PREPARAÇÃO PARA “ÁGUA, pH E TAMPÕES EM SISTEMAS BIOLÓGICOS”

Tempo que você deve dedicar a estes estudos antes de CADA aula (fora da sala de aula): 6 horas para cada
aula de 3 horas – venha para a aula preparado!!!

Leitura:
• Nelson e Cox, 7a edição. Princípios de Bioquímica de Lehninger, Capítulo 2, com foco em seções 2.2 e 2.3
• Esta apostila

Objetivos de aprendizagem para este tópico

Depois de estudar o tópico de “Água, pH e tampões em sistemas biológicos”, você deve:
• ser capaz de calcular a carga líquida de uma biomolécula (que tem um ou vários grupos ionizáveis) em um
dado pH
• ser capaz de fazer cálculos para sistemas tampão “fechados” (calcular o pH inicial do sistema dado as
concentrações, calcular as concentrações necessárias para dar um dado pH, calcular mudanças no pH com a
adição de ácido ou base etc)
• entender as interações fracas que são importantes em sistemas aquosas que contém biomoléculas (estas
interações vão ser importantes nos capítulos sobre biomoléculas que nós vamos estudar mais tarde na
disciplina)

Por que nós temos estes objetivos? Qual é a importância de água, pH e tampões na biotecnologia?
• cada micro-organismo que gostaríamos de cultivar tem um pH ótimo para seu crescimento. Cada enzima que
gostaríamos de usar tem um pH ótimo para sua ação catalítica. Muitas vezes é necessário incorporar tampões
no meio de cultivo/reação para fornecer um pH inicial ótimo. O sistema tampão pode ajudar atrasar variações
do pH durante crescimento/reação (que ocorre devido a produção/consumo de ácidos/bases). Um
biotecnologista TEM QUE SABER fazer os cálculos apropriados para preparar o tampão corretamente!!!
• o pH afeta a estrutura/função de biomoléculas – o biotecnologista pode querer melhorar a estrutura função de
biomoléculas, por exemplo, por “engenharia do proteínas. Tem que entender os efeitos de pH nas proteínas!
• o pH do sistema e o estado de protonação de biomoléculas são dois fatores cruciais em vários métodos de
separação e análise de biomoléculas que são usados na biotecnologia (eletroforese, focalização isoelétrica,
troca iônica...)

1
APOSTILA: pH e DISSOCIAÇÃO DE ÁCIDOS FRACOS, TAMPÕES

ESTA PRIMEIRA PARTE É REVISÃO

ÁGUA e Kw
• A água pura não contém somente H2O
• A água pode dissociar H2O  H+ + OH–
• na realidade o H+ não existe sozinho, mas como H3O+: H2O + H2O  H3O+ + OH–
• mas, para conveniência, pensamos em H+

Para qualquer reação podemos definir uma constante de equilíbrio

• para a reação H2O  H+ + OH–
[H + ]eqo [OH − ]eqo
𝐾EQ =
[H2 O]eqo
• para a dissociação de água, KEQ = 1,801810-16 M (25 °C)
• mas a concentração de água fica essencialmente constante nesta reação de dissociação
• qual é a concentração de água em água pura?
g 1 mol mol
1000 × = 55,5 = 55,5 M
L 18,01534 g L
• a dissociação de uma pequena quantidade de água não muda significativamente a concentração da água.
Então, nós consideramos que a concentração de água esteja constante.
• Nós incluímos a concentração constante de água na constante do equilíbrio, agora chamada de Kw
KW = [H2O].KEQ = [H+][OH–] = 1,801810-16 M  55,5 M
=1,0010-14 M2 (a 25 °C)

Então, a concentração de [H+] em água pura a 25 °C

Reação H2O → H+ + OH–

antes da dissociação 55,5 mol/L 0 mol/L 0 mol/L
admitindo que X mol de H2O dissocia – vai produzir X mol de H+ e X mol de OH– (conforme a estequiometria
da reação)
no equilíbrio 55,5-X mol/L X mol/L X mol/L
= 55,5 mol/L
(volume constante)

KW = 1,0010-14 M2 = [H+][OH–] = X.X = X2

então X2 = 110-14 M2
ou X = (110-14 M2) = 110-7 M
em água pura [H+] = [OH–] = 10-7 M

Não é muito conveniente trabalhar com números tão pequenos

• então foi definida uma quantidade pH
• e uma maneira conveniente de expressar concentrações de [H+] num grande intervalo
• definição pH = - log10[H+] (na calculadora, log é log10 enquanto ln é loge (Naperiano))
• dado um pH, dá para calcular a concentração de [H+]
[H+] = 10–pH (na calculadora, pode ser ou 10X ou “inv log”)

2
ÁCIDOS FRACOS, KA e pKA

(importante para entender de tampões)

Vamos usar um ácido fraco genérico “HA”. A reação de dissociação pode ser escrita como HA → H+ + A-
(por exemplo, para ácido acético, temos: CH3COOH (ácido) → CH3COO– (base conjugado) + H+)

Podemos definir uma constante de equilíbrio HA → H+ + A–:

[A− ]eqo [H + ]eqo
𝐾A =
[HA]eqo
Coloquei o subscrito “eqo” para lembrar vocês que são as CONCENTRAÇÕES NO EQUILÍBRIO – não são
as concentrações adicionadas originalmente à solução!

