Roteiros

Microbiologia de Alimentos
Manual de Estágio

REGRAS BÁSICAS DE SEGURANÇA NO LABORATÓRIO:

1. Durante a aula prática mantenha, sempre, a atenção ao roteiro, tendo-o sempre
próximo a você. Pode ser efetuada a marcação com caneta sob cada item realizado do
experimento, de forma a não se perder durante a execução;
2. Leia sempre o roteiro antes de iniciar a prática e, mesmo, antes das explicações do
professor;
3. Observe a localização do material e dos equipamentos de emergência (chuveiro, lava-
olhos etc.);
4. Não abra qualquer recipiente antes de reconhecer o seu conteúdo pelo rótulo;
5. Não pipete líquidos, diretamente, com a boca, use pipetas adequadas;
6. Não tente identificar um produto químico pelo odor ou pelo sabor;
7. Não deixe de utilizar os equipamentos de proteção;
8. Não adicione água aos ácidos, mas sim os ácidos à água;
9. Não trabalhe com sandálias, chinelos, ou sapatos abertos e de salto no laboratório;
10. Sempre identifique o conteúdo presente nos frascos ou nos tubos utilizados no
experimento com a caneta para vidros. Isso facilita o seu descarte adequado por parte dos
responsáveis pelo laboratório;
11. Mantenha os solventes em recipientes adequados e devidamente tampados, bem
como os materiais inflamáveis longe de fontes de calor (bico de Bunsen);
12. Utilize a capela sempre que manipular reagentes ou solventes que liberem vapores;
13. Conheça as propriedades tóxicas das substâncias químicas antes de empregá-las,
pela primeira vez, no laboratório. Caso tenha dúvidas, consulte o professor ou o técnico a
respeito;
14. Se tiver cabelos longos, leve-os presos ao realizar qualquer experiência no laboratório;
não se alimente e nem ingira líquidos nos laboratórios.
Serviço Social

INSTRUÇÕES:
1. Usar sapato fechado, jaleco e luva, sem adornos;
2. Os alunos devem realizar a higienização das mãos para adentrar ao laboratório;
3. Separar os materiais (alimentos, utensílios, entre outros) necessários à execução do
experimento, reunindo todos em um só local;
4. Sempre transportá-los em bandejas;
5. Escolher utensílios com capacidade de acordo com o experimento a executar;
6. Anotar todos os resultados no roteiro da aula;
7. Proceder a higienização dos materiais utilizados durante a aula.
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Disciplina: Microbiologia de Alimentos AULA 1

Título da aula: Determinação de alguns fatores ROTEIRO

intrínseco em alimentos 1

OBJETIVO: analisar dois fatores intrínsecos muito determinantes para a caracterização

de um alimento: a atividade de água e a presença de substâncias, naturalmente,
antimicrobianas.
Para a prática de análise da atividade de água (Aa):
Procedimento:
1 – Preparar, ao menos, 3 dessecadores adicionando, a cada um deles, uma das soluções
saturada de sal da tabela a seguir. É importante reforçar que seja selecionado sais com
valores bem distintos de Aa. Por exemplo, no primeiro dessecador adicionar o ácido sulfúrico
(Aa = 0,00); no segundo adicionar o carbonato de potássio (Aa = 0,43); e no terceiro,
adicionar o sulfato de sódio (Aa = 0,93);

Sal UR % (a 25 °C) Aa
Ácido sulfúrico 0,00 0,00
Hidróxido de potássio – KOH 8,23 0,08
Acetato de potássio – KC2H3O2 22,51 0,23
Cloreto de magnésio – MgCl2 32,8 0,33
Iodeto de sódio – NaI 38,2 0,38
Carbonato de potássio – K2CO3 43,16 0,43
Nitrato de magnésio –
52,89 0,53
Mg(NO3)2.6H2O
Brometo de sódio – NaBr 57,6 0,58
Iodeto de potássio 68,9 0,68
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Cloreto de sódio – NaCl 75,7 0,76

Sulfato de amônio – (NH4)SO4 80,9 0,81
Cloreto de potássio – KCl 84,34 0,84
Sulfato de sódio – Na2SO4.10 H2O 93,0 0,93

2 – Pesar 3 béqueres de 50 ml, anotando as respectivas massas;

3 – Adicionar a cada um destes béqueres, 5 g de um determinado alimento. Sugerimos
amostras de bolacha de água e sal, café em pó e molho de tomate;
4 – Colocar em cada um dos dessecadores, já contendo uma das soluções saturadas de
sal, um dos conjuntos de béquer + amostra;
5 – Após 7 dias, verificar a aparências dos alimentos.

