Biotecnologia

AVI

Aula 02 – Biologia Molecular e Biotecnologia - 11/08/15

- Biotecnologia é a utilização de processos biológicos para obtenção de um bem

ou serviço.
- Tecnologia do DNA Recombinante = Engenharia genética
- Transgênico – organismo com genoma exógeno
- Bactérias são usadas como fabricas para produzir proteínas, como, por
exemplo, a insulina. Antigamente a insulina era tirada do pâncreas do boi, o que
causava reações adversas, seja porque não foi bem isolada ou por reação
imunológica. Hoje é usado o gene humano introduzido na bactéria para que a
fabrique.
- Para isso ser possível é necessário os seguintes fatores, usando o exemplo
anterior da insulina:
- Organismo doador = ser humano
- Organismo receptor = bactéria
- Vetor = molécula usada para introduzir o gene no receptor. O mais usado é o
plasmídeo.
- DNA Recombinante = vetor + gene, ou seja, plasmídeo + gene da insulina
- Tipos de vetores:
~ Fagos = termo usado para bacteriófagos, vírus capazes de introduzir genes na
bactéria.
~ Plasmídeos = são pequenas moléculas de DNA circular extra-cromossômicas
encontradas em algumas bactérias, completamente independentes e capazes de
se replicar, transcrever e traduzir sozinhos. Tem sequencias gênicas que fazem
com que se repliquem usando o material celular da bactéria. Traz uma vantagem
para a bactéria, fornecendo resistência a antibióticos ao transcrever e traduzir
integrando o antibiótico.
~ Cromossomos artificiais = são plasmídeos transformados da seguinte forma:
plasmídeos são bons para trabalhar com bacterias, mas se quiser trabalhar em
leveduras, por exemplo, o plasmídeos não é muito bom, pois não tem esse tipo de
DNA em células eucariontes. Para transformar o DNA circular é necessário
cortar o plasmídeo e introduzir biossequencias telométricas, que são sequencias
que ficam nas pontas dos cromossomos, da moléculas de DNA, e sequencias de
centrômeros, e pronto, com o telomero ele perde sua forma circular e com os
centrômeros eles são capazes de se dividir. São chamados de cromossomos
artificiais de leveduras por serem usados primeiramente em leveduras. A
vantagem é eles se dividirem de forma igual entre as células e na forma linear é
possível introduzir genes maiores e em maior quantidade, quando na forma
pequena e circular só dá genes pequenos.
~ Cosmídeos = mistura entre bacteriófagos e plasmídeos. No genoma do
bacteriófago existe uma sequencia cos, fundamental para que o vírus introduza
seu DNA na bateria e produza as proteínas virais. Essa sequencia cos é
introduzida no plasmídeo para que tenha mais poder dentro da bactéria,
comandar mais, transcrever mais e obter mais resultados. Ele também pode ser
maior, conseguindo suportar segmentos maiores até que o fago. Não é muito
usado.
- Técnica de DNA Recombinante:
A – Isolamento do DNA = extrair e isolar esse DNA do DNA mitocondrial e dos
restos celulares.
B – Corte do DNA com Enzimas de Restrição = produzidas pelas bactérias para
se protegerem de vírus cortando o DNA deste quando entra nela. Mas essa
enzima não é aleatória, ela tem uma sequencia especifica de corte, e corta em
palíndromo, de trás pra frente e de frente pra trás. Não cortam reto, e sim em
diagonal, criando pontas adesivas, capazes de fazer novas ligações em outras
pontas adesivas complementar.
C – União do DNA = Bastando colocar as duas pontas juntas, uma do gene
humano e outro do plasmídeo, tendo um DNA recombinante pronto. Os dois
DNA, do doador e do vetor tem que ser cortado pela mesma enzima.
D – Amplificação do DNA = antigamente era usado a bactéria para copiar o DNA
e produzir, hoje se usa o PCR para fazer copias.
~ Transformação da bactéria =
Formas de variabilidade genéticas em bactérias = conjugação [uso de pilis sexual
para troca de material genético]; transdução [a bactéria recebe DNA do
bacteriófago] e transformação, que é rara na natureza, e consiste em absorver
moléculas de DNA livre no meio. É isso que será feito, o plasmídeo modificado
será colocado no meio para ser absorvido pela bactéria. Essa é a forma natural.
Esse processo depende da competência da bactéria, ou seja, se ela tem
receptores na membrana para DNA exógeno, ou se tem a capacidade de
incorporar esse DNA no seu genoma e não destruí-lo.
~ Formas artificiais de fazer o DNA passar pela membrana = colocando cátions
metálicos no meio, que aumenta a polaridade da membrana, a deixando mais
polar, e como o DNA é negativo, este é atraído para dentro, mas esse método
não é tão eficiente; eletroporação é a técnica de aplicar um choque, uma carga
elétrica e faz com que poros se abram, permitindo a passagem do DNA, sendo a
técnica mais usada; laboratórios grande e de alta tecnologia usa a biobalistica,
que é o uso de um acelerador de partículas portátil em forma de uma pistola
carregado com micropartículas de ouro ou tungstênio (mais caro) revestidas com
DNA isolado, que serão lançadas contra uma bactéria, e a microparticulas, por
ser extremamente pequena, atravessam a membrana sem destruir causar danos
e libera o DNA.
- Para selecionar as bactérias que funcionaram usa-se antibióticos, pois os
plamídeos são usados na resistência.
- Bibliotecas Genômicas
- Transgênese de Bactéria – usa bactéria como fabrica de insulina, hormônios do
crescimento.