Nos livros, os autores pressupõem que você já sabe que eles estão falando de concentrações em equilíbrio e,
portanto, escrevem a equação como:
[A− ][H + ]
𝐾A =
[HA]
mas, lembre-se que são as concentrações no equilíbrio
(afinal de contas, é uma constante de equilíbrio! Então, o constante vale somente para equilíbrio!)

Para um ácido forte KA   (100% dissociação)

podemos definir pKA como: pKA = –log10KA

Exemplos de vários ácidos fracos

Nome do ácido Ácido Próton + Base conj. Nome da KA (dissoc. pKA

base conj. do ácido)
Ácido fórmico HCOOH  H+ + HCOO– formiato 1,610-3 2,8
Ácido acético CH3COOH  H +
+ CH 3 COO –
acetato 1,810-5 4,74
Ácido carbônico H2CO3  +
H + CO3 –
bicarbonato 1,610-4 3,8
Ácido fosfórico H3PO4  H +
+ H2 PO 4
–
fosfato I 1,010-2 2,0
Fosfato I H2PO4 –
 +
H + HPO4 –2
fosfato II 1,410-7 6,86
Fosfato II HPO4–2  H +
+ PO 4
–3
fosfato III 5,010-13 12,3
Amônia NH4 +
 +
H + NH3 Amoníaco 5,610-10 9,25
Glicina H3N+-CH2-COOH  H+ + H3N+-CH2-COO– Glicinato I 4,610-3 2,34
Glicinato I +
H3N -CH2-COO –
 +
H + H2N-CH2-COO –
Glicinato II 2,510-10 9,60
importante:
• alguns ácidos podem perder mais do que um próton (por exemplo, H3PO4)
• glicina (H3N+-CH2-COOH) tem uma carga positiva, glicinato I tem uma carga global de 0 e glicinato II
tem uma carga negativa (analogamente... há um pH onde a carga global de uma proteína = 0, que tem
consequências para eletroforese, solubilidade...)

3
Nós podemos usar o KA para dizer qual vai ser o pH de uma solução de um ácido fraco

Exemplo: Qual vai ser o pH quando você adicionar 0,1 mol de ácido acético para água pura dar 1 L de
volume final?

Primeiro, checa a estequiometria da reação, colocando um desconhecido X para a quantidade dissociado

CH3COOH → CH3COO– + H+
antes da dissociação 0,1 mol/L 0 mol/L 10-7 mol/L
no equilíbrio 0,1–X mol/L X mol/L X+10-7 mol/L

substituir as concentrações no equilíbrio na equação de KA

[CH3 COO− ][H + ] X. (X + 10−7 ) M. M

𝐾A = = = 1,810−5 M
[CH3 COOH] (0,1 − X) M

Isto é uma equação quadrática – neste caso podemos fazer duas simplificações:
1. Quando a porcentagem de dissociação for pequena (vamos dizer < 5 %) podemos fazer a aproximação
que 0,1-X=0,1 (quer dizer, no equilíbrio, a concentração do ácido não é significativamente diferente que
a concentração adicionado, ou seja: 0,1>>X)
2. Mesmo que a porcentagem de dissociação seja pequena, a concentração de H+ produzida pela reação vai
ser muito maior que a concentração inicial de H+ na água pura - quer dizer, X+10-7 = X

com estas simplificações:

X. (X + 10−7 ) M. M X2
𝐾A = = 1,810−5 M ≈
(0,1 − X) M 0,1

ou seja X2 = 0,1 M  1,810-5 M = 1,810-6 M2

X = (1,810-6 M2) = 0,001342 M

Para calcular [H+], tem que lembrar que X = [H+]

• então [H+] = 0,001342 M
• e pH = -log(0,001342) = 2,87

tem que checar que a porcentagem de dissociação é suficientemente baixa para ter feito a simplificação 1
• definição:
[H + ]eqo
% 𝑑𝑖𝑠𝑠𝑜𝑐𝑖𝑎çã𝑜 = . 100%
[HA]adicionado
• neste caso,
0,001342 M
% 𝑑𝑖𝑠𝑠𝑜𝑐𝑖𝑎çã𝑜 = . 100% = 1,3%
0,1 M
• então, a aproximação foi boa.

a segunda aproximação [H+ ]>> 10-7 M foi boa?

• sim! [H+] = 1,3410-3 M e é quatro ordens de magnitude maior que o 10-7 M H+ que tinha originalmente.

4
Tem que tomar cuidado – não pode fazer as aproximações sempre

Qual é o pH quando você adiciona 0,0001 mol de ácido acético para água pura para dar 1 L de volume final?

CH3COOH → CH3COO– + H+
antes da dissociação 0,0001 mol/L 0 mol/L 10-7 mol/L
no equilíbrio 0,0001–X mol/L X mol/L X+10-7 mol/L

[CH3 COO− ][H + ] X. (X + 10−7 )

𝐾A = = = 1,810−5 M
[CH3 COOH] (0,0001 − X)

Melhor não fazer a aproximação!

