Departamento de Engenharia Química e de Materiais

Avaliação citotoxicológica de material particulado e sua correlação com

insumos industriais

Aluno: Pedro Rodrigues Sampaio

Colaboradores: José Rodrigues e Julia Pereira
Orientadora: Adriana Gioda
Coorientadora: Anna de Falco

Introdução
O Brasil é um dos países que possui uma das maiores reservas de minérios de ferro no
mundo, com uma escala de milhões de toneladas, que economicamente é favorável para o país
tendo em vista a exportações destes. Suas características o tornam relevantes para as
indústrias, principalmente siderúrgicas, que servem de insumos para a produção de aço por
exemplo, material que está composto em diversas infraestruturas e presente em grande parte
dos meios de transporte. Possuem outras utilidades, mas 90% da demanda em relação ao
mercado de minério de ferro está dedicado à produção de aço.[1]
No entanto, apesar dos minérios serem essenciais para indústria, sendo um dos
principais insumos no âmbito da siderurgia, os resíduos deixados, sendo eles principalmente
no estado sólido, contribuem de forma crítica para a poluição industrial no país. Um programa
do Instituto Federal de Educação no Espírito Santo mostra que as industrias de mármore no
Estado são responsáveis por despejar 35 mil toneladas de resíduo sólido em tanques abertos
apenas com o corte e polimento do mármore [2]. Pode-se visualizar as emissões setoriais de
indústrias no país para diferentes componentes de poluição, sendo estes em toneladas,
conforme a Tabela 1.

Tabela 1 – Componentes de poluição industriais para diferentes setores

Fonte: Dados da Pesquisa – Impactos da Poluição Brasileira na Economia Brasileira [3]

Todavia, testes toxicológicos podem ser realizados em insumos industriais, assim
como em outros poluentes, para avaliar seu impacto no meio ambiente. Para isso, um certo
organismo, normalmente a Saccharomyces cerevisiae, é exposto à diversas concentrações de
tal insumo, depois de passar por tratamentos, e diante de sua viabilidade celular e uma análise
do crescimento das mesmas ao longo destas concentrações é possível avaliar o nível de
toxicidade deste insumo.
A Saccharomyces cerevisiae é a levedura mais comum quando se trata de teste
toxicológicos, além de seu fácil acesso, sendo comercializada em supermercados e utilizada
em diversos âmbitos da indústria, sua característica celular eucariótica e sua manipulação
simples permitem seu cultivo e armazenamento de forma eficaz e econômica. Contudo,
mesmo suportando uma certa acidez, esta levedura começa a ter seu crescimento inibido em
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faixas de pH abaixo de 5 [6]. Estudos mostram que a levedura Saccharomyces boulardii,

embora tendo outros fins industriais e aplicações diferentes da S. cerevisiae, se assemelham
nas análises citoxicológicas, obtendo-se respostas semelhantes quanto ao nível de toxicidade
das amostras estudadas, todavia, a S.boulardii é capaz de resistir à uma alta acidez, sendo esta
em torno de um pH 2 e 3. Essa resistência a pH mais baixos permite a realização de testes
toxicológicos de extratos ácidos de minério, de maior liberação de elementos presentes nos
insumos de minério, possibilitando a comparação com extratos neutros.
Dessa forma, tendo em vista que a amostra a ser analisada passa por um processo de
lixiviação ácida, o presente projeto tem como principal objetivo determinar a faixa de
concentração de pelota de ferro na qual ocorre uma inibição no crescimento da levedura
Saccharomyces boulardii, e caracterizar a levedura quanto a resistência da acidez em
diferentes valores de pH, levando-se em conta também diferentes concentrações de células de
S. boulardii.

