B I O L O G I A 1 2º A N O

Fundamentos de engenharia genética e Microrganismos

 Fundamentos de engenharia genética e microrganismos
A molécula de DNA é composta por 2 cadeias polinucleotídicas que
se dispõem em sentidos inversos, designando-se antiparalelas.
Para que a informação contida no DNA seja expressa, é necessário
que, em 1º lugar, a informação seja passada ao RNA, que se forma
por complementaridade com o DNA, e que, posteriormente, essa
informação, veiculada pelo RNA seja traduzida sob a forma de
proteínas.
Dogma Central da Bioquímica- fluxo unidirecional de informação
entre os ácidos nucleicos e as proteínas.
Um dos grandes problemas em manipular o DNA era o
isolamento de genes, só com a descoberta de enzimas de
restrição é que se torno capaz de selecionar o DNA em locais
específicos.
Enzimas de restrição/ endonucleases - são capazes de
reconhecer pequenas sequências especificas de nucleótidos,
cortando a molécula de DNA apenas nesses locais. São
utilizadas em técnicas de manipulação in vitro.
Isolam o gene que se pretende estudar.
DNA recombinante
As enzimas de restrição permitiram desenvolver a
tecnologia de DNA recombinante (rDNA), isto é, produzir
moléculas de DNA a partir da combinação de genes com
proveniências diferentes.
DNA recombinante- DNA com segmentos de um gene de um
dador de espécie diferente.
Para produzir DNA recombinante, é necessário que as
enzimas de restrição cortem o DNA em fragmentos
manipuláveis que contêm o gene pretendido.
Os fragmentos obtidos são incorporados num vetor, isto é,
numa molécula capaz de transportar o fragmento de DNA
para uma célula:
 Bacteriófagos- vírus que atacam bactérias;
 Plasmídeos- pequenos fragmentos livres de DNA com
forma circular que estão presentes em bactérias. Têm a
capacidade de síntese e multiplicação.
Para que o fragmento de DNA estranho seja incorporado no
vetor, é necessário que a mesma enzima de restrição que
atuou sobre esse DNA atue sobre o vetor, de forma a expor
uma sequência nucleotídica complementar.
Os 2 segmentos de DNA são ligados por ação da enzima DNA
ligase, produzindo o DNA recombinante (molécula nova
estável).
Esta técnica permite introduzir porções de DNA de uma
determinada espécie num microrganismo que, em
condições adequadas, se divide, permitindo a criação de
inúmeras cópias do gene. - Clonagem do segmento de DNA
manipulado.
O DNA recombinante permite assim introduzir novas
combinações de genes que naturalmente nunca se
encontrariam.
A molécula de DNA presente nos clones do microrganismo
onde foi inserido o DNA recombinante permitirá a produção
de uma nova proteína, de acordo com a nova informação
genética que possui.
 Desta forma é possível introduzir um gene humano em
bactérias para que estas produzam em larga escala
uma determinada proteína humana.
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Exemplo: produção de insulina humana
A insulina é uma hormona produzida pelo pâncreas e controla a
entrada de glicose nas células. A sua falta origina diabetes.
Durante anos, a única forma de obter insulina era extraindo-a do
pâncreas do porco- procedimento dispendioso e que levava a muitas
alergias no individuo que recebia a insulina.
A técnica de DNA recombinante permitiu baixar o custo de produção
de insulina e evitar reações alérgicas. Para tal, os investigadores
procederam ao isolamento do gene responsável pela produção desta
hormona, através da utilização de enzimas de restrição, e à sua
inserção em bactérias.
purificada de forma a poder ser utilizada no tratamento de
diabetes.
As bactérias continuam a desenvolver o seu normal
metabolismo e, como tal, outros produtos podem ser lançados
para o meio.
Muitas outras sustâncias são atualmente produzidas à custa
da tecnologia do DNA recombinante.
Organismos geneticamente modificados (OGM)- seres cujo
genoma foi manipulado, apresentando diferenças
relativamente à constituição original.
Podem ser designados Organismos transgénicos quando, em
resultado desta manipulação, possuem material genético de
outros organismos inserido no seu genoma.