ERRADO
𝑋2
𝐾A = = 1,810−5 M
0,0001
então X = (1,810-5  0,0001) = 4,24310-5 M = [H+]
pH = - log(4,24310-5) = 4,37
%dissoc. = 4,24310-5/0,0001  100% = 42%

CORRETO – solucionar a equação quadrática:

[CH3 COO− ][H + ] X. (X + 10−7 )
𝐾A = = = 1,810−5 M
[CH3 COOH] (0,0001 − X)

rearranjando X.(X+10-7) = (0,0001-X)1,810-5

X2 + 10-7X = 0,00011,810-5 - 1,810-5X
X2 +(1,810-5 + 10-7)X – 1,810-9 = 0
lembre-se que para a equação quadrática aX2 + bX + c = 0

tem duas soluções: − b + b2 − 4ac − b − b2 − 4ac

e
2a 2a

a solução dá X = 3,4310-5 M
(a outra raiz dá um número negativo – é impossível ter uma concentração negativa!)

então pH = - log(3,4310-5) = 4,46

(0,1 unidades de pH é significante? Sim!)

neste caso % dissociação = 3,4310- 5 M

.100% = 34%
0,0001 M

Conclusão desta parte

As aproximações (1 e 2 na página anterior) só devem ser feitas quando % dissociação < 5%

o grau de dissociação de um ácido fraco depende da concentração adicionado (compare os resultados)

• 0,1 mol CH3COOH adicionado ao 1 L  1,3% dissociação
• 0,0001 mol CH3COOH adicionado ao 1 L  34% dissociação.

5
A EQUAÇÃO DE HENDERSON-HASSELBALCH

A MATÉRIA DA AULA COMEÇA AQUI

(mas claro, você tem que saber a parte acima! Era para ser revisão)

A equação de Henderson-Hasselbalch é simplesmente uma transformação logarítmica da equação da

constante de equilíbrio. Vamos fazer a dedução:

começa com a equação da constante de eqo

[A− ][H + ]
𝐾A =
[HA]

troque os lados de KA e o [H+]

1 1 [A− ]
= .
[H + ] 𝐾A [HA]

tire o log10 de ambos os lados

1 1 [A− ] 1 [A− ]
log = log ( . ) = log ( ) + log ( )
[H + ] 𝐾A [HA] 𝐾A [HA]

mas, dado que log(1/a) = log(a-1) = –1og(a) podemos escrever:

+]
[A− ]
− log[H = −log(𝐾A ) + log ( )
[HA]

mas, pelas definições –log[H+] = pH e –logKA = pKA

então
[A− ]
pH = pK A + log ( )
[HA]

Isto é a equação de Henderson-Hasselbalch

• qual é a importância? A equação de Henderson-Hasselbalch é a forma da equação mais conveniente de
usar (muito mais conveniente do que a expressão de KA!) para fazer cálculos com a titulação de ácidos
fracos e com tampões

TITULAÇÃO DE ÁCIDOS FRACOS

Nós vamos usar a equação de Henderson-Hasselbalch para construir uma curva de titulação de um ácido
fraco com uma base forte. Vamos titular 1 L de 0,1 M CH3COOH com 0,1 M NaOH

Nós já calculamos a situação inicial: pH inicial quando adiciona 0,1 mol de CH3COOH para 1 L H2O = 2,87

A situação depois de adicionar 50 mL de 0,1 M NaOH?

Quantos moles de NaOH foram adicionados? Resposta: 0,05 L  0,1 mol L-1 = 0,005 mol

O que acontece com o NaOH? NaOH é uma base forte. Então tem 100 % de dissociação

NaOH → Na+ + OH–

antes da dissociação 0,005 mol 0 mol ~0 mol
depois da 0 mol 0,005 mol 0,005 mol
dissociação

mas a produção de OH– vai deslocar o equilíbrio entre CH3COOH e CH3COO– pela reação:
CH3COOH + OH– → CH3COO– + H2O
• o grau de reação do OH– adicionado e de 99,999% (dá para calcular a partir das constantes de equilíbrio
das reações individuais), mas isto pode ser aproximado para 100%
• ou seja, vamos fazer o cálculo supondo 100% do OH– adicionado está consumida na reação com ácido
acético. Em outras palavras: 0,005 CH3COOH + 0,005 OH– → 0,005 CH3COO– + 0,005 H2O

6
Combinando esta informação com as concentrações de ácido acético e acetato na solução original

CH3COOH → CH3COO–
antes da adição de 0,005 mol NaOH 0,1 mol*** 0 mol
reagindo com o OH– 0,005 mol desaparecendo 0,005 mol aparecendo
depois da reação 0,095 mol 0,005 mol
(o volume está mudando – melhor trabalhar com moles (ou seja, uma grandeza absoluta) do que
concentrações)
*** de fato, conforme o cálculo feito na página 4, dá para calcular que tem 0,098658 mol de CH3COOH e
0,001342 mol de H+ que foi liberado. Este valor de 0,1 representa a soma dos dois. A base adicionada vai
primeiro reagir com o H+ que foi liberado quando o ácido acético foi adicionada à água e depois vai começar
a reagir com o CH3COOH.