Metodologia
Lixiviação Ácida
Para a Lixiviação ácida do insumo industrial em questão, utilizou-se uma alíquota de
seu minério previamente moído. Para isso, pesou-se 2,00 g da Pelota em um tubo Falcon de
50 mL, com o auxílio de uma balança analítica. Em seguida, o tubo foi avolumado com uma
solução de HNO3 10%, tendo o controle do pH ácido como um dos enfoques durante o
procedimento. O tubo Falcon contendo a solução foi colocada sob agitação, por meio de um
agitador vórtex e, então, posta em uma chapa de aquecimento à 100 °C durante 3 horas.
Antes de realizar as análises com as leveduras, dentro de uma capela de fluxo laminar
o minério é filtrado para um novo tubo Falcon, este transporte ocorre com o auxílio de uma
seringa contendo um filtro, em sua ponta, previamente ativado com metanol e lavado.

Processo de Caracterização das Leveduras

 Preparo dos Meios
As células de levedura são isoladas e cultivadas em meio YPG (extrato de levedura,
peptona e glicose) apropriado para estas e foram produzidos meios líquidos e meios semi-
sólidos (YPG-Agar) para os testes. Em ambos a mistura será composta por 2% de glicose, 1%
de peptona e 0,5% de extrato de levedura, realizando o ajuste para pH 6. Para o meio semi-
sólido a mistura será composta também de 4% de ágar. Finalmente, os meios são esterilizados
em uma autoclave por 15 minutos à uma pressão de 0,5 atm e transportados para um frasco
(meio líquido) e para placas de Petri (meio semi-sólido), mantendo, após isso, sob
refrigeração.
 Preparo do Pré-Inóculo
Um grupo específico da levedura em questão foi separado de sua linhagem para que
este possa ser utilizado nas análises toxicológicas. Para isso, dentro de uma capela de fluxo
laminar UV, sob constante esterilização de uma chama próxima a região de trabalho foi
utilizada a placa de Petri contendo o meio sólido previamente preparado com o objetivo de
armazenar e procriar a levedura. Tendo esta finalidade, uma porção de levedura comercial
suspensa em meio líquido foi espelhada sobre o meio sólido contida na placa com o auxílio de
uma alça metálica esterilizada nas chamas. Em seguida, após 24 horas, tempo suficiente para
o crescimento da levedura e a aparição de pequenas colônias, escolheu-se um grupo separado
dos demais, que destaca uma colônia especifica, e com o auxílio de uma alça metálica, este
grupo foi coletado e transferido para um meio líquido, no qual armazenará as células e ajudará
em sua procriação, obtendo-se finalmente o pré-inóculo.
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Uma linhagem específica de S. boulardii foi isolada, para isso, dentro de uma capela
de fluxo laminar UV, sob constante esterilização de uma chama próxima a região de trabalho,
foi utilizada a placa de Petri contendo o meio sólido previamente preparado com o objetivo de
armazenar e procriar a levedura. Tendo esta finalidade, uma porção de levedura comercial
suspensa em meio líquido foi espelhada sobre o meio sólido contida na placa com o auxílio de
uma alça metálica esterilizada nas chamas. Em seguida, após 24 horas, tempo suficiente para
o crescimento da levedura e a aparição de pequenas colônias, escolheu-se um grupo separado
dos demais, que destaca uma colônia especifica, e com o auxílio de uma alça metálica, este
grupo foi coletado e transferido para um meio líquido YPG, onde será cultivada e mantida em
140 RPM de agitação e 32 °C, para que este possa ser utilizado nas análises (pré-inóculo). O
pré-inoculo é avaliado quanto a sua turbidez em comprimento de onda de 570 nm. O valor em
u.t. (unidades de turbidez) do pré-inoculo é diluído para o valor inicial de 0,01 u.t. em todos
os testes.

Análise da Placa 96 poços

 Caracterização da Saccharomyces boulardii

Os testes foram realizados em placas de 96 poços em uma capela de fluxo laminar. As

leveduras foram expostas a concentrações crescentes de água acidificada (50x a 10x de
diluição), diluídas nos poços de 200 µL das placas. Cada concentração e o controle positivo
de crescimento (meio sem amostra) foram analisados em quintuplicata de exposição das
leveduras e brancos espectrométricos dispostos em triplicata. Duas metodologias foram
testadas, de baixa e alta concentração. A baixa concentração utiliza 100 µL de meio contendo
células em 100 µL de amostra em cada poço. A metodologia de alta concentração utiliza de 20
µL de meio contendo células em 180 µL de amostra.