Continuação Aula 02 – 18.08.15

- Transgênese de bactérias = inserção de genes eucariotos em plasmídeos para

que a bactéria sintetizam um produto que será usado em genes
- Transgênese de eucariontes = células eucariontes não possuem plasmídeos e
são mais complexas, tem genomas maiores, sendo necessário outras técnicas de
inserção. Os plasmídeos com o gene eucarionte são inseridos nas células por:
~ Injeção – usa micromanipuladores para injetar numa célula previamente
coletada do organismo na placa de petri, para depois devolver a célula ao
organismo. Pode ser injetado direto no músculo também.
~ Infecção viral – o vírus introduz seu material genético na célula quando a
infecciona, por isso eles são manipulados, tendo seu material genético retirado e
o plasmídeos colocado no lugar. Há risco envolvidos, pois o vírus pode voltar a
ser ativo, principalmente porque o vírus mais usado é o HIV, por ser mais
resistente as células imunológicas.
~ Biobalistica – já explicado na aula anterior.
- O plasmídeo, por não existir naturalmente no genoma humano, é incorporado ao
genoma humano, se inserindo em algum cromossomo, podendo se inserir bem no
meio de um gene importante que não será mais expressado.
- Trigo, milho, algodão, transgênicos
- Transgênese em vegetais – as plantas normalmente recebem genes que lhes dê
uma característica nova que as torne mais produtivas. Por exemplo, uma planta
mais resistência a pragas naturais, que produz inseticidas que teoricamente não
causam danos a seres humanos; sojas resistentes a inseticidas. Nos vegetais
existe uma bactéria chamada Agrobacterium tumefaciens, existente no solo,
que infecta a planta, tendo em sua fisiopatologia a introdução do plasmídeo Ti,
que causa um “câncer” na planta, fazendo as células se desenvolverem de forma
exagerada. Deferente das células animais, se pegarmos as células tumorais e a
desenvolvermos, outra planta ira surgir, com células diferenciadas,
completamente nova. Para realizar a transgênese, pega-se essa bactéria e insere
em seu plasmídeo Ti o gene pretendido e depois infecta a planta. Depois é só
pegar as células cancerosas e as desenvolver em uma nova planta com a
característica pretendida. O plasmídeos se incorpora ao genoma eucarionte.
- É possível fazer animais transgênicos, mas ainda não é feito.
- Existem cromossomos artificiais humanos.
- Engenharia genética de leveduras = importante interesse econômico.
Saccharomyces cerevisiae, produtora de cerveja, vinho. Por causa dessa
levedura foi feito o cromossomo artificial de levedura. Esse cromossomo é
chamado de YAC. Ele vetora pedaços de DNA muito maiores.
- Técnica de Hibridização de ácidos nucleicos = usadas para diagnósticos de
doenças genéticas, infecções. São técnicas em que vamos usar RNA para
detectar DNA em uma amostra. Tenta detectar DNA exógeno no DNA humano.
Usa-se uma sonda de DNA, para buscar informações, detectar um gene
complementar especifico. Essa sonda é pedaços de DNA complementar ao gene
que se quer encontrar. Etapas:
~ Desnatura o DNA – aumenta a temperatura.
~ Ligar a sonda - é necessário abaixar a temperatura para que a sonda forme
ponte de hidrogênio, mas é necessário evitar que o DNA volte a forma de dupla
hélice, para isso se imobiliza o DNA numa membrana de nitrocelulose ou nylon.
Depois se mergulha essa membrana num meio liquido que contenha a sonda.
Então se lava a membrana para tirar as sondas que não se ligaram. Agora é
preciso descobrir se as sondas grudaram, se sim o resultado é positivo, se não o
resultado é negativo para a presença daquele gene. Antigamente as sondas eram
radioativas, pois tinham ligadas nela um isótopo radioativo, assim usava-se uma
maquina de raio x para identificar a presença da sonda, deixando essa em
contato com o filme por dias, e as sondas queimavam o filme, que era revelado.
Hoje ainda são usadas essa técnica, mas o mais usado é a técnica de ligar a
sonda um fluorotopo, uma substancia que emite brilho, pega a membrana e
coloca num trasuminador verde, tipo luz ultravioleta de boate, que farão que as
sondas brilhem e uma foto é tirada.
~ As sondas e o DNA estão desorganizados, então é necessário organizá-los, e
para isso usa-se a eletroforese. Pega-se um gel de agarose feito na hora, coloca-
se numa forma, e espeta um pente, e depois de duro usa-se esses buracos para
colocar uma amostra em cada (DNA, RNA, PTN), levando para a cuba de
eletroforese e ligando os eletrodos e as correntes. Ligando a carga negativa
perto de onde os DNAs estão e o positivo no lado oposto, fazendo com que o
DNA corra em direção ao positivo, criando bandas de diversos tamanhos e
distancias. Depois disso tem que transferir o resultado do gel para a membrana,
colocando o gel entre a membrana e uma esponja numa solução, para que
transfiram as bandas na mesma posição do gel. Depois coloca essa membrana em
contato com as sondas, lava e para saber se grudou coloca em contato com o
filme de raio x, onde as sondas vão brilhar. O filme dura e a membrana não.
Depois se analisa as bandas, por tamanho, posição, etc. Sauternraidiograma.
~ Em que situação seria interessante usar a técnica de detecção de RNA? Para
detectar vírus ou avaliar a expressão de um gene pelo RNAm.
~ Western blot – detecta proteína, mais usado na imunologia, usa um anticorpo
anti-anticorpo como sonda.
- Marcadores moleculares – usa-se para identificar pessoas e graus de
parentesco (recebes-se parte dos marcadores da mãe e parte do pai).
Polimorfismo (varias formas).
- RFLP – técnica mais antiga. Usa enzimas de restrição para realizar milhares de
cortes no DNA de variados tamanhos, cada pessoa terá cortes em pontos
diferentes, gerando fragmentos de tamanhos diferentes. Depois se pega o DNA
picotado e coloca no gel e faz a eletroforese, transfere o resultado para a
membrana e da membrana para o filme de raio x. Amostras de comparação tem
que ser cortadas pela mesma enzima. Depois o resultado deve ser analisado pelo
tamanho, posição, comparação com outras amostras.

