CONTAGEM ESPECIFICA DE CLULAS DO LIQUIDO CFALO

RAQUIDEANO EM CMARA USANDO COLORAO SUPRAVITAL

SYDNEY

F. DE MORAES-RG0 * ANA LUCILA

KTIA G. DE MORAES-RGO **

RODRIGUES **

RESUMO Oa autores adaptaram ao estudo da citologia do LCR o liqido diluidor de

Anguiano e Ancira, proposto para realizao do hemograma em cmara de contagem. O
procedimento tcnico varia conforme o aspecto do LCR e de acordo com o nmero global
de clulas. A morfologia das clulas tcnica de colorao supravital (TCSV) descrita
pormenorizadamente. Utilizando a tcnica de Moraes-Rgo e Fernandes os autores determinaram os desvios padres para cada tipo de clulas e tabularam o percentual de clulas
determinado na lmina corada em cada caso. Demonstraram que os valores obtidos pela
TCSV caram dentro dos limites de tolerncia calculados sendo, portanto, os valores das
contagens equivalentes aos encontrados nas contagens feitas em lminas, tomadas,) estas,
como padro. Com a experincia adquirida durante 5 anos de utilizao da TCSV, os
autores a recomendam como tcnica de eleio para a contagem diferencial da clula do LCR.

Specific count of cerebrospinal fluid cells in counting-chamber using supravital

staining.

SUMMARY The authors adapted to the cerebrospinal fluid (CSF) the staining technic
developed by Anguiano and Ancira to perform differential leucocyte counts in the counting
chamber. The formula they used is the following: methyl alcohol 1 ml, destilled water
2 ml. To this mixture are added: 6 drops of Leishman stain filtered in Whatman paper
number 42; toluidine blue 0.25% aqueous solution (filtered in the same manner), 1 drop;
acetate buffer 0.1 M, pH 5.4, 1 drop. The technic varies according to the intensity of
pleocytosis. If the CSF is turbid or contains more than 100 cells per c.m. 1 drop is dripped
in the botton of a 10X75 test tube and then 2 drops of the staining fluid are added;
the mixture is then snaked; after one or two minutes 1 drop is placed in the Fuchs
-Rosenthal counting chamber. If the number of total cells is less than 100 per c.m. (Table
1), different CSF volumes are centrifuged at the rate of 2000r.p.m., during 6 minutes; the
supernatant fluid is poured off and the sedimented cells are suspended in 2 drops of
the staining fluid. The morphology of the cells as they appear after they are stained by
the supravital staining technic (SVST) is described and illustrated in photomicrographies.
By using the technic described by Moraes-Rgo and Fernandes the authors enumerated the
first 200 cells encountered in each of 10 smears of the same samples of CSF containing
250 cells per c.m., and calculated the standard desviation (SD) for each (Table 2). In
another experiment they counted 200 cells in 10 samples of CSF with different levels of
pleocytosis, by both technics. By applying the SD to the cell counts in stained smears they
determined the accetable superior and inferior limits for each count (Table 3). There one
verifies that the corresponding counting by SVST fell between the maximum and minimum
accetable values. With the experience acquired in 5 years of intensive countings by the
SVST the authors consider this technic the most adequate for differential counts of leucocytes
in the CSF.

Sidney F. de Moraes-Rgo Patologia Clinica e Hematologia: * Mdico; ** Farma

cutica-Bioquimica, Seco de LCR: *** Mdica Residente (Faculdade Federal de Biomedicina,
Uberlndia MG).
Dr. Sydney F. de Moraes-Rgo
Preto SP Brasil.

