USO DE SISTEMAS AQUOSOS BIFÁSICOS FORMADOS POR PEG +

FOSFATO DE SÓDIO PARA PRÉ-PURIFICAÇÃO DE PROTEASES DE

ORA-PRO-NÓBIS (PERESKIA ACULEATA MILLER)

ALVES AN 1*, AMARAL PN1, SANTOS MPF1, BONOMO P1, FONTAN RCI1 e BONOMO
RC2
1
Universidade Estadual do Sudoeste da Bahia, Laboratório de Engenharia de Processos
*E-mail para contato: annienolasoco.e2013@gmail.com

RESUMO – Proteases são enzimas de grande importância para o setor industrial,

sendo amplamente utilizadas na indústria têxtil, de detergentes, farmacêutica e
biotecnológica. Na indústria de alimentos são usadas como coagulantes tenderização
de carnes e mudanças em propriedades funcionais de proteínas. Objetivou-se com este
trabalho estudar a partição de proteases de ora-pro-nóbis em sistemas aquosos
bifásicos formados por PEG (1500 ou 4000 g.mol-1) + fosfato de sódio. A maioria das
proteínas foram particionadas preferencialmente para a fase inferior (Kp: 0,451-
0,984), enquanto proteínas que apresentara atividade proteolítica foram particionadas
para a fase superior. Os resultados obtidos para o índice de recuperação teórica (64-
73%), fator de purificação (0,463-1,116) e seletividade (1,691-5,942) dos sistemas
estudados evidenciam que sistemas aquosos bifásicos podem ser utilizados como uma
boa alternativa para o desenvolvimento de um protocolo de purificação deste grupo de
enzimas.
Palavras-chave: enzima; partição; downstream process

USE OF BIPHASIC AQUEOUS SYSTEMS FORMED BY PEG +SODIUM

PHOSPHATE FOR PRE-PURIFICATION OF PROEASES FROM ORA-
PRO-NOBIS (Pereskia aculeata MILLER)

ABSTRACT – Proteases are enzymes of great importance for the industrial sector and
are used in the textile, detergent, pharmaceutical, and biotechnology industries. In the
food industry, it's used as coagulants, meat tenderization, and changes in the functional
properties of proteins. The objective of this work was to study the partition of proteases
from ora-pro-nobis in aqueous two-phase systems formed by PEG (1500 or 4000 g.mol-
1
) + sodium phosphate. Proteases are enzymes of great importance for the industrial
sector and are used in the textile, detergent, pharmaceutical, and biotechnology
industries. In the food industry, it's used as coagulants, meat tenderization, and changes
in the functional properties of proteins. The objective of this work was to study the
partition of proteases from Pereskia aculeata Miller in aqueous two-phase systems
formed by PEG (1500 or 4000 g.mol-1) + sodium phosphate. Most proteins were
partitioned preferentially for the bottom phase (Kp: 0.451-0.984), while proteins that
showed proteolytic activity were partitioned for the top phase. The results obtained for

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 the theoretical recovery index (64-73%), purification factor (0.473-1.116) and
selectivity (1.691-5.942) of the studied systems show that aqueous two-phase systems
can be used as a good alternative for the development of a purification protocol for this
group of enzymes.
Keywords: enzyme; partition; downstream process

1. INTRODUÇÃO
As proteases são enzimas hidrolíticas que atuam nas ligações peptídicas de proteínas, e
assim as convertendo em suas menores unidades os peptídeos ou aminoácidos. Devido a sua
função as proteases possuem aplicações em diferentes setores na indústria, como por
exemplo, a indústria têxtil, de detergentes, farmacêutica e biotecnológica. As proteases
também são de grande importância na indústria de alimentos, na qual é utilizada para
produção de queijos, como agente coagulante, na texturização de carnes e modificação de
propriedades funcionais de proteínas (Amid et al., 2011; da Silva et al., 2017).