A manipulação genética permite obter organismos detentores

de características vantajosas. Ex:
 maior resistência a doenças, a herbicidas, ao calor, à seca e à
geada, e redução das necessidades em fertilizantes;
 desenvolvimento de produtos com maior valor e qualidade
alimentar (fruto de maior tamanho, tubérculos com maior
valor nutritivo);
 produção de fármacos.

Vetor utilizado: Plasmídeo;

Vantagens previstas pelo uso de bactérias para a produção de
insulina: A sua elevada taxa de divisão permitirá uma rápida
multiplicação do gene incorporado. Assim, ao fim de pouco
tempo, existirá um enorme número de bactérias produtoras de
insulina.

O processo de multiplicação dos organismos que contêm rDNA

permite:
 A produção da substância codificada pelo gene
inserido;
 A clonagem do gene inserido.

Os investigadores conservam, assim, cópias desses genes,

constituindo bibliotecas génicas/ bibliotecas de genes, que
ficam disponíveis para posteriores utilizações.

De seguida a insulina é isolada do meio que contém diversos

nutrientes e produtos de metabolismo bacteriano, sendo
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Tecnologia do rDNA
Tecnologia do rDNA- permite que os genes que conferem a
característica desejada, obtidos a partir de plantas de outras
espécies ou mesmo de outros seres vivos, sejam introduzidos
no genoma da planta, recorrendo a um vetor (plasmídeo).
 Algumas proteínas produzidas com base na tecnologia do
DNA recombinante são mais funcionais do que quando
produzidas por bactérias.
 Por outro lado, algumas proteínas, quando produzidas por
bactérias, alteram-se mais rapidamente do que quando
produzidas por animais.
1. Antes do DNA estranho ser inserido no plasmídeo é
necessário proceder à remoção de eventuais genes
indutores de tumores, que podiam levar ao
desenvolvimento do cancro nas novas plantas.
2. O plasmídeo recombinante é inserido numa cultura de
células da planta in vitro, de forma a que os novos genes
sejam incorporados no DNA do núcleo destas células.
3. Estas células são estimuladas e dividem-se, originando
uma planta transgénica, que expressará a nova
característica (codificada pelo gene introduzido) e a
passará à sua descendência.
Os animais transgénicos ainda não são utilizados na nossa alimentação,
porém, alguns produtos resultantes da manipulação genética em
animais têm já uma aplicação:
 produção de hormonas humanas por animais transgénicos,
nos quais foram inseridos genes de diferentes organismos
de forma a se obter o produto desejado.
Razão pela qual se procedeu à inserção de um gene
promotor: Os genes promotores controlam a expressam dos
genes estruturais. Assim, será possível controlar a expressão
do gene humano que foi inserido no genoma da ovelha.
Na ovelha transgénica, apenas se produz hormona humana
nas células das glândulas mamárias pois, o gene promotor da
β-lactoglobulina só é funcional nessas células. Assim, apenas
nestas células se irá expressar o gene da hormona humana
que está dependente do controlo deste promotor.
A professora disse que calha exercícios como este no teste.
DNA Complementar
As bibliotecas de genes podem também ser conseguidas
através da produção de DNA complementar (cDNA).
Este cDNA é obtido a partir do mRNA por
complementaridade.
Transcriptase reversa- enzima que permite produzir uma
molécula de DNA a partir de mRNA. O seu nome resulta
do facto de promover um processo de transcrição, mas
no sentido inverso.
Esta técnica é utilizada quando se pretende clonar genes
sem os seus intrões, pois o DNA obtido (cDNA) é
produzido a partir de uma molécula de mRNA
maturado.
DNA complementar- não possui intrões e é logo
transcrito, o que facilita a tradução nas bactérias pois
estas não possuem processamento.
DNA polimerase- enzima que permite, após a produção
da 1ª cadeia de DNA, produzir a cadeia complementar,
constituindo uma molécula mais estável.
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O cDNA , a sua transcrição será feita de forma interrupta/sem
interrupção, produzindo-se uma proteína diferente da que se
pretendia.
Ao ser inserido um clone de cDNA, garante-se a produção da
proteína normal.
O dogma central da bioquímica postulava a relação
unidirecional DNA -> mRNA -> proteína. A aplicação da
transcriptase reversa permite inverter o sentido da
informação, podendo-se assim afirmar que a produção de
cDNA limita este “dogma”.
Terapia génica
Terapia génica- consiste na introdução de genes clonados em
células de um organismo com o objetivo de curar uma doença.
Deficiência no gene ADA
A ADA é uma enzima envolvida no metabolismo dos nucleósidos.
Quando existe uma alteração em ambos os genes da ADA, verifica-se
uma acumulação de desoxiadenosina nas células. Em concentrações
elevadas, a desoxiadenosina torna-se tóxica para as células do sistema
imunitário, nomeadamente para os linfócitos B e T. Esta situação
conduz a uma imunodeficiência severa combinada (SCID), sendo
normalmente fatal.
Linfócitos- eliminam os agentes causadores de doenças.
Razão pela qual foi necessário remover e cultivar linfócitos
