sinal de localização nuclear acumulam-se essencialmente em
100% no núcleo. Como é que o ensaio padrão permite 100% de acúmulo no
núcleo?
CÁLCULOS
12–41 Seguindo o aumento da uorescência nuclear ao longo do tempo nos experimentos de

importação nuclear forçada na Figura 12–3B, os autores foram capazes de mostrar
que a uorescência nuclear atingiu metade de seu valor máximo em 60 segundos.
Como a concentração adicionada de NES-BSA foi de 0,3 ÿM, sua concentração
no núcleo após 60 segundos foi de 0,15 ÿM. Dado que o volume do núcleo é 500
fL e que cada núcleo contém 3.000 poros nucleares, calcule a taxa de importação
de NES-BSA por poro neste experimento. (Para este cálculo, despreze a
exportação de NES-BSA.) Sua resposta é fisiologicamente razoável? Por que ou
por que não?
12–42 Um poro nuclear pode dilatar para acomodar uma partícula de ouro de 26 nm de
diâmetro. Se pudesse acomodar uma proteína esférica com as mesmas dimensões,
qual seria a massa molecular da proteína (g/mol)? [Assuma que a densidade da
proteína é de 1,4 g/cm3. O volume de uma esfera é (4/3)r3.]
12–43 Supondo que 32 milhões de octâmeros de histonas sejam necessários para empacotar
o genoma humano, quantas moléculas de histonas devem ser transportadas por
segundo por complexo de poro nuclear em células cujos núcleos contêm 3.000
poros nucleares e estão se dividindo uma vez por dia?
(A)
12–44 O complexo do poro nuclear (NPC) cria uma barreira à livre troca de moléculas
entre o núcleo e o citoplasma, mas de uma forma que permanece misteriosa. Na
levedura, por exemplo, o poro central tem um diâmetro de 35 nm e 30 nm de
comprimento, o que é um pouco menor do que a sua contraparte nos vertebrados.
Mesmo assim, é grande o suficiente para acomodar praticamente todos os
componentes do citosol. No entanto, o poro permite a difusão passiva de
moléculas apenas até cerca de 40 kd; entrada de qualquer coisa maior requer
ajuda de um receptor de importação nuclear. A permeabilidade seletiva é controlada
por componentes proteicos do NPC que possuem caudas polares não estruturadas
que se estendem para o poro central. Essas caudas são caracterizadas por
(B) solução gel
repetições periódicas dos aminoácidos hidrofóbicos fenilalanina (F) e glicina (G).
Em concentração alta o suficiente (50 mM), os domínios de repetição FG
30s
dessas proteínas podem formar um gel, com uma malha de interações entre as
repetições FG hidrofóbicas (Figura 12-4A). Esses géis permitem a difusão passiva
10 minutos
de pequenas moléculas, mas impedem a entrada de proteínas maiores, como a
proteína fluorescente mCherry fundida à proteína de ligação à maltose
30 minutos
MBP-mCherry
Figura 12-4 Gel de repetição FG e influxo de proteínas no núcleo (Problema
12-44). (A) Desenho da malha (gel) formada por interações emparelhadas
30s
entre repetições FG hidrofóbicas. Para repetições FG separadas por 17
aminoácidos, como é típico, a malha formada por cadeias laterais de
aminoácidos estendidas corresponderia a cerca de 4 nm de lado, o que seria 10 minutos
grande o suficiente para explicar a difusão passiva característica de
proteínas através dos poros nucleares . (B) Difusão de MBP-mCherry e
30 minutos
importina-MBP-GFP em um gel de FG-repetições. Em cada grupo, a
solução é mostrada à esquerda e o gel à direita. As áreas brilhantes
indicam regiões que contêm as proteínas fluorescentes. importin-MBP-GFP
(MBP) (Figura 12-4B). (A fusão com MBP torna o mCherry muito grande para preparação de injeção injeção
entrar no núcleo por difusão passiva.) No entanto, se o receptor de importação nucleoplasmina nuclear citoplasmática
nuclear, importina, for fundido a uma proteína semelhante, MBP-GFP, a fusão intacto
importina MBP-GFP entra facilmente no gel ( Figura 12–4B).
A. FG-repetições apenas formam géis in vitro em concentração relativamente alta
(50 mM). Essa concentração é razoável para repetições de FG no núcleo do
NPC? Na levedura, existem cerca de 5.000 repetições de FG em cada NPC.
Dadas as dimensões do poro nuclear da levedura (35 nm de diâmetro e 30 nm Uma cauda
de comprimento), calcule a concentração de repetições FG no volume cilíndrico

do poro. Essa concentração é comparável à usada in vitro?
B. A difusão de importina-MBP-GFP através do gel de repetição FG é rápida o
suficiente para explicar o fluxo eficiente de materiais entre o núcleo e o citosol?
A partir de experimentos do tipo mostrado na Figura 12-4B, o coeficiente de
apenas cabeças
difusão (D) de importina-MBP-GFP através do gel de repetição FG foi
determinado em cerca de 0,1 ÿm2/seg. A equação para a difusão é t = x2/2D,
onde t é o tempo e x é a distância. Calcule o tempo que levaria importin-MBP-
GFP para diusar através de um poro nuclear de levedura (30 nm) se o poro
consistisse em um gel de repetições FG. Esse tempo parece rápido o suficiente apenas caudas
para as necessidades de uma célula eucariótica?
TRATAMENTO DE DADOS
12-45 Antes que os complexos de poros nucleares fossem bem compreendidos, não Figura 12–5 Localização celular da
estava claro se as proteínas nucleares difundiam-se passivamente no núcleo e nucleoplasmina injetada e dos
acumulavam-se ali ligando-se a residentes do núcleo, como os cromossomos, componentes da nucleoplasmina (Problema
12–45). Diagramas esquemáticos de
ou se eram ativamente importadas e acumuladas, independentemente de suas autorradiografias mostram o citoplasma e o
propriedades. anidade para componentes nucleares. núcleo com a localização da nucleoplasmina indicada pelo
Um experimento clássico que abordou esse problema usou várias formas áreas.
de nucleoplasmina radioativa, que é uma grande proteína pentamérica envolvida

na montagem da cromatina. Nesse experimento, a proteína intacta ou as
cabeças, caudas ou cabeças com cauda única da nucleoplasmina foram
injetadas no citoplasma de um oócito de rã ou no núcleo (Figura 12-5). Todas
as formas de nucleoplasmina, exceto cabeças, acumularam-se no núcleo
quando injetadas no citoplasma, e todas as formas foram retidas no núcleo
quando injetadas lá.
A. Que porção da molécula de nucleoplasmina é responsável pela localização no
núcleo?
B. Como esses experimentos distinguem entre transporte ativo, no qual um sinal de
localização nuclear desencadeia o transporte pelo complexo do poro nuclear, e
a difusão passiva, na qual um sítio de ligação para um componente nuclear
permite o acúmulo no núcleo?
pNL+
12–46 Você acabou de ingressar em um laboratório que está analisando o maquinário de proteína nuclear EcoRI
transporte nuclear em levedura. Sua orientadora, conhecida por suas ideias
extraordinariamente inteligentes, deu a você um projeto com enorme potencial. Gal1 NLS
Em princípio, permitiria uma seleção genética para mutantes letais condicionais promotor presente
no aparato de transporte nuclear.
Ela te deu dois plasmids. Cada plasmídeo consiste em um gene híbrido sob pNL–
o controle de um promotor regulável (Figura 12-6). O gene híbrido é uma fusão
proteína nuclear EcoRI
entre um gene cujo produto é normalmente importado para o núcleo e o gene
da nuclease de restrição EcoRI. O plasmídeo pNL+ contém um sinal de
Gal1 NLS
localização nuclear funcional (NLS); o plasmídeo pNL– não possui um NLS. O ausente
promotor
promotor, que é do gene Gal1 da levedura , permite a transcrição do gene
híbrido somente quando o açúcar galactose está presente no meio de
crescimento. Figura 12–6 Dois plasmídeos
Seguindo suas instruções, você introduz os plasmídeos na levedura (na para investigar a localização nuclear em
levedura (Problema 12–46). Os plasmídeos
ausência de galactose) e então analisa a levedura transformada em meio
são mostrados como moléculas lineares
contendo glicose e em meio contendo galactose. Seus resultados são mostrados para maior clareza. As setas indicam a direção
na Tabela 12–1. Você não se lembra do que seu orientador da transcriçãoGal1.
Problemas
p12.05/12.06 do promotor de
244 Capítulo 12: Compartimentos Intracelulares e Seleção de Proteínas
(A) + GTP – GTP

TABELA 12–1 Resultados de experimentos de proliferação com plasmídeos portadores de
levedura pNL+ ou pNL– (Problema 12–46).
Corrido
plasmídeo meio de glicose meio de galactose
pNL+ proliferação morte
Ran
pNL– proliferação proliferação
+ importin
importando
disse para esperar, mas você sabe que deverá explicar esses resultados na reunião
semanal do laboratório.
Por que as leveduras com o plasmídeo pNL+ proliferam na presença de glicose,
mas morrem na presença de galactose, enquanto as leveduras com o plasmídeo
pNL- proliferam em ambos os meios? (B) 1ª incubação: 2ª incubação:
Como você pode usar este sistema para um ensaio de seleção para isolar células importina + substrato Correu + GTP
defeituoso no transporte nuclear?
12–47 A importina purificada na presença de Ran e GTP promove a absorção de um substrato

marcado nos núcleos (Figura 12–7A). Nenhuma captação ocorre na ausência de
GTP, e Ran sozinho é incapaz de promover a captação nuclear.
A importina por si só causa um acúmulo de substrato independente de GTP na
periferia nuclear, mas não promove a captação nuclear (Figura 12-7A). Figura 12–7 Efeitos de Ran, importina e GTP na
absorção nuclear do substrato marcado com
uoresceína (Problema 12–47).
Para definir as etapas da via de absorção, você primeiro incuba núcleos com (A) Comparação de várias combinações de Ran e
substrato na presença de importina. Em seguida, você lava a importina livre e o importin na presença e ausência de GTP. (B)
substrato e incuba uma segunda vez com Ran e GTP (Figura 12-7B). Incubação em dois estágios dos restos celulares com
importina e substrato e depois com Ran e
GTP.
A. Por que você acha que o substrato se acumula na periferia nuclear, como é visto na
Os círculos são os núcleos; círculos muito claros são
ausência de GTP ou apenas com importina na presença de GTP? núcleos sem substrato ligado.
B. Na medida em que esses dados permitirem, defina a ordem dos eventos que levam a
captação de substrato para o núcleo.
12–48
As estruturas de Ran-GDP e Ran-GTP (na verdade, Ran-GppNp, um análogo estável
do GTP) são surpreendentemente diferentes, conforme mostrado na Figura 12-8. Não
surpreendentemente, Ran-GDP se liga a um conjunto diferente de proteínas do que
Ran GTP.
Para observar a captação do próprio Ran nos núcleos das células permeabilizadas,
você anexa uma etiqueta fluorescente vermelha a uma cadeia lateral de cisteína em
Ran para torná-la visível. é modificado Ran suporta absorção nuclear normal.
O Ran-GDP fluorescente é captado pelos núcleos apenas se o citoplasma for
adicionado, enquanto uma forma mutante, RanQ69L-GTP, que é incapaz de hidrolisar
o GTP, não é captada na presença ou ausência de citoplasma. Para identificar a
proteína citoplasmática que é crucial para a captação de Ran-GDP, você constrói
colunas anity com Ran-GDP ligado ou RanQ69L-GTP ligado e passa
Ran-GppNp Ran-PIB
Figura 12–8 Estruturas de Ran-GDP e Ran-GppNp (Problema 12–48). O segmento de Ran mostrado em
vermelho exibe duas conformações dramaticamente diferentes, dependendo se o GDP ou o análogo de GTP
está ligado.
Plm 12712
citoplasma através deles. O citoplasma passado por uma coluna Ran-GDP não suporta
mais a absorção nuclear de Ran-GDP, enquanto o citoplasma passado por uma coluna
Ran-PIB RanQ69L-GTP
de RanQ69L-GTP retém essa atividade. Você elui as proteínas ligadas de cada coluna
e as analisa em um gel SDS de poliacrilamida, procurando diferenças que possam kd
identificar o fator necessário para a captação nuclear de Ran (Figura 12-9). 158
116
97
A. Por que você usou RanQ69L-GTP em vez de Ran-GTP nesses experimentos? Você
68
poderia ter usado Ran-GppNp em vez de RanQ69L-GTP para atingir o mesmo objetivo?
46
B. Qual das muitas proteínas eluídas das duas colunas de anidade diferentes é uma
candidata provável para o fator que promove a importação nuclear de Ran-GDP? 27
20
C. Que outra proteína ou proteínas você preveria a importação Ran-GDP 14
fator se ligaria para realizar sua função? 7
D. Como você pode confirmar que o fator que você identificou é necessário 1 2
para promover a absorção nuclear de Ran?

Figura 12–9 Proteínas eluídas das colunas
12–49 O antibiótico de amplo espectro leptomicina B inibe a exportação nuclear, mas como
de afinidade Ran GDP (pista 1) e RanQ69L-
isso funciona? Na levedura S. pombe, a resistência à leptomicina B pode surgir por GTP (pista 2) (Problema 12–48). As massas
mutações no gene Crm1 , que codifica um receptor de exportação nuclear para moleculares das proteínas marcadoras são
proteínas com sinais de exportação nuclear ricos em leucina. Para observar a exportação mostradas à esquerda.
nuclear diretamente, modifique a proteína fluorescente verde (GFP) adicionando um

sinal de exportação nuclear (NES). Tanto nas células selvagens quanto nas mutantes
que são resistentes à leptomicina B, a NES-GFP é encontrada exclusivamente no
citoplasma na ausência de leptomicina B (Figura 12-10). Na presença de leptomicina
B, no entanto, NES-GFP está presente nos núcleos das células do tipo selvagem, mas
no citoplasma das células mutantes (Figura 12-10). Esse resultado é o que você
esperaria se a leptomicina B bloqueasse a exportação nuclear?
Por que ou por que não?
12–50 Oócitos de rã são um sistema experimental útil para estudar a exportação nuclear porque
são células grandes com núcleos grandes. É fácil (com prática) injetar oócitos com
RNA marcado e separar o núcleo e o citoplasma para seguir o destino do marcador
injetado. Você injeta uma mistura de várias moléculas de RNA marcadas com 32P no
núcleo na presença e ausência de leptomicina B para estudar seu efeito na exportação
nuclear de RNA.
Imediatamente após a injeção e três horas depois, você analisa o conteúdo total (T),
citoplasmático (C) e nuclear (N) por eletroforese em gel de poliacrilamida e
autorradiografia (Figura 12-11).
A. Quão boa foi sua técnica de injeção? Você realmente injetou no núcleo? Você rasgou o
envelope nuclear quando injetou os RNAs? Como você sabe?
B. Quais dos RNAs, se houver, são normalmente exportados do núcleo?