MATERIAIS QUANTIDADE
Dessecadores 3 unidades
Sugerimos os seguintes sais: ácido sulfúrico
Soluções saturadas de sais (ao menos 3 sais
(Aa = 0,00); carbonato de potássio (Aa =
com valores de Aa bem distintos).
0,43); e sulfato de sódio (Aa = 0,93).
Balança analítica
Béquer de vidro 6 unidades por bancada
Sugerimos: bolacha de água e sal, café em
Alimentos variados
pó e molho de tomate.
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Para a prática de análise da presença de substâncias antimicrobianas naturais

Procedimento:
1 – Em uma placa de Petri contendo o meio de cultura sólido TSB ou BHI, semear,
com o auxílio de um swab, uma solução contendo Staphylococcus aureus previamente
crescido em meio de cultura líquido TSB ou BHI;
2 – Faça movimentos em zigue-zague de forma que toda a superfície da placa seja
coberta com a solução da bactéria em questão;
3 – Enquanto aguarda a solução na placa secar por alguns minutos, macere, se for
necessário, em gral e pistilo, os alimentos que serão testados. Sugerimos alho, canela,
cravo, e tomilho ou orégano (frescos);
4 – Com o auxílio de uma espátula, de preferência estéril, coloque uma pequena
porção das amostras de alimento sob a superfície do meio de cultura sólido cultivado com
Staphylococcus aureus;
5 – Coloque para incubar em estufa bacteriológica a 35 °C por 24 – 48 horas.

MATERIAIS QUANTIDADE
Cepa de Staphylococcus aureus
previamente cultivada (24 horas antes) em 1 tubo
meio de cultura líquido BHI ou TSB
Placas de Petri com meio BHI ou TSB 4 por bancada
Swab 4 por bancada
Gral e pistilo 3 por bancada
Alimentos variados
Estufa bacteriológica
Espátulas de metal estéreis Por bancada
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Questões para a fixação do conteúdo:

1) Explique a relação entre a Aa dos alimentos e a propensão às contaminações
microbianas.
2) Se a atividade de água de um determinado alimento é menor que a do ambiente de
armazenamento, a tendência é ocorrer a desidratação do produto ou seu intumescimento?
Por quê?
3) Explique porque alguns alimentos utilizados nesta prática inibiram o crescimento da
cepa indicadora utilizada.
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AULA 1
Disciplina: Microbiologia de Alimentos
ROTEIRO
Título da aula: Produção de iogurte
2

OBJETIVO: observar o processo de fermentação (nomenclatura usada em indústria de

fermentação: mosto, inóculo, vinho, uso ou não de oxigênio). Discutir a fermentação lática.
Procedimento:
1 – Adicionar 2% de açúcar refinado a um frasco de iogurte (comprado em um
supermercado) e colocar na estufa a 37 °C, por 1 hora, para a ativação dos microrganismos
presentes no frasco;
2 – Em um béquer, colocar 750 mL de leite para aquecer a 80 °C, durante 15 minutos, e
resfriar, rapidamente, em banho de água fria;
3 – Separar 100 mL de leite pasteurizado em béquer (ainda quente) e dissolver a gelatina
completamente;
4 – Colocar no leite sacarose a 10%;
5 – Adicionar 40 g de iogurte ativado (inóculo) quando a temperatura chegar a cerca
de 40 ºC;
6 – Cobrir o recipiente com papel alumínio e incubar em estufa a 37 °C, durante, no
mínimo, de 1, e, no máximo, 2 dias;
7 – Depois do iogurte pronto, fazer um esboço de controle de qualidade com a verificação
de propriedades organolépticas (cor, sabor, odor, textura).
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MATERIAIS QUANTIDADE
Leite UHT integral 1 litro
Açúcar refinado 10%
Inóculo 3%
Gelatina 1%
Frasco de iogurte 1 unidade
Proveta 1 L 1 unidade
Béquer 500 mL, 250 mL 1 e 2 unidades
Espátula 2 unidades
Estufa 37 ºC

Descarte do material utilizado conforme as Normas Internacionais de Segurança:

As soluções podem ser jogadas na pia com a água correndo.