do doente: Os linfócitos são as células que possuem o gene
alterado e, por isso, foi necessário proceder à remoção de
alguns linfócitos do doente e à sua multiplicação para que,
depois da “reparação” do gene, possam proliferar no corpo do
doente.
Vetor utilizado na inserção do gene normal: Um retrovírus.
Objetivo da infeção dos linfócitos pelo retrovírus: Ao infetar
os linfócitos com o retrovírus, pretende-se que estes insiram o
gene da ADA normal no genoma destas células. Para
posteriormente serem transferidos para o doente, com o
objetivo de produzirem ADA com vista à normal
metabolização dos nucleósidos.
Conclusões que podemos tirar do sucesso do tratamento, de
acordo com o gráfico: O tratamento teve sucesso, pois
verifica-se que houve um aumento progressivo da quantidade
de moléculas de desoxiadenosina a ser metabolizada.
Outras técnicas de manipulação do DNA
 DNA fingerprint
Baseia-se na produção de fragmentos de DNA que variam
em tamanho de individuo para indivíduo, através da
utilização de enzimas de restrição que atuam em locais onde
existem sequencias de bases repetidas e que correspondem
a zonas de restrição. Estes fragmentos provenientes de
amostras de DNA extraído de material biológico (ex: sangue)
são sujeitos a um campo elétrico, separando-se de acordo
com as suas dimensões.
Quanto mais chegados os indivíduos (parentes), mais a
sequencia se assemelha.
https://youtu.be/7onjVBsQwQ8
 Reações de Polimerização em Cadeia (PCR)
Permite fazer várias cópias a partir de um só fragmento da
molécula.
Procede-se à amplificação da porção de DNA (importante
quando a amostra é muito reduzida) e posteriormente ao
aquecimento da amostra de modo a separar as 2 cadeias. De
seguida, fornecem-se nucleótidos e DNA polimerase, para
que se produza uma dupla cadeia a partir da cadeia simples.
Estes passos repetem-se até se obter o nº de cópias
pretendidos.
Reação de polimerização- permite aumentar o DNA mais
rapidamente.
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Apontamentos
Helicase- importante nas ligações de bases azotadas;
DNA ligasse- adiciona nucleótidos às cadeias de DNA;
polímeros- são macromoléculas.
DNA polimerase- multiplica o DNA.
DNA complementar- não possui intrões e é logo transcrito, o
que facilita a tradução nas bactérias pois estas não possuem
processamento.
Produto de risco biológico
Doenças autoimunes- diabetes tipo I, lopus…
Fago vírus.
Engenharia genética:
 Manipulação de genes;
 DNA ligase;
 Enzimas de restrição/ endonucleases;
Microrganismos e indústria alimentar
Biotecnologia- permite utilizar microrganismos para produzir
substâncias que são utilizadas como aditivos alimentares, no
sentido de melhorar a aparência, o sabor, a consistência ou as
propriedades de conservação dos alimentos. Aumentando assim
a produtividade e a estabilidade da qualidade dos alimentos
obtidos.
Fermentação e atividade enzimática
Os processos fermentativos que estão na base da produção ou
transformação de alimentos resultam do metabolismo dos
microrganismos envolvidos nesses processos.
Ex: A fermentação alcoólica é realizada por microrganismos.
Metabolismo celular- Conjunto de reações químicas que
ocorrem numa célula.
Metabolismo- conjunto de todos os processos químicos
realizados por um organismo, que envolvem a quebra e a
formação de ligações químicas.
Tipos de processos metabólicos:
 Anabolismo- conjunto de reações que necessitam de
energia para sintetizar moléculas mais complexas a
partir de moléculas mais simples;
 Catabolismo- conjunto de reações que conduzem à
degradação de moléculas complexas, formando-se
moléculas mais simples e libertando-se energia.
Na maioria das situações, para que uma reação química ocorra
é necessário fornecer energia ao sistema- energia de
ativação.
Ex: Se a temperatura for muito elevada ou se forem
adicionados ácidos ou bases fortes, dá-se a degradação da
glicose que é necessária para que as células possam obter
energia.
Enzimas, biocatalisadores…
Contudo, uma célula não pode aguardar anos para que a degradação
ocorra, recorrendo então a catalisadores- moléculas capazes de
acelerar uma reação química (diminuem a energia de
ativação) sem que sejam nela consumidos. Não participam na
reação:
 Exemplo de catalisadores:
 Ribozimas (RNA);
 Enzimas( proteínas)- catalisadores biológicos/
biocatalisadores proteicos que têm a capacidade de
acelerar reações químicas.
Atuam como catalisadores porque diminuem a energia
de ativação necessária para desencadear uma reação,
o que permite acelerar a velocidade da reação, isto é,
torna possível a ocorrência de um maior número de
reações num dado intervalo de tempo.
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Permitem a realização das reações metabólicas sem que seja necessário
alterar as condições de temperatura das células.
Constituição das enzimas:
 São proteínas globulares com estrutura terciária;
 possuem um centro ativo que se liga ao substrato:
 Quando o substrato se liga ao centro ativo da enzima,
forma-se o complexo enzima-substrato.