C. A exportação de algum dos RNAs é inibida pela leptomicina B? O que sua resposta
leptomicina B, nM 00 100 tempo, hr
implica sobre a exportação dessa coleção de RNAs?
0 3 3
TCNTCNTCN
mRNA
- leptomicina B + leptomicina B
NES-GFP NES-GFP U1 snRNA
U5 snRNA
U6 snRNA
DNA DNA
tRNA
tipo selvagem mutante mutante

tipo selvagem
Figura 12-11 Efeitos da leptomicina B na
Figura 12–10 Distribuição de NES-GFP em S. pombe na presença e ausência de leptomicina B exportação de vários RNAs de núcleos
(Problema 12–49). As áreas claras nos painéis NES-GFP mostram a posição do GFP. As áreas de oócitos de rã (Problema 12-50). As frações
claras nos painéis de DNA resultam de uma mancha que se liga ao DNA e marca a posição dos total (T), citoplasmática (C) e nuclear (N) são
núcleos nas células nos painéis NES-GFP. indicadas.
246 Capítulo 12: Compartimentos intracelulares e classificação de proteínas
O TRANSPORTE DE PROTEÍNAS PARA

MITOCÔNDRIAS E CLOROPLASTIOS
cloroplasto precursor mitocondrial membrana interna Complexo SAM

proteína espaço intermembranas estroma
espaço matriz da membrana externa tilacoide
Complexo OXA Complexo TIM
mitocôndria porina mitocondrial complexo TOM
proteína hsp70 translocador
DEFINIÇÕES
12–51 Organelas envoltas por membrana, aproximadamente do tamanho de bactérias, que realizam
a fosforilação oxidativa e produzem a maior parte do ATP nas células eucarióticas.
12–52 Parte de um conjunto de proteínas com várias subunidades que está ligado ao lado da matriz
do complexo TIM23 e atua como um motor para puxar a proteína precursora para o
espaço da matriz.
12–53 Conjunto de proteínas de múltiplas subunidades que transporta proteínas através do mito
membrana externa condrial.
12–54 e espaço da matriz de um cloroplasto.
12–55 Membrana de uma mitocôndria que envolve a matriz e é dobrada em cristas.
12–56 Subcompartimento central de uma mitocôndria, envolvido pelo

membrana mitocondrial.
12–57 Saco achatado de membrana em um cloroplasto que contém as subunidades proteicas do

sistema fotossintético e da ATP sintase.
12–58 Proteína codificada por um gene nuclear, sintetizada no citosol e subsequentemente

transportada para a mitocôndria.
VERDADEIRO FALSO
12–59 O complexo TOM é necessário para a importação de todos os núcleos codificados

proteínas mitocondriais.
12–60 As duas sequências de sinal necessárias para o transporte de proteínas codificadas

no núcleo para a membrana mitocondrial interna através do complexo TIM23 são clivadas
da proteína em diferentes compartimentos mitocondriais.
12–61 A importação de proteínas para as mitocôndrias e cloroplastos é muito semelhante; até

mesmo os componentes individuais de suas máquinas de transporte são homólogos,
como aposta em sua origem evolutiva comum.
12–62 Para auxiliar seus estudos sobre a importação de proteínas para as mitocôndrias, você trata
células de levedura com cicloheximida, que bloqueia o movimento dos ribossomos ao
longo do mRNA. Ao examinar essas células no microscópio eletrônico, você fica surpreso
ao encontrar ribossomos citosólicos ligados à parte externa da mitocôndria. Você nunca
viu ribossomos ligados na ausência
O TRANSPORTE DE PROTEÍNAS PARA AS MITOCÔNDRIAS E CLOROPLASTOS 247
de cicloheximida. Para investigar melhor esse fenômeno, você prepara mitocôndrias de

células que foram tratadas com cicloheximida e, em seguida, extrai o mRNA que está
ligado aos ribossomos associados às mitocôndrias. Você traduz esse mRNA in vitro e
compara os produtos proteicos com mRNA traduzido de forma semelhante do citosol.
Os resultados são claros: os ribossomos associados às mitocôndrias são mRNAs
translantes que codificam proteínas mitocondriais.
Você está surpreso! Aqui, claramente visível nas micrografias eletrônicas, parece
ser a prova de que a importação de proteínas para as mitocôndrias ocorre durante a
tradução. Como você pode reconciliar esse resultado com a visão predominante de que
as proteínas mitocondriais são importadas somente depois de terem sido sintetizadas
e liberadas dos ribossomos?
12–63 Você criou um peptídeo que contém um sinal de importação mitocondrial funcional. Você
esperaria que a adição de um excesso desse peptídeo afetasse a importação de
proteínas mitocondriais? Por que ou por que não?
12-64 Os componentes dos complexos TIM, os translocadores de proteínas de várias subunidades

na membrana interna mitocondrial, são muito menos abundantes do que os do complexo
TOM. Eles foram inicialmente identificados usando um truque genético. O gene Ura3 da
levedura, cujo produto é uma enzima normalmente localizada no citosol onde é essencial
para a síntese de uracil, foi modificado para que a proteína carregasse um sinal de
importação para a matriz mitocondrial. Uma população de células portadoras do gene
Ura3 modificado no lugar do gene normal foi então cultivada na ausência de uracil. A
maioria das células morreu, mas as raras células que cresceram mostraram-se
defeituosas para serem importadas para a matriz mitocondrial. Explique como essa
seleção identifica células com defeitos em componentes necessários para importação
na matriz mitocondrial. Por que as células normais com o gene Ura3 modificado não
crescem na ausência de uracil? Por que as células defeituosas para importação
mitocondrial crescem na ausência de uracil?
12–65 As mitocôndrias normalmente fornecem às células a maior parte do ATP necessário para
atender às suas necessidades de energia. As mitocôndrias que não podem importar
proteínas são defeituosas para a síntese de ATP. Como é que as células com
mitocôndrias defeituosas podem sobreviver? Como eles obtêm o ATP de que precisam
para funcionar?
12–66 Descreva de forma geral como você pode usar proteínas e proteases radiomarcadas para
estudar processos de importação em mitocôndrias isoladas e intactas.
Que tipos de controles experimentais você pode incluir para garantir que os resultados
obtidos signifiquem o que você acha que significam?
12–67 Se a enzima dihidrofolato redutase (DHFR), que normalmente está localizada no citosol, é
projetada para transportar uma sequência de direcionamento mitocondrial em seu N-
terminal, ela é importada com eficiência para as mitocôndrias. Se a DHFR modificada
for primeiro incubada com metotrexato, que se liga firmemente ao sítio ativo, a enzima
permanece no citosol. Como você supõe que a ligação do metotrexato interfere na
importação mitocondrial?
12–68 Por que as mitocôndrias precisam de um translocador especial para importar proteínas
através da membrana externa, quando a membrana já possui grandes poros formados
por porinas?
CÁLCULOS
12–69 A grande maioria das proteínas mitocondriais é importada através da membrana

externa pelos translocadores de proteínas de várias subunidades conhecidos como
complexos TOM. Como o número de complexos TOM nas mitocôndrias de levedura é
conhecido (10 pmole/mg de proteína mitocondrial), é possível calcular se um
mecanismo co-traducional poderia explicar
para a maior parte da importação de proteína mitocondrial. Se todas as proteínas

mitocondriais fossem importadas co-translacionalmente, então 10 pmol de complexos
TOM precisariam importar 1 mg de proteína a cada geração. Dado que as
mitocôndrias dobram a cada 3 horas e que a taxa de síntese de proteínas é de 3
aminoácidos por segundo (que é, portanto, a taxa máxima de importação através de
um único complexo TOM), quantos miligramas de proteína mitocondrial poderiam
importar 10 pmol de complexos TOM em uma geração? (Em média, um aminoácido
tem uma massa de 110 daltons.)
TRATAMENTO DE DADOS
12–70 Barnase é uma ribonuclease bacteriana de 110 aminoácidos que é frequentemente

usada como modelo para estudos de dobramento e desdobramento de proteínas.
Forma uma estrutura dobrada compacta que possui alta energia de ativação para
desdobramento (cerca de 85 kJ/mol). Essa proteína pode ser importada para as mitocôndrias?
Ao N-terminal da barnase, você adiciona 35, 65 ou 95 aminoácidos do N-terminal do
pré-citocromo b2, todos os quais incluem o sinal de importação mitocondrial do
citocromo. A N35-barnase não é importada, a N65-barnase é importada a uma taxa
baixa e a N95-barnase é importada de forma muito eficiente para as mitocôndrias
isoladas. Nenhuma dessas extensões N-terminais tem qualquer efeito mensurável
na estabilidade do domínio barnase. Se essas proteínas forem desnaturadas antes
do teste para importação, todas serão importadas na mesma taxa alta. Como você
supõe que extensões N-terminais mais longas facilitam a importação de barnase?
12–71 As proteínas são importadas para a mitocôndria como cadeias polipeptídicas

completamente desdobradas, ou o aparelho de translocação pode acomodar
estruturas total ou parcialmente dobradas? Ou seja, a proteína é sugada como um
macarrão, ou é engolida inteira, como uma píton devora sua presa? É possível
transformar aminoácidos de cisteína em barnase e, em seguida, reticulá-los para
formar ligações dissulfeto entre C5 e C78 ou entre C43 e C80 (Figura 12-12). A
importação de N95-barnase (consulte o Problema 12-70) foi testada na presença e
ausência de ligações cruzadas de dissulfeto nessas duas posições. Sua importação
não foi afetada por nenhuma das ligações cruzadas. Por outro lado, a importação de
N65-barnase foi bloqueada pelo cross-link C5-C78, mas não foi afetada pelo cross-
link C43-C80. Esses resultados permitem distinguir entre a importação de cadeias
polipeptídicas estendidas ou de estruturas dobradas? Por que ou por que não?
12–72 Tim23 é um componente chave do complexo translocador de proteína mitocondrial

TIM23. A metade N-terminal de Tim23 é hidrofílica, enquanto a metade C-terminal é
hidrofóbica e provavelmente atravessa a membrana quatro vezes, conforme sugerido
pelo gráfico de hidropatia na Figura 12-13A . Para determinar o arranjo de Tim23 nas
membranas mitocondriais, uma protease foi adicionada a mitocôndrias intactas ou a
mitoplastos, que são mitocôndrias
barnase (C5–C78) barnase (C43–C80)
Figura 12–12 Estruturas de

S moléculas de barnase com
C-terminal S C-terminal
SS
ligações dissulfeto entre cisteínas nas
posições 5 e 78 (C5–C78) ou entre as
N-terminal N-terminal posições 43 e 80 (C43–C80) (Problema 12–71).
PEROXISOMAS 249
(A) (B) Figura 12-13 Arranjo de Tim23 nas

–
membranas mitocondriais (Problema
hidrofóbico mitocôndrias + +
– – +
12-72). (A) Gráfico de hidropatia para Tim23.
mitoplastos
protease
– + + (B) Sensibilidade de Tim23 em mitocôndrias
e mitoplastos à digestão com uma
hidrófilo protease.
anticorpos
50 100 150 200
número de resíduo específicos para
C-terminal
anticorpos
específicos para
metade N-
terminal
123
das quais as membranas externas foram removidas. A mobilidade de Tim23 foi detectada em
géis de poliacrilamida SDS por immunoblotting com anticorpos específicos para a metade N-
terminal ou para os problemas extremos de C-ter p12.16/12.13 menos de Tim23 (Figura
12-13B) . O Tim23 de tamanho normal estava presente tanto nas mitocôndrias quanto nos
mitoplastos (como mostrado para as mitocôndrias na Figura 12-13B), mas o Tim23 foi
parcialmente digerido quando as mitocôndrias e os mitoplastos foram tratados com uma
protease (Figura 12-13B).
A. O Tim23 é um componente integral da estrutura mitocondrial interna ou externa?
membrana? Explique seu raciocínio.
B. Na medida em que as informações deste problema permitirem, faça um diagrama do arranjo de
Tim23 nas membranas mitocondriais.
PEROXISOMAS
peroxina peroxissomo
DEFINIÇÕES
12–73 Pequena organela delimitada por membrana que usa oxigênio molecular para oxidar moléculas
orgânicas.
12–74 Uma das várias proteínas envolvidas na importação de proteínas para o peroxi
somes.
VERDADEIRO FALSO
Decida se essa afirmação é verdadeira ou falsa e explique por quê.
12–75 Os peroxissomos são encontrados em apenas alguns tipos especializados de células eucarióticas.
12–76 A catalase, uma enzima normalmente encontrada nos peroxissomos, está presente em
quantidades normais em células que não possuem peroxissomos visíveis. É possível
determinar a localização da catalase nessas células usando microscopia de imunouorescência
com anticorpos específicos para catalase. Micrografias de fluorescência de células normais e
células deficientes em peroxissoma são mostradas na Figura 12-14. Onde a catalase está
localizada nas células sem peroxissomos (Figura 12-14B)? Por que a catalase aparece como
pequenos pontos de fluorescência em células normais (Figura 12-14A)?
(A) (B) Figura 12-14 Localização da catalase nas células

conforme determinado por microscopia de
imunouorescência (Problema 12-76). (A)
Células normais. (B) Células deficientes em
peroxissoma. As células reagiram com anticorpos
específicos para catalase, lavadas e depois
coradas com um segundo anticorpo marcado
com uoresceína que é específico para o
anticorpo específico para catalase. Os
dois painéis estão na mesma ampliação; uma
barra de escala de 10 ÿm é mostrada em (B).
10 µm
12–77 Células com peroxissomos funcionais incorporam 9-(13-pireno)nonanol (P9OH) em

lipídios de membrana. A exposição dessas
Problemas células A
12.19/12.14 aoluz
ultravioleta (UV)
causa a morte celular porque a excitação da porção pireno gera espécies reativas de
oxigênio, que são tóxicas para as células. As células que não produzem peroxissomos
carecem de uma enzima crítica responsável por incorporar P9OH em lipídios de
membrana. Como você pode usar o P9OH para selecionar células que não possuem
peroxissomos?
TRATAMENTO DE DADOS
12–78 Você isolou duas linhagens de células mutantes que não possuem peroxissomos típicos.
Quando você testa essas células para enzimas peroxissômicas, descobre que a
atividade da catalase é virtualmente a mesma que nas células normais. Em contraste,
a atividade da acil CoA oxidase está ausente em ambas as linhagens celulares
mutantes. Para investigar a deficiência de acil CoA oxidase, você realiza um
experimento de pulso: você cultiva células por 1 hora em meio contendo 35S-
metionina, então as transfere para meio não marcado e imunoprecipita a acil CoA
oxidase em vários momentos após a transferência (Figura 12-15 ). Você observa
duas formas de oxidase em células normais, mas apenas uma nas linhagens de
células mutantes. Para esclarecer a relação entre as formas de 75 kd e 53 kd da
oxidase, você isola o mRNA do tipo selvagem e das linhagens de células mutantes,
traduz-o in vitro e imunoprecipita a acil CoA oxidase. Todas as três fontes de mRNA
fornecem níveis semelhantes da forma de 75 kd, mas nenhum da forma de 53 kd.
A. Como você acha que as duas formas de acil CoA oxidase em células normais estão
relacionadas? Qual deles, se for o caso, você acha que é a enzima ativa?
B. Por que as células mutantes têm apenas a forma de 75 kd da acil CoA oxidase e por
que você acha que ela desaparece durante o experimento de busca por pulso?
Se você tivesse feito um experimento semelhante com a catalase, acha que ela teria
se comportado da mesma maneira?
12–79 As proteínas que são importadas para a matriz do peroxissomo usando um sinal
tripeptídico C-terminal são reconhecidas pelo receptor citosólico Pex5, que se atraca
em um complexo de proteínas na membrana peroxissomal. A entrega por um receptor
citosólico distingue a importação peroxissômica da importação para as mitocôndrias,
cloroplastos e retículo endoplasmático. Além disso, ao contrário da importação para
essas organelas, os peroxissomos podem importar proteínas totalmente dobradas e
oligômeros de proteínas. Você deseja distinguir três modos de ação potenciais para
o Pex5: (1) ele entrega sua carga à membrana peroxissômica, mas permanece
citosólico; (2) entra no peroxissomo junto com sua carga; ou (3) circula entre o citosol
e a matriz peroxissômica.
células CHO normais mutante 1 mutante 2
perseguição (horas) 0 1 3 8 24 0 1 3 8 24 0138 24
75 kd
53 kd
Figura 12–15 Experimentos de busca por pulso
com células normais de ovário de hamster chinês
(CHO) e células mutantes (Problema 12–78).
PEROXISOMAS 251
Figura 12–16 Mecanismo de importação peroxissômica mediada por Pex5

(A) CONSTRUIR
(Problema 12–79). (A) Pex5 modificado. (B) Expectativas para diferentes
mecanismos de importação peroxissômica mediada por Pex5. (C) Análise local de
da transfecção do gene Pex5 modificado em células. “WCE” significa extrato de clivagem
células inteiras, “P” para pellet e “S” para sobrenadante. As proteínas foram Marca FLAG
Pex5
detectadas por immunoblotting usando mAb1 ou mAb2, seguido por reação
com um segundo anticorpo que se liga a mAb1 e mAb2 e também carrega
peroxidase de rábano ligada, que então converte um precursor adicionado em peptídeo
uma molécula emissora de luz que pode ser detectada em filme fotográfico.
As faixas pretas correspondem aos locais onde o filme foi exposto pela
molécula emissora de luz. Em (B), Pex5 não clivado (banda superior) e Pex5 (B) TEÓRICO
clivado (banda inferior) são separados por uma distância maior do que no experimento (C) para maior clareza.
PWCE S P WCE S
citosólico
Para definir o mecanismo de importação mediada por Pex5, você modifica o

gene Pex5 para codificar um segmento peptídico N-terminal que inclui um local de importado
clivagem para uma protease localizada exclusivamente na matriz do peroxissoma
(Figura 12-16A). Imediatamente adjacente ao local de clivagem está uma
ciclismo
sequência de aminoácidos (a chamada tag FLAG) que pode ser reconhecida por
mAb2 mAb1
anticorpos comerciais. Um anticorpo, mAb2, se liga à tag FLAG em qualquer
contexto, enquanto outro, mAb1, se liga à tag FLAG apenas quando está no (C) EXPERIMENTAL
terminal N e, portanto, detectará apenas Pex5 clivado. Ao preparar um extrato de PWCE S P WCE S
célula inteira (WCE) e fracioná-lo em um pellet (P), que contém os peroxissomos,
e sobrenadante (S), que contém o citosol, você pode distinguir os três mecanismos
mAb2 mAb1
possíveis de importação mediada por Pex5— citosólico, importado, cíclico -
usando os anticorpos mAb1 e mAb2, conforme mostrado na Figura 12–16B.
Quando você expressa o gene Pex5 modificado em células, prepara frações