As proteases podem ser obtidas de diversas fontes, embora as de origem microbiana

sejam usadas preferencialmente. Apresar de algumas limitações para obtenção de proteases de
origem vegetal, como por exemplo a pequena quantidade de enzima que é extraída de uma
grande massa de vegetal, essas enzimas tem apresentado algumas vantagens como a alta
especificidade de substrato e a estabilidade em ampla faixa de pH e temperatura, além disso a
descoberta de proteases de origem vegetal com diferentes características pode resultar em um
produto final com características muito específicas, como acontece quando cardosinas da
Cynara cardunculus são usadas na produção de queijos (Salehi et al., 2017). Uma dessas
possíveis fontes alternativas é a ora-pro-nóbis (Pereskia aculeata Miller), pertencente à
família Cactaceae. Esta planta apresenta alto valor nutricional associado principalmente ao
alto conteúdo de proteínas, que pode chegar a 28%, além de fibras, minerais e compostos
bioativos. Mesmo com consumo cultural expressivo em algumas regiões do país,
principalmente a região sudeste, seu uso como uma potencial fonte para extração de
compostos de interesse industrial ainda não foi amplamente estudado (Lima Jr. et al., 2013;
Pinto et al., 2015)

Apesar das proteases vegetais apresentarem propriedades que se mostrem adequadas à

aplicação em processos industriais, a sua viabilidade econômica depende da eficiência nas
etapas de extração e purificação. Normalmente a etapa de purificação engloba técnicas como
precipitação, diálise e cromatografia, e podem aumentar o custo final do produto em média
75%. O uso de sistemas aquosos bifásicos (SAB) é uma alternativa conveniente para a
purificação de biomoléculas. Esses sistemas podem ser formados pela mistura de dois
polímeros, polímero e sal, polímero e líquido iônico, ou álcool e sal. Esta técnica de
purificação tem como a principal vantagem a biocompatibilidade e baixa probabilidade de
desnaturação da biomolécula, visto que são formados majoritariamente por água, além de ser
de baixo custo (Asenjo e Andrews, 2011; da Silva et al., 2017).

Neste contexto, objetivou-se com esse estudo estudar o uso de sistemas aquosos
bifásicos formados por PEG + sal na purificação parcial de proteases de ora-pro-
nóbis (Pereskia aculeata Miller).

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2. METODOLOGIA
Para obtenção do extrato bruto, a amostra de ora-pro-nóbis previamente seca e triturada
foi misturada a solução de fosfato de sódio 0,1 M pH 7,0, proporção líquido/sólido de (21
mL:1g) por 60 min com auxílio de um agitador orbital. Em seguida a mistura foi centrifugada
por 5000 g por 10 min para remoção do sobrenadante, que foi usado como extrato bruto.

O teor de proteínas no extrato bruto e nas fases inferior e superior foi obtido segundo a
metodologia proposta por Bradford (1976), utilizando a albumina sérica bovina como padrão
para a curva de calibração. A atividade proteolítica foi obtida a partir da hidrólise da caseína.
O extrato enzimático bruto (0,150 mL) foi adicionado a 1,0 mL de solução de caseína 1,0 %
em tampão fosfato de potássio 100 mM pH 6,0. A mistura foi incubada a 37°C em um banho
termostático por 10 minutos. Para parar a reação foi utilizada solução de ácido tricloroacético
10%, e a mistura obtida centrifugada a 7000g por 15 min. A quantidade de aminoácidos foi
determinada pela absorbância do sobrenadante a 280 nm, usando a tirosina como padrão para
a construção da curva de calibração.

Uma unidade de atividade enzimática (U) foi definida como a quantidade de enzima
necessária para produzir 1,0 μmol/mL de tirosina por minuto

çã
= çã á ( ) (01)
çã

Para os ensaios de partição das proteases em SAB foram utilizados sistemas formados
por polietilenoglicol (1500 e 4000 g.mol-1)+ fosfato de sódio pH 7,0. As composições globais
e o parâmetro comprimento da linha de amarração estão na Tabela 1.

Tabela 1- Composição global das linhas de amarração (LA) e comprimento da linha de

amarração (CLA) de sistemas aquosos bifásicos formados por PEG 1500 e 4000 g.mol-1+
fosfato a 25°C de sódio utilizados para partição de proteases de ora-pro-nóbis

Composição global (% m/m) CLA

LA
SAL PEG PEG 1500 PEG 4000

1 11,5 12,0 27,668 29,796

2 12,0 13,0 31,849 33,637

3 12,5 14,0 35,955 34,560

4 13,0 15,0 38,086 41,137

Os sistemas foram preparados em tubos de centrífuga, com uma massa final de 5,0g.
Para todos os sistemas uma quantidade fixa de extrato bruto enzimático (1,0g) foi utilizada.
Baseado na concentração de sal e água presente no extrato, as quantidades necessárias de

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solução estoque de PEG, sal e água foram adicionadas ao extrato. Os tubos foram então
agitados e permaneceram em estufa B.O.D. a 25°C por 12 horas. Em seguida, as fases inferior
e superior foram separadas com auxílio de seringas e então determinada a concentração de
proteínas e atividade enzimática em cada fase.