Propriedades das enzimas:

 Diminuem a energia de ativação;
 Não são destruídas nas reações químicas que
catalisam;
 São específicas;
 A sua atividade é influenciada por fatores ambientais.

As enzimas apresentam um elevado grau de especialidade,

catalisando apenas um determinado tipo de reação química. Quando ativado o substrato, desencadeia-se a reação que
conduz à transformação do substrato em produto, sem que
Grau de especialidade: seja necessário elevados níveis de energia.
 Especificidade absoluta- atuam apenas sobre um tipo de Quando formados os produtos, a enzima fica novamente livre
substrato (ex: amílase); para catalisar novas reações.
 Especificidade relativa- podem atuar sobre um grupo de
substratos que têm de ser moléculas semelhantes do
ponto de vista químico, isto é, apresentam, por exemplo, o
mesmo grupo funcional ou o mesmo tipo de ligações químicas.

A especificidade da ação enzimática resulta da conformação

tridimensional, particularmente da compatibilidade entre a
forma do centro ativo e a forma do substrato.

Modelos de ligação enzima-subtrato:

 Fisher (1890) ou chave fechada- o centro ativo da
enzima tem uma estrutura rígida e pré-complementar
do substrato;
 Koshland (1959) ou encaixe induzido- o substrato induz uma
mudança no centro ativo tornando-o complementar.
Concentração do substrato e do produto ao longo do tempo:
A enzima catalisa a reação que consome o substrato, cuja
concentração vai diminuindo, e leva à formação do produto,
cuja concentração vai aumentando (de forma
proporcionalmente inversa à concentração do substrato).
Enzima livre e complexo enzima-substrato: Inicialmente,
existia uma determinada concentração de enzima no meio,
sendo nula a quantidade de [ES]. À medida que se vão
estabelecendo ligações entre a enzima e o substrato, a
concentração da enzima livre diminui, aumentando a
concentração do complexo enzima-substrato.
Posteriormente dá-se uma estabilização que resulta do facto
de a velocidade de formação do complexo enzima-substrato
se aproximar da velocidade de dissociação/separação da
enzima do produto formado.
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A enzima não se consome.
A sacarose é um dissacarídeo.
 algumas enzimas são constituídas apenas por material
proteico. No entanto existem enzimas que apenas
conseguem catalisar reações se estiverem associadas a
cofatores. Componentes da constituição destas enzimas:
 apoenzima- molécula de natureza proteica;
 cofator- substância de natureza não proteica.
Ex de cofatores enzimáticos: iões metálicos
(magnésio, cálcio, ferro, cobre); coenzimas
(compostos orgânicos de natureza não proteica).
A apoenzima e os cofatores, quando isolados, não têm poder
catalítico. A associação destes 2 componentes permite formar
uma enzima ativa- holoenzima.
Fatores que afetam a atividade enzimática
A atividade enzimática é fundamental para regular os processos
metabólicos, porém é condicionada por diversos fatores:
 Temperatura;
 PH,
 Concentração do substato;
 Concentração da enzima;
 Inibidores.
A temperatura e o pH interferem com a ação catalítica da
enzima.
Temperatura…
A influência da T na atividade enzimática resulta do facto de