celulares, separa as proteínas por eletroforese e as reage com anticorpos mAb1
e mAb2, você obtém os resultados mostrados na Figura 12-16C. Problemas p12.22/12.16
A. Explique os resultados teóricos (Figura 12–16B) esperados para cada um dos três
mecanismos possíveis de importação mediada por Pex5.
B. Com base nos resultados da Figura 12-16C, como o Pex5 medeia a importação de
proteínas para a matriz do peroxissoma? Explique seu raciocínio.
C. A importação mediada por Pex5 para os peroxissomos se assemelha mais à
importação para qual outra organela celular?
LINKS MÉDICOS
12–80 A hiperoxalúria primária tipo 1 (PH1) é uma doença autossômica recessiva letal
causada por uma deficiência da enzima peroxissomal específica do fígado alanina:
glioxilato aminotransferase (AGT). Cerca de um terço dos pacientes com PH1
possuem níveis significativos de proteína AGT e atividade enzimática.
A análise desses pacientes mostra que seu AGT contém duas alterações críticas
de aminoácidos únicos: uma que interfere no direcionamento peroxissômico e
uma segunda que permite que o N-terminal forme uma hélice anfifílica com um
lado carregado positivamente. Onde você acha que esse AGT mutante é
encontrado nas células desses pacientes? Explique seu raciocínio.
12–81 Os tripanossomas são parasitas unicelulares que causam a doença do sono quando
infectam humanos. Os tripanossomas de humanos carregam as enzimas para
uma porção da via glicolítica em uma organela semelhante ao peroxissomo,
denominada glicossoma. Em contraste, os tripanossomas do tsé-tsé y - o
hospedeiro intermediário - realizam a glicólise inteiramente no citosol. Esta
intrigante diferença despertou o interesse da empresa farmacêutica que o
emprega. Sua empresa deseja explorar essa diferença para controlar a doença.
Você decide estudar a enzima fosfoglicerato quinase (PGK) porque ela está
na porção afetada da via glicolítica. Os tripanossomas do y tsé-tsé expressam
PGK inteiramente no citosol, enquanto os tripanossomas de humanos expressam
90% da atividade total de PGK em glicossomas e apenas 10% no citosol. Quando
você clona genes PGK de
tripanossomas, você encontra três formas que diferem ligeiramente umas das outras. sonda oligo 1 oligo 2 oligo 3
fonte
Explorando essas pequenas diferenças, você projeta três oligonucleotídeos que se de mRNA H F HFHF
hibridam especificamente com os mRNAs de cada gene. Usando esses
oligonucleotídeos como sondas, você determina quais genes são expressos por
tripanossomas de humanos e de moscas tsé-tsé. Os resultados são mostrados na
Figura 12–17.
gene
A. Quais genes PGK são expressos em tripanossomas de humanos? Qual 3 gene 1
são expressos em tripanossomas de moscas tsé-tsé? gene 2
B. Qual gene PGK provavelmente codifica a forma glicossomal de PGK?
C. Você acha que a menor atividade citosólica de PGK em tripanossomas de humanos
se deve à classificação imprecisa em glicossomos? explique seu
responder.
Figura 12–17 Hibridização de sondas

RETÍCULO ENDOPLASMÁTICO oligonucleotídicas específicas
(oligos) para mRNA isolado de
TERMOS PARA APRENDER tripanossomas de humanos (H) e tsé-tsé (F)
(Problema 12–81). A intensidade das
BiP microssoma
bandas na autorradiografia reflete as
calnexina multipass proteína transmembrana polirribossomo
Problemas
concentrações 12.20/12.17
dos mRNAs.
calreticulina glicosilação
cotranslacional dolicol proteína pós-traducional
retículo RE rugoso
endoplasmático (RE)
lúmen ER Sec61 complexo de
proteína residente ER partícula de reconhecimento de sinal (SRP)
sinal de retenção ER proteína transmembrana de passagem única ER
sequência de sinal ER liso
Glicoproteína de ribossomo livre Receptor SRP sinal

de proteína de início de transferência
ancorada na cauda do RE sinal de parada de
Ribossomo transferência
ligado à membrana âncora GPI translocon resposta de proteína desdobrada
DEFINIÇÕES
12–82 Região do RE não associada a ribossomos.
12–83 Tipo de ligação lipídica pela qual algumas proteínas se ligam ao mem
brana.
12–84 Compartimento labiríntico envolto por membrana no citoplasma de células eucarióticas,

onde os lipídeos são sintetizados e as proteínas ligadas à membrana e as proteínas
secretoras são produzidas.
12–85 Complexo ribonucleoproteico que se liga a uma sequência sinal do RE em uma cadeia
polipeptídica parcialmente sintetizada e direciona o polipeptídeo e seu ribossomo
ligado ao RE.
12–86 Sequência de aminoácidos hidrofóbica que interrompe a translocação de uma cadeia

polipeptídica através da membrana do RE, ancorando assim a cadeia proteica na
membrana.
12–87 Descreve a importação de uma proteína para o RE antes que a cadeia polipeptídica seja
completamente sintetizada.
12–88 Sequência curta de aminoácidos em uma proteína que a mantém no RE.
12-89 Ação celular desencadeada por um acúmulo de proteínas mal dobradas no

É.
12–90 O translocador de proteína que forma um poro cheio de água no RE

RETÍCULO ENDOPLASMÁTICO 253
membrana, permitindo a passagem de uma cadeia polipeptídica enquanto ela é sintetizada

por ribossomos ligados à membrana.
12–91 Qualquer proteína com uma ou mais cadeias de oligossacarídeos ligadas covalentemente a
cadeias laterais de aminoácidos.
12–92 Ribossomo no citosol que não está ligado a nenhuma membrana.
VERDADEIRO FALSO
12–93 O peptídeo sinal se liga a um sítio hidrofóbico no ribossomo causando uma pausa na
síntese de proteínas, que recomeça quando o SRP se liga ao peptídeo sinal.
12-94 As cadeias polipeptídicas nascentes são transferidas através da membrana do RE

através de um poro no complexo translocador da proteína Sec61.
12–95 Em proteínas transmembrana multipass, os segmentos transmembrana ímpares (contando a

partir do N-terminal) agem como sinais de início de transferência e os segmentos pares
agem como sinais de parada de transferência.
12–96 O lúmen do RE contém uma mistura de agentes redutores contendo tiol que impedem
a formação de ligações S–S (ligações disulde) ao manter as cadeias laterais de cisteína
das proteínas luminais em forma reduzida (–SH).
12–97 Explique como uma molécula de mRNA pode permanecer ligada à membrana do RE enquanto
os ribossomos individuais que a traduzem são liberados e se juntam novamente ao pool
citosólico de ribossomos após cada ciclo de tradução.
12–98 Por que as proteínas chaperonas citosólicas hsp70 são necessárias para a importação de
proteínas para as mitocôndrias e cloroplastos, mas não para a importação cotranslacional
para o RE?
12–99 Onde você esperaria ver microssomos em uma micrografia eletrônica de uma célula hepática?
12–100 Compare e contraste a importação de proteínas para o RE e para o núcleo.

Liste pelo menos duas diferenças principais nos mecanismos e especule sobre por que o
mecanismo nuclear pode não funcionar para a importação de ER e vice-versa.
12–101 Quatro proteínas de membrana são representadas esquematicamente na Figura 12–18. As

caixas representam segmentos transmembrana e as setas representam locais para
clivagem da sequência de sinal. Preveja como cada uma das proteínas maduras será
disposta através da membrana do RE. Indicar
(A)
N 1 2 C
(B) –
+
Figura 12-18 Distribuição dos
N 1 C
segmentos transmembrana nas
proteínas a serem inseridas na
(C) – + membrana do RE (Problema 12-101). As
1 2 3 4
caixas representam os segmentos que abrangem
N C
a membrana e as setas indicam os locais nos
quais as sequências de sinal são clivadas. Os
(D) sinais positivos e negativos indicam os
aminoácidos carregados nas extremidades
N 1N 2 3 4 5 C de alguns segmentos transmembranares.
COOH Figura 12-19 Disposição de uma

proteína transmembrana multipassagem na
1 3 5 membrana do RE (Problema 12-102).
Hexágonos azuis representam
CITOSOL
oligossacarídeos ligados
covalentemente. As posições dos
aminoácidos carregados positivamente e
negativamente no segundo segmento transmembranar são mostr
É O LÚMEN
2 4 6
NH2
claramente os terminais N e C em relação ao citosol e ao lúmen do RE, e rotule cada

caixa como um sinal de início de transferência ou parada de transferência.
12–102 Examine a proteína transmembrana multipassagem mostrada na Figura 12–19.

Problemas p12.24/12.19 Qual
você preveria que seria o efeito da conversão do primeiro segmento transmembranar
hidrofóbico em um segmento hidrofílico? Esboce o arranjo da proteína modificada na
membrana do RE.
12–103 Por que seria vantajoso adicionar um bloco pré-montado de 14 açúcares a uma proteína
no RE, em vez de construir as cadeias de açúcar passo a passo na superfície da
proteína pela adição sequencial de açúcares por enzimas individuais ?
12–104 Descreva as etapas pelas quais proteínas mal dobradas no RE desencadeiam a síntese
de proteínas chaperonas adicionais do RE. Como essa resposta beneficia a célula?
12–105 Todos os novos fosfolipídios são adicionados à folha citosólica da membrana do RE,
mas a membrana do RE tem uma distribuição simétrica de diferentes fosfolipídios em
suas duas camadas. Em contraste, a membrana plasmática, que recebe todos os
seus componentes de membrana do RE, tem uma distribuição muito assimétrica de
fosfolipídios nas duas camadas de sua bicamada lipídica. Como a simetria é gerada
na membrana do RE e como a assimetria é gerada e mantida na membrana
plasmática?
TRATAMENTO DE DADOS
12–106 A translocação de proteínas através de membranas microssomais rugosas pode ser

julgada por vários critérios experimentais: (1) as proteínas recém-sintetizadas são
protegidas de proteases adicionadas, a menos que detergentes estejam presentes
para solubilizar a bicamada lipídica; (2) as proteínas recém-sintetizadas são
glicosiladas por oligossacarídeos transferases, localizadas exclusivamente no lúmen
do RE; (3) os peptídeos de sinal são clivados pela pepti-dase de sinal, que é ativa
apenas no lado luminal da membrana do RE.
Use esses critérios para decidir se uma proteína é translocada através das
membranas microssomais rugosas. O mRNA é traduzido em proteína em um sistema
livre de células na ausência ou presença de microssomos. Amostras de proteínas
recém-sintetizadas são tratadas de quatro maneiras diferentes: (1) nenhum
tratamento, (2) adição de uma protease, (3) adição de uma protease e detergente e
(4) rompimento de microssomos e adição de endoglicosidase H ( endo H), que
remove os açúcares N-ligados que são adicionados no ER. Uma análise eletroforética
dessas amostras é mostrada na Figura 12–20.
A. Explique os resultados experimentais observados na ausência de microsomes (Figura
12–20, pistas 1 a 4).
B. Usando os três critérios descritos no problema, decida se os resultados experimentais
na presença de microssomos (Figura 12-20, pistas 5 a 8) indicam que a proteína é
translocada através dos microssomos
MICROSSOMAS MICROSSOMAS
Figura 12–20 Resultados da tradução de
AUSENTE PRESENTE um mRNA puro na presença e ausência de
TRATAMENTO
membranas microssomais (Problema
– – – –
protease + + + + 12–106). Os tratamentos dos produtos
– – + – – – + – da tradução antes da eletroforese são
detergente
indicados no topo de cada pista.
– – – + – – – +
endo H A eletroforese foi em um gel de
poliacrilamida SDS, que separa as
proteínas com base no tamanho, com
proteínas de menor peso molecular
migrando mais para baixo no gel.
1 2 3 4 5 6 7 8
membranas. Como você explicaria a migração das proteínas nos Problemas p12.25/12.20
Figura 12-20, pistas 5, 6 e 8?
C. A proteína está ancorada na membrana ou é translocada por todo o caminho
através da membrana?
12–107 as coisas não estão indo bem. Você acabou de ter uma reunião breve, mas tensa, com
seu orientador de pesquisa que nunca esquecerá, e está claro que seu futuro em seu
laboratório está em dúvida. Ele não gosta do seu hábito de trabalhar até tarde e dormir até
tarde; ele acha que está na raiz da sua falta de produtividade (como ele a percebe). Alguns
dias depois da reunião, você chega bem cedo ao meio-dia, para ser informado por seus
colegas estudantes de que seu orientador está “procurando por você”. Você tem certeza de
que o machado vai cair. Mas acontece que ele está animado, não chateado. Ele acabou de
ouvir um seminário que o lembrou do bilhete que você deixou em sua mesa no mês anterior,
descrevendo um esquema de seleção que você criou (tarde da noite, é claro) para isolar
mutantes no maquinário de translocação de ER. Você está completamente abbergasted.
Você rapidamente define os detalhes da seleção, que envolve a fusão de um sinal de

importação de ER ao N-terminal do produto do gene His4 . His4 é uma enzima citosólica que
converte histidinol em histidina. As cepas de levedura que são defeituosas para uma etapa
inicial na via biossintética da histidina podem crescer com histidinol adicionado, se His4
estiver presente. Você decide procurar por mutantes sensíveis à temperatura (ts) , que são
normais a 24°C, mas defeituosos a 37°C. Usando uma cepa que expressa His4 com um
sinal de importação ER, você seleciona células que crescem em histidinol a 30°C e as
examina para aquelas que morrem a 37°C. O primeiro mutante que você isolou está no gene
Sec61 (demonstrado mais tarde como codificando um componente principal do translocador
através do qual os ribossomos inserem proteínas nascentes através da membrana do RE).
Você está de volta às boas graças de seu orientador!
A. Por que é que as células normais com o His4 modificado não podem crescer em histidi nol,
enquanto as células com um aparelho de importação de ER defeituoso podem?
B. Por que o esquema de seleção foi criado para encontrar os mutantes ts ? Por que a seleção
foi aplicada na temperatura intermediária de 30°C, em vez de 24°C ou 37°C?
12–108 Um artigo clássico descreve um método genético para determinar a organização de uma
proteína bacteriana na membrana de E. coli. O gráfico de hidropatia da proteína na Figura
12-21 indicou três potenciais segmentos de membrana. Proteínas de fusão híbridas de
comprimentos diferentes, algumas com deleções internas, foram produzidas com a proteína
de membrana no terminal N e a fosfatase alcalina no terminal C (Figura 12-22).
A fosfatase alcalina é fácil de testar em células inteiras e não tem

256 Capítulo 12: Compartimentos intracelulares e classificação de proteínas
Figura 12–21 Gráfico de hidropatia de

mais hidrofóbico uma proteína de membrana (Problema 12–
108). Os três picos hidrofóbicos indicam
hidropatia
índice
de
0 as posições de três segmentos potenciais

de abrangência da membrana.
mais hidrofílico
0 50 100 150 200 número de 250 300

aminoácidos
trechos hidrofóbicos. Além disso, quando está no lado citoplasmático da membrana

sua atividade é baixa, e quando está no lado externo da membrana (no espaço
periplasmático) sua atividade é alta. Os níveis testados da atividade da fosfatase
alcalina são indicados (ALTO ou BAIXO) na Figura 12–22.
Problemas p12.28/12.21 A. Como
a proteína é organizada na membrana? Explique como os resultados
com as proteínas de fusão indicam este arranjo.
B. Como a organização da proteína de membrana é alterada pela deleção?
Suas medições da atividade da fosfatase alcalina nos plasmídeos deletados
internamente são consistentes com o arranjo alterado?
12–109 Mitocôndrias e peroxissomos, ao contrário da maioria das outras membranas

celulares, adquirem novos fosfolipídios por meio de proteínas de troca de fosfolipídios.
Uma dessas proteínas, proteína de troca de PC, transfere especificamente
fosfatidilcolina (PC) entre as membranas. Sua atividade pode ser medida pela
mistura de fantasmas de glóbulos vermelhos (membranas plasmáticas intactas com
citoplasma removido) com vesículas fosfolipídicas sintéticas contendo PC marcado
radioativamente em ambas as monocamadas da bicamada vesicular. Após incubação
a 37°C, a mistura é centrifugada brevemente para que os fantasmas formem um
pellet, enquanto as vesículas permanecem no sobrenadante. A quantidade de troca
é determinada medindo a radioatividade no pellet.
A Figura 12-23 mostra o resultado de um experimento ao longo dessas linhas,
usando vesículas marcadas (doadoras) com um raio externo de 10,5 nm e uma
bicamada de 4,0 nm de espessura. Nenhuma transferência ocorreu na ausência da
proteína de troca, mas em sua presença até 70% do PC marcado nas vesículas
pode ser transferido para as membranas das hemácias.
Vários experimentos de controle foram realizados para explorar o motivo
por que apenas 70% do rótulo nas vesículas doadoras foi transferido.
construções originais
atividade da fosfatase alcalina
34
1 ALTO
55
2 ALTO
105
3 BAIXO
131
4 BAIXO
225
5 ALTO
310
6 ALTO Figura 12-22 Estruturas de proteínas
híbridas usadas para determinar a
organização de uma proteína de
derivados excluídos
internamente membrana (Problema 12-108). A proteína de
105 membrana (segmento laranja) está no
3* ALTO terminal N e a fosfatase alcalina (segmento
131 azul) está no terminal C da proteína. O V
4* ALTO invertido indica o local do qual os aminoácidos
225 foram deletados das proteínas híbridas
5* BAIXO
310
modificadas. O aminoácido mais C-
6* BAIXO terminal da proteína de membrana é
numerado em cada proteína híbrida. A
deleção de atividade da fosfatase alcalina em cada
resíduos 68-103 proteína híbrida é mostrada à direita.
1. Cinco vezes mais membranas de fantasmas de glóbulos vermelhos foram incluídas na 100
incubação: a transferência ainda parou no mesmo ponto. + proteína de troca de PC
80
2. Nova proteína de troca foi adicionada após 1 hora: não causou mais
transferir.
60
3.
(porcentagem)
vesículas
removido
marcado
das
PC
Os lipídios marcados remanescentes nas vesículas doadoras no final da reação foram

extraídos e transformados em vesículas frescas: 70% do marcador nessas vesículas era 40
trocável.
20
Quando os fantasmas de glóbulos vermelhos que foram marcados neste experimento – Proteína de troca de PC
foram usados como membranas doadoras no experimento reverso (ou seja, transferência
00 0,5 1,0 1,5
de PC de membranas de glóbulos vermelhos para vesículas sintéticas), 96% do marcador
vez (horas)
pode ser transferido para as vesículas aceitadoras.
A. Que explicações possíveis para o limite de 70% cada um dos três controles Figura 12-23 Transferência de PC marcada de
experimentos eliminam? vesículas doadoras para as membranas das
hemácias pela proteína de troca de PC (Problema 12-109).
B. Qual você acha que é a explicação para o limite de 70%? (Dica: a área da superfície externa
dessas pequenas vesículas doadoras é cerca de 2,6 vezes maior que a área da superfície
interna.)
C. Por que você acha que quase 100% do rótulo na membrana da hemácia
pode ser transferido de volta para a vesícula?
ESTILO MCAT
Você está estudando um fator de transcrição que controla a entrada no ciclo celular. Está presente no
núcleo das células que não se dividem, mas sai rapidamente do núcleo quando as células são
estimuladas a iniciar a divisão celular. Você supõe que o fator de transcrição reprime a expressão de
genes que impulsionam a entrada no ciclo celular e que o transporte do repressor para fora do núcleo
é uma etapa crítica que ajuda a iniciar o ciclo celular. Ao procurar os sinais que controlam essa etapa,
você descobre que a proteína é fosforilada por uma proteína quinase em uma serina específica. Como
a fosforilação de proteínas é um importante modo de regulação, você investiga mais. Para isso, você
cria uma versão mutante do fator de transcrição em que a serina alvo da fosforilação é alterada para
uma alanina, que não pode ser fosforilada. Quando você expressa essa versão mutante do fator de
transcrição na célula, descobre que muito pouco dele pode ser detectado no núcleo.
12–110 O transporte do fator de transcrição para o núcleo provavelmente requer:

I. Ligação a um receptor de importação nuclear II.
Participação direta do Ran-GDP III.
Envolvimento do complexo Sec61
A. I
B. I e II C. I
e III D. I, II e III
12–111 Qual das seguintes hipóteses explica melhor como a fosforilação regula a localização nuclear
do fator de transcrição?
A. A fosforilação causa uma mudança conformacional que expõe um núcleo
sinal de exportação.
B. A fosforilação perto de um sinal de exportação nuclear bloqueia a ligação de um nuclear
fator de exportação.
C. A fosforilação perto de um sinal de localização nuclear bloqueia a ligação de um fator de
importação nuclear.
D. A fosforilação promove a ligação do fator de transcrição a Ran
GTP.
12–112 Como você poderia testar a melhor hipótese da questão anterior?

A. A adição de um sinal de importação nuclear ao fator de transcrição mutante deve permitir
que ele se acumule no núcleo.
B. Deleção do sinal de exportação nuclear do fac de transcrição mutante
tor deve permitir que ele se acumule no núcleo.
C. Deleção do sítio de ligação Ran-GDP do fac de transcrição mutante

tor deve permitir que ele se acumule no núcleo.
D. A inativação da Ran-GTPase deve permitir o normal, mas não o
mutante - fator de transcrição para entrar no núcleo.

Quando as células são quebradas, o retículo endoplasmático (RE) se fragmenta em vesículas
esféricas revestidas com ribossomos, que são chamados de microssomos rugosos. Esses
microssomos rugosos podem ser purificados e usados para formar uma bicamada lipídica que
separa duas câmaras cheias de líquido. Um lado da bicamada lipídica é revestido por ribossomos e
corresponde ao lado citosólico do RE, enquanto o outro corresponde ao lado luminal do RE. As
câmaras de cada lado da membrana podem ser monitoradas para detectar a condutância de íons
salinos através da membrana.
Nenhuma condutância pode ser detectada através da membrana microssomal áspera, uma vez que
é isolada das células. No entanto, o tratamento do lado revestido por ribossomos da membrana
com puromicina, um composto que causa a liberação de cadeias peptídicas crescentes dos
ribossomos, causa um grande aumento na condutância. O tratamento adicional com tampões com
alto teor de sal faz com que a membrana fique novamente impermeável aos íons.
12–113 A associação de ribossomos com o retículo endoplasmático requer: I. Partícula de

reconhecimento de sinal II.
Acompanhantes
III. tradução de proteínas
A. I
B. I e III C. II
e III D. I, II e III
12–114 Qual das seguintes afirmações explica melhor o aumento na condutância causado pela
puromicina?
A. O término prematuro da síntese de peptídeos pela puromicina leva a proteínas mal
dobradas que ativam a resposta de proteína desdobrada.
B. A liberação do peptídeo em crescimento expõe o poro cheio de água que é usado para a
translocação de proteínas através da membrana do RE.
C. A liberação do peptídeo permite que a partícula de reconhecimento de sinal abra um canal
para translocação de peptídeos através da membrana do RE.
D. O tratamento com puromicina abre canais na membrana que são
normalmente usado para liberar Ca2+ do RE.
12–115 Por que a lavagem da membrana com um tampão contendo altas concentrações de sal
bloqueia a condutância da membrana microssomal?
A. Sal alto faz com que o canal de Ca2+ se feche.
B. Sal alto aumenta a resistência da membrana.
C. A remoção de alto teor de sal dos ribossomos fecha o poro.
D. O alto teor de sal bloqueia a resposta da proteína desdobrada.
259 259
Capítulo 13
CAPÍTULO
Tráfego de Membrana Intracelular 13

OS MECANISMOS MOLECULARES DA MEMBRANA NESTE CAPÍTULO
TRANSPORTE E MANUTENÇÃO DE OS MECANISMOS MOLECULARES

DIVERSIDADE COMPARTIMENTAL DE MEMBRANA DE TRANSPORTE
E A MANUTENÇÃO DE
DIVERSIDADE COMPARTIMENTAL
proteína adaptadora Efetor Rab da vesícula revestida por COPI
proteína ARF Vesícula revestida com COPII Rab proteína TRANSPORTE DA IS
de carga dinamina Lúmen de clatrina
ATRAVÉS DE
de proteína Sar1 Proteína SNARE (SNARE)
APARELHO DE GOLGI
Vesícula revestida por clatrina NSF Vesícula de transporte Vesícula revestida
Fosfatidilinositide t-SNARE revestimento-recrutamento v-SNARE
TRANSPORTE DO
(PIP)
REDE TRANS GOLGI PARA
GTPase Rab cascata
LISOSSOMOS
DEFINIÇÕES
TRANSPORTE PARA O
Combine cada definição abaixo com seu termo na lista acima. CÉLULA DO PLASMA
MEMBRANA: ENDOCITOSE
13–1 Termo geral para um recipiente fechado por membrana que move o material entre os
compartimentos fechados por membrana dentro da célula. TRANSPORTE DO TRANS
REDE GOLGI PARA A CÉLULA
13–2 Qualquer um de uma grande família de GTPases monoméricas presentes na membrana plasmática
EXTERIOR: EXOCITOSE
e membranas de organelas que conferem especificidade no encaixe de vesículas.
13–3 Uma proteína que medeia a ligação entre o revestimento de clatrina e as proteínas transmembrana,
incluindo os receptores de carga transmembrana.
13–4 GTPase citosólica que se liga ao gargalo de uma vesícula revestida por clatrina e a ajuda a se
desprender da membrana.
13–5 A proteína que catalisa a desmontagem dos domínios helicoidais de

proteínas SNARE pareadas.
13–6 Vesícula revestida que transporta material da membrana plasmática e entre os compartimentos
endossomal e de Golgi.
13–7 A GTPase de recrutamento de revestimento é responsável pela montagem do revestimento COPI e

pela montagem do revestimento de clatrina nas membranas de Golgi.
13-8 Proteína que facilita o transporte vesicular, ancoragem e fusão da membrana, uma vez ligada por
uma proteína Rab ativada.
13–9 Termo geral para um membro da grande família de proteínas que catalisa as reações de fusão
de membrana no transporte de membrana.
13–10 O espaço interior de um compartimento fechado por membrana.
13-11 Termo geral para uma vesícula de transporte que carrega uma gaiola distinta de
proteínas que cobrem sua superfície citosólica.
260 Capítulo 13: Tráfego de Membrana Intracelular
13–12 e GTPase de recrutamento de revestimento responsável pela montagem do revestimento COPII

na membrana do RE.
VERDADEIRO FALSO
13–13 Em todos os eventos que envolvem a fusão de uma vesícula a uma membrana alvo, as
folhas citosólicas da vesícula e as bicamadas alvo sempre se fundem, assim como as
folhas que não estão em contato com o citosol.
13–14 Proteínas Rab complementares em vesículas de transporte e membranas-alvo ligam-se

umas às outras para permitir que as vesículas de transporte se encaixem seletivamente
em suas membranas-alvo apropriadas.
13-15 Em uma célula que não se divide, como a do fígado, por que o fluxo da membrana entre
os compartimentos deve ser equilibrado, de modo que as vias de recuperação
coincidam com o fluxo externo? Você esperaria o mesmo fluxo equilibrado em uma
célula epitelial do intestino, que está se dividindo ativamente?
13–16 O diagrama na Figura 13-1 mostra os vários compartimentos intracelulares

envolvidos nas vias biossintéticas-secretoras, endocíticas e de recuperação.
A. Rotule os vários compartimentos no diagrama.

B. Indique nas setas se o fluxo indicado faz parte da via biossintética-secretora, via
endocítica ou via de recuperação.
13–17 Discuta a seguinte analogia: “Receptores de carga competindo para serem transportados
pelo sistema de poços revestidos podem ser comparados a esquiadores entrando em
uma rede de teleféricos. A entrada é permitida apenas para portadores de ingresso,
mas não há garantia de quem é encontrado com quem em um determinado teleférico,
embora todos os viajantes, esperamos, cheguem à próxima estação.”
13–18 O revestimento de clatrina em uma vesícula é composto de numerosos triskelions

que formam uma gaiola de 60 a 200 nm de diâmetro, composta de faces pentagonais
e hexagonais, assim como o fulereno C60 (Figura 13-2) . Esboce a localização de um
tríscele individual na vesícula revestida de clatrina na Figura 13-2B.
CITOSOL ESPAÇO EXTRACELULAR
Figura 13-1 Os compartimentos

intracelulares nas vias biossintéticas
secretoras, endocíticas e de
recuperação, com o fluxo entre
os compartimentos indicado (Problema 13-16).
OS MECANISMOS MOLECULARES DE TRANSPORTE DE MEMBRANA 261
(A) (B) (C) Figura 13–2 Estrutura de um revestimento de

clatrina (Problema 13–18). (A) Uma subunidade triskelion.
(B) Uma vesícula revestida por clatrina. (C) Um
fulereno C60.
25 nm
tríscele vesícula revestida de clatrina fulereno (C60)
Em que ponto de sua estrutura um tríscele deve ser mais flexível para acomodar
mudanças no tamanho da vesícula? Em que ponto ele deve ser mais flexível para
encaixar nas faces pentagonal e hexagonal?
13–19 A levedura e muitos outros organismos produzem um único tipo de cadeia pesada de clatrina
e um único tipo de cadeia leve de clatrina; assim, eles formam um único tipo de
revestimento de clatrina. Como é,
então, que
tardios, membrana
um únicoplasmática
diferentes
revestimento
para
- Golgi
deendossomos
clatrina
para endossomos
pode
iniciais
ser usado
e vesículas
para três
secretoras
vias de transporte
imaturas
para Golgi - cada uma envolvendo diferentes proteínas de carga especializadas?
13–20 Imagine que a proteína ARF1 sofreu uma mutação que a impediu de hidrolisar o GTP,
independentemente de seus parceiros de ligação. Você esperaria que as vesículas
revestidas com COPI se formassem normalmente? Como você esperaria que o transporte
mediado por vesículas revestidas com COPI fosse afetado? Se esta fosse a única forma
de ARF1 em uma célula, você esperaria que fosse letal? Explique suas respostas.
13–21 Como pode ser verdade que pares complementares de SNAREs específicos marcam
exclusivamente vesículas e suas membranas-alvo? Após a fusão da vesícula, a
membrana alvo conterá uma mistura de t-SNAREs e v-SNAREs.
Inicialmente, esses SNAREs estarão fortemente ligados um ao outro, mas o NSF pode
separá-los, reativando-os. O que você acha que impede as membranas-alvo de acumular
uma população de v-SNAREs igual ou maior que sua população de t-SNAREs?
13–22 Os vírus são os derradeiros necrófagos — uma consequência necessária de seus pequenos
genomas. Sempre que possível, eles fazem uso da maquinaria da célula para realizar
as etapas envolvidas em sua própria reprodução. Muitos vírus diferentes têm coberturas
de membrana. Esses chamados vírus envelopados obtêm acesso ao citosol por meio
da fusão com uma membrana celular. Por que você acha que cada um desses vírus
codifica sua própria proteína de fusão especial, em vez de usar os SNAREs de uma
célula?
CÁLCULOS
13-23 Para que ocorra a fusão de uma vesícula com sua membrana-alvo, as membranas devem
ser trazidas para dentro de 1,5 nm para que as duas bicamadas possam se unir (Figura
13-3). Supondo que as porções relevantes das duas membranas no local de fusão
sejam regiões circulares de 1,5 nm de diâmetro, calcule o número de moléculas de água vesícula
que permaneceriam entre as membranas. (A água tem 55,5 M e o volume de um
cilindro é r2h.) Dado que um fosfolipídio médio ocupa uma área de superfície de
membrana de 0,2 nm2, quantos fosfolipídios estariam presentes em cada uma das membrana alvo 1,5 nm
monocamadas opostas no local de fusão? Existem moléculas de água suficientes para

se ligar às cabeças hidrofílicas desse número de fosfolipídios? (Estima-se que 10 a 12
moléculas de água estejam normalmente associadas a cada grupo de cabeça
Figura 13-3 Abordagem aproximada de uma
fosfolipídica na superfície exposta de uma membrana.) vesícula e sua membrana-alvo em preparação
para a fusão (Problema 13-23).
262 Capítulo 13: Tráfego de membrana intracelular
GTP CÓPIA DE Figura 13-4 Via normal para a formação de

ARF-GDP ARF-GTP Vesículas revestidas
vesículas revestidas com COPI (Problema 13-24).
(citosol) (membrana) com COPI A pequena GTPase ARF carrega um GDP ligado em sua
forma citosólica. Em resposta a um fator de troca
PIB
de nucleotídeos de guanina (GEF), o ARF libera GDP e
catalisado por GEF capta GTP. A ligação do GTP causa uma mudança
conformacional que expõe uma cauda de ácido graxo no
ARF, que promove a ligação do ARF-GTP à membrana.
TRATAMENTO DE DADOS
13–24 Quando o metabólito fúngico brefeldina A é adicionado às células, o aparelho de Golgi As subunidades COPI ligam-se ao ARF-GTP para formar
vesículas revestidas com COPI.
desaparece em grande parte e as proteínas de Golgi se misturam com as do RE. O
tratamento com Brefeldina-A também causa a rápida dissociação de algumas proteínas
periféricas da membrana associadas ao Golgi, incluindo subunidades do revestimento
COPI. Essas observações implicam que a brefeldina A evita o transporte envolvendo
vesículas revestidas com COPI bloqueando a montagem de revestimentos e, portanto,
o brotamento de vesículas de transporte. Em princípio, a brefeldina A poderia bloquear
a formação de vesículas revestidas com COPI em qualquer ponto do esquema normal
de montagem, que é mostrado na Figura 13-4. As seguintes observações identificam o
ponto de ação da brefeldina A.
1. ARF com GTPS ligado (um análogo não hidrolisável de GTP) causa a formação de
vesículas revestidas com COPI quando adicionado às membranas de Golgi. A
formação de vesículas desta forma não é afetada pela brefeldina A.
2. ARF com GDP ligado troca o GDP por GTP quando adicionado às membranas de
Golgi. Essa reação de troca não ocorre na presença de brefeldina A. O componente
essencial da membrana de Golgi é sensível à digestão da tripsina, sugerindo tratar-se
de uma proteína.
Dadas essas observações experimentais, como você acha que a brefeldina A
bloqueia a formação de vesículas revestidas com COPI?
13-25 Pequenas GTPases são geralmente ativas no estado ligado ao GTP e inativas quando o
GTP é hidrolisado a GDP. Na ausência de uma proteína ativadora de GTPase (GAP),
pequenas GTPases tipicamente hidrolisam o GTP muito lentamente. O mecanismo
pelo qual um GAP estimula a hidrólise do GTP é conhecido para a pequena GTPase
Ras. Quando Ras-GAP se liga a Ras, ele altera a conformação de Ras e fornece um
“interruptor” crítico e catalítico de arginina que estabiliza o estado de transição para a
hidrólise de GTP, estimulando assim a hidrólise em várias ordens de grandeza.
Durante a montagem das vesículas revestidas com COPI, o ARF1 – uma pequena
GTPase – liga-se ao ARF1-GAP, que bloqueia o ARF1 em sua conformação catalítica
ativa, mas não fornece a arginina catalítica. Como as subunidades do COPI também se
ligam ao ARF1, você se pergunta se elas podem afetar a hidrólise do GTP. Para testar
essa possibilidade, você mistura as subunidades ARF1, ARF1-GAP e COPI em várias
combinações e mede a hidrólise de GTP (Tabela 13-1).
Como você interpretaria esses resultados? Como você poderia testar ainda mais
suas conclusões?
13–26 SNAREs existem como parceiros complementares que realizam fusões de membrana entre
vesículas apropriadas e suas membranas-alvo. Desta forma, uma vesícula com uma
determinada variedade de v-SNARE se fundirá apenas com um
TABELA 13–1 Taxas de hidrólise de GTP por várias combinações de subunidades ARF1,
ARF1-GAP e COPI (Problema 13–25).
Componentes adicionados Taxa de hidrólise de GTP
ARF1 0
ARF1 + ARF1-GAP 1
ARF1 + COPY subunidades 0
ARF1 + ARF1-GAP + subunidades COPI 1000