[A− ]
pH = p𝐾A + log
[HA]

0,005 mol
( ) 0,005 mol
1 + 0,05 L
pH = 4,74 + log = 4,74 + log = 3,46
0,095 𝑚𝑜𝑙 0,095 mol
( )
1 + 0,05 L

Podemos fazer este tipo de cálculo várias vezes para diferentes quantidades de NaOH adicionado – para
construir uma curva de titulação. Importante: Na abscissa do gráfico na próxima página, “uma equivalente de
OH-” é a quantidade de OH- necessária para fazer 100% da titulação de um grupamento ácido

mol de OH− adicionado desde o início da titulação mol de OH− adicionado

neq (unidades de mol/mol) = = [𝐻𝐴]𝑖𝑛𝑖𝑐𝑖𝑎𝑙 ×𝑉𝑖𝑛𝑖𝑐𝑖𝑎𝑙
mol inicial do ácido fraco adicionado

Neste caso, % da titulação = neq  100%

7
 0,1 mol de CH3COOH adicionado ao 1 L de água pura e titulado com 0,1 M NaOH
depois de adicionar 0,1 mol OH-
depois de adicionar 0,01 mol NaOH depois de adicionar 0,05 mol NaOH PONTO DE EQUIVALÊNCIA –
depois de adicionar 0,05 mol OH- para 1 L de água pura para 1 L de água pura Quando você adiciona um número de
ou seja, 50% da titulação [OH-]=0,01 M [OH-] =0,05 M mol de OH- igual a concentração de
mol CH3COOH mol CH3COO- [H+]=1x10-14 M2/0,01 M = 1x10-12 M [H+]=1x10-14 M2/0,05 M = 2x10-13 M ácido na solução inicial
0,1-0,05 =0,05 ~0+0,05 =0,05 pH = -log(1x10-12)=12 pH = -log(2x10-13)=12,70
mol CH3COOH mol CH3COO-
13 0,1-0,1 ~0+0,1
pH = pKa + log([A-]/[HA]) =0,0??? =1,0???
=4,74 + log(0,05/0,05) pH
= 4,74+0,00 = 4,74 12 pH = pKa + log([A-]/[HA])
ou seja, pH = pKa =4,74 + log(1,0/0,0)
= 4,74+log!!!
11
pH = 7,0???
mas não é correto – todo o ácido
depois de adicionar 0,009 mol OH- acético foi convertido em CH3COO-,
10
ou seja, 9% da titulação sim. Mas o CH3COO- e uma base e
mol CH3COOH mol CH3COO- vai tirar prótons de água para
0,1-0,009 =0,091 ~0+0,009= 0,009 9 produzir uns íons hidroxilas
CH3COO- +H2O → CH3COOH+OH-
pH = pKa + log([A-]/[HA]) o pH vai ser maior que 7,0
=4,74 + log(0,009/0,091) 8
= 4,74-1,00 = 3,74
ou seja, pH = pKa – 1
7

depois de adicionar 0,005 mol OH- 6

depois de adicionar 0,099 mol OH-
mol CH3COOH mol CH3COO-
mol CH3COOH mol CH3COO-
0,1-0,005 ~0+0,005
=0,095 =0,005 5 0,10-0,099 = ~0+0,099=
0,001 0,099
pH = pKa + log([A-]/[HA]) 4
=4,74 + log(0,005/0,095) pH = pKa + log([A-]/[HA])
(os volumes se anulam no cálculo) =4,74 + log(0,099/0,001)
= 4,74-1,28 = 3,46 3 = 4,74+2,00 = 6,74
ou seja, pH = pKa + 2

2
depois de adicionar 0,001 mol OH- depois de adicionar 0,091 mol OH-
mol CH3COOH mol CH3COO- 0,01 0,02 0,03 0,04 0,05 0,06 0,07 0,08 0,09 0,10 ou seja, 91% da titulação
0,1-0,001 =0,099 ~0+0,001 =0,005 mol OH- adicionado mol CH3COOH mol CH3COO-
10 20 30 40 50 60 70 80 90 100 0,1-0,091 ~0+0,091
pH = pKa + log([A-]/[HA]) % da titulação =0,009 =0,091
=4,74 + log(0,001/0,099)
(os volumes se anulam no cálculo) 0,1 0,2 0,3 0,4 0,5 0,6 0,7 0,8 0,9 1,0 pH = pKa + log([A-]/[HA])
= 4,74-1 = 2,74,46 litros da base adicionado =4,74 + log(0,091/0,009)
ou seja, pH = pKa – 2 = 4,74+1,00 = 5,74
1,0 8
0,1 0,2 0,3 0,4 0,5 0,6 0,7 0,8 0,9 ou seja, pH = pKa + 1
equivalentes
TAMPÕES
• retardam a mudança de pH num dado intervalo de pH frente à adição de H+ ou OH–
• por exemplo, nós queremos ter uma solução de pH 4,7 em que a adição de ácido ou base não muda o pH
muito
• Nós não podemos conseguir isto com um ácido forte, mas é bem fácil com um ácido fraco

curva de titulação de 0,001342 M HCl com 0,1 M NaOH:

começa com o pH no limite inferior do intervalo desejado,
mas o pH muda rapidamente

13
pH 12
solução de 0,05 M CH3COOH e
nós conseguimos isto com uma

11
10
0,05 M CH3COO-

9
8
7
6
3,74 a 5,74 para CH3COOH/CH3COO-
Zona de tamponamento = pKa  1

4
3
2
1
0,02 0,04 0,06 0,08 0,10
mol OH- adicionado
curva de titulação de 0,1 M HCl com 0,1 M NaOH: tem uma mudança pequena
no pH até 90% de equivalência, mas não no intervalo de pH desejado

9
Ácidos fracos diferentes atuam como tampões em intervalos diferentes de pH
pH 13
12 NH3
pKA = 9,25
11 [NH3] = [NH4+]
NH4+/NH3 10
HPO4–2
8,25  9,25 9