Questões para a fixação do conteúdo:

1) Quais são os principais produtos metabólicos produzidos em uma fermentação lática?
2) Explique o princípio do processo de pasteurização para o controle de microrganismos.
3) Explique porque os produtos lácteos não podem ser esterilizados em autoclave (vapor
úmido sob pressão).
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AULA 2
Disciplina: Microbiologia de Alimentos
ROTEIRO
Título da aula: Destilação de garapa fermentada
1

OBJETIVO: entender o processo de fermentação alcoólica. Comparar as várias

fermentações alcoólicas: álcool combustível, pinga, cachaça, vinho e cerveja.
Procedimento:
1 – No dia anterior ao dia da aula, colocar em 1-2 L de garapa em um container fechado;
2 – Adicionar 2 pacotes de levedura dissolvido em garapa (fermento do tipo Fleischmann),
com uma “espatulada” de fonte de nitrogênio NH4 (SO4)2;
3 – Depois de, aproximadamente, 24 h, filtrar a solução fermentada em filtro de papel;
4 – Remover uma pequena quantidade do material retido na superfície do filtro de
papel e checar a presença de leveduras, colocar uma amostra em uma lâmina + azul de
metileno + lamínula), realizando a análise em microscópio óptico;
5 – Com o líquido filtrado, realizar a destilação.

MATERIAIS QUANTIDADE
3-5 Erlenmeyer (para a coleta do destilado) 1 conjunto por bancada
Garapa fermentada 1 por bancada
1-2 pacotes de fermento tipo Fleischmann 1 por bancada
NH4 (SO4)2 “1 espatulada”
Azul de metileno 50 mL
Lâminas e lamínulas 1 conjunto por bancada
Container com 1-2 L de garapa + inóculo + destilador +
1 conjunto
densitômetro
Microscópio 1 por bancada
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Descarte do material utilizado conforme as Normas Internacionais de Segurança:

As soluções podem ser jogadas na pia com a água correndo.

Questões para a fixação do conteúdo:

1) Explique o mecanismo de funcionamento de um destilador.
2) Quando a solução, sendo destilada, atinge a temperatura de 100 °C, deve-se parar a
destilação. Por quê?
3) Explique como é possível determinar a graduação alcoólica do produto obtido na
destilação da garapa fermentada.
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Disciplina: Microbiologia de Alimentos AULA 3

Título da aula: Análise Microbiológica da água: ROTEIRO
contagem padrão de bactérias heterotróficas por
pour plate 1

OBJETIVO: realizar o método de contagem microbiana, precisamente as bactérias

aeróbias mesófilas, em amostras de água utilizando-se de técnicas de semeadura em
profundidade (pour plate), além de saber interpretar os resultados obtidos, levando-se em
consideração os parâmetros nacionais para a potabilidade de água.

Contagem padrão de bactérias heterotróficas

Procedimento:
1 – Transferir, com uma pipeta estéril, 1 mL da amostra em duplicata para uma placa de
Petri previamente esterilizada;
2 – Caso a amostra seja clorada ou coletada da rede de abastecimento público, adicionar
0,1 mL de tiossulfato de sódio, a 10%, a cada 100 mL de amostra e esperar dez minutos
antes de começar a análise!;
3 – Entreabrir a placa e adicionar o meio de cultura, previamente fundido e já estabilizado
em banho-maria a 44-46 ºC, contido no tubo de ensaio;
4 – Homogeneizar o conteúdo da placa em movimentos circulares moderados em forma
de (∞), em torno de 10 vezes consecutivas;
5 – Quando o meio de cultura se solidificar, incubar a placa em posição invertida a 35 ±
0,5 º C, durante 48 ± 3 horas;
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6 – Ao final do período de incubação, fazer a contagem das colônias com o auxílio de

um contador de colônias.

Expressão dos resultados:

Os resultados são expressos como o nº de Colônias de Bactérias/mL ou Unidades
Formadoras de Colônias (UFC)/mL).
Contagem (UFC/mL) = número de colônias na placa após a incubação/volume da amostra
transferida para a placa.