OS MECANISMOS MOLECULARES DE TRANSPORTE DE MEMBRANA 263
A niarts (A) B niarts (B)
em t 100
pro-Pass protease
t em
75
ATRACAÇÃO
50
fosfatase
máximo)
alcalina
(%
pro-Pass protease
25
FUSÃO
0
passar
LAÇO cepa A vt tt vt v combinações cepa B vt t v vt t em
– vt
vt t experimento 1234 5 v vt vvt vt –
6 7 8 1 9 0 11
membrana que transporta o t-SNARE complementar. Em alguns casos, no Figura 13–5 Requisitos SNARE para
fusão de vesículas (Problema 13–26).
entanto, sabe-se que ocorrem fusões de membranas idênticas (fusões
(A) Esquema para medir a fusão de
homotípicas). Por exemplo, quando uma célula de levedura forma um botão, as vesículas vacuolares. (B) Resultados das
vesículas derivadas do vacúolo da célula-mãe se movem para o botão onde se fusões de vesículas com diferentes
fundem para formar um novo vacúolo. Essas vesículas transportam v-SNAREs combinações de v-SNAREs e t-SNAREs.
Problems p13.06/13.05 e t-SNAREs. Ambos os tipos de SNAREs são essenciais Os SNAREs presentes nas vesículas das
para este evento de fusão homotípica? duas cepas são indicados como v (v-
SNARE) e t (t-SNARE).
Para testar esse ponto, você desenvolveu um engenhoso ensaio de fusão de
vesículas vacuolares. Você prepara vesículas de duas cepas mutantes diferentes
de levedura: a cepa B tem um gene defeituoso para fosfatase alcalina vacuolar
(Pase); cepa A é defeituosa para a protease que converte o precursor da fosfatase
alcalina (pró-Pase) em sua forma ativa (Pase)
(Figura 13-5A). Nenhuma das cepas tem fosfatase alcalina ativa, mas quando
extratos das cepas são misturados, a fusão das vesículas gera fosfatase alcalina
ativa, que pode ser facilmente medida (Figura 13-5).
Agora você exclui os genes para o vacuolar v-SNARE, t-SNARE ou ambos
em cada uma das duas cepas de levedura. Você prepara vesículas vacuolares de
cada uma e as testa quanto à sua capacidade de fusão, medida pelo ensaio da
fosfatase alcalina (Figura 13-5B).
O que esses dados dizem sobre os requisitos para v-SNAREs e t-SNAREs na
fusão de vesículas vacuolares? Importa qual tipo de SNARE está em qual vesícula?
13–27 Você deseja identificar as proteínas-alvo que estão ligadas ao NSF e suas duas
proteínas acessórias. Você incuba NSF purificado e suas proteínas acessórias
com um extrato detergente bruto de membranas sinápticas e, em seguida,
adiciona anticorpos específicos de NSF que estão ligados a contas. Ao centrifugar
a mistura, você pode facilmente separar os grânulos e quaisquer proteínas
anexadas do restante do extrato bruto. As proteínas ligadas aos grânulos podem
ser analisadas por eletroforese em gel de poliacrilamida SDS. Quando a
incubação é realizada na presença ou ausência de ATP, você descobre que
apenas NSF está presente nas esferas. Se você incubar na presença de ATPS,
um análogo não hidrolisável do ATP, os grânulos reduzem o NSF, suas proteínas
acessórias, sintaxina, SNAP25 e sinaptobrevina. Qual é o substrato para NSF e
suas proteínas acessórias? Por que o experimento funciona quando o ATPS está
presente, mas não na presença ou ausência de ATP?
13–28 O gene Sec4 da levedura de brotamento codifica uma pequena GTPase que
desempenha um papel essencial na via de secreção que forma o broto filho.
Normalmente, cerca de 80% da proteína Sec4 é encontrada na superfície
citosólica das vesículas de transporte e 20% está livre no citosol. Quando
mutantes de levedura Sec4 sensíveis à temperatura (Sec4ts) são incubados em alta

temperatura, o crescimento cessa e pequenas vesículas se acumulam no broto filho.
Para definir o papel de Sec4 na secreção, você projeta dois mutantes específicos
de Sec4 com base na maneira como outras pequenas GTPases funcionam. Um
mutante, Sec4- cc, carece de duas cisteínas em seu terminal C, o que você espera que
impeça a ligação do ácido graxo necessário para a ligação à membrana. O segundo
mutante, Sec4N133I, codifica uma isoleucina no lugar da asparagina normal na
posição 133; você espera que essa proteína seja bloqueada em seu estado ativo,
mesmo que não seja capaz de se ligar a GTP ou GDP.
Você descobre que o Sec4-cc se liga ao GTP, mas permanece totalmente citosólico,
sem ligação às vesículas. Quando expresso em níveis elevados em leveduras que
também possuem um gene Sec4 normal , não inibe seu crescimento. Em contraste,
Sec4N133I está localizado quase inteiramente em vesículas e, quando é expresso em
níveis elevados em leveduras normais, inibe completamente o crescimento, e as
leveduras estão repletas de pequenas vesículas.
A. Você acha que o Sec4 é necessário para a formação de vesículas, para a fusão das
vesículas com as membranas-alvo ou para ambos? Com base em sua função, você
imaginaria que era análogo às proteínas ARF, Sar1 ou Rab de mamíferos?
B. Usando seu conhecimento sobre o funcionamento da proteína análoga de mamíferos,
descreva como você acha que a Sec4 normal funciona na formação e fusão de
vesículas. Por que alguns Sec4 estão livres no citosol de células do tipo selvagem?
Como a remoção das cisteínas C-terminal impede que Sec4-cc desempenhe sua
função?
C. Por que você acha que a expressão de Sec4N133I inibe o crescimento da levedura que
também expressa Sec4 normal?
TRANSPORTE DA ER PELO GOLGI

APARELHO
cis face Modelo de transporte de

cis Rede de Golgi (CGN) vesículas de
modelo de maturação cisternal
oligossacarídeo complexo proteoglicanos de glicosilação
Aparelho de Golgi (complexo de Golgi) O-linked trans face trans Golgi network (TGN)
oligossacarídeo rico em manose
DEFINIÇÕES
13–29 A hipótese de que novas cisternas se formam continuamente na face cis do

Golgi e, em seguida, migram pela pilha à medida que amadurecem.
13–30 Molécula que consiste em uma ou mais cadeias de glicosaminoglicanos ligadas a uma
proteína central.
13–31 O lado da pilha de Golgi no qual o material entra na organela.
13–32 Cadeia de açúcares ligada a uma glicoproteína que é gerada inicialmente cortando o
oligossacarídeo original ligado ao RE e adicionando outros açúcares.
13–33 Organela envolvida por membrana em células eucarióticas nas quais proteínas e
os lipídios transferidos do RE são modificados e classificados.
13–34 Cadeia de açúcares ligados a uma glicoproteína que contém muitas manoses
resíduos.
13–35 Rede de cisternas e túbulos interconectados na lateral do

Pilha de Golgi na qual o material é transferido para fora do Golgi.
TRANSPORTE DA ER PELO APARELHO DE GOLGI 265
VERDADEIRO FALSO
13–36 Há um requisito estrito para a saída de uma proteína do RE: ela deve ser
dobrada corretamente.
13–37 Todas as glicoproteínas e glicolipídeos nas membranas intracelulares têm suas

cadeias de oligossacarídeos voltadas para o lado luminal, e todos aqueles na
membrana plasmática têm suas cadeias de oligossacarídeos voltadas para
fora da célula.
13–38 O aparelho de Golgi confere a glicosilação mais pesada de todas às

proteínas centrais de proteoglicanos, que são convertidas em proteoglicanos
pela adição de uma ou mais cadeias de glicosaminoglicanos ligadas a O.
13-39 Como as proteínas solúveis no RE podem ser seletivamente recrutadas para as

vesículas destinadas ao Golgi?
13–40 O controle de qualidade não é sempre uma coisa boa? Como o controle de qualidade no pronto-
socorro pode ser prejudicial aos pacientes com brose cística?
13–41 Os 40 aminoácidos C-terminais de três proteínas residentes no RE -

calnexina, calreticulina e HMG CoA redutase - são mostrados na Figura 13-6.
Decida, para cada proteína, se é provável que seja uma proteína
transmembrana ou solúvel. Explique suas respostas.
13–42 Se você removesse o sinal de recuperação do RE da proteína disulde isomerase

(PDI), que normalmente é um residente solúvel do lúmen do RE, onde você
esperaria que a PDI modificada estivesse localizada?
13–43 O receptor KDEL deve ir e voltar entre o RE e o aparelho de Golgi para

cumprir sua tarefa de garantir que as proteínas solúveis do RE sejam retidas
no lúmen do RE. Em qual compartimento o receptor KDEL liga seus ligantes
mais firmemente? Em qual compartimento ele liga seus ligantes mais
fracamente? O que se pensa ser a base para suas diferentes anidades de
ligação nos dois compartimentos? Se você estivesse projetando o sistema,
em qual compartimento você teria a maior concentração do receptor KDEL?
Você poderia prever que o receptor KDEL, que é uma proteína transmembrana,
possuiria ele próprio um sinal de recuperação do RE?
13–44 Quando o sinal de recuperação KDEL é adicionado ao hormônio de crescimento

de rato ou à gonadotrofina coriônica humana, duas proteínas normalmente
secretadas, as proteínas ainda são secretadas, mas cerca de seis vezes mais
lentamente. Se o C-terminal L no sinal for alterado para V, as proteínas são
novamente secretadas em sua taxa normal. Em contraste, as proteínas
residentes no ER raramente, ou nunca, são secretadas da célula; eles
geralmente são capturados e devolvidos com muita eficiência. Como você
acha que as proteínas residentes normais com um sinal KDEL são retidas com
eficiência no RE, enquanto as proteínas secretadas às quais um sinal KDEL
foi adicionado não são retidas com eficiência? Isso é o que você esperaria se
o sinal KDEL e o receptor KDEL fossem inteiramente responsáveis pela
retenção de proteínas solúveis no RE?
Calnexina C-terminal
...KDKGDEEEEGEEEKLEEKQKSDAEEDGGTVSQEEEDRKPKAEEDEILNRSPRNRKPRRE
Calreticulina
...KQDEEQRLKEEEEDKRKEEEEAEDKEDDEDKDEDEEDEEDKEEDEEEDVPGQAKDEL
Figura 13-6 Aminoácidos C-terminais
HMG CoA redutase de proteínas residentes no RE
...PGENARQLARIVCGTVMAGELSLMAALAAGHLVKSHMIHNRSKINLQDLQGACTKKTA (Problema 13-41).
segmento Figura 13-7 Os domínios transmembrana

transmembrana das proteínas VSV G normais e mutantes
(Problema 13-46). Os números dos
pMS20 K SSIASFFFIIGLIIGLLFLVL R
plasmídeos indicam o número de aminoácidos
pMS18 K SSIASFFFIIGL - - GLFLVL R no segmento transmembrana; por
exemplo, pMS20 contém o tipo selvagem,
pMS16 K SSIASFFFIIG - - - - LFLVL R
segmento de 20 aminoácidos.
pMS14 K SSIASFFFII - - - - - - FLVL R As linhas tracejadas indicam aminoácidos
que estão faltando nos outros plasmídeos.
pMS12 K SSIASFFFI - - - - - - - - LVL R
As letras destacadas indicam os
pMS8 KSSIA - - - - - - - - - - - - FLVL R aminoácidos básicos que contornam o
segmento de extensão da membrana.
pMS0 K--------------------R
13-45 As células desenvolveram um conjunto de caminhos complicados para a adição de

carboidratos às proteínas,
implicando
nas proteínas
quedesempenham.
ostrês
carboidratos
funções que
desempenham
os carboidratos
funções importantes. Liste pelo menos
TRATAMENTO DE DADOS
13–46 A proteína G do vírus da estomatite vesicular (VSV) é uma típica glicoproteína de

membrana. Além de seu peptídeo sinal, que é removido após a importação para o
RE, a proteína G contém um único segmento transmembrana que ancora a proteína
na membrana plasmática. O segmento transmembrana consiste em 20 aminoácidos
não carregados e principalmente hidrofóbicos que são cercados por aminoácidos
básicos (Figura 13-7). Vinte aminoácidos dispostos em uma hélice são suficientes
apenas para cobrir a espessura de 3 nm da bicamada lipídica da membrana.
Para testar os requisitos de comprimento para os segmentos transmembranosos,

você modifica uma versão clonada da proteína VSV G para gerar uma série de
mutantes em que o segmento transmembrana é mais curto, conforme indicado na
Figura 13-7. Quando você introduz os plasmídeos modificados em células cultivadas,
aproximadamente a mesma quantidade de proteína G é sintetizada de cada mutante
como de células do tipo selvagem. Você analisa a distribuição celular das proteínas G
alteradas de várias maneiras.
1. Você examina a localização celular das proteínas VSV G modificadas por
microscopia de imunouorescência, usando anticorpos específicos da proteína G
marcados com uoresceína.
2. Você caracteriza as cadeias oligossacarídicas ligadas por digestão com
endoglicosidase H (Endo H), que cliva os oligossacarídeos N-ligados até que a
primeira manose seja removida na porção medial do aparelho de Golgi (consulte a
Figura 13-8, Problema 13- 47).
3. Você determina se as proteínas VSV G alteradas retêm o pequeno domínio
citoplasmático C-terminal (que caracteriza a proteína G normal) tratando microssomas
isolados com uma protease. Na proteína VSV G normal, este domínio é sensível ao
tratamento com protease e é removido. Os resultados desses experimentos estão
resumidos na Tabela 13–2.
A. Na medida em que esses dados permitirem, deduza a localização intracelular de cada
proteína VSV G alterada que não consegue atingir a membrana plasmática.
B. Para a proteína VSV G, qual é o comprimento mínimo do segmento transmembrana
suficiente para ancorar a proteína na membrana?
C. Qual é o comprimento mínimo do segmento transmembrana que é consistente com a

classificação adequada da proteína G? Como é que segmentos de membrana
transmembrana mais curtos do que isso podem chegar ao aparelho de Golgi, mas
depois não conseguem sair?
13–47 Você isolou várias linhagens de células mutantes que são defeituosas em sua capacidade
de adicionar carboidratos a proteínas exportadas. Usando um facilmente purificado
TABELA 13–2 Resultados de experimentos que caracterizam a distribuição celular de proteínas G de

células normais e mutantes (Problema 13–46).
plasmídeo localização celular Tratamento Endo H tratamento com protease
pMS20 membrana de plasma resistente confidencial
pMS12 intracelular +/– resistente confidencial
pMS8 intracelular confidencial confidencial
pMS0 intracelular confidencial resistente
proteína que transporta apenas oligossacarídeos complexos N-ligados, você analisou

os monômeros de açúcar que são adicionados nas diferentes células mutantes. Cada
mutante é único nos tipos e números de diferentes açúcares contidos em seus
oligossacarídeos N-ligados (Tabela 13-3).
A. Organize os mutantes na ordem que corresponde às etapas do caminho para o
processamento de oligossacarídeos ligados a N (Figura 13-8). (Assuma que cada linha
celular mutante é defeituosa para uma única enzima necessária para construir o
oligossacarídeo N-ligado.)
B. Quais desses mutantes são defeituosos no processamento de eventos que ocorrem no
RE? Quais mutantes são defeituosos no processamento de eventos que ocorrem no
Golgi?
C. Quais dos mutantes são provavelmente defeituosos em uma enzima de processamento
que é diretamente responsável pela modificação de oligossacarídeos N-ligados?
Quais mutantes podem não ser defeituosos em uma enzima de processamento, mas
sim em outra enzima que afeta indiretamente o processamento de oligossacarídeos?
TABELA 13–3 Análise dos açúcares presentes nos oligossacarídeos N-ligados de linhagens de células
mutantes e de tipo selvagem com defeito no processamento de oligossacarídeos (Problema 13–47).
Linha celular Homem GlcNAc Garota NANA Glc
Tipo selvagem 3 5 3 3 0
Mutante A 3 5 0 0 0
Mutante B 5 3 0 0 0
Mutante C 9 2 0 0 3
Mutante D 9 2 0 0 0
Mutante E 5 2 0 0 0
Mutante F 3 3 0 0 0
Mutante G 8 2 0 0 0
Mutante H 9 2 0 0 2
mutante eu 3 5 3 0 0
Abreviaturas: Man = manose; GlcNAc = N-acetilglucosamina; Gal = galactose;