Continuação Aula 02 – 25.08.15

- DNA Fingerprinting = impressão digital de DNA. Técnica mais atual para
identificação. Trabalha com os números de pequenas repetições,
microssatélites, que herdamos do pai e da mãe. Essas repetições são cortadas
num sitio próximo por enzimas de restrição. A enzima corta o começo e o final
do fragmento com repetições. Depois faz a eletroforese para separar os
fragmentos. O padrão de vezes que ocorre essa repetição, o padrão
eletroforetico, são únicos para cada pessoa e é possível identificar parentesco.
Como são muitos, um programa analisa o resultado da eletroforese, que é muito
grande e cheio de bandas.
- PCR = altamente sensível (uma pequena porção do DNA já é suficiente para
identificação, o responsável por isso é o primer, que reconhece as pequenas
moléculas) e especifica (identifica exatamente o DNA que é para ser
identificado, o primer também é responsável por isso, pois ele é complementar a
molécula que quer encontrar).
- Determinação de variabilidade genética - Estudos filogenéticos – aplicação –
qualquer coisa que precise isolar e copiar o gene.
- Preparo: DNA polimerase (extraída de uma bactéria chamada Thermus
aquaticus, por isso chamada de Taq polimerase, essa bactéria é resistente a
calor e por isso suas enzimas também são, podendo suportar ate quase 100º sem
desnaturar); primer (é uma molécula de RNA complementar ao gene procurado,
que marcara o inicio da ação da taq polimerase, cada primer reconhece um gene,
e cada gene tem um par de primers, froud e revers, começo e fim do gene, um
em cada fita); nucleotídeos (matéria prima da taq); tampão (evitar mudança de
pH); DNA ou RNA pesquisado; Mg (cofator da enzima, pois sem ele, ela não
funciona).
- Termociclador – programado para realizar as mudanças de temperaturas a
cada ciclo.
- Fases: Desnaturação (quebra as pontes de hidrogênio aumentando a
temperatura até uma media de 94º, fazendo a separação das fitas); Anelamento
(a temperatura abaixa para uma media de 50º, fazendo com os primers possam
se ligar as fitas separadas); Extensao (a taq polimerase dá continuidade ao
primer, na temperatura de 72º).
- O numero de ciclo faria.
- Chamada de amplificação, é feita de forma exponencial, pois as copias são
múltiplos do numero inicial. Começa com uma molécula e acaba com 68 bilhões em
35 ciclos. Todos do mesmo tamanho. Fora os pedaços maiores descartados, pois
possuem mais do que apenas o gene procurado. Nos primeiros ciclos são feitas
copias não isoladas cada vez menores até isolar o gene. As moléculas grande
continuam sendo produzidas, tanto em novas moléculas grande com em genes. No
final dos 35 ciclos teriam 80 moléculas grandes. Para separar essas moléculas
coloca-se o resultado do PCR para correr na eletroforese. As moléculas grandes
aparecerão encima mais claras que quase não aparecem e as menores aparecerão
embaixo mais fortes por estarem agrupadas.
- Anfribons – Amplicons – bandas, fragmentos.
- Visualização dos fragmentos – é colocado na eletroforese o brometo de etídio
intercalado com a molécula do produto da PCR para causar florescência na luz
ultravioleta do trasuminador.
- Marcador de peso molecular – responsável por contar o tamanho dos
fragmentos, pois é uma solução contendo um bandas de tamanhos em escalas, de
100, de 1000, etc. É parecido com uma régua, pois a banda reta a do marcador é
do mesmo tamanho.
- Existem variações, atualizações, aprimorações, da PCR, para evitar erros, como
o de o primer se ligar no lugar errado. Cada primer tem uma temperatura de
anelamento, e quando o DNA no temociclador começa a aumentar, passa da
temperatura ambiente para 95, mas quando passa pela temperatura do primer
ele se liga, podendo se ligar no lugar errado porque ainda não esta
completamente desnaturado o DNA, e quando chegar a certa temperatura a taq
começa a trabalhar antes, assim quando ela começar a produzir de verdade já
haverá moléculas prontas. Causando falsos positivos.
- A PCR Hot Start foi criado para evitar isso, pois coloca-se todos os reagente
menos a enzima, que é separado por uma película de cera, derretida em altas
temperaturas. Outra forma mais atual é usar anticorpos para bloquear a enzima,
que irão desnaturar em altas temperaturas, mas é mais caro. O primer ira
desgrudar dos fragmentos em altas temperaturas e depois grudará novamente.