Rua Amrico

Brasiliense

284, 3 andar - 14/100 Ribeiro

A contagem global de clulas do liquido cfalo raquideano (LCR) no apresenta

maiores dificuldades tcnicas, podendo ser feita em amostras da ordem de 20 microlitros. J a contagem especfica, realizada sobre sedimento corado, esbarra com limitaes s vezes intransponveis. Tais limitaes referem-se a pequenos volumes da
amostra disponvel e a pteocitoses de pequena monta. As dificuldades tcnicas atingem
seu grau mximo quando estas duas condies se associam. Considerando-se que a
centrifugao, especialmente se realizada mais de uma vez no mesmo material, e a
transferncia das clulas sedimentadas para a lmina de colorao so procedimentos
traumatizantes, que levam destruio de grande nmero delas, seria altamente desejvel que se pudesse utilizar uma tcnica de colorao a fresco, que permitisse o
reconhecimento dos vrios tipos de clulas do LCR em preparaes midas, sem prvia
centrifugao. Nos casos de amostras com discreto aumento de clulas, no sendo
possvel a colorao direta, uma nica centrifugao seria desejvel. Em nosso laboratrio, usando o lquido diluidor proposto por Anguiano e Ancira * para a realizao
do hemograma em cmara de cpntagem e fazendo adaptaes especficas pafa o estudo
da citologia do LCR, Conseguimos testar aquela hiptese de trabalho, tornando-a
exeqvel na prtica. Nossa experincia com a tcnica de colorao supravital (TCSV)
na contagem diferencial das ciulas do LCR vem-se acumulando por mais de 5 anos,
com excelentes resultados.
No presente estudo descrevemos os diferentes passos dessa tcnica, desde a
preparao dos reagentes at s adaptaes feitas, de acordo com a intensidade da
pleocitose do LCR e referimos os parmetros estatsticos que forneceram o grau de
confiabilidade exigido para que a adotssemos na rotina de nosso laboratrio.
MATERIAL E MTODOS. RESULTADOS
A. Reagentes 1. Liqido diluidor de A/A (corante) lcool metlico p.a. lml, gua
destilada 2ml; a esta mistura juntar 6 gotas da soluo stoek do corante de Leishman
previamente filtrado em papel Whatman 42; acrescentar 2 gotas da soluo aauosa de azul
de toluidina a 0,25%, tambm filtrada; misturar; juntar 1 gota do tampo de acetato 0,1M,
pH 5,4-5,5; conservar temperatura ambiente. 2. Tampo de acetato cido actico glacial
0,8ml, acetato de sdio 7,06g; dissolver em gua destilada o acetato; juntar o cido actico;
acertar o pH a 5,4-5,5, potenciometricamente; completar 1000ml com gua destilada; conservar
em geladeira.
B. Tcnica de colorao supravital O procedimento varia, conforme o aspecto do
LCR: 1. LCR turvo pingar 1 gota no fundo de tubo de hemlise (10X75) e acrescentar
2 gotas do corante A/A; agitar; preencher um dos lados da cmara de Fuchs-Rosenthal;
esperar 1 a 2 minutos; identificar e contar as clulas. Nos casos de LCR turvo a mesma
preparao serve para a contagem global e especfica; o resultado da contagem global ser
multiplicado por 3, para corrigir a diluio inicial (1:3). 2. LCR lmpido procede-se
inicialmente contagem global de suas clulas carregando-se a cmara com LCR puro; a
orientao ser diferente conforme a contagem global se apresente superior ou inferior
a 100 elulas/mm3, assim: (a) contagem global superior a 100 clulas/mm3 proceder como
no caso de LCR turvo; (b) contagem global inferior a 100 clulas/mm3 Centrifugar volumes variveis de LCR (Tabela 1) em tubo de hemlise, a cerca de 2000 r.p.m. por 6
minutos; decantar o sobrenadante para outro tubo e pingar 2 gotas do corante no tubo
com o sedimento; agitar para ressuspender as clulas; encher a cmara e contar aps 1-2
minutos. 3. LCR acidentalmente hemorrgico se o LCR apresentar leve hemorragia como
por acidente de puno e leuccitos abaixo de 100/mm3, havendo portanto necessidade de
centrifugao, proceder do seguinte modo: (a) aps a contagem direta em cmara, centrifugar
volume de LCR indicado na tabela 1, correlacionado ao nmero de leuccitos/mm3; decantar
o sobrenadante e pingar 2 gotas do corante sobre o sedimento; aguardar cerca de 1-2
minutos, aps agitao; (b) pingar 1 gota do liqido de Trk, usado para contar leuccitos,
no mesmo tubo; agitar e preencher a cmara de contagem; as hemcias desaparecem e os
leuccitos so facilmente identificveis.
C. Tcnica para a obteno de esfregaos das clulas do LCR Usamos em nosso
laboratrio a tcnica de Moraes-Rgo e Fernandes 5, cujo princpio se baseia na obteno
de esfregaos suficientemente finos, que secam quase instantaneamente sobre lminas, a fin?
de que a estrutura celular seja conservada.
D. Morfologia das clulas do LCR em preparaes coradas a fresco Na descrio
que se faz a seguir so referidos os aspectos discrlminativos de cada tipo celular obtidos
com microscpio Zeiss, usando-se 250 aumentos (ocular 10X, objetiva 25X Plan) e cmara