– –2
8 4+
NH
H2PO4 /HPO4 pKA = 6,86
7 CH3COO–
5,86  7,86 [H2PO4–] = [HPO4–2]
6
CH3COOH/CH3COO– H25PO4–
3,74  5,74 4
CH33COOH pKA = 4,74
[CH3COOH] = [CH3COO–]
2
1
0,2 0,4 0,6 0,8 1,0
OH– (equivalentes)
10
Então:
• uma solução tampão é uma mistura de um ácido fraco e sua base conjugada atrasa bem as mudanças de
pH com a adição de ou H+ ou OH– ao redor de seu pKa (dentro de um intervalo de +/- 1)
• o poder de tamponamento depende da concentração do tampão

Podemos preparar um tampão

• por exemplo, tampão fosfato pH 6,86 0,1 M (onde 0,1 M = [ácido fraco] + [base conjugada])
• ou adicionando os dois componentes diretamente: adicionar 0,05 mol de KH2PO4 e 0,05 mol de
K2HPO4 para 1 L de água (mas checa o pH com um potenciômetro!)
• ou titulando: Adicionar 0,1 mol de ácido fosfórico para um volume menor do que 1 L e titular com
KOH até pH 6,86. Depois, completar para 1 L com água pura

Pergunta
No sangue, precisamos de tamponamento ao redor de pH 7,2 a 7,4. Qual sistema ácido/base conjugado seria
usado para tamponar o sangue?

Pergunta
Qual seria a curva de titulação de ácido fosfórico (H3PO4), que tem três grupos dissociáveis? (vamos usar
valores aproximados dos pKa’s, ou seja, 2, 7 e 12). Em quais faixas de pH o “tampão-fosfato” tampona bem?
Para responder esta questão, tem que perceber que um equivalente de OH- representa a quantidade de OH-
necessário para titular um grupo dissociável.

pKa1=2,00 pKa2=6,86 pKa3=12,3

H3PO4 H2PO4– HPO4–2 PO4–3
+ H+ + H+ + H+
13
12
11
pH
10
9
8
7
6
5
4
3
2
1
1 2 3
equivalentes de OH-
11
Duas questões para demonstrar (1) como fazer e (2) como não fazer cálculos com tampões

Questão 1: Qual concentração de cada sal (KH2PO4 e K2HPO4) você deve ter em água pura para ter
"tampão fosfato 1 M pH 7", se o pKa da reação H2PO4-  HPO4–2 + H+ é 6,86?

"tampão 1 M" quer dizer que [H2PO4–] + [HPO4–2] = 1 M

[ A− ]
Equação de Henderson-Hasselbalch pH = pK a + log
[ HA]
−2
[ HPO4 ]
fazemos a substituição do pH e do pKa 7,0 = 6,86 + log −
[ H 2 PO4 ]
−2
[ HPO4 ]
leve 6,8 para o lado direto 7,0 − 6,86 = log −
[ H 2 PO4 ]
−2
[ HPO4 ]
eleve os dois lados como expoentes de 10 10 0,14 = 1,38 = −
[ H 2 PO4 ]
−2
[ HPO4 ] −2 −
se −
= 1,38 então [ HPO4 ] = 1,38[ H 2 PO4 ]
[ H 2 PO4 ]
e lembre-se que nós já temos a equação que fala que [H2PO4–] + [HPO4–2] = 1 (Molar)

portanto [H2PO4–] + 1,38[H2PO4–] = 1

portanto (1+1,38) [H2PO4–] = 1

− 1
portanto [ H 2 PO4 ] = = 0,42 M (42% do tampão está na forma de HA, ou seja, H2PO4–)
1 + 1,38

Para calcular o outro componente

[H2PO4–] + [HPO4-2] = 1 M
então 0,42 + [HPO4–2] = 1 M
então [HPO4–2] = 0,58 M

Resposta:
Para ter pH 7 com H2PO4– e HPO4–2, devemos ter 0,42 M de H2PO4– e 0,58 M de [HPO4–2] em
equilíbrio

Mas não resolva este tipo de problema deste jeito!!!

Tem como fazer este cálculo de maneira mais rápida. Veja a próxima página

12
Vamos refazer Questão 1 de maneira mais rápida, mas ANTES DISTO, temos que deduzir a
equação apropriada.

Dedução de uma equação para “o grau fracionado de dissociação do grupo dissociável (F)”

[A− ] [A− ]
pH = pKa + 𝑙𝑜𝑔 portanto pH − pKa = 𝑙𝑜𝑔 (1)
[HA] [HA]

Se a = b, então 10a = 10b, portanto podemos escrever

pH−pKa
[A− ]
10 = (2)
[HA]

(quer dizer, dado o pH e o pKa do grupo, dá para calcular a razão “dissociado/não-dissociado”)

Se nós queremos calcular a fração do total (ou seja, de HA + A–) que é dissociada (F), nós
queremos calcular

[A− ]
𝐹= (3)
[HA] + [A− ]

A equação (2) pode ser rearranjada para dar

[HA] × 10pH−pKa = [A− ] (4)

[A-] em equação (3) pode substituído pela equação (4). Isto vai dar

[HA] × 10pH−pKa
𝐹= (5)
[HA] + [HA] × 10pH−pKa

Dá para cancelar [HA] entre o numerador e denominador. A equação fica

10pH−pKa
𝐹= (6)
1 + 10pH−pKa

Dividindo o numerador e o denominador por 10pH-pKa, temos

1 1 1
𝐹= = = (7)
1 10−(pH−pKa) +1 10(pKa−pH) +1
+1
10pH−pKa

Conclusão: Dado o pKa do grupo dissociável, o grau fracionado de dissociação daquele grupo em
um dado pH é dado por Equação 7. A dedução não é difícil, e seria muito bom entender a dedução,
mas para a prova não é essencial lembrar como fazê-la. O que é importante é o resultado. Coloque a
equação para F na sua folha de cola.