 Análise da amostra de minério

O preparo da placa de 96 poços contendo a amostra de minério é semelhante ao

efetuado anteriormente para caracterizar a S. boulardii, todavia neste método além da adição
do meio líquido para o crescimento da levedura, a amostra em questão (pelota) é distribuída
ao longo da placa com uma concentração crescente de 1% a 100%, além do controle positivo
com água. Vale ressaltar, que as diluições para a amostra são realizadas em água acidificada.
Novamente foram realizadas análises em quintuplicata para cada concentração, expondo as
leveduras e os brancos espectrométricos em triplicata, utilizando também as duas
metodologias de alta e baixa concentração.

Resultados
Resultados da caracterização da Saccharomyces boulardii
Para analisar a viabilidade celular com a variação de pH para uma concentração de
0,01 ut de célula de levedura, realizou-se o preparo da placa com método de baixa
concentração, distribuindo as concentrações da água acidificada em uma faixa de 50x a 20x
de diluição, obtendo-se, portanto, um gráfico conforme a Figura 1. Observou-se uma
diferença significativa, em relação ao controle, a partir de uma diluição de 45x, indicando que
a concentração do ácido (uma vez que o pH se mantem entre 2 e 3 em toda a faixa estudada)
inibe o crescimento em diluições menores de 50x da amostra.
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Figura 1: 0,01 ut

A análise da viabilidade celular também foi realizada utilizando a metodologia de alta

concentração, a expectativa desta era de um resultado semelhante ao da baixa concentração,
conforme visto na Figura 1. Todavia, a resposta apresentada quanto a viabilidade celular ao
longo de toda faixa de diluições foi de aproximadamente 0%. Diante do resultado obtido, o
principal fator que poderia estar inibindo o crescimento da levedura ao longo da placa é a
baixa concentração de célula de levedura, que em um baixo volume não se torna apropriada
para o desenvolvimento e a procriação. Dessa forma, testou-se diferentes concentrações, em
unidade de turbidez, para a metodologia de alta concentração, com os valores de 0,05 ut, 0,1
ut, 0,2 ut, 0,3 ut, 0,5 ut, 1 ut.
Primeiramente, para a concentração de 0,05 ut, as análises foram feitas em duplicata
gerando dois resultados, a partir destes resultados calculou-se uma média de valores obtendo-
se, o gráfico conforme a Figura 2.

Figura 2: 0,05 ut

O mesmo foi realizado para as concentrações de 0,1 ut, 0,2 ut e 0,3 ut em duplicata,
conforme as Figuras 3, 4, 5, respectivamente.
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Figura 3: 0,1 ut

Figura 4: 0,2 ut

Figura 5: 0,3 ut
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Para as concentrações de 0,5 ut e 1 ut realizou-se apenas uma análise gerando a partir

dos resultados os gráficos conforme as Figuras 6 e 7, respectivamente.

Figura 6: 0,5 ut

Figura 7: 1 ut

Observa-se uma diferença com o controle semelhante ao método de baixa

concentração, a partir de diluições de 45x em todas as concentrações iniciais de levedura,
menos na concentração de 1 u.t. provavelmente pela relação entre as leveduras em um
ambiente repleto de células e quantidade baixa de nutrientes, onde permaneçam em fase
estacionária. Desse modo, optou-se, para as futuras análises com a amostra de pelota, utilizar
uma concentração de 0,01 ut de célula de levedura para os testes com baixa concentração, e
de 0,3 ut de célula de levedura para testes com alta concentração
A concentração de 0,3 ut para a metodologia de alta concentração foi escolhida pois
além de apresentar um resultado semelhante com o método de baixa concentração, a diluição
de 50x apresentou uma viabilidade celular mais próxima de 100% em relação às demais
concentrações de células de levedura.