este fator interferir com as ligações intramoleculares da
enzima responsável pela sua estrutura globular. -
Tanto as baixas como as elevadas temperaturas inativam as
enzimas.
 Temperaturas baixas- a inativação é reversível: não
ocorre rompimento de ligações, mas apenas
compactação da molécula, dificultando as ligações
com o substrato. Uma vez restabelecida a T mais
elevada, a enzima torna-se novamente ativa.
 Temperaturas elevadas- a inibição é irreversível (a
enzima fica permanentemente inativa): dá-se a
desnaturação (perda de atividade biológica), devido
ao rompimento de ligações que conduzem a uma
alteração da conformação da enzima e,
consequentemente, a uma modificação do centro
ativo.
Efeito da temperatura na atividade enzimática:
A atividade enzimática tende a aumentar com a
temperatura, até se atingir a temperatura ótima de atuação
(atividade enzimática é máxima).
Para temperaturas superiores à temperatura ótima, verifica-
se uma diminuição da atividade enzimática, pois as
temperaturas elevadas tendem a alterar a conformação das
moléculas das enzimas (desnaturação).
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Assim, será de prever que a percentagem de substrato digerido Concentração da enzima no meio…
vá aumentando à medida que se aumenta a temperatura do A velocidade da reação aumenta de forma proporcional ao
meio, até se atingir um valor ótimo (onde aumento da concentração da enzima, enquanto houver
100% do substrato é digerido). Para valores de temperatura substrato disponível no meio.
superiores, a atividade enzimática tende a diminuir (e, por isso,
também a percentagem de substrato) até a atividade ser nula.

Ex de resposta à pergunta: Explica a variação da atividade enzimática

das enzimas das bactérias termófilas em função da temperatura:
Embora se verifique que as enzimas das bactérias termófilas atuam
num intervalo de temperatura compreendido entre os 40 ºC e os 90ºC,
a sua atividade é reduzida para valores próximos do extremo inferior
desse intervalo; à medida que a temperatura vai aumentando,
constata-se um aumento da atividade enzimática, até se atingir um
valor máximo, aproximadamente aos 75ºC; a partir daí, à medida que a
temperatura continua a aumentar, verifica-se um progressivo Concentração do substrato no meio…
decréscimo da atividade, que se extingue quando a temperatura O aumento da concentração de substrato no meio
ultrapassa os 90 ºC. corresponde a um aumento da atividade enzimática, desde
que haja enzima disponível.
PH… Quando os centros ativos das enzimas se encontram todos
Pode alterar a distribuição das cargas elétricas da enzima, ocupados, atinge-se um ponto de saturação, a partir o qual,
podendo torna-la inativa (desnaturação) (ex enzima catalase), por mais que a concentração do substrato aumente, a
pois interfere com a conformação do centro ativo. Em casos velocidade da reação mantém-se constante- atividade
extremos pode conduzir à desnaturação da enzima, tornando-a enzimática estabiliza. Isto deve-se ao facto da taxa de
permanente inativa. formação de novas ligações ao substrato ser igual à taxa de
separação dos produtos.
 PH baixo- valores elevados de acidez;
 PH elevado- basicidade.