Foi calculado o coeficiente de partição de atividade enzimática para avaliar a

distribuição das proteases nas fases (Equação 02). O coeficiente de partição de proteína
determina a concentração de equilíbrio da proteína na fase superior e inferior foi obtida pela
Equação 03.
á
= á
(02)

çã í
= çã í
(03)

Também foram calculados a seletividade dos sistemas (Equação 04) e o índice de

recuperação teórica de atividade (Y), fator de purificação(F.P.), como mostrado nas Equações
05 e 06 respectivamente.
çã á
= çã í
(04)

(%) = (05)
( )

Onde R corresponde à razão entre os volumes da fase superior e inferior e K

corresponde ao coeficiente de partição de atividade da protease.

á í
. .= á í
(06)

3. RESULTADOS E DISCUSSÃO
Os parâmetros de partição das proteases de ora-pro-nóbis em SAB formados por PEG +
fosfato de sódio estão apresentados na Tabela 2. Com relação aos valores obtidos para Kp,
verifica-se que o aumento de CLA favoreceu a partição de proteínas na fase inferior em SAB
formados por PEG 1500. O aumento na diferença da composição entre as fases favorece as
interações específicas entre biomolécula e os componentes de cada fase (de Souza Jr., 2014).
O aumento da massa molar de 1500 para 4000 favoreceu interações entre a fase polimérica e
proteínas hidrofóbicas, pois o aumento da massa molar resulta na expulsão das moléculas de
água para a fase inferior, que também pode ter sido intensificado pelo aumento da
concentração de polímero no sistema (Silva et al, 2013).

Ainda que o os valores de Kp indiquem a partição das proteínas para a fase inferior,
verifica-se que as proteínas que apresentam atividade proteolítica foram particionadas
preferencialmente para a fase superior (Ke >1). A partir desse comportamento é possível
inferir que as proteases de ora-pro-nóbis apresentam caráter hidrofóbico, viso que a fase
inferior apresenta maior hidrofilicidade (Costa et al.,2015). O aumento na diferença de
composição entre as fases favoreceu a partição de proteínas com atividade enzimática para a

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fase superior devido a maiores interações entre a biomolécula e os constituintes da fase.

Com a obtenção do índice de recuperação teórica é possível inferir quanto de atividade

enzimática foi recuperada na fase para qual a enzima foi particionada em relação a atividade
inicial do extrato. Os resultados encontrados em SAB formados por PEG 1500 (65-73%)
foram superiores aos encontrados em SAB formados por PEG 4000 (63,373-68,08%).
Comportamento semelhante também foi observado por da Silva et al. (2017) na partição de
proteases de Aspergillus tamarii URM4634 em sistemas PEG + citrato. Altos índices de
recuperação podem indicar que as condições de estudo não provocaram alterações
significativas em sua estrutura nativa e assim não houve variação da atividade enzimática
(Sampaio et al., 2016) Resultados semelhantes também foram encontrados na literatura com
relação ao fator de purificação (Nascimento et al., 2016; Amid et al., 2012)

Tabela 1- Parâmetros de partição de proteases de ora-pro-nóbis em sistemas aquosos bifásicos

formados por PEG (1500 e 4000 g.mol-1) + fosfato de sódio a 25°C

LA Kp Ke Y (%) F.P S
PEG 1500
1 0.984±0.010 1.990±0.093 65.247±0.834 0.546±0.071 2.022±0.115
2 0.893±0.007 2.433±0.323 67.327±2.723 0.515±0.004 2.723±0.340
3 0.451±0.024 2.485±0.457 73.204±2.852 1.116±0.035 5.942±0.722
4 0.608±0.061 1.594±0.080 66.314±0.116 0.731±0.076 2.633±0.267
PEG 4000
1 0.617 ±0.025 2.119±0.351 64.988±1.118 0.547±0.071 3.427±0.432
2 0.815±0.115 2.251±0.070 64.373±0.714 0.484±0.020 2.783±0.307
3 1.315±0.047 2.217±0.094 68.028±2.480 0.463±0.004 1.691±0.284
4 0.766±0.050 2.079±0.035 67.770±1.759 0.640±0.055 2.719±0.132

4. CONCLUSÃO
As concentrações dos componentes dos SAB assim como a massa molar do polímero
afetaram a partição das proteases de ora-pro-nóbis. O aumento na diferença da composição
entre as fases favorece a partição de proteínas. A maioria das proteases foram particionadas
preferencialmente para a fase superior, sendo, portanto possível concluir que se trata de
moléculas de caráter hidrofóbico. Os resultados obtidos de seletividade e índice de
recuperação teórica mostram que os sistemas aquosos estudados são adequados para pré
purificação de proteases de ora-pro-nóbis.