de Fuchs-Rosenthal, montada com lamnula fina. As observaes foram feitas entre 1 e 5

minutos aps a colorao. Ressalte-se que todos os aspectos morfolgicos tendem a se
acentuar com o decorrer do tempo.
a. Neutrfilos Apresentam-se como pequenas formaes arredondadas, outras vezes grosseiramente retangulares, de ngulos rombos, com citoplasma apresentando granulaes finas
que, no conjunto, conferem tonalidade ligeiramente verde-ma clula. O ncleo, em
clulas bem conservadas, ntido, lobado ou no, de cor arroxeada. Em outras preparaes
nota-se apenas o contorno dos lobos dos ncleos ou, ento, a clula lembra o aspecto de
um cisto de ameba: pequenos crculos que se amoldam entre si. Esta imagem ocorre
quando os lobos do ncleo se unem no centro da clula e so visualizados em viso frontal,
como se vistos a partir da sua poro mais dilatada (vide clula do meio, na foto 1). Em
processos inflamatrios de evoluo crnica os grnulos so raros, agrupados em pequena
rea de um citoplasma hialino (Fotos 1, 2 e 3).
b. Linfcitos So clulas menores que os neutrfilos, com halo hialino de citoplasma e
ncleo que em geral o ocupa quase inteiramente, de aspecto vesiculoso, j que s a membrana nuclear vem demarcada. Observam-se freqentemente nuclolos. Podem apresentar
tamanhos variveis, mas a relao ncleo-citoplasmtica sempre prxima de 1. (Fotos 1,
2, 3, 4 e 7).
c. Moncitos So clulas maiores que os linfcitos e facilmente identificveis quando
apresentam morfologia semelhante dos moncitos do sangue perifrico: clulas maiores
que os neutrfilos, com citoplasma hialino ou fracamente azulado, com ncleo grande, reniforme, lobado ou arredondado, em geral com nuclolo. O ncleo bem demarcado nos
seus contornos mas, geralmente, tenuamente corado. Outras vezes estas clulas so de
porte menor, muito semelhantes aos linfcitos. O critrio que adotamos para sua identificao como moncito o halo citoulasmtico bem mais abundante que o do linfcito. Duas
clulas podem ter ncleos praticamente iguais: identificamos como moncitos aquela que
tiver citoplasma mais evidente que o da maioria dos linfcitos, que quase sempre um
halo apenas (Fotos 6 a 7).
d. Eosinfilos So facilmente identificveis; seu porte igual ou ligeiramente menor
que o do neutrfilo. Apresentam incluses caractersticas, grosseiras, s vezes em forma
de peauenos grnulos ou de bastonetes curtos, cor de fumo, castanho-amarelado claro, que
tende a se tornar castanho-escuro e at preto com o passar do tempo, por intensificao
da colorao. Neste estdio a clula assume aspecto caracterstico: ncleo claro, citoplasma
hialino com uma rea justa-nuclear negra, contendo grnulos compactados (Foto 5). Decorridos cerca de 3 minutos de colorao, pode-se suspeitar de eosinofilia no LCR j em
exame feito com a objetiva panormica: algumas clulas tm citoplasma mais escuro que
as demais. A confirmao feita ao grande aumento (Fotos 4 e 5).
e. Plasmcitos Clula de fcil identificao, pois guarda na colorao supravital as
caractersticas do plasmcito sangneo. Apresenta-se como clula de vasto citoplasma,
sem grnulos, que se tinge em azul claro ou mais escuro, conforme o tempo de colorao,
com ncleo vesiculoso, freqentemente com barras de cromatina no seu interior. Nos casos
de intensa plasmocitose do LCR, temos visto clulas arredondadas, do porte de moncitos,
com ncleo vesiculoso, com nuclolos e halo citoplasmtico que se coram em azul claro, as
quais temos identificado como imunoblastos (Fotos 3 e 8).