NANA = ácido N-acetilneuramínico ou ácido siálico; Glc = glicose. Os números indicam o
número de monômeros de açúcar no oligossacarídeo.
glicosidase I UDP (2) GlcNAc transferase II
UDP (3) galactose transferase

Golgi Golgi
glicosidase II manosidase I GlcNAc transferase I manosidase II CMP (3) NANAtransferase
ER manosidase UDP UDP

5 + UDP 3 CMP
Asn Asn Asn Asn Asn Asn
1 2 3 4 5
oligossacarídeo de Endo H Resistente

alto teor de manose sensível a Endo H oligossacarídeo complexo
É O LÚMEN GOLGI LUMEN
CHAVE:
= N -acetilglucosamina (GlcNAc) = manose (Homem) = glicose (Glc) = galactose (Gal) = Ácido N-acetilneuramínico (ácido siálico ou NANA)
13–48 Dois modelos extremos – transporte de vesículas e maturação cisternal – foram Figura 13-8 Processamento de
propostos para explicar o movimento de moléculas através da estrutura polarizada oligossacarídeos no RE e no
aparelho de Golgi (Problema 13-47).
do aparelho de Golgi. No modelo de transporte de vesículas, as cisternas de
Golgi individuais permanecem no local enquanto as proteínas se movem através
delas (Figura 13-9A). Em contraste, no modelo de maturação cisternal, as
cisternas de Golgi individuais se movem pela pilha, carregando as proteínas com
elas (Figura 13-9B). As vesículas de transporte desempenham funções críticas
em ambos os modelos, mas seus os papéis sãodos
papéis distintamente
Problemas diferentes. Descreva
p13.11/13.08 das vesículas de transporte em cada um dos dois modelos.
Comente especificamente sobre o papel das vesículas no movimento para frente
das proteínas através da pilha de Golgi, na retenção de proteínas residentes no
Golgi em cisternas individuais e no retorno de proteínas que escaparam do RE para o RE.
(A) MODELO DE TRANSPORTE DE VESÍCULAS
(B) MODELO DE MATURAÇÃO CISTERNAL
cisternas
aglomerado
RÉ tubular vesicular CGN cis medial trans NGT
Figura 13-9 Dois modelos para o

movimento de moléculas através do
aparelho de Golgi (Problema 13-48).
(A) O modelo de transporte de vesículas.
(B) O modelo de maturação cisternal.
Em (B), as cisternas individuais foram
separadas para fins de ilustração. RE,
retículo endoplasmático; CGN, rede
cis Golgi; TGN, rede trans Golgi.
TABELA 13–4 Adição de galactose à proteína G do VSV após fusão de células infectadas por VSV
com células não infectadas (Problema 13–49).
Células infectadas Células não infectadas Precipitado Sobrenadante
células mutantes Células do tipo selvagem 45% 55%
células mutantes células mutantes 5% 95%
Células do tipo selvagem Células do tipo selvagem 85% 15%
A porcentagem de radioatividade no precipitado indica a fração da

proteína G marcada com GlcNac que adquiriu galactose.
13–49 Um teste inicial dos modelos de transporte de vesículas e maturação cisternal (ver Figura 13–9)
procurou o movimento de uma proteína entre as cisternas de Golgi. Esse estudo fez uso de
células mutantes que não podem adicionar galactose às proteínas, o que normalmente ocorre
no compartimento trans do Golgi (ver Figura 13-8). As células mutantes foram infectadas com
o vírus da estomatite vesicular (VSV) para fornecer uma proteína marcadora conveniente, a
proteína G viral.
Em um ponto apropriado da infecção, um inibidor da síntese proteica foi adicionado para
interromper a síntese adicional da proteína G. As células infectadas foram então incubadas
brevemente com um precursor radioativo de GlcNAc, que é adicionado apenas na cisterna
medial do Golgi (ver Figura 13-8). Em seguida, as células mutantes infectadas foram fundidas
com células de tipo selvagem não infectadas para formar um citoplasma comum contendo
pilhas de Golgi de tipo selvagem e mutante. Após alguns minutos, as células foram dissolvidas
com detergente e toda a proteína VSV G foi capturada usando anticorpos específicos para
proteína G.
Após a separação dos anticorpos, as proteínas G portadoras de galactose foram precipitadas,
utilizando uma lectina que se liga à galactose. A radioatividade no precipitado e no sobrenadante
foi medida. Os resultados deste experimento junto com os experimentos de controle (que
usaram apenas células mutantes ou apenas células do tipo selvagem) são mostrados na
Tabela 13–4.
A. Entre quais dois compartimentos do aparelho de Golgi o movimento das proteínas está sendo
testado neste experimento? Explique sua resposta.
B. Se as proteínas passassem pelo aparelho de Golgi por maturação cisternal, o que você preveria
para os resultados desse experimento? Se as proteínas se movessem através do Golgi via
transporte vesicular, o que você preveria?
C. Qual modelo é suportado pelos resultados da Tabela 13–4?
LINKS MÉDICOS
13–50 O processamento de oligossacarídeos ligados a N não é uniforme entre as espécies.

A maioria dos mamíferos, com exceção dos humanos e dos primatas do Velho Mundo,
ocasionalmente adiciona galactose – no lugar de um ácido N-acetilneuramínico – a uma
galactose, formando um dissacarídeo Gal(1–3)Gal terminal em algumas ramificações de um
oligossacarídeo N-ligado . Como isso explica o uso preferencial de primatas do Velho Mundo
para a produção de proteínas recombinantes para uso terapêutico em humanos?
TRANSPORTE DA REDE TRANS GOLGI PARA

LISOSSOMOS
hidrolase ácida doença de armazenamento lisossômico vacúolo de proteína do

autofagossomo lisossomo autofagia receptor M6P
DEFINIÇÕES
13–51 Digestão de partes obsoletas da célula pelos lisossomos da própria célula.
13–52 Vesícula muito grande e cheia de líquido encontrada na maioria das células vegetais e
fúngicas, normalmente ocupando mais de 30% do volume celular.
13–53 Organela envolvida por membrana em células eucarióticas que contém enzimas digestivas,
que são tipicamente mais ativas no pH ácido encontrado no lúmen.
VERDADEIRO FALSO
13–54 As membranas lisossômicas contêm uma bomba de prótons que utiliza a energia da hidrólise
do ATP para bombear prótons para fora do lisossomo, mantendo assim o lúmen em um
pH baixo.
13–55 Os endossomos tardios são convertidos em lisossomos maduros pela perda de proteínas de
membrana endossomais distintas e uma diminuição adicional em seu pH interno.
13–56 Se as células fossem tratadas com uma base fraca, como amônia ou cloroquina, que eleva
o pH das organelas para a neutralidade, seria esperado que os receptores M6P se
acumulassem no Golgi porque não poderiam se ligar às enzimas lisossômicas.
13–57 Como o baixo pH dos lisossomos protege o restante da célula das enzimas lisossômicas
caso o lisossomo se rompa?
13–58 Imagine que um autofagossomo é formado pelo engolfamento de uma mitocôndria pela
membrana do RE. Quantas camadas de membrana separariam a matriz da mitocôndria
do citosol fora do autofagossomo? Identifique a fonte de cada membrana e os espaços
entre as membranas.
13–59 A principal via de transporte de hidrolases lisossômicas da rede trans do Golgi (pH
6,6) para os endossomos tardios (pH 6) e para a reciclagem dos receptores M6P de
volta ao Golgi depende da diferença de pH entre esses dois compartimentos. A partir
do que você sabe sobre a ligação e reciclagem do receptor M6P e as vias de entrega de
material aos lisossomos, descreva as consequências da alteração do pH nesses dois
compartimentos.
A. O que você acha que aconteceria se o pH nos endossomos tardios fosse aumentado para
pH 6,6?
B. O que você acha que aconteceria se o pH na rede trans de Golgi fosse reduzido para pH
6?
13-60 Os melanossomos são lisossomos especializados que armazenam pigmentos para eventual
liberação por exocitose. Várias células, como as células da pele e do cabelo, absorvem
o pigmento, o que explica sua pigmentação característica. Mutantes de camundongos
que têm melanossomas defeituosos geralmente têm cores de pelagem pálidas ou rato normal rato Mocha
incomuns. Um desses camundongos de cor clara, o camundongo Mocha (Figura 13-10),
tem um defeito no gene de uma das subunidades do complexo de proteína adaptadora
Figura 13–10 Um camundongo normal
AP3, que está associado a vesículas revestidas brotando da rede trans de Golgi. Como
e o camundongo Mocha (Problema 13–60).
a perda de AP3 pode causar um defeito nos melanossomas? Além de sua cor de pelagem clara, o
camundongo Mocha tem um senso de equilíbrio ruim.
TRANSPORTE DA REDE TRANS GOLGI PARA OS LISOSOMOS 271
(A) (B) (C) Figura 13-11 Defeitos de pigmentação em

camundongos Ashen (Problema 13-61). (A) Camundongos
normalmente pigmentados e camundongos Ashen pálidos.
(B) Um melanócito de um camundongo normal.
(C) Melanócitos de um camundongo Ashen.
ratos normais e Ashen melanócito normal melanócitos acinzentados
TRATAMENTO DE DADOS
13–61 Mais de 50 genes diferentes são conhecidos por afetar a cor da pelagem em
camundongos. Vários deles - Dilute, Leaden e Ashen - são agrupados por causa
de seus fenótipos altamente semelhantes. Embora esses camundongos tenham
melanócitos,
pelagens pálidas, nosomas
o pigmento
como
células
mostradonormais
nos ciliadas,
melanossomosem seus
paradando
camundongos
origem
não é entregue
a Ashen corretamente
na Figura 13-11A
às .
Camundongos diluídos carecem de uma cadeia pesada de miose não
convencional, MyoVa, que interage com um motor de transporte baseado em
microtúbulos. Camundongos Ashen carregam uma mutação no gene da proteína
Rab, Rab27a, que se associa aos melanossomas. Camundongos chumbo não
possuem melanofilina (Mlph), que é uma proteína modular com domínios
individuais que se ligam a MyoVa, a Rab27a e a lamentos de actina no córtex
celular.
Os melanócitos de camundongos normais têm uma morfologia ramificada

característica (Figura 13-11B) e normalmente descarregam seus melanossomas
perto das pontas dos ramos. Conforme mostrado na Figura 13-11C, os
melanócitos de camundongos Ashen têm uma morfologia normal, mas seus
melanossomas circundam o núcleo. Os melanócitos de camundongos Dilute e
de camundongos Leaden têm a mesma aparência que os de camundongos
Ashen . Tente colocar essas observações juntas para formular uma hipótese
para explicar a entrega normal de melanossomas às pontas dos ramos dos
melanócitos e para os defeitos na função dos melanossomas nesses camundongos.
LINKS MÉDICOS
13–62 Pacientes com doença de células I não possuem a enzima GlcNAc fosfotransferase,
que catalisa a primeira das duas etapas necessárias para a adição de fosfato à
manose para criar o marcador M6P (consulte a Figura 13–12). Na ausência do
marcador M6P, o receptor M6P não pode se ligar à proteína e entregá-la a um
lisossomo. Como você supõe que os lisossomos em algumas células desses
pacientes - células do fígado, por exemplo - adquirem um complemento normal
de enzimas lisossômicas?
13–63 Pacientes com síndrome de Hunter ou com síndrome de Hurler raramente vivem
além da adolescência. Esses pacientes acumulam glicosaminoglicanos nos
lisossomos devido à falta de enzimas lisossômicas específicas necessárias para
sua degradação. Quando as células dos pacientes com as duas síndromes são
fundidas, os glicosaminoglicanos são degradados adequadamente, indicando
que as células não possuem diferentes enzimas degradativas. Mesmo que as
células sejam apenas cultivadas juntas, elas ainda corrigem os defeitos umas
das outras. O mais surpreendente de tudo é que o meio de uma cultura de células
de Hurler corrige o defeito nas células de Hunter (e vice-versa). Os fatores
corretivos no meio são inativados pelo tratamento com proteases, pelo tratamento
com periodato, que destrói os carboidratos, e pelo tratamento com fosfatase
alcalina, que remove os fosfatos.
Figura 13-12 Síntese do marcador M6P em

UDP UMP uma hidrolase lisossômica (Problema 13-64).
GlcNAc
GlcNAc
CH2OH CH2O PP
CH2O P
O O GlcNAc O
OH OH OH OH OH OH
O GlcNAc O GlcNAc O
OH OH OH
fosfotransferase fosfoglicosidase
ÿ-D-manose manose 6-fosfato
A. O que você acha que são os fatores corretivos? Começando com as células do paciente
doador, descreva a rota pela qual os fatores atingem o meio e subsequentemente entram
nas células receptoras para corrigir os defeitos lisossômicos.
Problemas
você supõe que os tratamentos
fatorescom p13.14/13.12
corretivos?
protease, B. Poreque
periodato fosfatase de linha alca inativam os
C. Você esperaria que um tipo semelhante de esquema de correção funcionasse para enzimas
citosólicas mutantes?
13-64 Crianças com doença de célula I sintetizam enzimas lisossômicas perfeitamente boas, mas são
secretadas fora da célula em vez de serem classificadas em lisossomos. O erro ocorre
porque as células não possuem GlcNAc fosfotransferase, que é necessária para criar o
marcador M6P que é essencial para a classificação adequada (Figura 13-12). Em princípio,
a doença da célula I também pode ser causada por deficiências na fosfoglicosidase GlcNAc,
que remove GlcNAc para expor M6P (Figura 13-12), ou no próprio receptor M6P. Assim,
existem três tipos potenciais de doença de células I, que podem ser distinguidas pela
capacidade de vários sobrenadantes de cultura de corrigir defeitos em células mutantes.
Imagine que você tem três linhagens de células (A, B e C), cada uma derivada de um
paciente com uma das três doenças hipotéticas de células I. Experimentos com sobrenadantes
dessas linhas celulares fornecem os resultados abaixo. 1. O sobrenadante de células
normais corrige os defeitos em B e C, mas não o defeito em A. O sobrenadante de A corrige
o defeito nas células de
Hurler, que estão 2. faltando uma enzima lisossômica específica, mas os sobrenadantes de
B e C não não.
3. Se os sobrenadantes das células mutantes forem primeiro tratados com fosfoglicosidase

para remover GlcNAc, então os sobrenadantes de A e C corrigem o defeito nas células de
Hurler, mas o sobrenadante de B não.
A partir desses resultados, deduza a natureza do defeito em cada uma das linhagens
celulares mutantes.
TRANSPORTE DO PLASMA PARA A CÉLULA