Inibição enzimática
Diferentes enzimas podem exigir condições de temperatura de
pH diferentes para que sejam capazes de atuar, existindo
Inibidores- moléculas capazes de inibir/diminuir a atividade
assim, um valor de temperatura ótimo e um valor de pH ótimo.
enzimática:
As enzimas têm um pH ótimo de atuação em que se atinge a
velocidade máxima das reações catalisadas por essas enzimas.
Tipos de inibição enzimática/ Mecanismos de atuação:
A partir desse valor ótimo, regista-se um rápido decréscimo da
velocidade de reação, até se tornar nula, em consequência da
alteração dos centros ativos provocada pela temperatura.
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 Inibição enzimática reversível- (ex: vias metabólicas, como
 inibição competitiva- o inibidor e o substrato competem
pelo centro ativo, pois ambos são estruturalmente
semelhantes ; o inibidor liga-se ao centro ativo,
impedindo a ligação do substrato,. Se a concentração do
substrato for superior à do inibidor, será maior a
probabilidade de o centro ativo estar ocupado com o
verdadeiro substrato. - A inibição competitiva depende
da relação entre a concentração do inibidor e a do
verdadeiro substrato.
na fotossíntese) quando se ligam temporariamente à
enzima e, após a sua dissociação, a enzima permanece
funcional; fracas ligações entre o inibidor e a enzima;
o Inibição reversível competitiva- o aumento da
concentração de substrato permite aumentar a
atividade enzimática, dado que cada vez mais centros
ativos passam a ser ocupados pelo substrato;
o Inibição reversível não competitiva- a atividade
enzimática diminui com o aumento da concentração
do inibidor. O aumento da concentração do substrato
não tem qualquer efeito.

Controlo de vias metabólicas

Cada célula possui um elevado número de enzimas que

catalisam um elevado número de reações químicas.
 Inibição não competitiva/ alostérica-não existe competição
Geralmente, estas reações ocorrem de forma sequencial,
entre inibidor e substrato, uma vez que o inibidor é
isto é, o produto de uma reação é utilizado como substrato
estruturalmente diferente do substrato; o inibidor liga-se à
da reação seguinte, até se obter o produto final- via
enzima num local diferente do centro ativo (centro alostérico)
metabólica- cadeia de reações catalisada por uma cadeia
Esta ligação provoca uma alteração da conformação do
enzimática.
centro ativo o que leva à inativação da enzima, impedindo a
ligação do substrato, não se formando, por isso, o complexo
As vias metabólicas são, geralmente reguladas por
enzima-substrato.
moléculas que se comportam com inibidores reversíveis não
A inibição não competitiva é utilizada na regulação das vias
competitivo, isto é, que se ligam à enzima numa região
metabólicas.
especifica diferente do centro ativo (Centro alostérico)
Muitos destes inibidores combinam-se de forma reversível
modificando a conformação da 1ª enzima.
com as enzimas.
O resultado dessa alteração pode ser a inibição ou a
estimulação da atividade enzimática/ ativação da enzima.

Efeitos da inibição:

 Inibição enzimática irreversível- quando se combinam

com a enzima de forma permanente, inativando-a ou
destruindo-a (ex: venenos: mercúrio);
 o aumento da concentração do inibidor leva a uma
diminuição da atividade enzimática, dado que os
centros ativos da enzima vão ficando progressivamente
bloqueados.
 pode induzir à morte do individuo.
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Razão pela qual se pode afirmar que algumas situações de
regulação alostérica são efetuadas por inibição não
competitiva: Na situação representada, verifica-se que a
regulação da via metabólica é feita através da ligação de uma
substância (produto final) a um local da enzima diferente do
centro ativo (centro alostérico), o que conduz à modificação da
sua conformação e, por isso, à sua inibição. Assim, neste caso, a
regulação baseia-se num mecanismo de inibição não
competitiva.

Frequentemente, é o produto final de uma via metabólica,

quando se acumula em excesso, que inibe a 1ª enzima, por
ligação ao centro alostérico.
Quando a concentração de produto final diminui, este liberta-
se do centro alostérico e a enzima retoma a atividade, fazendo
aumentar de novo a concentração do produto final.

Medida na qual o retrocontrolo exercido pelo produto final de

uma via metabólica contribui para a economia celular:
Verifica-se que, quando o produto final é formado em excesso,
estas moléculas atuam como inibidores da 1ª enzima da cadeia
metabólica, evitando o excesso dessa substância relativamente
às necessidades celulares.

Razão pela qual a inibição não competitiva, que está na base

do controlo de diversas vias contribui para a economia celular:
Quando a concentração do produto começa a ser baixa, é
necessário que a via metabólica se torne novamente ativa,
repondo essa substância em falta. Para que a via metabólica
volte a funcionar, é necessário que a inibição seja revertida
(inibição reversível), isto é, que a molécula que estava ligada à
1ª enzima da cadeia metabólica se liberte do centro alostérico
da enzima, permitindo o reinício da sua atividade catalítica,
começando, assim, a aumentar a concentração de produto final.