Continuação Aula 02 – 01.09.15

- PCR Touchdown – O anelamento inespecífico ocorre quando a temperatura esta
abaixo da ideal mais bem próximo. A temperatura começa alta e vai abaixando
aos poucos ate chegar ao ideal. Hoje há uma maquina que faz as reduções
automaticamente. Os ciclos também tem que ser testados para saber o ideal.
- PCR Multiplex – PCR normal, sem nada novo, apenas usa vários pares de primers
na mesma reação, mas não do mesmo tamanho, senão é inútil. Usado para
diagnostico de doenças infecciosas, varias doenças ao mesmo tempo.
Identificação de transgênicos, testa uma mesma planta para vários genes
diferentes. Investigação de paternidade. Cada banda é um par de primer
diferente. No mesmo slot.
- Nestead PCR – usa dois pares de primers. Numa primeira reação usa um par de
primer, depois usa o produto para fazer outra PCR com outro par de primer.
Usado para identificar gene dentro de gene. Ex: Procurar o agente infeccioso
Mycrobacterium tuberculosis e qual o tipo de M. tuberculosis é, para isso faz
uma PCR para amplificar e identificar o M. tuberculosis, depois pega esse
resultado e faz outra PCR para amplificar uma parte do gene para identificar o
tipo. A especificidade aumenta mais que a sensibilidade (se a primeira deu
certo, a segunda também tem que dar; se a segunda deu certo a primeira
também tem que dar). O fragmento da segunda não pode ser maior que o da
primeira.
- RT-PCR – usada quando se trabalha com RNA. Trancriptase reversa é uma
enzima tirada do retrovírus, capaz de pegar uma molécula de RNA e através
dela produzir uma molécula de DNA complementar. Ex: Saber se uma
determinada célula expressa determinado gene, para isso é preciso procurar
RNAm desse gene. Para isso pega essa molécula de RNA e faz uma PCR com ela,
mas ao invés de usar a taq polimerase, usa-se a transcriptase reversa. Depois
pega-se o produto dessa PCR e faz uma nova PCR usando a taq. Aplicação: avaliar
a expressão gênica, identificar vírus que tenha RNA (ex: HIV). Primer?
- Real Time PCR – abole a parte perigosa da PCR, que é o uso do brometo de
etídio, pois não precisa fazer eletroforese, usa-se nucleotídeos marcados com
fluoroforos, e uma maquina aclopada ao computador usa um laser que a medida
que os fragmento são gerados ele faz uma leitura que quantifica as moléculas
produzidas em tempo real pela marcação. Saber o quando foi amplificado.
Aplicação: acompanhar um tratamento, verificando se o numero de agentes
infecciosos esta diminuindo ou aumentando pela quantidade de DNA desse
agente esta presente. Os nucleotídeos possuem marcadores da mesma cor, pois
o objetivo é analisar a quantidade de moléculas geradas. O resultado é em
gráficos.
- RAPD PCR – não é muito utilizada; é semelhante ao RFLP. Pega um primer de um
gene humano qualquer e coloca em contado com o DNA de varias pessoas, e o
primer não vai encontrar no mesmo lugar em cada pessoa, encontrará o gene em
vários lugares, sendo o padrão único para cada individuo, gerando em cada
pessoa fragmentos diferentes, a quantidade de fragmentos e o padrão
eletroforético é único para cada pessoa. Usado para identificar parentesco,
individuo, espécie, gênero, etc. Essa técnica esta ultrapassada, hoje é usado
mais para estudos populacionais.
- Sequenciamento do DNA – técnica mais usada na área. Útil para detectar
mutações, principalmente na filogenética. Técnica de Sanger é a mais usada.
Primeiro faz a PCR para isolar o gene, pois será usado o produto da PCR. Um
laser identificar a sequencia das moléculas coloridas, sendo cada cor um base
diferente. Vão aparecer fragmento de 1, 2, 3, 4, 5, etc pares de bases. O G na
verdade é amarelo, mas é identificado pelo programa como preto. As cores são
padronizadas. O resultado vem em gráfico e como sequencia, mas é bom analisar
o gráfico, cromatograma, para ver se há erros na leitura.
- Quais os melhores genes para estudar filogenia, mitocondriais ou nucleares –
Monografia. – Comparação de dados morfológicos com dados moleculares,
filogenia.