Resultados das análises com a Pelota

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Conforme previamente observado, é notório que as células de levedura exibem

tolerância a concentrações de água acidificada em até 50x ou mais, implicando, portanto, que
a faixa de pH associada a concentrações pouco diluídas exerce influência sobre a viabilidade
celular da levedura. No entanto, é fundamental ressaltar que o presente objetivo do teste
toxicológico consiste na avaliação da toxicidade do metal em questão, desprezando a
influência do pH no crescimento da levedura a um segundo plano. Dessa forma, tanto a água
acidificada quanto a amostra de pelota foram diluídas 50x e as análises foram realizadas
utilizando a metodologia de baixa e alta concentração.
Primeiramente, analisou-se os resultados para a baixa concentração, utilizando uma
concentração de 0,01 ut de célula de levedura, obtendo-se, portanto, um gráfico conforme a
Figura 8 abaixo.

Figura 8: Análise de pelota de ferro (baixa concentração)

Realizando a análise para uma alta concentração, com uma concentração de 0,3 ut de
célula de levedura, obteve-se o gráfico conforme a Figura 9 abaixo.

Figura 9: Análise da pelota de ferro (alta concentração)

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Pode-se visualizar, a partir dos dois gráficos, que dentro da faixa de concentrações da
amostra em questão houve um crescimento positivo das células de levedura, atingindo
percentagens máximas de viabilização celular, isso indica que em uma diluição de 50x de
pelota de ferro concentrada não há inibição no crescimento da Saccharomyces boulardii.
Dessa forma, em uma análise de uma amostra mais concentrada, com o objetivo de verificar a
toxicidade desta exposta a S.boulardii, o pH ácido afetaria o crescimento da levedura,
obtendo-se, portanto, um resultado inconclusivo quanto a análise de toxicidade.

Conclusão
É possível concluir diante dos resultados referentes as duas metodologias, que a pelota
de ferro 50x diluída, partida de uma lixiviação ácida, demonstrou um nível praticamente nulo
de toxicidade quando exposta a Saccharomyces boulardii, A qual, por sua vez, apresentou
uma viabilidade celular de aproximadamente 100% em todas as concentrações testadas e
demonstrou completa adaptabilidade a essa faixa de valores de pH.
Ademais, quanto a caracterização da levedura, identificou-se que a Saccharomyces
boulardii começa a ter seu crescimento inibido a partir da diluição de 45x de água acidificada
e uma viabilidade celular baixa conforme o aumento da concentração da mesma, observou-se
também que este padrão de crescimento seguiu para concentrações entre 0,05 ut à 0,5 ut,
sendo afetadas para valores abaixo e acima desta faixa. Essa faixa de trabalho garantira a
utilização da boulardii em testes toxicológicos, de extratos ácidos de insumos de minério.
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Referências

[1] CARVALHO, P. S. L; SILVA, M. M; ROCIO, M. A. R; MASZKOWICZ, J. Minério de

Ferro. Insumos Básicos, BNDES Setorial 39, p. 197-234

[2] DA SILVA, I. G. Uso de resíduos provenientes do processo de corte de mármores

como um substituto dos fundentes na produção de pelotas de minério de ferro. Vitória,
2014. Programa de Pós-Graduação em Engenharia Metalúrgica e de Materiais - Instituto
Federal de Educação do Espírito Santo.

[3] MATA, H. T. D. C. Impacto da poluição industrial na economia brasileira. Viscosa,

2001. Programa de Pós-Graduação em Economia Rural – Universidade Federal de Viscosa.

[4] Vitorino, L. C., Vanin, L. G. de S., Bessa, L. A., & Braghiroli, R. (2021). Saccharomyces
cerevisiae como modelo de ensino de toxicologia a estudantes do ensino médio. Scientia
Plena, 17(01). https://doi.org/10.14808/sci.plena.2021.012702

[5] ZANCHET, A. C. Análise da tolerância de leveduras decompositoras de biomassa

lignocelulósica frente a altas concentrações de etanol e a variações de pH do meio.
Chapecó, 2016. Universidade Federal da Fronteira Sul, campus Chapecó, Curso de
Engenharia Ambiental

[6] SANT’ANA, G. D. S. Resposta ao estresse ácido em Saccharomyces cerevisiae e efeito

protetor do íon sódio na morte celular induzida por ácido. Ouro Preto, 2009. Programa de
Pós-Graduação em Ciências Biológicas. Universidade Federal de Ouro Preto.