13
Então, vamos refazer Questão 1 agora.

Lembrando da questão – queremos fazer um "tampão fosfato 1 M pH 7", para um caso em que o
pKa da reação HA → A- + H+ é 6,86. “Tampão 1 M" quer dizer que [H2PO4–] + [HPO4–2] = 1 M

Vamos calcular a concentração da base em pH 7

[𝐴− ] 1 1
Usando a equação para F 𝐹 = [𝑇𝑂𝑇𝐴𝐿] = 106,86−7 +1 = 10−0,14 +1 = 0,5799

Portanto [A–] = F  [TOTAL] = 0,5799  1 M = 0,5799 M (ou seja, 0,58 M)

Portanto [HA] = [TOTAL] – [A-] = (0,1 – 0,5799) M = 0,4201 M (ou seja, 0,42 M)

O cálculo vai ser MUITO MAIS RÁPIDO se você usar a equação para F em vez de começar com a
equação de Henderson-Hasselbalch na sua forma original!!! Saiba quando e como usar a equação
para F !!! Repetindo – Coloque a equação para F na sua folha de cola!

14
Outro exemplo – para mostrar um princípio importante
(você não precisa saber fazer este tipo de cálculo, mas é interessante ver o resultado)

Questão 2: Se você colocar 0,42 mol KH2PO4 e 0,58 mol de K2HPO4 em água pura e ajustar o
volume para 1 L com água pura, quantas mols você vai ter de H2PO4- e HPO4-2 no equilíbrio?

X=?
-
H2PO4 0,42 mol HPO4-2 + H+ V=1L
no início 0,58 mol
no início

*todos os valores na tabela têm unidades de molar (V constante)

H2PO4–  HPO4–2 + H+
antes da dissociação 0,42 0,58 10-7
(água pura)
dissociação de H2PO4- -X +X +X
em equilíbrio 0,42-X 0,58+X 10-7+X
−2
−6,86
[ HPO4 ]eqo .[ H + ]eqo (0,58 + X ).(10 −7 + X )
K a = 10 = −
=
[ H 2 PO4 ]eqo (0,42 − X )

Se resolver isto (usando a Bhaskara) , vai descobrir que X = -3,710-11 M

Portanto, no equilíbrio
[H2PO4-] = 0,42 – X = 0,42 – (-3,710-11) = 0,42 M !
[HPO4-2] = 0,58 + X = 0,58 + (-3,710-11) = 0,58 M !
[H+] = 10-7+X = 10-7 + (-3,710-11) = 10-7 M (pH 7!)

Resposta e princípio
• A quantidade de H2PO4- que dissocia para estabelecer o equilíbrio é desprezível.
• Quando você preparar um tampão, as concentrações dos sais que você colocou
originalmente vão ser as concentrações em equilíbrio.

Isto é bom – é fácil calcular a razão dos sais necessários usando a estratégia de questão 1. Não
precisamos levar em conta a dissociação do ácido! As concentrações do ácido e da base conjugado
em equilíbrio vão ser iguais às concentrações originais do ácido e da base adicionado à água.

Cuidado – esta regra se aplicará nesta disciplina – mas não funciona muito bem para tampões muito
diluídos (ou seja, para tampões < 50 mM) e quando a razão [base]:[ácido] é fora da zona de
tamponamento (ou seja, [A–] /[HA] <1:10 ou > 10:1).

15
O que vai acontecer se você adicionar ácido (ou base) para um tampão?
É MUITO importante saber fazer este cálculo!!!!

Qual seria o pH depois de adicionar 0,5 L de HCl 0,1 M para 1 L de tampão fosfato pH 7 1 M?

*todos os valores em "mol" porque tem volume na adição da HCl

H2PO4-  HPO4-2 + H+
equilíbrio para tampão 0,42 0,58 10-7
fosfato 1 M pH 7 antes da
dissociação (1 L)
(já calculamos
anteriormente)
aparecendo depois da 0,05
adição de HCl**
100% de consumo do H+ +0,05 -0,05 -0,05
produzido pelo HCl***
mols no novo equilíbrio 0,42+0,05=0,47 0,58-0,05=0,53 pequeno

**admite-se 100% dissociação de um ácido forte como HCl

***dá para calcular que, na verdade, não tem 100% de consumo do H+ que provem do HCl (se
tivesse 100% de consumo, o pH não mudaria – e nós sabemos que a adição de ácido ou base para
um tampão vai mudar o pH um pouco!). Afinal das contas, o consumo do H+ que vem do HCl que
foi adicionado fica em torno de 99,9999%. Isto faz com que seja bem razoável
(1) Admitir 100% do consumo do H+ que provem de HCl
(2) Calcular o pH a partir das novas concentrações do ácido e da base do tampão

Qual é o pH então?