MEMBRANA: ENDOCITOSE
cavéola macropinocitose corpo

caveolina multivesicular neutrófilo
fossa revestida por fagocitose
clatrina endossoma fagossomo
inicial vesícula pinocitose
endocítica endocitose
endocitose maturação do endossoma mediada por receptor reciclagem
Complexos de proteína ESCRT endossomo transcitose
macrófago de receptor de
lipoproteína de baixa densidade transferrina
(LDL) de endossoma tardio
TRANSPORTE DA MEMBRANA DE PLASMA PARA A CÉLULA: ENDOCITOSE 273
DEFINIÇÕES
13-65 Termo geral para o processo pelo qual as células absorvem macromoléculas, substâncias
particuladas e até mesmo outras células em vesículas envoltas por membrana.
13–66 Vesícula complexa com brotos invaginantes e vesículas internas envolvidas em

a maturação dos endossomos iniciais em endossomos tardios.
13–67 Célula fagocítica – derivada de uma célula-tronco hematopoiética – que ingere

microorganismos invasores e desempenha um papel importante na eliminação de
células senescentes e células apoptóticas.
13-68 Tipo de endocitose em que materiais solúveis são retirados do

ambiente e incorporados em vesículas para digestão.
13–69 Invaginação que se forma a partir de jangadas lipídicas na superfície celular e brotos
internamente para formar uma vesícula pinocítica.
13–70 Região da membrana plasmática de células animais que é recoberta pela proteína clatrina
em sua face citosólica; brotará da membrana para formar uma vesícula intracelular.
13-71 Processo pelo qual macromoléculas se ligam a proteínas receptoras transmembrana

complementares, acumulam-se em depressões revestidas e então entram nas células
como complexos receptor-macromolécula em vesículas revestidas por clatrina.
13–72 Uma de uma família de proteínas estruturais em cavéolas que são incomuns porque
estendem múltiplas alças hidrofóbicas para dentro da membrana a partir do lado
citosólico, mas não atravessam a membrana.
13-73 Compartimento envolto por membrana logo abaixo da membrana plasmática, para o qual
as moléculas externas são entregues pela primeira vez por endocitose.
13–74 Forma especializada de endocitose na qual uma célula usa grandes vesículas endocíticas
para ingerir partículas grandes, como microorganismos e células mortas.
VERDADEIRO FALSO
13–75 Qualquer partícula que esteja ligada à superfície de um fagócito será ingerida por fagocitose.
13-76 Assim como o receptor de LDL, a maioria dos mais de 25 receptores diferentes conhecidos
por participar da endocitose mediada por receptor entra nas cavidades revestidas
somente depois de terem ligado seus ligantes específicos.
13–77 Todas as moléculas que entram nos endossomos iniciais acabam alcançando os
endossomos tardios, onde se misturam com as hidrolases ácidas recém-sintetizadas e
terminam nos lisossomos.
13–78 Durante a transcitose, as vesículas que se formam a partir de depressões revestidas na

superfície apical se fundem com a membrana plasmática na superfície basolateral e,
dessa forma, transportam moléculas através do epitélio.
13–79 Um macrófago ingere o equivalente a 100% de sua membrana plasmática a cada meia
hora por endocitose. Qual é a taxa na qual a membrana é devolvida por exocitose?
(A) MICROGRAFIA (B) DESENHO Figura 13-13 Um poço revestido prestes a brotar
da membrana (Problema 13-80).
(A) Micrografia eletrônica.
C (B) Um desenho esquemático.
A B
F
D
E
100 nm
13–80 A micrografia eletrônica na Figura 13-13A é ilustrada esquematicamente pelo

desenho na Figura 13-13B. Nomeie as estruturas que são rotuladas no desenho.
13–81 Acredita-se que as cavéolas se formem a partir de jangadas lipídicas, que são manchas
da membrana plasmática que são especialmente ricas em colesterol e glicosfina
golipídeos. As cavéolas podem coletar proteínas de carga em virtude da composição
lipídica de sua membrana, e não pela montagem de uma proteína citosólica.
Problemas p13.16/13.13. O que você poderia prever seria uma característica da
estrutura das proteínas transmembrana que se acumulam nas cavéolas?
13–82 Ferro (Fe) é um metal residual essencial que é necessário para todas as células. É
necessário, por exemplo, para a síntese dos grupos heme que fazem parte dos
citocromos e da hemoglobina. O ferro é levado para as células através de um
sistema de dois componentes. A proteína solúvel transferrina circula na corrente
sanguínea, e o receptor de transferrina é uma proteína de membrana que é
continuamente endocitada e reciclada para a membrana plasmática. Os íons Fe (A) CAPTAÇÃO DE HRP
ligam-se à transferrina em pH neutro, mas não em pH ácido. A transferrina se liga ao
receptor de transferrina em pH neutro somente quando se liga a um íon Fe, mas se 2
liga ao receptor em pH ácido mesmo na ausência de ferro ligado. A partir dessas
propriedades, descreva como o ferro é obtido e discuta as vantagens desse esquema
elaborado. 1
)sllec
ekatpu
lomp(
ruoh/
PRH
01/
6
CÁLCULOS
0
0 10 20 30 40
13–83 As células captam moléculas extracelulares por endocitose mediada por receptor e por HRP em meio (ÿM)
endocitose de fase líquida. Um artigo clássico comparou a eficiência dessas duas
vias incubando células humanas por vários períodos de tempo em uma faixa de
concentrações de fator de crescimento epidérmico (EGF) marcado com 125I, para (B) CAPTAÇÃO DE EGF
medir a endocitose mediada por receptor, ou peroxidase de rábano silvestre (HRP ), 20
para medir a endocitose da fase líquida. Verificou-se que EGF e HRP estavam
16
presentes em pequenas vesículas com um raio interno de 20 nm. A absorção de
HRP foi linear (Figura 13-14A), enquanto a de EGF foi inicialmente linear, mas 12
atingiu um platô em concentrações mais altas (Figura 13-14B).
8
521
)sllec
ekatpu
lomp(
ruoh/
FGE-
I01/
6
A. Explique por que as formas das curvas na Figura 13-14 são diferentes para 4
PRH e EGF.
B. A partir das curvas da Figura 13–14, estime a diferença nas taxas de captação de 0
0 20 40 60 80
HRP e EGF quando ambos estão presentes em 40 nM. Qual seria a diferença se EGF em meio (nM)
ambos estivessem presentes a 40 ÿM?
C. Calcule o número médio de moléculas de HRP que são absorvidas por cada vesícula Figura 13–14 Captação de HRP e EGF em
endocítica (raio de 20 nm) quando o meio contém 40 ÿM de HRP. [o volume de uma função de sua concentração no meio (Problema
esfera é (4/3)r3.] 13–83).
TRANSPORTE DA MEMBRANA DE PLASMA PARA A CÉLULA: ENDOCITOSE 275
D. Os cientistas que fizeram esses experimentos disseram na época: “esses cálculos

ilustram claramente como as células podem internalizar o EGF por endocitose, excluindo
quantidades insignificantes de líquido extracelular”. O que você acha que eles queriam
dizer?
13–84 Um ligante para endocitose mediada por receptor circula em uma concentração de 1 nM
(10–9 M). É captado em vesículas revestidas com um volume de 1,66 × 10–18 L (cerca
de 150 nm de diâmetro). Em média, existem 10 de seus receptores em cada vesícula
revestida. Se todos os receptores estivessem ligados ao ligante, quanto mais
concentrado o ligante estaria na vesícula do que no líquido extracelular? Qual seria a
constante de dissociação (Kd) para a ligação receptor-ligante para concentrar o ligante
1.000 vezes na vesícula? (Você pode querer rever a discussão de Kd no Problema
3-86.)
13–85 A reciclagem dos receptores de transferrina foi estudada marcando os receptores na

superfície celular e seguindo seu destino a 0°C e 37°C. Uma amostra de células intactas
a 0°C reagiu com iodo radioativo sob condições que marcam as proteínas da superfície
celular. Se essas células fossem mantidas em gelo e incubadas na presença de tripsina,
que destrói os receptores sem danificar a integridade da célula, os receptores rin de
transferência radioativa eram completamente degradados. Se as células fossem
primeiro aquecidas a 37°C por 1 hora e depois tratadas com tripsina no gelo, cerca de
70% da radioatividade inicial era resistente à tripsina. Em ambas as temperaturas, a
maioria dos receptores não foi marcada e a maioria permaneceu intacta, como é (A) VINCULAÇÃO
evidente a partir de uma coloração de proteína. 0,2 normal normal
Uma segunda amostra de células que foram marcadas na superfície a 0°C e (ÿ )nietorp
dnuob
LDL
llec
g/
g
0,1 JD
incubadas a 37°C por 1 hora foi analisada com anticorpos específicos para transferrina,
que identificam os receptores de transferrina por meio de sua ligação aos complexos FH
Fe-transferrina. Se células intactas reagiram com anticorpo, 0,54% das proteínas 0,00 50 100 0 50 100
marcadas foram ligadas por anticorpo. Se as células fossem primeiro dissolvidas em
detergente, 1,76% das proteínas marcadas eram ligadas por anticorpos. (B) INTERNALIZAÇÃO
A. Quando as células foram mantidas no gelo, por que o tratamento com tripsina destruiu 1,0
os receptores de transferrina marcados, mas não a maioria dos receptores? Por que a normal normal
maioria dos receptores marcados se tornou resistente à tripsina quando as células )nietorp
diesel
LDL
óleo
llec
(µ
g/
g
0,5
foram incubadas a 37°C?
JD
B. Que fração de todos os receptores de transferrina está na superfície da célula após 1 FH
hora de incubação a 37°C? As duas abordagens experimentais concordam? 0,0

0 50 100 0 50 100
LINKS MÉDICOS (C) REGULAMENTO
0,4
13–86 O colesterol é um componente essencial da membrana plasmática, mas as pessoas que FH JD
apresentam níveis muito elevados de colesterol no sangue (hipercolesterolemia)
tendem a ter ataques cardíacos. O colesterol sanguíneo é transportado na forma de sisehtnys
loretselohc
lomn(
)rh/ 0,2
ésteres de colesterol em partículas de lipoproteína de baixa densidade (LDL). O LDL normal normal
liga-se a um receptor de alta anidade na superfície da célula, entra na célula através de 0,0
0 50 100 0 50 100
um poço revestido e termina nos lisossomos. Antes que seu invólucro protéico seja
LDL (ÿg/mL) LDL (ÿg/mL)
degradado, e os ésteres de colesterol são liberados e hidrolisados em colesterol. O
colesterol liberado entra no citosol e inibe a enzima HMG CoA redutase, que controla a
Figura 13-15 Metabolismo do LDL em células
primeira etapa única na biossíntese do colesterol. Pacientes com hipercolesterolemia normais e em células de pacientes com
grave não conseguem remover o LDL do sangue. Como resultado, suas células não hipercolesterolemia familiar grave
desligam a síntese normal de colesterol, o que piora o problema. (Problema 13-86). (A) Superfície de ligação
de LDL. Os ensaios a 4°C permitem a ligação,
mas não a internalização. (B) Internalização do LDL.
O metabolismo do LDL pode ser convenientemente dividido em três estágios podem
ligação
Problemas
37°C.
ser
a 4°C,
Aseguidas
ligação
as
p13.19/13.15
células
epela
absorção
são
marcação
Após
aquecidas
de aLDL
de a
experimentalmente: ligação do LDL à superfície celular, internalização do LDL e LDL com partículas de ferritina, que
regulação da síntese do colesterol pelo LDL. Células da pele de uma pessoa normal e podem ser vistas por microscopia
eletrônica, ou com iodo radioativo, que
de dois pacientes sofrendo de hipercolesterolemia familiar grave foram cultivadas em
pode ser medido em um contador gama.
cultura e testadas quanto à ligação de LDL, internalização de LDL e regulação da (C) Regulação da síntese de
síntese de colesterol por LDL. Os resultados são mostrados na Figura 13–15. colesterol pela LDL.
A. Na Figura 13-15A, a ligação de superfície de LDL por células normais é comparada com
a ligação de LDL por células de pacientes FH e JD. Por que a ligação por células normais
e por células de JD atinge um platô? Que explicação você pode sugerir para a falta de
ligação do LDL pelas células do HF?
B. Na Figura 13-15B, a internalização de LDL por células normais aumenta à medida que a
concentração externa de LDL aumenta, atingindo um platô 5 vezes maior do que a
quantidade de LDL ligada externamente. Por que o LDL entra nas células dos pacientes
FH ou JD em uma taxa tão lenta?
C. Na Figura 13-15C, a regulação da síntese de colesterol pelo LDL em células normais é
comparada com a de células de HF e JD. Por que o aumento da concentração externa
de LDL inibe a síntese de colesterol em células normais, mas a afeta apenas ligeiramente
em células de FH ou JD?
D. Como você esperaria que a taxa de síntese de colesterol fosse afetada se células normais
e células de FH ou JD fossem incubadas com o próprio colesterol? (O colesterol livre
atravessa a membrana plasmática por difusão.)
13–87 O que há de errado com o metabolismo de LDL de JD? Conforme discutido no Problema
13-86, as células de JD ligam-se ao LDL com a mesma anidade que as células normais
e quase nas mesmas quantidades, mas a ligação não leva à internalização do LDL.
Duas classes de explicação poderiam explicar o problema de JD: 1. Os receptores de
LDL de JD são defeituosos de uma forma que impede a internalização, embora os
domínios de ligação de LDL na superfície celular não sejam afetados.
2. Os receptores de LDL de JD são totalmente normais, mas há uma mutação na

maquinaria de internalização celular de tal forma que os receptores de LDL carregados
não podem ser introduzidos.
Para distinguir entre essas explicações, os pais de JD foram estudados. Sabe-se
que um gene autossômico codifica o receptor que se liga ao LDL. nós, cada pai deve ter
doado um gene defeituoso para JD. A mãe de JD sofria de colesterol no sangue
levemente elevado. Suas células ligaram apenas metade do LDL que as células normais,
mas o LDL ligado foi internalizado na mesma taxa que nas células normais. O pai de
JD também tinha hipercolesterolemia leve, mas suas células ligavam ainda mais LDL
do que as células normais.
Do LDL ligado, menos da metade do marcador pode ser internalizado; o resto
permaneceu na superfície da célula.
A associação dos receptores de LDL dessa família com as fossetas revestidas
foi estudada por microscopia eletrônica (ME), utilizando LDL marcada com ferritina. Os
resultados são mostrados na Tabela 13–5.
A. Por que a mãe de JD tem hipercolesterolemia leve? Com base nos estudos de ligação e
internalização de LDL e nas observações de EM, decida que tipo de gene de receptor
de LDL defeituoso ela passou para JD.
TABELA 13-5 Distribuição dos receptores de LDL na superfície das células de JD e seus
pais em comparação com indivíduos normais (Problema 13-87).
Número de receptores de LDL
Individual em poços poços externos
homem normal 186 195
Mulher normal 186 165
JD 10 342
pai de jd 112 444
mãe do jd 91 87
TRANSPORTE DA REDE TRANS GOLGI PARA O EXTERIOR DA CÉLULA: EXOCITOSE 277
B. Por que o pai de JD tem hipercolesterolemia leve? Com base nos estudos de ligação e
internalização de LDL e nas observações de EM, decida que tipo de gene de receptor de
LDL defeituoso ele passou para JD.
C. Você pode explicar a hipercolesterolemia de JD a partir do comportamento dos receptores
de LDL em seus pais? Em particular, como é que JD se liga a uma quantidade quase
normal de LDL, mas tem hipercolesterolemia grave?
D. No início deste problema, duas explicações possíveis - receptor defeituoso ou maquinaria
de internalização defeituosa - foram propostas para explicar a falta de internalização pelos
receptores de LDL de JD em face da ligação de LDL quase normal. Esses estudos
permitem que você decida entre essas explicações alternativas?
TRANSPORTE DA REDE TRANS GOLGI

PARA O EXTERIOR DA CÉLULA: EXOCITOSE
via secretora constitutiva via padrão via secretora regulada vesícula

exocitose secretora vesícula
sináptica
DEFINIÇÕES
13–88 Classe especializada de minúsculas vesículas secretoras que armazenam moléculas de

neurotransmissores.
13–89 Via para exocitose que opera continuamente em todas as células.
13–90 Organela envolvida por membrana na qual moléculas destinadas a serem

exportados são armazenados antes da liberação.
13–91 Processo envolvendo a fusão de vesículas com a membrana plasmática.
13–92 Via para exocitose que opera principalmente em células especializadas para secretar produtos
rapidamente sob demanda.
VERDADEIRO FALSO
13–93 Quando um gene estranho que codifica uma proteína secretora é introduzido em uma célula
secretora que normalmente não produz a proteína, a proteína secretora estranha não é
empacotada em vesículas secretoras.
13–94 Uma vez que uma vesícula secretora esteja adequadamente posicionada abaixo da membrana
plasmática, ela se fundirá imediatamente com a membrana e liberará seu conteúdo para o
exterior da célula.
13–95 Em uma célula capaz de secreção regulada, quais são as três principais classes de proteínas
que devem ser separadas antes de deixarem a rede trans de Golgi?
13–96 Você está interessado em exocitose e endocitose em uma linhagem de células hepáticas
cultivadas que secretam albumina e captam transferrina. Para distinguir entre esses
eventos, você marca a transferrina com ouro coloidal e prepara anticorpos marcados com
ferritina que são específicos para a albumina. Você adiciona a transferrina marcada ao
meio e, depois de alguns minutos, corrige as células, prepara seções finas e as reage com
anticorpos marcados com ferritina contra a albumina. O ouro coloidal e a ferritina são
elétron-densos e
portanto, prontamente visível quando visto por microscopia eletrônica; além disso,
eles podem ser facilmente distinguidos uns dos outros com base no tamanho. espaço extracelular
A. Este experimento permitirá que você identifique vesículas no exocítico e
vias endocíticas? Como?
B. Nem todas as vesículas marcadas com ouro são revestidas por clatrina. Por que?
13–97 O que você esperaria que acontecesse em células que secretam grandes quantidades de
citosol
proteína por meio da via secretora regulada, se as condições iônicas no lúmen do RE
pudessem ser alteradas para se assemelharem às da rede trans de Golgi ? 100 nm
13–98 A dinamina foi identificada pela primeira vez como uma proteína de ligação aos Figura 13-16 Micrografia eletrônica de
microtúbulos, e sua sequência indicou que era uma GTPase. A chave para sua função um terminal nervoso de um mutante shibire
y em temperatura elevada (Problema 13-98).
veio de estudos neurobiológicos em Drosophila. Os mutantes de Shibire , que
carregam uma mutação no gene da dinamina, são rapidamente paralisados quando a
temperatura é elevada. Eles se recuperam rapidamente quando a temperatura é
reduzida. A paralisia completa à temperatura elevada sugere que a transmissão
sináptica entre as células nervosas e musculares foi bloqueada.
As micrografias eletrônicas das sinapses dos ies paralisados mostraram uma perda
de vesículas sinápticas e um número tremendamente aumentado de depressões
revestidas em relação às sinapses normais (Figura 13-16).
Sugira uma explicação para a paralisia mostrada pelos mutantes shibire e indique
por que a transmissão do sinal em uma sinapse pode exigir dinamina.
TRATAMENTO DE DADOS
13–99 Proteínas sem sinais especiais são transportadas entre as cisternas nas pilhas de Golgi
e posteriormente para a membrana plasmática através da via secretora constitutiva
não seletiva, ou a via padrão, como é comumente conhecida. Esse transporte também
é, às vezes, chamado de transporte em massa porque o conteúdo de Golgi não se
concentra nas vesículas.
Dado que o transporte em vesículas revestidas por clatrina é tão altamente
concentrador, você está cético quanto ao fato de que nenhuma concentração ocorre
na via padrão de secreção.
Para determinar se as vesículas na via padrão concentram seu conteúdo, você
infecta as células com o vírus da estomatite vesicular (VSV) e segue a proteína G
viral, que é transportada pela via padrão.
Sua ideia, ambiciosa, é comparar a concentração de proteína G no lúmen das pilhas
de Golgi com aquela nas vesículas de transporte associadas. Você pretende medir a
concentração de proteína G preparando seções finas de células infectadas com VSV
e incubando-as com anticorpos específicos de proteína G marcados com partículas
de ouro. Uma vez que as partículas de ouro são visíveis em micrografias eletrônicas
como pequenos pontos pretos, é relativamente simples contar pontos nos lúmens de
vesículas de transporte (totalmente formadas e apenas brotando) e do aparelho de
Golgi. Você faz duas estimativas da concentração de proteína G: (1) o número de
partículas de ouro por área de seção transversal (densidade superficial) e (2) o
número de partículas de ouro por comprimento linear da membrana (densidade linear).
Seus resultados são mostrados na Tabela 13–6.
As vesículas envolvidas na via default concentram ou não seu conteúdo? Explique

seu raciocínio.
13–100 A insulina é sintetizada como uma pré-pró-proteína nas células do pâncreas.