Aula 03 – Manipulação Genética: Terapia Gênica, Células-tronco e Clonagem

– 08.09.15
- Terapia gênica – ex: aumentar a imunidade, destruir células. As células
germinativa seria uma vantagem para evitar passar um defeito genético para a
próxima geração, mas o mais feito são em células somáticas.
- Obstáculos: é preciso saber qual o gene que causa o que quero corrigir e isola-
lo, o gene normal. Escolher o melhor vetor para entrar na célula e no tecido
pretendido, o mais o usado é o vírus, mas muitas vezes o vírus voltou a ficar
ativo, infectando o individuo. Duração da expressão, pois muitas vezes a terapia
dura pouco tempo, pois o gene é expressado por pouco tempo, voltando o
problema. Segurança do vetor, pois muitas vezes o vetor pode causar mais
problemas, como o retrovírus HIV, um vírus interessante a ser usado em
doenças autoimunes, que de uma hora para outra pode voltar a causar a doença.
A resposta imune pode ser um problema, pois pode acontecer de forma violenta
ao vetor.
- Técnica - Vetores
~ Retrovírus – RNA, só insere nas células que são objetivo. Ex. aplicação: –
Imunodeficiência severa combinada (não produz leucócitos, principalmente
linfócitos T, afeta mais crianças chamadas crianças da bolha, pois são obrigadas
a viver isolada; é uma doença genética que afeta o gene ADA). Tratada com
terapia gênica, usando retrovírus.
~ As células da medula óssea do paciente são isoladas. Usa plasmideos para
introduzir o gene no vírus. Depois infecta as células com o vírus em ex vivo,
depois devolve a célula ao organismo.
~ Adenovírus – não inserem em cromossomos, então não tem risco de causar
mutações, mas inserem em todas as células, sendo mais difícil acertar o alvo.
Também tem mais chance de ter resposta imune severa, pois células a mais
receberam esse gene. Dobra o genoma da célula.
~ Outras formas de vetor não são tão eficases.
~ Lipossomos – é como se fosse uma capsula de lipídeo, com fosfolipídios, criada
em laboratório, com composição similar a da membrana plasmática, forma uma
bola oca no centro onde é colocada o gene. Usado bastante em vacina de DNA.
Não funciona bem em terapia gênica.
~ Cromossomo artificial humano – HAC – já falado.
- Técnica – Sem vetor
~ Microinjeção – usa uma micropipeta para aplicar o DNA direto dentro da
célula. Ex vivo.
~ Biobalistica – micropartículas revestida com DNA. In vivo e ex vivo. Mais para
vacina de DNA.
~ Eletroporação – aplica choque eletromagnético para abrir poros. In vivo e ex
vivo (aplica uma injeção com o vetor e dá o choque). Mais para vacina de DNA.
~ Terapia gênica usa mais ex vivo.
- As maiorias das doenças genéticas são poligênicas. Só doenças monogênicas,
que afetam apenas um gene, são mais fáceis de serem tratadas por terapia
gênica, e só se afetarem principalmente um tecido, pois não daria para aplicar a
terapia em vários tecidos ao mesmo tempo. Ex: Hemofilia e fibrose cística.
- Não só doenças genéticas podem ser tratadas: doenças infecciosas – insere
nas células um gene que estimule a produção ou maior produção de algo que
ajude a combater o microorganismo, como anticorpos, citocinas, RNA de
interferência (molécula de RNA complementar que vai se ligar ao RNA do vírus,
impedindo a produção de proteína, interfere no funcionamento do microorganimo
invasor). Isquemia – usa um gene que estimule a produção de uma proteína que
estimula a formação de novos vasos que vão melhorar a circulação; angiogenese
(novas veias) e arteriogenese (artérias). Câncer – gene suicidas estimula a
apoptose das células cancerígenas; antiangiogenese, usando um gene que produza
uma proteína que agira como uma droga que inibe formação de novas veias para
que as celulas. Estimulação da resposta imune.
- Hemifilia – fígado
- Fibrose cística – afeta o pulmão, aspiração do vírus
- Imunodeficiência severa combinada – a criança não tem nenhuma imunidade.
Primeira doença a ser tratada com terapia gênica. Existe dois casos de crianças
que desenvolverem câncer na medula óssea.
- Terapia com células-tronco – doença crônico-degenerativa (células vão
morrendo. Ex: diabetes, Alzheimer, Parkinson); reconstrução de tecidos em
acidentes traumáticos, infartos, doenças neurais, cardiovasculares,
musculoesqueléticas, câncer, hematopoiéticas, diabetes, etc.
- Alguns autores diferenciam pluripotente de multipotente.
- As células do blastômeros podem gerar cada uma, um embrião. A partir da
mórula as células se diferenciam, parte vai virar a placenta e outra o embrião.
- Células-tronco embrionário – tira do blastocisto, pluripotente, só é preciso
direcionar. O ambiente estimular a diferenciação. Não geram novo embrião, pois
não terá placenta. Bioengenharia – produzir novo órgão. Já criaram olhos e
coração de sapo. Já é possível criar pele. Maiores problemas: bioética, pois ao
retirar as células mata o embrião. Lei: 2005, lei de biossegurança, permite o uso
de células-tronco desde que o embrião não seja criado só para isso, os embriões
tinham que ser doados, não podiam estar na fase de blastocisto e tinham que
estar congelados há mais de 3 anos.
- Celulas-tronco adultas – não serve para bioengenharia. Dente de leite tem
células tronco. Sem rejeição, pois usa o próprio paciente. Porem não cura, apenas
corrige as lesões. O ideal seria combinar terapia gênica e células tronco.
Cardiologia: lesões no coração e vasos sanguíneos; neurologia: lesão medular,
esclerose múltipla, Alzheimer, Parkinson; endocrinologia: diabetes; oncologia:
leucemia.
- Células-tronco de cordão umbilical – as chances de compatibilidade é muito
maior. Mais barato. Não se sabe se as células estão viáveis em vinte anos ou
mais, pois não há casos anteriores. Bancos públicos é muita burocracia.
- Clonagem terapêutica – cria um clone para tirar células. Menos risco de
rejeição. Limitações: doação de ovócitos, nem todas as mulheres doariam
ovócitos. Pega um ovócito, tira o núcleo e coloca o núcleo de uma célula somática,
mas as mitocôndrias contem o DNA da dona do ovócito, o que a varia mãe celular
do clone. Células somáticas acumulam mutações ao longo da vida, podendo
resultar em um clone não saudável. Células somáticas adultas já tem sinais de
envelhecimento, de encurtamento dos telômeros, o que pode causar
envelhecimento precoce no clone.
- Clonagem é proibida no mundo todo. A lei generaliza, não permitindo nem
clonagem terapuetica, que clona apenas até a fase de blastocisto.
- Clonagem – a Dolly foi a primeira mamífera a ser clonagem. PCR é clonagem
molecular, células-tronco são clones da mesma célula – clonagem molecular.
- Embriologia inicial – quando o zigoto é formado, os cromossomos da mãe e do
pai possuem alguns genes que ficam inativados durante a vida, até que ocorra a
reprogramação genética, na qual todos os genes serão reativados, porque quando
o espermatozoide fecunda o ovócito é uma célula diferenciada, ou seja, os genes
que não eram importantes para a função do espermatozoide estão desativados, o
mesmo ocorre com o ovócito. O zigoto é formado com genes ativos e inativos,
mas é necessário que todos os genes estejam ativas para a formação, inclusive
genes que num adulto não eram mais necessários. Nas primeiras divisões ainda
não há reprogramação. Na medida que as células vão diferenciando a
reprogramação acontece. Todos os blastômeros já são células reprogramadas.
Proteínas do citoplasma do ovócito são responsáveis por fazer essa
reprogramação durante a primeira semana.
- Clonagem reprodutiva – gerar um novo organismo
- Clonagem terapêutica – gerar células-tronco embrionárias
- Clonagem reprodutiva:
- Riscos e perdas:
~ Genes de imprinting – geralmente os genes que recebemos do pai e da mãe
estão ativos, mas existem alguns genes que nunca os dois genes se expressam,
um é inativo, de forma aleatória nas células. Se na clonagem for usado o gene
inativo, isso trará problema, pois não haverá a proteína e a função desse gene.
~ Acumulo de mutações que podem ou não afetar o embrião. Nem todas as
mutações causam efeitos num adulto. Tentativa e erra, por isso menos 1% dos
clones dá certo.
- Clonagem terapêutica:
- Limitações: mesma da reprodutiva.
- Herança citoplasmática – genes mitocondriais tem importância no fenótipo. Um
individuo clonado pode ter característica da doadora do ovócito.

