BMM 5777 Culturas celulares e suas aplicaes em Microbiologia

P3a - Contagem de clulas em cmara de Neubauer 1. Colocar a lamnula sobre a rea de marcada na cmara de contagem. Usar lamnulas especiais que fornecem a profundidade correta da cmara de contagem. No usar lamnulas comuns. 2. Homogeneizar bem a suspenso celular e transferir com esterilidade 0,1 ml para um pequeno tubo de ensaio. 3. Adicionar 0,3 ml de corante azul de tripano 0,2% ao tubo, obtendo assim uma diluio 1/4. 4. Misturar os contedos e retirar uma alquota de 0,5 ml com a pipeta. 5. Encostando a ponta da pipeta na borda da lamnula, preencher cuidadosamente a cmara de contagem. O lquido deve preencher apenas um lado da cmara e no deve chegar aos canais de cada lado da rea de contagem (Fig. 1). 6. Deixar as clulas sedimentarem por 2 min. 7. Focalizar a rea demarcada da cmara de contagem com a objetiva de menor aumento (Fig.2). Nas reas 1, 2, 3 e 4, o volume com a lamnula colocada corresponde a 0,1 mm3. 8. Contar as clulas nas 4 reas de um lado da cmara de contagem, seguindo o esquema da Fig. 2 e dividir o valor por 4 para obter a mdia. 9. Como a suspenso foi inicialmente diluda a 1/4, o nmero de clulas contadas ser igual mdia multiplicada pelo fator de diluio, no caso 4. 10. Para obter o nmero de clulas/ml, multiplicar corrigir o valor obtido por 10.000, pois: 1 ml = 1 cc 1 cc = 10 x 10 x 10 mm = 1.000 mm3 .Na cmara de Neubauer obtemos o nmero de celular por 0,1 mm3, ento devemos multiplicar por 10, portanto 10 x 1.000 = 10.000 11. Assim temos: no total de clulas no de clulas/ml = n de quadrantes contados
o

x fator de diluio x 10.000

Critrios para a contagem (Fig. 3): enumerar clulas com ncleo bem visvel; contar clulas isoladas como 1 clula (a);

contar grumos constitudos por clulas facilmente distinguveis por seus ncleos e citoplasmas como grupos de clulas isoladas e contar cada clula (b); grumos, cujas clulas so difceis de serem distinguidas umas das outras, devem ser contados como um nico grupo (c).

Fig. 1

Fig. 2

Sentido da contagem

Grumos de clulas

Fig. 3

Fig. 4

Clculo do no de clulas desejadas no de clulas/ml da suspenso original x concentrao de clulas desejada/ml volume original = volume final