1.

INTRODUÇÃO

Proteínas são compostos poliméricos complexos com alto peso molecular (PM).
Podem ser formadas apenas por cadeias de aminoácidos ou constituídas por
aminoácidos (parte proteica) conjugados com outras classes de compostos como
lipídios, ácidos nucleicos, carboidratos, grupo inorgânico, entre outros (SANTANA,
2012).

Por serem formadas por aminoácidos e considerando-se que os aminoácidos

aromáticos absorvem luz na região ultravioleta, as proteínas, em geral, podem ser
detectadas através da absorção de luz a 270 nm. No entanto, a detecção de proteínas em
materiais biológicos envolve reações específicas com determinados reativos, os quais
originam substâncias coloridas que absorvem luz na região visível, permitindo a sua
quantificação. Dentre os métodos utilizados, situa-se o método do biureto, que é
baseado na reação do sulfato de cobre em meio alcalino (reativo do biureto) com
proteínas e peptídeos (no mínimo tripeptídeos) (IB/UFF, 2013). As ligações peptídicas
das proteínas (-CONH-) reagem com os íons cúpricos, em meio alcalino, formando um
complexo de coloração violeta que é proporcional ao teor das Proteínas no meio
(BIOCLIN, 2013).

O nome do método provém do fato de que a ureia aquecida a 180°C dará reação
positiva com desprendimento de amônia (SOUSA, et al 2013):
 O método de biureto tem sido aplicado para determinar a concentração de
proteínas totais em diversos meios, sendo eles: soro ou plasma sanguíneo, líquido
cérebro-espinhal, urina, alimentos, saliva, fibrinogênio e tecido animal. O método de
biureto tem sido, também, utilizado em análise por injeção em fluxo, assim como em
alguns métodos cinéticos. Apesar de ser rápido, utilizar reagentes de baixo custo e não
apresentar grande variação da absortividade específica para diferentes proteínas, este
método não é muito sensível, como foi destacado por diversos autores, colocando-o em
grande desvantagem, em relação a outras metodologias, e por isto tem sido, ao longo
dos anos, substituído por métodos mais sensíveis. Mesmo assim, o método de biureto
continua sendo recomendado para a determinação da concentração de proteínas totais
em plasma sanguíneo pela Associação Americana de Análises Clínicas e por diversos
autores, bem como para a determinação de proteínas totais em saliva e leite, quando
comparado com outros métodos

2. OBJETIVO

 Determinação de proteínas totais pelo método de Biureto do leite integral, gema

de ovo, cara de ovo e bebida à base de soja.

3. EQUIPAMENTO E MATERIAIS

 Balança analítica

 Espectrofotômetro

 Tubos de ensaio

 Pipetas Graduadas

 Balão volumétrico de 500 mL

 Sulfato Cúprico

 Tartarato de sódio e potássio

 Água destilada
  Hidróxido de sódio de 10%

 Leite integral

 Clara de ovo

 Gema de ovo

 Bebida à base de soja

4. PROCEDIMENTO EXPERIMENTAL

Inicialmente o biureto foi preparado, pesou-se 0,75 g de sulfato de cobre e 3,0 g

de tartarato duplo de sódio e potássio em seguida foi dissolvido em 150 mL de solução

de NaOH 10%, e o volume foi completado para 500 mL de água destilada.

Para preparar a curva padrão tubos foram enumerados e adicionou-se volumes de

0,1 a 1,0 mL de solução de 1% (mV) em proteína. O volume foi completado para 1,0

mL de água destilada, em seguida foi adicionado 4,0 mL do reagente de biureto e doi

encubado a 37°C por 20 min. Em seguida as absorbâncias foram lidas a 540 nm. Por

regressão linear, foi correlacionado A540 e quantidade de proteínas. Sendo foram

usadas curva padrão com o mesmo tipo de proteína que está sendo usado na análise.

Para preparo da clara de ovo e da gema, uma alíquota de 5 mL da clara e gema foi

batido no liquidificador com 100 mL de água. O leite foi diluído, 5 mL de amostra em

100 mL de água. Para preparo da bebida à base de soja, também foi diluído 5 mL da

amostra em 100 mL de água.

5. RESULTADOS E DISCUSSÃO

As proteínas, por apresentarem muitas ligações peptídicas, quando tratadas com o

Reagente de Biureto, produzem uma coloração cuja intensidade obedece a Lei de

Lambert-Bier. Esta Lei estabelece que a absorbância de uma solução aumente à medida

que aumenta a concentração de partículas absorventes. Isto pode ser comprovado pela

visualização da coloração obtida em cada amostra durante o experimento e com as

medidas de absorbâncias, como pode-se observar na seguinte tabela.

AMOSTRA ABSORBÂNCIA

Tubo 1 (Branco) 0,00

Tubo 2 (leite integral a 5%) 0,212

Tubo 3 (Gema do ovo) 0,417

Tubo 4 (Clara do ovo) 0,340

Tubo 5 (Bebida à base de soja) 0,070

É possível observar que a clara de ovo a concentração de proteína foi alta, devido

a uma maior concentração de proteína na amostra, a gema de ovo tem uma absorbância

maior o que leva a pensar que existe mais proteína na gema do que na clara, o que não

poderia ser possível, sendo assim uma razão possível para isso ter ocorrido poderia ser

erro de pipetagem dos alunos ou até mesmo uma contaminação. Na bebida à base de

soja é possível observar uma absorbância bem menor e consequentemente uma

concentração de proteínas totais bem menor, quando comparados as outras amostras.