−2
[ HPO4 ]
pH = 6,86 + log −
[ H 2 PO4 ]

 0,53 mol 
 
 (1 + 0,5) L  0,53
pH = 6,86 + log = 6,86 + log = 6,91
 0,47 mol  0,47
 
 (1 + 0,5) L 

Ou seja, o pH caiu de 7,0 para 6,91

6,91 – 7,00 = uma variação de –0,09 unidades de pH

Qual teria sido o pH com a adição deste HCl para 1 L de água pura?

0,05 mol
pH = − log = 1,48
(1 + 0,5) L

Ou seja, o pH teria caído de 7,0 para 1,5

1,5–7,0 = uma variação de –5,5 unidades de pH

16
Relevância para nós

Ponto 1
Os grupos dissociáveis de aminoácidos e peptídeos vão atuar como tampões quando o pH ficar ao
redor das pKa’s destes grupos. Tome cuidado – devido ao ambiente químico diferente, os pKa’s dos
grupos dissociáveis dentro de peptídeos podem ser bem diferentes dos pKa’s dos mesmos grupos
dentro de aminoácidos livres em solução aquosa.

Ponto 2
Nós temos que ser capazes de calcular o grau de dissociação dos grupos dissociáveis de
aminoácidos e peptídeos em função do pH. Claro, os valores de pKa destes grupos têm que ser
fornecidos para nós! É bem fácil calcular o grau de dissociação destes grupos dissociáveis – use a
equação para F!!!

[𝐴− ] 1
𝐹= = 𝑝𝐾𝑎−𝑝𝐻
[𝑇𝑂𝑇𝐴𝐿] 10 +1

17
CARGA LÍQUIDA

O que é “carga líquida” de uma molécula?

A carga líquida de uma molécula é a carga média daquela molécula, levando em conta todos os
grupos carregados da molécula. Vamos trabalhar um exemplo – qual é a carga líquida de ácido
acético em pH 4,74? Para CH3COOH → CH3COO-, pKa = 4,74

Quando pH = pKa, tem 50% de cada espécie (já usamos a equação de Henderson-Hasselbalch para
demonstrar isto)

Uma fração de 0,5 das moléculas (i.e. 50%) não tem carga: estão presentes na forma de CH3COOH
Uma fração de 0,5 das moléculas (i.e. 50%) tem carga -1: estão presentes na forma de CH3COO-

Portanto, a carga líquida de ácido acético em pH 4,74 vai ser

𝑓𝑟𝑎çã𝑜 𝑐𝑎𝑟𝑟𝑒𝑔𝑎𝑑𝑎 × 𝑐𝑎𝑟𝑔𝑎 𝑑𝑎 𝑒𝑠𝑝é𝑐𝑖𝑒 𝑐𝑎𝑟𝑟𝑒𝑔𝑎𝑑𝑎 0,5 × −1

= = −0,5
𝑡𝑜𝑡𝑎𝑙 0,5 + 0,5

Estratégia para calcular a carga liquida total quando tem mais do que um grupo dissociável

1. Trate cada grupo separadamente

2. Primeiro procure saber se há grupos totalmente dissociados ou totalmente protonados.

Se “pH > pKa+2” para um grupo, trate o grupo como 100% dissociado (F=1).
Se “pH < pKa–2” para um grupo, trate o grupo como 0% dissociado (F=0).
Se “pKa–2  pH  pKa+2” use equação a equação para F, uma vez para cada grupo.

3. Tome muito cuidado de identificar as cargas

“Não dissociado” é sem carga e “dissociado” tem carga negativa? (é uma combinação comum)
“Não dissociado” tem carga positiva e “dissociado” é sem carga? (é uma outra combinação
comum)
Tem uma outra combinação? (pode acontecer!)

3. Some as frações.

Se todos os grupos carregados da molécula são “totalmente carregados”, é bem simples calcular a
carga líquida total. Por exemplo, qual é a carga líquida total da glicina em pH 7?
Glicina tem dois grupos dissociáveis
• −COOH → −COO- pKa1 = 2,34 pH 7 é mais do que duas unidades acima deste pKa,
portanto, este grupo vai ser 100% dissociado. O grupo carboxila vai contribuir, então, uma
carga de –1 à molécula
• −NH3+ → −NH2 pKa2= 9,60 pH 7 é mais do que duas unidades abaixo deste pKa,
portanto, este grupo vai ser 100% não dissociado. O grupo amino vai contribuir, então, uma
carga de +1 à molécula
A carga líquida total da glicina em pH 7 é igual à soma destas contribuições (porque a glicina tem
um grupo carboxila e um grupo amino) = (-1) + (+1) = 0

18
Exemplo – quando uma ou mais grupos é parcialmente carregado
H
Questão
H2N C COOH
Tirosina tem três grupos ionizáveis. Qual é a sua carga
líquida total em pH 9,5? H2C
pKa1 = 2,20 forma sem
pKa2 = 9,11 carga de
pKaR = 10,07 tirosina
(não arredonda demais! A resposta tem que ser correta até
a segunda casa decimal!)
OH
Elaboração da resposta
Primeiro, a determinação dos valores de F para cada grupo.