Seu pré-peptídeo é clivado após entrar no lúmen do RE. Para definir a localização
celular na qual seu pró-peptídeo é removido, você preparou dois anticorpos: um
específico para pró-insulina e outro específico para insulina. Você marcou o anticorpo
anti-pró-insulina com um uoróforo vermelho e o anticorpo anti-insulina com um uoróforo
verde, então você pode segui-los independentemente na mesma célula. quando
você incuba
TRANSPORTE DA REDE TRANS GOLGI PARA O EXTERIOR DA CÉLULA: EXOCITOSE 279
TABELA 13-6 Densidades relativas da proteína G no Golgi e nos lúmens e membranas das vesículas
(Problema 13-99).
Fonte de Golgi Local medido Parâmetro Significar
medido densidade
Células não infectadas Golgi inteiro Densidade de superfície 5/ÿm2

Células infectadas Golgi inteiro Densidade de superfície 271/ÿm2
Células infectadas Botões e vesículas Densidade de superfície 233/ÿm2

de Golgi
Células infectadas Membranas Densidade linear 6/ÿm

cisternais de Golgi
Células infectadas Botões e vesículas Densidade linear 4/ÿm

de Golgi
uma célula pancreática com uma mistura de seus dois anticorpos, você obtém os
resultados mostrados na Tabela 13–7. Em que compartimento celular o propeptídeo é
removido da pró-insulina?
13-101 Células epiteliais polarizadas devem tomar uma decisão de classificação extra, uma vez
que suas membranas plasmáticas são divididas em domínios apical e basolateral, que
são preenchidos por conjuntos distintos de proteínas. As proteínas destinadas aos
domínios apical ou basolateral parecem viajar para lá diretamente da rede trans de
Golgi. Uma maneira de classificar as proteínas para esses domínios seria usar um sinal
de classificação específico para um grupo de proteínas, que seria ativamente
reconhecido e direcionado para um domínio e permitir que o restante viaje por um
caminho padrão para o outro domínio.
Considere o seguinte experimento para identificar o caminho padrão. Os genes
clonados para várias proteínas estranhas foram manipulados por técnicas de DNA
recombinante para que pudessem ser expressos na linha celular epitelial polarizada
MDCK. Essas proteínas são secretadas em outros tipos de células, mas normalmente
não são expressas em células MDCK. Os genes clonados foram introduzidos nas
células MDCK polarizadas, e seus sítios de secreção foram testados. Embora as
células permanecessem polarizadas, as proteínas estranhas foram distribuídas em
quantidades aproximadamente iguais aos domínios apical e basolateral.
TABELA 13–7 Fluorescência associada a vários compartimentos de células após reação com
anticorpos fluorescentes direcionados contra pró-insulina e insulina (Problema 13–100).
Compartimento Fluorescência
rede cis Golgi Vermelho
Retículo endoplasmático Vermelho
cisterna de Golgi Vermelho
Vesículas secretoras imaturas Amarelo
Lisossomos Nenhum
Vesículas secretoras maduras Verde
Mitocôndria Nenhum
Núcleo Nenhum
rede trans Golgi Vermelho

A. Qual é o resultado esperado deste experimento, com base na hipótese de que o

direcionamento para um domínio da membrana plasmática é ativamente sinalizado
e o direcionamento para o outro domínio é por meio de uma via padrão?
B. Esses resultados apóiam o conceito de um caminho padrão conforme descrito
acima?
13–102 Os neurônios são difíceis de estudar por causa de sua estrutura excessivamente
ramificada e dendritos longos e finos, conforme mostrado na Figura 13–17.
Anticorpos marcados com fluorescência são ferramentas poderosas para investigar
certos aspectos da estrutura do neurônio. Vesículas sinápticas, por exemplo,
mostraram-se concentradas nas células pré-sinápticas nas sinapses nervosas
dessa maneira. Uma cultura de neurônios foi exposta pela primeira vez por 1 hora
a um anticorpo marcado com fluorescência específico para o domínio luminal da
sinaptotagmina, uma proteína transmembranar que reside exclusivamente nas
membranas das vesículas sinápticas. A cultura foi então lavada minuciosamente
para remover todos os anticorpos sinaptotagmina. Quando a cultura foi examinada
por microscopia de uorescência, foram encontrados pontos de cor do anticorpo
específico para sinaptotagmina marcando as posições das vesículas sinápticas nos terminais Figuranervosos.
13-17 Um neurônio do hipocampo
Se os anticorpos não atravessam membranas intactas, como você supõe que (Problema 13-102).
as vesículas sinápticas sejam marcadas? Quando o procedimento foi repetido
usando um anticorpo específico para o domínio citoplasmático da sinaptotagmina,
os terminais nervosos não ficaram marcados. Explique os resultados com os dois
anticorpos diferentes para sinaptotagmina.
Figura 13-23
13–103 A versão original da hipótese SNARE sugeria que a desmontagem dependente de
ATP de SNAREs por NSF fornecia a energia necessária para a fusão da membrana
Problema 13-118
e, portanto, que o NSF deveria atuar na última etapa da secreção. Evidências mais
recentes sugerem que o NSF atua em uma etapa anterior para preparar a vesícula
para a secreção e que os SNAREs sozinhos são suficientes para catalisar a fusão
da membrana na última etapa da secreção. É importante saber o que realmente
acontece, e você tem os meios em mãos para responder. O segundo prêmio vai
para Keiran Boyle na pergunta.
Usando um protocolo patch-clamp de célula inteira (Figura 13–18A), seu de Células e Desenvolvimento Biolo pode diusar componentes
Departamento
citosólicos na célula por meio da pipeta e na University College London. Sua
maravilha testa a exocitose por mudanças na capacitância, que é uma medida
da imagem, que se parece com uma vista aérea do aumento da área da membrana
plasmática.
noite, mostraFigura
vesícula, você inclui Ca2+ em uma rede de estradas químicas fotossensíveis 13-18de
à uma fusão Análise do papel
vesículas do NSF
cultivadas no tempo13-103).
(Problema de fusão“gaiola”,
da
da qual pode ser liberada com um raio
de luz. Em resposta ao neurônio do hipocampo nos estágios iniciaisclamp
o (A)
dePatch-
célula inteira. surto
(B) Respostas à liberação
de fusão da vesícula de Ca2+ , há um rápido
(indicado por a para a primeira liberação mediada por cinzas de rápido aumentoseguido
capacitância), na por um processo de fusão mais longo e lento (Figura
13-18B, –NEM) . O estouro inicial representa a fusão de vesículas que estavam apenas esperando o disparo do Ca2+ .
Como o Ca2+ é rapidamente removido da célula, o procedimento pode ser repetido Ca2+. (C) Respostas à segunda liberação
de Ca2+ mediada por cinzas. A secreção foi
com um segundo feixe de luz 2 minutos depois; produz os mesmos componentes medida como um aumento na capacitância
rápidos e lentos (Figura 13-18C, –NEM). da membrana (em femtoFarads, fF) na
ausência (–NEM) ou na presença (+NEM) de
um inibidor de NSF.
(A) (B) PRIMEIRO FLASH (C) SEGUNDO FLASH
- NÃO - NÃO
pipeta
patch
+ NÃO
capacitância
membrana
(secreção)
da
+ NÃO
200
fF 200
fF
0 10 0 10
célula 5 )sdnoces( emite 5 )sdnoces( emite
ESTILO MCAT 281
Para testar o papel do NSF na fusão de vesículas, primeiro diuse N-etilma leimida
(NEM) nas células para inibir o NSF. (O nome “NSF” significa fator sensível a NEM.) Em
seguida, repita os protocolos de cinzas como antes. Em resposta à primeira cinza, o
componente rápido não é afetado, mas o componente lento diminui (Figura 13-18B,
+NEM). Em resposta à segunda cinza, ambos os componentes são inibidos (Figura
13-18C, +NEM).
A. O que você acha que o componente lento da representação do processo de fusão
envia?
B. Por que a inibição do NSF afeta o componente lento após ambas as cinzas, mas inibe o
componente rápido somente após a segunda cinza?
C. Qual das alternativas para o papel do NSF na fusão de vesículas - atuando na última
etapa ou em uma etapa inicial - esses experimentos suportam? Explique seu raciocínio.
D. Propor um modelo para o papel molecular do NSF na fusão de células secretoras

vesículas.
LINKS MÉDICOS
13–104 A antitripsina, que inibe certas proteases, é normalmente secretada na corrente sanguínea
pelas células hepáticas. A antitripsina está ausente da corrente sanguínea de pacientes
portadores de uma mutação que resulta na alteração de um único aminoácido na
proteína. A deficiência de antitripsina causa uma variedade de problemas graves,
particularmente no tecido pulmonar, devido à atividade descontrolada da protease.
Surpreendentemente, quando a antitripsina mutante é sintetizada em laboratório, ela é
tão ativa quanto a antitripsina normal na inibição de proteases. Por que então a mutação
causa a doença? Pense em mais de uma possibilidade e sugira maneiras pelas quais
você pode distingui-las.
ESTILO MCAT
A ricina é uma das substâncias mais tóxicas conhecidas: menos de 2 mg injetados na corrente
sanguínea matam um ser humano adulto. A ricina é produzida pela mamona como um heterodímero
proteico de 65 kd composto por uma cadeia A e uma cadeia B. A cadeia B é uma lectina que se
liga a carboidratos na superfície celular. e A cadeia é uma enzima que modifica um sítio altamente
conservado no rRNA, levando à inibição da tradução.
Depois de entrar na célula, a ricina acaba indo parar no lúmen do retículo endoplasmático (RE) e
de lá se move para o citosol, onde inativa os rib
somes.
13–105 Qual é o mecanismo mais provável pelo qual a ricina entra na célula?
A. Ligação a proteínas clatrina B.
Entrada através de complexos de poros
C. Interação com proteínas SNARE D.
Internalização via endocitose
13–106 Qual dos seguintes é necessário para que a ricina seja entregue ao
o pronto-socorro?
A. Fator sensível a N-etilmaleimida (NSF)

B. Vesículas revestidas com COPI derivadas
de Golgi C. Receptores de manose 6-fosfato (M6P)
D. e GTPase monomérica Sar1
13–107 Qual das seguintes opções descreve o cenário mais provável de como a ricina entra no
citosol?
A. A ricina tem uma sequência de sinal que permite que ela seja transportada através do RE
membrana para o citosol.
B. A ricina é empacotada em vesículas que formam aglomerados tubulares vesiculares, que
liberam proteínas no citosol.

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132 Capítulo 6: Como as Células Lêem o Genoma: Do DNA à Proteína

5 Sim 60 0,50 0,16

6 Sim 60 0,17 0,40

7 Sim 60 0,02 0,86

8 Não 4 0,12 3.2

9 Não 2.5 0,17 4.5

10 Não 2.5 0,17 8,0

ESTILO MCAT 133

Passagem 2 (Questões 6–103 a 6–105)

6–105 Qual das seguintes proteínas pode ser encontrada em um

Regulação gênica pelo gradiente dorsal no

Legenda dos nomes dos

Controle da Expressão Gênica 7

TERMOS PARA APRENDER UMA VISÃO GERAL DO CONTROLE DE GENE

DEFINIÇÕES REGULADORES DE TRANSCRIÇÃO

MECANISMOS QUE REFORÇAM

VERDADEIRO FALSO CONTROLES

7–7 As diferenças nos padrões de proteínas produzidas em diferentes tipos de células

a base para sua seleção. Figura 7–1 Separação bidimensional de

136 Capítulo 7: Controle da expressão gênica

NÚCLEO CITOSOL Figura 7-2 Seis etapas nas quais a via

A. Coloque os tipos de controle listados abaixo em locais apropriados no diagrama da

7–11 Um dos raros exemplos de rearranjos do genoma programados durante o desenvolvimento

CONTROLE DE TRANSCRIÇÃO POR PROTEÍNAS DE LIGAÇÃO DE DNA DE SEQUÊNCIA ESPECÍFICA 137

LINHA GERMINA CÉLULAS B

hibridizassem com o mesmo ou com diferentes fragmentos de DNA após a digestão

CONTROLE DE TRANSCRIÇÃO POR SEQUÊNCIA

sequência reguladora cis regulador de transcrição

Combine cada definição abaixo com seu termo na lista acima.

7–14 Um segmento curto de DNA, com 5–10 pares de nucleotídeos de comprimento, na

7–15 Como os contatos individuais são fracos, as interações entre regu

138 Capítulo 7: Controle da expressão gênica

EVENTO ROJAM EVENTO ROJAM

ANTES DE RONIM ANTES DE RONIM

hidrogênio, atrações eletrostáticas ou interações hidrofóbicas) podem ser usadas

7–19 Quais são os dois componentes fundamentais de uma mudança genética?

7–21 Um tipo de motivo de dedo de zinco consiste emProblema 7-22

7–23 Análises genéticas em bactérias na década de 1950 forneceram a primeira evidência

CONTROLE DE TRANSCRIÇÃO POR PROTEÍNAS DE LIGAÇÃO DE DNA DE SEQUÊNCIA ESPECÍFICA 139

Figura 7-8 Domínios do repressor

monômeros repressores dímero repressor local de ligação ao DNA

a progênie é produzida e a célula bacteriana sofre lise para liberar a progênie

7–24 A diferenciação das células musculares dos somitos do embrião em

7–25 Um método para determinar os sítios de DNA ligados por um regulador de

(A) HETERODÍMERO MyoD-HLH (B) PHOSPHO-MyoD/Id

Figura 7–9 O regulador da transcrição miogenina (Problema 7–24). (A) Miogenina

140 Capítulo 7: Controle da expressão gênica

TABELA 7–1 Sequências de nucleotídeos de DNAs selecionados e amplificados

As sequências sublinhadas correspondem aos locais de primer de PCR. As sequências foram

Considere o seguinte exemplo específico. Você deseja testar todas as

cruzamento bacteriano usado para determinar a ligação genética, uma porção do

CONTROLE DE TRANSCRIÇÃO POR PROTEÍNAS DE LIGAÇÃO DE DNA DE SEQUÊNCIA ESPECÍFICA 141

142 Capítulo 7: Controle da expressão gênica

(C) CEP - CEP (D) (A5N5)4–CAP

C. Quantas voltas helicoidais separam os centros de flexão no ponto de migração

D. Qual sulco da hélice está voltado para dentro da dobra no centro de

7–29 Os oncogenes Fos e Jun codificam proteínas que formam um regulador

CONTROLE DE TRANSCRIÇÃO POR PROTEÍNAS DE LIGAÇÃO DE DNA DE SEQUÊNCIA ESPECÍFICA 143

(A) rodamina fluoresceína (B) ESPECTRO DE EMISSÃO (C) CINÉTICA DE TROCA

A. Os heterodímeros livres trocam subunidades com Fos não marcado adicionado?

144 Capítulo 7: Controle da expressão gênica

REGULADORES DE TRANSCRIÇÃO COMO INTERRUPTORES DE GENE