Continuação Aula 03 e Aula 04 – Manipulação Genética: Farmacogenética,

Vacinas de DNA – 15.09.15
- Continuação clonagem, Aula 03 – Etapas importantes
- As células dos blastômeros são completamente indiferenciadas, com todos os
genes ativos. Quando passa para blastocisto já não são completamente
indiferenciadas, pois já sofreram uma pequena diferenciação. E algumas
características fundamentais também dependem das mitocôndrias.
- Etapa 01 – o citoplasma do ovócito é fundamental. O ovocito tem que esta no
ponto de fecundação para as organelas funcionarem corretamente.
- Etapa 02 – retirada do núcleo do ovocito com micropipeta, por aspirçao.
- Etapa 03 – selecionar o tecido adulto. Antigamente era usado blastômeros,
mas eles já viam indiferenciados, não era um desafio. Hoje é usada células
adultas. Dolly – glândula mamaria.
- Etapa 04 – formar o zigoto, colocando o núcleo da célula somática no ovocito
através do espaço perivitelínico, que é o espaço entre a zona pelúcida e a
membrana do ovocito, isso pode ser feito por eletroporação. Ou pode-se usar um
micropipeta.
- Etapa 05 – ativação – fazer o zigoto se dividir de forma artificial, pois não
houve interação entre os núcleo do ovócito e espermatozoide que desencadeia a
elevação da concentração de cálcio no citoplasma que estava armazenado no
REA, que estimula a divisão celular. Para fazer de forma artificial, ou se injeta o
cálcio na citoplasma da célula ou se aplica uma carga elétrica para fazer o cálcio
sair do REA. Ou então usar cálcio ionofor, em meio de cultura, que abre canais,
feito por microinjeção.
- É possível fazer um ovocito de mamífero se dividir por partenogênese (sem
fecundação).
- A ativação artificial é semelhante a fazer uma partenogênese numa célula de
mamífero.
- Etapa 06 - A reprogramação acontece nos blastômeros. Cada espécies
acontece em números de divisão diferentes.
- Hipoplasia – falha no desenvolvimento
- Nem sempre o clono é igual ao original.
- Os genes não se expressam sempre da mesmo forma.
- Gêmeos são clones naturais.
- O tatu galinha sempre tem quatro filhotinhos gêmeos. Uma espécie tem oito. É
uma estratégia para aumentar o numero de crias. A variabilidade não é afetada,
pois eles viajam muito, se espalhando.
- Aula 04 – Manipulações genéticas: farmacogenética e vacina de DNA.
- Farmacogenética
- Ex: Barfarina – anticoagulante – para quem tem problemas de trombos. Alguns
pacientes reagem bem, outros não reagem e outros reagem mal. As vezes uma
quantidade da droga é funcional para uma pessoa, mas é toxica para outra. Isso
acontece porque cada pessoa tem uma genética própria.
- Existem grupos específicos de genes estudados por essa área.
- No Brasil essa área ainda não existe.
- Farmacocinética - caminho e forma que a droga passa pelo nosso corpo. Como
ela vai ser absorvida, como ela vai ser distribuída, sozinha ou não, como é o
metabolismo da droga, se ela estará inteira ou não, como ela será eliminada.
- Farmacodinâmica – a forma como a droga entra na célula, se, se liga a um
receptor, se é retarda por enzima, se é ativada dentro da célula, qual a via
metabólica dentro da célula. Voltada para a célula. Para a interação celular.
- Por que existem pessoas que reagem diferentes as drogas? Por causa da
metabolização. A presença de receptores para aquela droga, mas não é possível
corrigir isso. O metabolismo é.
- Fase 01: ligar um grupo polar para deixar a droga mais polar e assim passar
pela via metabólica. Hidroxilação, no fígado, ligar uma hidroxila na molécula para
deixa-la mais solúvel em água para ser eliminada na urina. Enzimas hepáticas
fazem isso, citocromo P450.
- Fase 02: desativa a droga e facilita a excreção.
- Influencia da Fase 1: se uma droga é hidroxilada rapidamente, mais rápido ela
será eliminada e menos efeito terá, ou quanto mais lento ocorrer a hidroxilação,
mais lento será a eliminação e mais tempo e maior será o efeito. É onde é mais
mexido na farmacogenetica. Fase 1 é a mais importante. Mais importante é a
CYP2D6, e existem 26 alelos diferentes, 26 genes que podem decodificar essa
