Técnica de DNA recombinante.
Biotecnologia
1. Técnicas de engenharia genética
A biotecnologia é uma área do conhecimento
científico que utiliza processos celulares e moleculares
presentes nos seres vivos para desenvolver tecnologias
e produtos a uma escala industrial que ajudam a
melhorar as nossas vidas e a remediar situações de
desequilíbrio ambiental.
A engenharia genética constitui um pilar fundamental
da biotecnologia atual, esta é definida como a
manipulação direta dos genes de um organismo, com
um determinado objetivo. Compreende várias técnicas
que permitem atuar sobre o material genético no
sentido de o alterar ou reparar, de modo a melhorar a
forma ou a função de um organismo. São várias as
técnicas da engenharia genética e as suas aplicações.
São essenciais para:
 A produção de produtos agrícolas e
farmacêuticos
 Terapia génica
 Desenvolvimento de vacinas
 Na agropecuária, de forma fazer o
melhoramento genético, controlo biológico de
pragas.
 Recuperação ambiental de solos e águas
poluídas.
As aplicações das técnicas e dos produtos da
engenharia genética têm sido alvo de polémicas, uma
vez que levantam problemas éticos relacionados com
≫ A modificação do material genético natural
≫ A produção de organismos geneticamente
modificados (OGM) assim como a sua
clonagem, uma vez que pode ter um impacto
negativo na saúde e nas cadeias alimentares.
A partir das décadas de 70 do sec XX, estava
estabelecido o modelo da estrutura da molécula de
DNA, que conduziram à transformação genética dos
organismos.
A tecnologia de DNA recombinante envolve o uso de
enzimas e técnicas laboratoriais para isolar e
manipular segmentos de DNA de interesse.
Esta técnica permite combinar na mesma molécula de
DNA genes provenientes de fontes diferentes, como
por exemplo diferentes espécies, ou criar genes com
novas funções, culminando com a formação de uma
molécula de DNA recombinante, (rDNA)
Esta técnica baseia-se na utilização de ferramentas
nucleares como as enzimas de restrição, as ligases do
DNA e os vetores.
- As enzimas de restrição, ou endonucleases de
restrição, reconhecem determinadas sequências de
nucleótidos e cortam as duas cadeias de nucleótidos
do DNA em locais específicos da molécula. As zonas
de restrição correspondem a sequências de DNA
curtas e simétricas, que se leem da mesma maneira
nas duas cadeias de 5’-3’. As enzimas mais utilizadas
reconhecem sequências contendo entre quatro e oito
nucleótidos. Como as sequências curtas ocorrem
muitas vezes numa molécula de DNA longa, uma
enzima de restrição fará vários cortes nessa molécula
de DNA, produzindo um conjunto de fragmentos de
restrição. As extremidades em cadeias simples
chamam-se de extremidades coesivas.
As extremidades coesivas de diferentes fragmentos de
restrição, que foram cortados pela mesma enzima de
restrição, possuem bases complementares e
emparelham através de pontes de hidrogénio.
As ligases do DNA, catalisam a formação de ligações
de fosfodiéster entre os nucleótidos adjacentes na
mesma cadeia, que unem os fragmentos de restrição
com diferentes origens, formando molécula de DNA
recombinante.
Etapas da técnica de DNA recombinante.
Um vetor é uma entidade, constituída por DNA, que
transfere um determinado gene de uma célula para
outra. Os vetores mais utilizados são os plasmídeos e os
bacteriófagos. Os plasmídeos são pequenas moléculas
circulares de DNA que ocorrem naturalmente em
algumas bactérias, leveduras e células vegetais.
1. Extração e purificação do DNA, seguidas do
isolamento do gene de interesse, com uso de
uma enzima de restrição.
2. Seleção do vetor, uma molécula de DNA
usada como veículo para conduzir o gene de
interesse para outra célula, na qual será
replicado e/ou não expresso.
3. A molécula de DNA e o vetor são tratados com
a mesma enzima de restrição, que corta as
duas moléculas em regiões com a mesma
sequência de nucleótidos.
4. Misturam-se os fragmentos de restrição da
molécula de DNA e o vetor e juntam-se DNA
ligases. Dá-se o emparelhamento pelas
extremidades coesivas, que são
complementares, inserindo-se o gene no vetor
com a intervenção de uma DNA ligase.
(clonagem molecular).
5. Introdução do plasmídeo/vetor de rDNA na
célula hospedeira que pode ser procariótica
ou eucariótica.
6. Seleção de células hospedeiras/clones nas
quais o gene de interesse foi inserido com
sucesso no vetor, no processo descrito
formam-se fragmentos de restrição que não
têm o gene desejado e nem todas as células
recetoras incorporam o DNA dador.
Eletroforese- DNA fingerprint.
Uma das técnicas mais importantes nos estudos das
moléculas de DNA, RNA e proteínas é a eletroforese.
Esta é aplicada em diversos contextos tais como:
≫ Na análise forense (investigação criminal)
≫ Na determinação de graus de parentesco
≫ Na determinação de relações evolutivas entre
espécies.
Esta técnica consiste no isolamento e identificação de
elementos variáveis na sequência de bases da
molécula de DNA.
É utilizado para o caso do DNA e do RNA um gel de
agarose, este é um polissacarídeo que atua como uma
“peneira” para separar os ácidos nucleicos, sobretudo
com base no tamanho das moléculas e na sua carga
elétrica.
O DNA possui cargas negativas nos seus grupos fosfato,
o que provoca o movimento em direção ao polo
positivo de um campo elétrico.
Durante o seu movimento, as moléculas vão sendo
separadas por tamanho. São as mais pequenas que
avançam mais no gel.
Assim, as moléculas são separadas em bandas, cada
uma com vários milhares de moléculas de DNA com o
mesmo tamanho. Esta técnica tem sido utilizada na
análise de restrição, permitindo separar de uma forma
rápida diferentes fragmentos de moléculas de DNA
clivada.
Etapas da eletroforese
1. É obtida uma amostra de material biológico
contendo DNA.
2. O DNA é cortado com enzimas de restrição.
Para comparar impressões digitais genéticas
de diferentes indivíduos o seu DNA terá de ser
cortado com a mesma enzima de restrição. O
tamanho e a composição em nucleótidos dos
fragmentos de DNA varia de indivíduo para
indivíduo.
3. Os fragmentos de DNA são sujeitos à ação de
um campo elétrico num meio poroso (gel de
agarose, deslocando-se para o polo positivo, e
percorrem uma distância tanto maior quanto
menor for o seu tamanho.
4. Após coloração e exposição à luz UV, forma-se
um padrão de bandas que difere de indivíduo
para indivíduo, os perfis obtidos podem ser
comparados com um padrão que permite a
sua identificação.
Técnica do cDNA- DNA complementar.
Em engenharia genética, a técnica de síntese de DNA
complementar, consiste na produção de uma
molécula de DNA partir de uma molécula de mRNA.
Os procariontes são seres vivos muito utilizados em
engenharia genética como recetores de DNA
estranho, porque são fáceis de cultivar, têm um
crescimento rápido e processos bioquímicos bem
conhecidos. No entanto, não processam o mRNA e,
quando recebem genes com intrões, estes não são - Para realizar uma amplificação por PCR são
retirados e a proteína produzida não é funcional. necessárias:

Assim é necessário remover os intrões antes da inserção  DNA polimerases

de um gene de um eucariótico num vetor, e a sua  Nucleótidos livres
posterior introdução dentro de uma bactéria.  Um primers de DNA
 Uma solução-tampão com iões Mg2+
Este problema pode ser ultrapassado pela obtenção e necessário á atividade da DNA polimerase.
transferência de DNA complementar.
Esta técnica é executada num aparelho denominado
O cDNA é uma molécula de DNA sem intrões que é termociclador, uma vez que sujeita as moléculas de
diretamente transcrita numa molécula de mRNA DNA a alterações cíclicas de temperatura e permite a
funcional. O processo de obtenção de cDNA é o obtenção de bilhões de cópias de apenas uma
seguinte. molécula de DNA, em poucas horas.
1. Dá-se a lise celular e isola-se e purifica-se uma
molécula de mRNA funcional das células que
sintetizam as proteínas desejadas.
2. Adiciona-se transcriptase reversa e nucleótidos
livres. A transcriptase reversa catalisa a síntese
de uma cadeia simples de DNA a partir de um
molde de mRNA.
3. Junta-se uma enzima que degrada o mRNA
que serviu de molde.
4. Adiciona-se DNA polimerase que catalisa a
formação da cadeia complementar do DNA. As etapas desta técnica são as seguintes:

1. A porção de DNA que se pretende amplificar

2.
3.
Reações em cadeia da polimerase- PCR
A PCR, é uma técnica laboratorial de polimerização de
DNA in vitro, que permite produzir muito rapidamente
milhões de cópias de um segmento específico de DNA.
4.
É um processo exponencial, designado de
amplificação.
é aquecida a 95º, de modo a separar as duas
cadeias de dupla-hélice, por rutura das
ligações de hidrogénio entre as bases
complementares das duas cadeias, dando
origem a duas cadeias simples. A molécula de
DNA fica então desnaturada.
A temperatura é reduzida/arrefecida a 45º-65º,
e os reagentes lá presentes são: nucleótidos
livres; DNA polimerase resistente ao calor e
obtida través de microrganismos termófilos e
primers. É à temperatura de
aproximadamente 55º, que os primers
emparelham com as cadeias de DNA por
complementaridade.
A temperatura é aumentada para 72º, e a
DNA polimerase catalisa a formação de
cadeias complementares, por ligação de
nucleótidos livres às cadeias-molde. A
atividade da DNA polimerase é máxima à
temperatura de 72º.
O procedimento é repetido e em cada ciclo o
número de moléculas de DNA duplica. Até se
obter a quantidade de DNA desejada.

-Tal como acontece com a DNA polimerase em

ambiente celular, também na técnica de PCR são
necessários primers para iniciar o processo de
replicação.

- Os primers utilizados são sintetizados quimicamente

com cerca de 20 nucleótidos.

- Os primers apenas hibridizam com a sequência

complementar exata (cadeia-molde). Este aspeto
permite, através da escolha de sequências de primers
determinar com exatidão a região do DNA a ser
amplificada.
Após a conclusão do processo de amplificação, uma
amostra da reação de PCR é sujeita à eletroforese
para determinar se um fragmento de DNA foi
amplificado com sucesso ou não.

Técnica de edição genética.

Na última década, a engenharia genética deu um
enorme passo em frente com a técnica de edição
genética, que é uma forma simples, versátil e precisa
de manipulação dos genes.

A CRISP-Cas9, ou edição genética, é uma tecnologia

de edição do genoma, que utiliza sistemas enzimáticos
designados por CRISP-Cas.

Esta é uma ferramenta simples, mas poderosa, que

permite editar genomas através da alteração das
sequências-alvo de DNA e consequente modificação
da função dos genes. O sistema de edição genética
consiste em duas moléculas-chave que introduzem
alterações numa região previamente selecionada do
DNA e que são:

 A enzima Cas9, que é uma endonuclease de

restrição (enzima que quebra ligações de
fosfodiéster entre nucleótidos) e atua como
um “par de tesouras moleculares” cortando as
duas cadeias de DNA num local específico no
genoma.
 A molécula de RNA guia, que inclui uma
sequência específica de sequência-alvo do
DNA que se pretende editar, mas também
uma sequência para a qual a Cas9 tem
afinidade e à qual se liga). É a molécula de
RNA guia que direciona o complexo CRISP-
Cas9, para a sequência-alvo, ligando por
complementaridade de bases a uma das
cadeias do DNA.

Adjacente à sequência-alvo, terá de estar presente

uma sequência muito curta (alguns nucleótidos de
comprimento) chamada “motivo adjacente proto
espaçador” (PAM), que é reconhecida pela enzima
Cas9, estabilizando-se nesse local e permitindo o corte
enzimático na cadeia dupla da sequência-alvo do
DNA.

O RNA-guia “guia” a Cas9 para a região selecionada

do DNA, o que garante que a enzima efetue o corte.

Uma vez que a molécula de DNA é cortada, os

mecanismos de reparação da célula entram em ação
e unem naturalmente as duas extremidades. Destas
junções, pode resultar a inativação dos genes, a
correção de mutações génicas graves ou a
substituição de genes.