Prática 5

Métodos para quantificação de

microorganismos
Cinética de fermentações
S P + X Próxima aula

Batelada

S P
concentração

tempo
 Cálculo das velocidades específicas
• Em bioprocessos estas velocidades são função da quantidade de
células responsáveis pelo processo biológico.
• Para calcular as velocidades específicas, necessitamos quantificar o X
(concentração celular).

1  dX    1 *  dS 1 dP
x  *   s
x dt
p  *
x  dt c x dt
Velocidade específica de Velocidade específica de Velocidade específica de
crescimento celular consumo de substrato formação de produto

Unidades: h-1 ou d-1 mgS/ mg célula. d ou h mgP/ mg célula. h ou h

MÉTODOS PARA A QUANTIFICAÇÃO DE
MICRORGANISMOS
1) Peso seco total das células (g/L)
filtração, secagem e pesagem (gravimetria)

2) Variação no número de células (n°cel/mL)

a) contagem de células totais (direta) – câmara de Neubauer
b) contagem de células viáveis (indireta)- Placa de Petri

3) Turbidimetria
a) método indireto que pode ser comparado com outro pela sua facilidade de
aplicação (600 ou 660 nm)

4) Determinação de algum componente celular (mg/L)

N, DNA, ATP
 Prática 5: Métodos de quantificação de células

• Cada grupo vai receber :

• Tubo Falcon contendo meio de cultura YPD estéril (10 mL)
para zerar o espectrofotômetro
• Erlenmeyer contendo pré-inóculo 250 mL da cultura de S.
cerevisae para fazer as correlações entre os métodos de
quantificação celular:
• Realizar diferentes diluições da cultura de levedura
• Em cada uma das diluições determinar:
 Densidade ótica a 600 nm,
 massa celular seca
 número de células pela contagem em
microscópio.
Prática 5: Métodos de quantificação de células

Os papéis de filtro Whatman n° 1 já estarão adequados ao

tamanho do funil de Büchner e previamente secos a 105°C.
Identificar (lápis) e pesar cada um dos papéis secos no
dessecador. Anotar a massa dos papéis secos.
• Diluir o meio líquido sem levedura nas respectivas diluições
da cultura de levedura, para zerar o espectro.
• Usar o pré-inóculo de 250 mL fornecido para preparar 5
diluições entre 2 e 50 vezes, conforme tabela 1, com 250 mL
cada uma, em balão volumétrico. AGITAÇÃO!
• Realizar a leitura de cada diluição da cultura em 600 nm.
Utilizar o meio YPG sem inóculo, na respectiva diluição, para
zerar o espectro.
 Prática 5
Tabela 1: Preparo das diluições da suspensão de S. cerevisae
Balão Volume da
Branco. *Volume
cultura (pré-
de meio YPG 2% Fator de
inóculo) em mL Densidade
(mL) diluição
retirada do ótica 600
Do balão do pré-
balão nm
volumétrico de 10 inóculo
volumétrico de
mL
250mL
1 2
2 5
3 10
4 20
5 50

*Usar o meio de cultura YPG2 % sem inóculo para preparar o

branco de cada diluição em balão de 10 mL.
Prática 5: Métodos de quantificação de células
• Filtrar um volume de 200 mL de cada uma das diluições do pré-
inóculo em papel de filtro Whatman n° 1, previamente seco e
pesado (Atenção, pois antes de retirar cada uma das alíquotas
de 200 mL, a amostra deve ser agitada para garantir a
distribuição “homogênea” das células no meio de cultura).
• Os demais 50 mL do balão serão utilizados para medir a DO a 600
nm e realizar a contagem das células em câmara de Neubauer.
• Terminada a filtração, secar os papéis por 15 min em forno micro-
ondas a uma potência de 350W. Após a secagem, os papéis
deverão ser armazenados em dessecador até atingirem a
temperatura ambiente.
• Determinar a massa final de cada papel + células e então calcular
a massa de levedura por L (no protocolo, está por mL, mas na
tabela pede em g/L)
Prática 5: Métodos de quantificação de células

2-Massa do Concentração
1-Massa
Balão papel filtro Diferença celular em
filtro
Diluição seco + pré- (1-2) massa seca
seco
inóculo (g) 3x (g/L)
(g)3X
3x 3x
1 2
2 5
3 10
4 20
5 50

Fazer a correlação da massa seca em g/L

Prática 5: Métodos de quantificação de células
2) Contagem de células

Contagem no quadrante C: para células pequenas ou número elevado de células

-Quadrante C (0,1 mm3) tem 25 sub-quadrantes de 0,004 mm3 (0,1 mm3/ 25)
-Fazer a contagem em 5 sub-quadrantes (c) de C, os 4 dos cantos e 1 central
- Dividir o número total de células contadas nos 5 sub-quadrantes por 0,02 mm 3 (0,004 mm3 x 5)
obtendo o número de células por mm3
- Dar o resultado em n° esporos/mL (1mm3 ---10-3 mL)
 Correlacionando medidas de concentração celular
600 nm

Massa seca 0.6

f(x)
0.5 = 6.63643637723574E-08 x + 0.106933915906017
R² = 0.999009395274412
0.4
Absorbância 600 nm

0.3
0.2
0.1
0
0.0E+00 2.0E+06 4.0E+06 6.0E+06 8.0E+06

número de células/mL
 Questões para o relatório
• Construir os gráficos relacionando as diferentes medidas
de concentração celular. Massa seca X Densidade ótica a
600 nm, e, n° células x Densidade ótica a 600 nm.

• Por que a Densidade ótica em 600 nm é normalmente

utilizada para medir concentração celular?

• Qual deveria ser o método de contagem de células, caso

se quisesse considerar apenas as células viáveis de micro-
organimo. Explique como seria este experimento.