Importante:
1. Todas as amostras a serem examinadas devem ser homogeneizadas, pelo menos,
25 vezes;
2. Tiossulfato de sódio, a 10%, colocado nos frascos de coleta para neutralizar a ação
do cloro;
3. As placas de Petri devem ser colocadas na posição invertida para evitar a condensação
de água na superfície do ágar.
Manual de Estágio

MATERIAIS QUANTIDADE
Garrafa de água mineral 2 litros
Placas de Petri 4 por bancada
Pipeta graduada 5 mL 2 por bancada
Bico de Bunsen
Plate Count ágar 4 por bancada
Estufa bacteriológica
Contador de colônia 1 por bancada
Tiossulfato de sódio a 10% 100 mL
Béquer 200 mL 2 por bancada
Banho-maria 44 ºC

Questões para a fixação do conteúdo:

1) Comente sobre a gravidade da detecção de coliformes fecais em água e em alimentos.
2) Analisando o método anterior, comente sobre a sua especificidade.
3) Existe o risco de resultados falso-positivos? Explique.
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Disciplina: Microbiologia de Alimentos AULA 3

Título da aula: Análise microbiológica da água: ROTEIRO

detecção de coliformes fecais 2

OBJETIVO: mostrar ao aluno a técnica de detecção de amostras de coliformes fecais

em água.

TESTE PRESUNTIVO (COLIFORMES TOTAIS):

Procedimento:

1 – Inocule uma série de 3 tubos contendo 10 mL (concentração dupla), 9 mL e 9,9 mL

do meio Caldo Lauril Triptose com, respectivamente, 10 mL, 1 mL e 0,1 mL da amostra;
2 – Incube a 37 °C, por 48 horas.

A presença de gás no tubo de Durham indica um teste presuntivo positivo. Anote o

número de testes positivos para cada diluição.

TESTE PARA O GRUPO DE COLIFORMES FECAIS:

1 – Transfira uma alçada de todos os tubos do teste presuntivo que deram um resultado
positivo para os tubos contendo 5 mL do meio EC;
Manual de Estágio

2 – Incube os tubos em banho-maria, a 44,5 °C, por 48 horas;

3 – A presença de gás no tubo de Durham indica um teste positivo;
4 – Anote o número de tubos positivos para cada diluição.

DIFERENCIAÇÃO DE BACTÉRIAS DO GRUPO COLIFORME:

1 – Inocule por esgotamento, a partir de um dos tubos positivos de meio EC, uma placa
com meio EMB (ou meio de cultura ágar sangue);
2 – Incube as placas invertidas por 24 horas.

Colônia típica: nucleada com ou sem brilho metálico.

Colônia atípica: anucleada, opaca, rosada e de consistência gomosa.

MATERIAIS QUANTIDADE
Tubos de ensaio de vidro 12 por bancada
Meio Caldo Lauril Triptose 1 litro
Meio EC 1 litro
Meio EMB 6 placas por bancada
Bico de Bunsen
Banho-maria 44,5 ºC
Estufa bacteriológica
Pipeta 10 mL 2 por bancada
Placas de Petri 6 por bancada
Tubos de ensaio de vidro
Caneta para vidro 1 por bancada
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Meio Caldo Lauril Triptose

Triptose 20 g
Lactose 5g
Fosfato de potássio dibásico 2,75 g
Fosfato de potássio monobásico 2,75 g
Cloreto de sódio 5g
Lauril sulfato de sódio 0,1 g
Água destilada 1000 mL

Meio EC
Triptose 20 g
Lactose 5g
Fosfato de potássio dibásico 4g
Fosfato de potássio monobásico 1,5 g
Cloreto de sódio 5g
Sais biliares 5g
Água destilada 1000 mL

Meio EMB
Peptona 10 g
Lactose 5g
Sacarose 5g
Fosfato de potássio dibásico 2g
Eosina azul de metileno 13,5 g
Azul de metileno 0,065 g
Ágar 2g
Água destilada 1000 mL
Manual de Estágio

Questões para a fixação do conteúdo:

1) Descreva a importância da detecção e do controle da presença de coliformes fecais
na água.
2) Comente as condições em que podem ocorrem a contaminação da água.
3) Descreva a importância dos microrganismos indicadores.
Serviço Social

AULA 4
Disciplina: Microbiologia de Alimentos
ROTEIRO
Título da aula: Análise microbiológica de leites
1

OBJETIVO: realizar a determinação do número de bactérias mesófilas em leite

pasteurizado utilizando a técnica de semeadura de superfície.