enzima, e cada um tem uma resposta diferente. É preciso fazer o perfil genético
do paciente para metabolização de drogas. O polimorfismo afeta a atividade
enzimática, por causa que mudou algum códon, cada um tem dois alelos. Esses
alelos diferentes, por mais que produzam a mesma enzima, o trabalho enzimático
não será o mesmo. Então pode-se dividir em três grupos esses alelos diferentes.
Que tem atividade reduzida, ausente e aumentada. Isso vai resultar em três
fenótipos: metabolizadores normais, lentos e rápidos. M. lentos faz acumulo do
medicamento no organismo, pois antes que seja metabolizada já terá ingerido a
próxima dose e a outra depois, causando a toxicidade. Para resolver o problema
tem que diminuir a dose ou aumentar o tempo entre as doses. Ai é onde entra a
medicina personalizada. M. rápido não sofrem efeito do tratamento, pois quando
a porxima dose for tomada, a anterior já terá sido metabolizada a muito tempo,
e a bactéria fará enfeito de novo ou adquirirá resistência. Para isso é necessário
aumentar a dose ou diminuir o tempo entre as doses.
- Tomar uma droga inativa e ela precisa ser metabolizada para se tornar ativa.
- Codeína é uma droga com efeito fraco, que quando entra no organismo é
transformada em morfina, muito mais potente. Uma pessoa m. rápido, vai ter
toxicidade, tem que dar uma dose menor. O m. lentos tem que dar uma dose
maior. Existem varias drogas que precisam ativar pela hidroxilação. Corticoides
– pretimizona vira pretizolona (quem tem problema hepático tem que tomar já
ativada).
- Quem for usar as drogas do slade 11 é bom fazer um perfil genético.
- N-acetiltransferase – glicuronidase da isoniazida, faz parte do tratamento de
tuberculose.
- Colinesterase – degrada aceticolina, usada na contração, a degradação relaxar
o músculo. Existem drogas que inibem o efeito da acetilcolina, como a
succinilcolina, usada em cirurgia para causar relaxamento muscular. Algumas
pessoas acordam paralisada por ter polimorfismo nessa enzima e metabolizar a
droga mais lentamente.
- Diferença da farmacodinâmica – pessoa com deficiência na G6PD reage com
sulfonamidas, primaquina, etc, que causa a anemia hemilitica, que pode matar –
halotanto é um anestésico inalatorio, que em algumas pessoas tem rigidez
muscular, aumento da temperatura e rabdomiolise – necrose muscular.
- Vacinas de DNA
Historia: primeira vacina foi ao acaso. A mesma doença que afetava vacas
afetava humanos, mas não as pessoas que trabalhavam com as vacas. Existem
uma proteína na vaca que causa imunidade.
- Primeira geração - vivos podem se reativar e mortos não causam um efeito tão
bom, sendo necessários substancias que potencializam o efeito, mas podem
causar alergia. Ainda hoje são usadas.
- Segunda geração – começa a usar tecnologia do DNA recombinante. Em vez de
usar o agente, usa-se a proteína dele. Usa uma bactéria para produzir a proteína
e depois faz a vacina. Diminui o risco de pegar a doença. Mas é necessária mais
doses.
- Terceira geração – coloca-se o gene que produz a proteína viral nas células
humanas, que irão produzir a proteína e ter uma reação imunológica, que é o que
o vírus faz, fazendo com que essa mais se assemelhe a uma infecção real.
Injeta-se plasmideos com o gene e infecta-se as células humanas.
- Vias de administração:
~ 1 - Injeta-se o plamideo diluído em salina no músculo e faz eletroporação
(intradermica), mas isso pode causar autoimunização, pois os sistema
imunológico entende que a célula é estranha e reage contra as próprias células.
~ 2 – Usa-se biobalistica para injetar na derme
- Vantagens: Logistica – não precisam de refrigeração, facilitando o trasnporte,
deixando mais barato. Econômica: mais barata a fabricação. Eficiente: simula
melhor a infecção viral.
- Riscos: Autoimunidade: as células que absorve o plasmideo ser vista como
estanhas, causando reação imunológica. Tolerância: a pessoa não responder a
vacina, o que ocorre em qualquer vacina. Integração: os plasmideos podem se
inserir no genoma e causar mutações, o que pode levar ao câncer. Por isso não é
feita usada ainda em humanos, mas já é usada na medicina veterinária, em
bovinos.