f. Basfilos Estas pequenas clulas so identificadas com surpreendente facilidade: tm

o ncleo vesiculoso e, no citoplasma azulado, agrupam-se grnulos metacromticos azul-arroxeados que tm tendncia a ocupar rea restrita do citoplasma (Foto 9).
g. Macrfagos Apresentam-se como clulas volumosas, s vezes em sinete, outras vezes
com vasto citoplasma contendo debris celulares, como ocorre na evoluo das hemorragias;
outras vezes aparecem agrupadas. Tm nuclolos evidentes e confundem-se freqentemente
com clulas neoplsicas.
h. Clulas neoplsicas Apresentam-se geralmente em grupos, mas podem ocorrer isoladas,
como nas meningites carcinomatosas. Deve-se levantar a suspeita de neoplasia toda vez
que se encontrarem no exame com colorao supravital clulas de grande porte, isoladas ou
agrupadas, com nuclolos gigantes (Foto 10). O material deve ser examinado, ento,
em esfregao corado, aps centrifugao 5 ou sedimentao em cmaras apropriadas, tipo
Klmel 3, ou citocentrifuga (Foto 11).
E. Comparao entre a contagem especfica de clulas do LCR em esfregaos corados
e em cmara (TCSV) O estudo comparativo entre a contagem especfica de clulas do
LCR em esfregaos corados pelo Leishman e a TCSV precedeu a implantao desta na rotina
de nosso laboratrio. A tcnica de Moraes-Rgo e Fernandes antes referida foi usada como
padro. Com efeito, sua confiabilidade fora demonstrada em experincias prvias, cujos

relatrios fazern parte de trabalho em andamento. O experimento consistiu em fazer a

contagem de clulas sobre 10 preparaes em pente 7 de uma mesma amostra de LCR
com pleocitose de 250 clulas/mm-^. Em cada preparao fez-se a contagem diferencial das
primeiras 200 clulas encontradas. O conjunto das 10 contagens foi submetido a tratamento estatstico, calculando-se a mdia e o desvio padro (SD) paia as contagens de cada
tipo celular. Esses ndices constam da tabela 2 e serviram para avaliar a confiabilidade
das contagens pela TCSV. Dez amostras de LCR com pleocitoses variadas foram contadas
simultaneamente pelos dois mtodos: a fresco e em lminas coradas. As contagens efetuadas
constam da tabela 3, onde vm indicados os limites de tolerncia para 2 SD. Esses limites
foram calculados a partir do valor percentual encontrado na contagem de cada tipo de
clula na lmina. Sobre este valor, considerado padro, foi aplicado o SD do tipo de clula
respectivo (Tabela 2). Desse modo pode-se verificar facilmente se o valor encontrado
para TCSV caiu dentro dos limites aceitveis ou no.
F. Tcnica de preparao de LCR artificialmente meningtico Nas sesses de demonstrao da TCSV temos preparado amostras de LCR com pleocitose acentuada, que
mimetiza a pleocitose das meningites, do seguinte modo: em tubo> de hematcrito de Wintrobe
centrifuga-se amostra le sangue cuia contagem global de leuccitos no seja menor que
SOOO/mntf; despreza-se o plasma sobrenadante e recolhe-se cem agulha longa, montada
em seringa, o creme leucocitrio; pinga-se 1 gota deste material em l-2ml de LCR lmpido.
Aps homogeneizao obtm-se amostra turva, como ocorre com o LCR em meningites.
Este material, uma vez tratado pela TCSV, permite treinamento de tcnicos no reconhecimento das clulas inflamatrias do LCR; alia vantagem da disponibilidade imediata de
abundante material aauela de no oferecer risco de contaminao, ao ser manuseado.
G. Documentao fotomicrogrfica A documentao fotomicogrfica apresentada foi
feita com o aparelho de microfotografia da Zeiss, acoplado ao microscpio. Usou-se ocular
12.5X e objetiva da imerso 63X Planapo. Para as preparaes midas usou-se cmara de
contagem de Neubauer improved e lamnula fina. As microfotograias que documentam os
neutrfilos (Foto 1) e os eosinfilos (Foto 5) foram tiradas com filme branco e preto;
as demais so cpias de diapositivos coloridos.