Para saber as concentrações de proteínas totais de cada amostra utilizada foram

usadas duas curvas padrão uma de caseína e uma de albumina. Considerando a equação

da reta de ambas:

y = 0,0373x – 0,002
em que,

y = valor da absorbância

x = valor da concentração (mg de proteína)

Encontramos que,

 Para o Leite Integral a 5%:

Absorbância: 0,212
0,212 = 0,0373x – 0,002
0,214 = 0,0373x
x = 5,7 mg de proteína
Como foi transportado uma amostra de 5 mL para um balão de 100 mL:

5,7 mg ------ 5 mL
x mg ------ 100mL
x = 154 mg em 100 mL
Se em 100 mL, temos 5 g, então temos que:

154 mg ----- 5 g
x mg ----- 1g
x = 30,8 mg/g da amostra

 Para a gema de ovo:

Absorbância: 0,417
0,417 = 0,0602x + 0,002
0,415 = 0,0602x
x = 6,89 mg de proteína na alíquota de 1 mL
Como foi transportado para a amostra 1 mL para um balão de 100 mL:

6,8 mg ------ 1 mL
x mg ------ 100mL
x = 686 mg
Se em 100 mL, temos 5 g, então temos que:

686 mg ----- 5 g
x mg ----- 1g
 x = 137,2 mg/g da amostra

 Para a Clara do ovo:

Absorbância: 0,340
0,340 = 0,0602x + 0,002
0,338 = 0,0602x
x = 5,6 mg de proteína na alíquota de 1 mL
Como foi transportado para a amostra 1 mL para um balão de 100 mL:

5,6 mg ------ 1 mL
x mg ------ 100mL
x = 561 mg
Se em 100 mL, temos 5 g, então temos que:

561 mg ----- 5 g
x mg ----- 1g
x = 112 mg/g da amostra

 Para a bebida à base de soja

Absorbância: 0,070
0,070 = 0,0373x – 0,002
0,068 = 0,0373x
x = 1,82 mg de proteína na alíquota de 1 mL
Como foi transportado para a amostra 1 mL para um balão de 100 mL:

1,82 mg ------ 1 mL
x mg ------ 100mL
x = 182 mg
Se em 100 mL, temos 5 g, então temos que:

182 mg ----- 5 g
x mg ----- 1g
x = 36,4 mg/g da amostra
 Podemos observar de acordo com os cálculos realizados que a gema de ovo teve

maior concentração de proteínas totais em relação a clara, o que não era o esperado

umas vez que a clara tem maior concentração de proteínas que a gema.

Para as concentrações de leite integral e bebida à base de soja de acordo com os

rótulos, os valores foram muito baixos em relação ao valor real, como pode ser

observado na seguinte tabela.

Amostra Valor teórico (de acordo Valor experimental

com o rótulo)
Leite integral 190 mg/g 30,8 mg/g
Bebida à base de soja 420 mg/g 36,4 mg/g

Tanto no leite integral como na bebida à base de soja houve uma distorção dos

valores, apresentando um quantitativo de proteína muito maior que os valores obtidos

experimentalmente. Isso pode ser explicado pela proporção feita, pois a quantidade de

proteína contida no rótulo para 200 mL é de 1,2 g e para 100 mL é de 0,6 g. Para 1 g, o

valor é significativamente maior, por isso ocorreu uma discrepância entre os valores.

Considerando os erros de pipetagem e contaminação de amostra, as diluições talvez não

tenham sido feitas corretamente, uma vez que foram muitas pessoas realizando o

procedimento.

6. CONCLUSÃO

Os valores experimentais estão de acordo com a literatura, pois a clara e gema do

ovo apresentaram as maiores absorbâncias, consequentemente maiores concentrações de

proteína. No entanto a gema apresentou concentração maior o que não era o esperado,

então pode-se considerar nesse caso um erro de pipetagem, contaminação entre outros

fatores. O leite integral deveria ser mais próximo e o da bebida de soja apresentou a
menor concentração de proteína, como o esperado. Pode-se concluir que o uso do

método de biureto para determinação de proteínas é um método simples, rápido e

barato, apresentando resultados experimentais relativamente satisfatórios, apesar da

distorção dos valores entre o teórico e o experimental.

7. REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS

 ZAIA, Dimas A. M.; ZAIA, Cássia Thaïs B. V.; LICHTIG, Jaim. Determinação

de proteínas totais via espectrofometria: vantagens e desvantagens dos métodos

existentes. Quím. Nova [online]. 1998, vol.21, n.6, p. 787-793. ISSN 0100-4042.

 PARK, K. J.; ANTONIO, G. C. Análises de materiais biológicos. Campinhas:

Unicamp, 2006. 21p

 ZAIA, D. A. M.; ZAIA C. T. B. V.; LICHTIG J.; Determinação de proteínas

totais via espectrofometria: vantagens e desvantagens dos métodos existentes.

Química Nova, 21(6) (1998).