CONTAGEM DE CÉLULAS VIÁVEIS PELA

TÉCNICA DA CÂMARA DE CONTAGEM

Bianca Nathália
Matheus Costa
Rayssa Pessoa
OBJETIVO
A câmara de contagem, conhecida como câmara de Neubauer, ou ainda hemocitômetro, foi
desenvolvida inicialmente para determinar a concentração de células sanguíneas (por isso o prefixo “hemo”).
Uma das formas mais comuns de se determinar a viabilidade de células de levedura é através do uso da
câmara de Neubauer. Esta câmara consiste de uma lâmina de microscopia, bem mais alta do que uma lâmina
normal, com marcações em quadrantes, de medidas conhecidas. Observando-se ao microscópio, percebe-se
que existem três tipos de quadrantes denominados A, B e C, que juntos formam um quadrado maior. O
objetivo é determinar o número de células em um volume específico de solução, possuindo várias aplicações
biológicas. Além de células sanguíneas é utilizada em microbiologia, contagem de células suspensas,
espermatozoides, entre outros.
 Pode-se notar que estes quadrantes têm sub-divisões diferentes, fazendo com que o critério para
escolha do quadrante onde serão contados as células, seja o tamanho das células a serem quantificados.
Assim, usualmente, células muito pequenas são contados no quadrante C, as de tamanho intermediário no
quadrante B, enquanto células grandes são contados no quadrante A. A área total compreendida pelos 9
quadrantes é de 9 mm2 sendo que cada quadrante (A, B e C) são quadrados de 1 x 1 mm. Ao ser colocada a
lamínula (especial para ser usada na câmara de Neubauer) a distância da lamínula até a lâmina
(profundidade) mede 0,1 mm, o que permite se obter um volume de 0,1 mm3 em cada quadrante. A técnica de
coloração consiste em se misturar partes iguais da suspensão de levedura (amostra), adequadamente diluída,
e da solução corante (azul de metileno ou eritrosina). As células com alta atividade fisiológica não se colorem,
enquanto as células inativas (mortas) apresentar-se-ão coloridas de azul (azul de metileno) ou rosa
(eritrosina). A porcentagem ou o número de células viáveis é determinado transferindo-se com uma pipeta de
Pasteur a amostra para a câmara de Neubauer. Trata-se de uma lâmina especial, precisamente dividida em
quadrados de 1 mm2 de área; a lâmina é coberta com uma lamínula, que deixa um volume, sobre cada
quadrado, de 10-4 cm3 ou 0,1 mm3..
MATERIAL

● Microrganismo: cultura de Saccharomyces cerevisiae;

● Reagentes: solução salina fisiológica (0,85% NaCl);
● Equipamentos: microscópio óptico comum e Câmara de contagem de Neubauer, bico de Bunsen;
● Diversos: pipeta Pasteur.
PROCEDIMENTO
Inicialmente, colocar a lamínula sobre a área de marcada na câmara de contagem. Depois usar lamínulas especiais
que fornecem a profundidade correta da câmara de contagem. Não usar lamínulas comuns. Posteriormente
homogeneizar bem a suspensão celular e transferir com esterilidade 0,1 ml para um pequeno tubo de ensaio. Em seguida,
adicionar 0,3 ml de corante azul de tripano 0,2% ao tubo, obtendo assim uma diluição 1/4. Misturar os conteúdos e
retirar uma alíquota de 0,5 ml com a pipeta. Encostando a ponta da pipeta na borda da lamínula, preencher
cuidadosamente a câmara de contagem. O líquido deve preencher apenas um lado da câmara e não deve chegar aos
canais de cada lado da área de contagem. Deixar as células sedimentarem por 2 min. 7. Focalizar a área demarcada da
câmara de contagem com a objetiva de menor aumento. Nas áreas 1, 2, 3 e 4, o volume com a lamínula colocada
corresponde a 0,1 mm3. Contar as células nas 4 áreas de um lado da câmara de contagem, e dividir o valor por 4 para
obter a média. Assim, como a suspensão foi inicialmente diluída a 1/4, o número de células contadas será igual à média
multiplicada pelo fator de diluição, no caso 4.
RESULTADOS
Para obter o número de células/ml, contidas em uma suspensão, segue da seguinte forma. Multiplica corrigindo o valor
obtido por 10.000, pois: 1 ml = 1 cc (contagem de células), 1 cc = 10 x 10 x 10 mm = 1.000 mm 3. Na câmara de Neubauer obtemos
o número celular por 0,1 mm3, então devemos multiplicar por 10, portanto 10 x 1.000 = 10.000. Logo: o total de células/ml = o
fator de diluições vezes 10.000 vezes (n° de células nos quadrados)/4. E a viabilidade celular utilizando a fórmula abaixo:

VIABILIDADE CELULAR (%) = células vivas x 100

células vivas + células mortas