COMENTRIOS
A condio de ser o LCR suspenso com baixa concentrao de clulas nucleadas permite obterem-se preparaes isentas de detritos em cmara ao contrrio do
sangue, que apresenta contingente de elementos slidos de at 50% do volume a ser
tratado. O lquido diluidor deve ter atividade hemoltica nas diluies empregadas
para a feitura do hemograma em cmara, a fim de que as hemcias no interfiram
na visualizao das clulas coradas. Resultam preparaes sujas que no se comparam s preparaes limpas obtidas com o LCR na diluio de 1:3, aqui preconizada. Em observaes piloto, nas fases de adaptao que antecederam implantao
da TCSV, ao estudarmos o comportamento das clulas do LCR frente ao corante de
A / A , verificamos que nas baixas diluies empregadas (1:2 e 1:3) a hemlise, em
casos com hemorragia, era em mdia de 60%. Este fato tem importncia prtica
nos casos de hemorragias menngeas, quando h interesse em estudar-se a reao
inflamatria ou, mesmo, uma meningite associada.
A relao entre a contagem global de clulas e o volume mnimo de LCR a ser
centrifugado consta da tabela 1. Os volumes indicados como mnimos foram os que
a experincia demonstrou serem os mais adequados. No houve preocupao de se
fazer tabela relacionando cada caso estudado, porque houve grande variao entre
o nmero de clulas contadas em todo o retculo da cmara quando se variava o
volume de LCR centrifugado. Os volumes indicados prevem perdas celulares mximas
de 3 5 % no processo de manipulao. A previso terica das contagens obtidas matematicamente no correspondeu, na maior parte dos casos, ao valor obtido na prtica.
Nestes estudos comparativos contvamos as clulas que caam apenas dentro do retculo. Na prtica, evidente que a contagem especfica feita dentro e fora do
retculo. A morfologia das clulas normais e inflamatrias do LCR coradas pela TCSV
de aprendizado rpido para quem est habituado ao estudo das clulas do sangue.
A segurana em reconhecer as clulas com exatido deve ser baseada em estudos
comparativos com esfregaos corados, como feito neste estudo. Clulas neoplsicas,
especialmente em grupos, podem ser reconhecidas facilmente.
Serve de exemplo o
caso documentado nas fotos 9 e 10 de material de um mesmo paciente, corado sucessivamente pela TCSV e pelo Leishman, aps sedimentao na cmara de Klmel 3.

Deve-se enfatizar que o encontro de clulas volumosas, isoladas ou em grupos, levanta

a suspeita de clulas neoplsicas, obrigando o pesquisador a proceder a tcnicas especificamente recomendadas para essa finalidade. Embora autores americanos 4,6 recomendem tcnicas semelhantes TCSV para pesquisa de clulas neoplsicas, nossa
experincia ainda pequena com a aplicao da tcnica presente nesse campo.
A anlise do tabela 3 mostra claramente que, nos 10 casos estudados, a s contagens feitas com aTCSV estiveram dentro dos limites de tolerncia estipulados, levando-se em conta os desvios padres encontrados para cada tipo de clula, contadas
em lmina corada. Estes ndices, alis, so muito prximos daqueles encontrados por
acie2 em esfregaos de sangue.
Este fato se explica pela semelhana existente
entre a tcnica do pente e aquela adotada para sangue pelo autor referido. No caso
do LCR a distribuio de clulas certamente mais homognea, feitura do esfregao,
por se tratar de suspenso concentrada de leuccitos, sem a interferncia das hemtias.
A TCSV descrita apresenta uma srie de vantagens sobre outras tcnicas usadas
em laboratrios de patologia clnica, principalmente aquelas fastidiosas de dupla centrifugao, com suspenso em soro. Tais processos, alm de trabalhosos, condicionam
a perda de grande nmero de clulas. A grande vantagem da tcnica aqui descrita
permitir que se utilizem pequenos volumes: as clulas so perfeitamente identificveis
em uma gota diluda de LCR, se houver pleocitose acima de 100 clulas/mm3 ou, no
mximo, aps uma nica centrifugao, sem manuseio agressivo delas. A experincia
adquirida em 5 anos de intensa utilizao da TCSV, examinando nmero considervel
de amostras de LCR, particularmente em situaes de emergncia, com finalidade
diagnostica e no controle evolutivo das meningites, autoriza-nos a recomend-la como
tcnica de eleio para a contagem diferencial das clulas do LCR. A simplicidade de
sua execuo, exigncia de um mnimo de material, necessidade de apenas alguns
minutos para liberar resultados confiveis, so aspectos que, no conjunto, lhe conferem
a condio de ser a tcnica que melhor se presta, no momento, para a contagem
diferencial das clulas do LCR.
REFERNCIAS
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