5. AGRADECIMENTOS
A CAPES pela concessão da bolsa e à Universidade Estadual do Sudoeste da Bahia.

6. REFERÊNCIAS

1° Simpósio sobre Inovação em Engenharia e Ciência de Alimentos – INECA2020

20 a 22 de outubro de 2020 – Canal INECA2020 – UESB/UFLA/UFVJM Página 5
Amid M, Tan CP, Mirhosseini H, Aziz NA, Ling TC. Optimisation of serine protease
extraction from mango peel (Mangifera Indica Cv. Chokanan). Food Chem, v. 124, p. 666–
671, 2011.

Asenjo JA, Andrews BA. Aqueous two-phase systems for protein separation: A perspective. J
Chromatogr A, v. 1218, p. 8826–8835, 2011.

Bradford MM. A rapid and sensitive method for the quantitation of microgram quantities of
protein utilizing the principle of protein-dye binding. Anal Biochem, v. 5, p. 248–254, 1976.

Costa AR Da, Coimbra JSDR, Ferreira LA, Marcos JC, Santos IJB, Saldaña MD, Texeira
JAC. Partitioning of bovine lactoferrin in aqueous two-phase system containing poly(ethylene
glycol) and sodium citrate. Food Bioprod Process, v. 95, p. 118–124, 2015.

da Silva OS, Gomes MHG, de Oliveira RL, Porto ALF, Converti A, Porto TS, Partitioning
and extraction protease from Aspergillus tamarii URM4634 using PEG-citrate aqueous two-
phase systems. Biocatal Agric Biotechnol, v. 9, p.168–173, 2017.

de Souza Jr. EC, Coimbra JSR, de Oliveira EB, Bonomo RCF. Recovery of casein-derived
peptides with in vitro inhibitory activity of angiotensin converting enzyme (ACE) using
aqueous two-phase systems. J Chromatogr B, v. 973, p. 84–88, 2014.

Junior FAL, Conceição MC, Vilela de Resende J, Junqueira LA, Pereira CG, Prado MET.
Response surface methodology for optimization of the mucilage extraction process from
Pereskia aculeata Miller. Food Hydrocoll, v. 33, p. 38–47, 2013.

Nascimento TP, Sales AE, Porto CS, Brandão RMP, de Campos –Takaki GM, Texeira JAC,
Converti A. Purification of a fibrinolytic protease from Mucor subtilissimus UCP 1262 by
aqueous two-phase systems (PEG/sulfate). J Chromatogr, v. 1025, p. 16–24, 2016.

Pinto NDCC, Machado DC, Da Silva JM, Conegundes JLM, Gualberto ACM, Gameiro J,
Scio E. Pereskia aculeata Miller leaves present in vivo topical anti-inflammatory activity in
models of acute and chronic dermatitis. J Ethnopharmacol, v. 173, p. 330–337, 2015.

Sampaio D de A, Mafra LI, Yamamoto CI, de Andrade EF, de Souza Mo, Mafra MR, de
Castilhos F. Aqueous two-phase (polyethylene glycol + sodium sulfate) system for caffeine
extraction: Equilibrium diagrams and partitioning study. J Chem Thermodyn, v. 98, p. 86–94,
2016.

Silva GM de M e, Marques D de AV, Porto TS, Lima Filho JL, Texeira JAC, Pessoa-Junior
A, Porto ALF. Fluid Phase Equilibria Extraction of fibrinolytic proteases from Streptomyces
sp. DPUA1576 using PEG-phosphate aqueous two-phase systems. Fluid Phase Equilibria, v.
339, p. 52–57, 2013.

Salehi M, Aghamaali MR, Sajedi RH, Purification and characterization of a milk-clotting

aspartic protease from Withania coagulans fruit. Int J Biol Macromol, v.98, p.847–854, 2017.

1° Simpósio sobre Inovação em Engenharia e Ciência de Alimentos – INECA2020

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