Procedimento:
1 – Preparar uma diluição de 1:10 dos leites, em uma solução salina estéril no volume
final de 5 mL;
2 – A partir dessa solução, realizar as diluições seriadas até 10-5, sempre em solução
salina;
3 – A quantidade de 0,1 mL de cada tubo contendo as diluições de 10-4 a 10-5 será
semeada com uma alça de Drigalsky em duplicata, em placas contendo plate count ágar;
4 – As placas serão incubadas sob condições anaeróbias a 45 °C em estufa bacteriológica;
5 – Ao final do período de incubação, fazer a contagem das colônias com o auxílio de
um contador de colônias.

Expressão dos resultados:

Os resultados são expressos como nº de Colônias de Bactérias/mL ou Unidades
Formadoras de Colônias (UFC)/mL).
Contagem (UFC/mL) = número de colônias na placa após a incubação/volume da amostra
transferida para a placa.
Manual de Estágio

Para a execução da análise do queijo, um derivado do leite, utilizaremos um fragmento

de 2,5 g, que será depositado em um recipiente estéril contendo 22,5 mL de solução salina,
a 0,8%, estéril.
O material será homogeneizado por um minuto em um agitador Vortex e, a partir daí,
seguiremos o protocolo utilizado na análise microbiológica do leite.

MATERIAIS QUANTIDADE

Leite pasteurizado UHT 1 litro

Leite A 1 litro
Leite B 1 litro
Leite de soja 1 litro
Tubos de ensaio de vidro 24 por bancada
Solução salina estéril 500 mL
Alça de Drigalsky 1 por bancada
Placas de Petri com meio Plate Count ágar 4 por bancada
Estufa bateriológica
Bico de Bunsen
Pipeta graduada 2 ou 5 mL 4 por bancada
Contador de colônia 1 por bancada
Serviço Social

AULA 4
Disciplina: Microbiologia de Alimentos
ROTEIRO
Título da aula: Coloração de Gram
2

OBJETIVO: a avaliação da morfologia microbiana é muito importante para a execução

da maior parte dos exames microbiológicos. A coloração de Gram também deve ser revisada,
dada a sua grande importância no diagnóstico clínico das amostras microbiológicas.

TÉCNICA DE COLORAÇÃO DE GRAM:

Procedimento:
1 – Em uma lâmina, pingar uma gota de solução salina estéril;
2 – Recolher uma colônia pré-cultivada com uma alça bacteriológica;
3 – Colocar a colônia selecionada junto à lâmina e homogeneizar;
4 – Fixar o esfregaço no calor;
5 – Cobrir o esfregaço com cristal de violeta por 1 minuto;
6 – Lavar o esfregaço com água corrente removendo o excesso de corante;
7 – Cobrir o esfregaço com lugol por 1 minuto;
8 – Repetir o passo 6;
9 – Descorar com álcool acetona até remover o excesso de corante;
10 – Repetir o passo 6;
11 – Cobrir o esfregaço com safranina por 30 segundos;
12 – Lavar e secar;
13 – Examinar ao microscópio (1000x).
Manual de Estágio

MATERIAIS QUANTIDADE

Solução salina 10 mL por bancada

Corantes para a coloração de Gram 1 por bancada
Óleo de imersão 1 por bancada
Corantes para a coloração de Gram 1 por bancada
Estufa bacteriológica
Lâminas 05 por bancada
Microscópios 01 por bancada
Alças bacteriológicas 01 por bancada

Atenção: todas as práticas da presente disciplina devem ser executadas seguindo

as boas práticas em microbiologia, no que diz respeito à manipulação e ao descarte de
microrganismos.
Descarte do material utilizado conforme as Normas Internacionais de Segurança:
Questões para a fixação do conteúdo:
1) Descreva a importância dos métodos de coloração diferencial.
2) Diante desta identificação, o que podemos concluir com a análise da água e do leite?
3) Quais os procedimentos para evitar a contaminação do alimento por esses
microrganismos?