Continuação Aula 04 – Genética do Câncer – 22.09.15

- Câncer começa com divisão celular descontrolada. Ou porque a célula esta se
dividindo muito ou porque não esta fazendo a apoptose quando deveria. Quando
temos câncer é porque sofremos uma mutação no gene que controla, regula, a
divisão celular ou no gene que regula a apoptose.
- A proliferação das células causa um tumor que evolui para câncer.
- Infecções podem causar câncer. Geralmente virais, como o Papiloma virus.
- São duas categorias de genes que estão envolvidos no mescanismo do câncer.
- Oncagenese – oncogenese é o termo do gene mutado. Proto-ocogenege
- Neoplasia quer dizer nava formação – câncer, tumor.
- Só um dos alelos sofrer a mutação é suficiente para causar câncer. O outro
continua funcionando normalmente. Mas basta uma para a proteína que causara o
descontrole. Para mudar o fenótipo da célula.
- Maligna é quando tem invasão de outros tecidos, mestatase. Benigno é possível
tirar, não foi para outros tecidos.
- O oncogene leva a produção de substancias erradas, fatores de crescimentos,
fatores de transcrição, proteínas de apoptose, receptores de proteínas.
- Genes supressores tumorais – controla o crescimento. Checkpoints – proteínas
detectam mutações e induzem apoptose. Ambos os alelos tem que sofrer
mutação e parar de funcionar. É mais difícil ocorrer tumor por causa desse
gene. Pois se um para de funcionar tem o outro para assumir a função. A
hereditariedade nesses genes sozinha não causa câncer, a não ser que ambos os
pais sejam portadores do alelo defeituoso e transmitam para o filho. Mas mesmo
se apenas um dos pais transmitir, sempre há a possibilidade de ocorrer
mutações no outro alelo por fatores externos.
- Divididos em dois grupos: controladores – TP53, câncer de pâncreas; RB1 –
retinoblastoma; manutenção – repara o DNA; BRCA1, câncer de mama; BRCA2,
câncer de ovário.
- Teste genéticos identificam mutações.
- Oncogene produz muita proteína e supressor para de produzir.
- Esporádico – uma célula sofre mutação e se multiplica.
- Hereditário – todas as células.

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