Grupo -carboxila: –COOH → –COO- pKa1 = 2,20.

pH 9,5 é mais do que 2 unidades acima deste pKa, então, o grupo COOH vai ser totalmente
dissociado (F=1)

Grupo -amino: –NH3+ → –NH2 pKa2 = 9,11

1 1 1 1
𝐹= = = = = 0,71
10𝑝𝐾𝑎−𝑝𝐻 +1 109,11−9,5 +1 10−0,39 +1 0,41 + 1

Grupo R: –OH → –O- pKaR = 10,07

1 1 1 1
𝐹= = = = = 0,21
10𝑝𝐾𝑎−𝑝𝐻 + 1 1010,07−9,5 + 1 100,57 + 1 3,715 + 1

Um quadro para resumir as informações e ajudar no cálculo (vai ter uma linha na tabela para cada
grupo dissociável)

Grupo 1-F CN F CD Carga

Escreva (fração não (Carga do (fração (Carga do líquida
“ácido → base + H+” dissociado) grupo não dissociado) grupo do grupo
ou seja dissociado) dissociado)
“não dissoc → dissoc”
–COOH → –COO– + H+ 0 0 1,0 -1 -1
–NH3+ → –NH2 + H+ 1-0,71 = 0,29 +1 0,71 0 +0,29
–OH → –O– + H+ 1-0,21 = 0,79 0 0,21 -1 -0,21
CARGA LÍQUIDA TOTAL -0,92

Carga líquida total = [(1 – F)CN + (F CD)]

Com os dados na tabela, o cálculo simplifica para (1-1) + (0,29+1) + (0,21-1) = -0,92
1a linha 2a linha 3a linha

Interpretação da resposta
A carga líquida de tirosina em pH 9,5 é –0,92. Tome cuidado na interpretação deste resultado: isto não quer dizer
que sempre cada molécula de tirosina na solução tem uma carga de –0,92. Nós estamos falando de um equilíbrio
dinâmico.
• Em um dado instante, uma molécula de tirosina pode ter carga +1, 0, –1 ou –2. Só que, se nós
conseguimos “congelar o sistema” em um dado instante, nós acharíamos muito poucas moléculas na
forma que dá uma carga global de “+1”, poucas moléculas nas formas que dão uma carga global de “0”,

19
 um número relativamente grande nas formas que dão uma carga global de “–1” e um número
intermediário na forma que dá uma carga global de –2. Se nós fizemos uma média das cargas de todas as
moléculas de tirosina presente na população naquele instante, o resultado daria “–0,92”!
• Outra maneira de dizer a mesma coisa – se conseguíssemos rastrear uma dada molécula de tirosina ao
longo do tempo, nós veríamos esta molécula em todas as formas possíveis. Só que, muito raramente esta
molécula estaria na forma que dá uma carga global de “+1”. Raramente esta molécula estaria em uma das
formas que dá uma carga global de “0”. Relativamente frequentemente esta molécula estaria em uma das
formas que dá uma carga global de “–1”. Muito raramente, esta molécula estaria na forma que dá uma
carga global de “–2”. Se nós fizemos uma média ao longo do tempo, com cada forma ponderada pelo
tempo que a molécula fica naquela forma, o resultado daria “–0,92”!

Resumindo – O roteiro para calcular a carga líquida de uma molécula

(1) Monte a tabela – vai ter uma linha para cada grupo dissociável da molécula

(2) Para a carga líquida de cada grupo (ou seja, para cada linha), calcule
“fração do grupo que fica não dissociado  carga do grupo quando não dissociado
+ fração que fica dissociado  carga do grupo quando dissociado”

em outras palavras, calcule

“(1-F)  carga do grupo quando não dissociado + F  carga do grupo quando dissociado”

O cálculo comumente simplifica, porque é bem comum que uma das formas (ou a forma não dissociada, ou a
forma dissociada) na linha não tenha carga.

(3) No final, some os resultados (a carga líquida total da molécula é a soma das cargas líquidas dos grupos
individuais)

20
QUESTÕES PARA TESTAR A APRENDIZAGEM: “ÁGUA, pH E TAMPÕES EM SISTEMAS
BIOLÓGICOS”

Questão 1
O aminoácido histidina tem três grupos funcionais ionizáveis. Desenhe a curva de titulação deste aminoácido
com NaOH. Não esqueça de preencher os números apropriados no eixo-X. Um equivalente de NaOH é a
quantidade de NaOH necessária para titular um grupo dissociável.
12
H 11
pKa3 =9,17 pKa1 =1,82 10
H2N C COOH 9
8
H2C
pH 7
6
C 5
HC NH 4
3
N CH
2
histidina 1
pKa2 = 6,00
0

equivalentes de NaOH
Questão 2
Durante a disciplina, vai ser 1,0
necessário saber o grau de 0,9
dissociação de grupos
grau de dissociação do

0,8
funcionais ionizáveis como
grupo (ou seja, F)

função do pH do meio. No 0,7

gráfico ao lado, plote as curvas 0,6
de grau de dissociação para os
0,5
três grupos funcionais de
histidina (veja Q1): o grupo 0,4
-carboxila, o grupo imidazol 0,3
(a cadeia lateral) e o grupo -
0,2
amino. Não esqueça de
preencher os números 0,1
apropriados no eixo-X. 0

pH
Questão 3
Qual é a carga líquida de histidina em pH 7? (Mostre todos os cálculos)
Questão 4
O pKa de ácido acético é 4,74. Você adiciona 0,02 mol CH3COONa e 0,08 mol CH3COOH para 900 mL de
água pura e depois você completa o volume para 1 litro (com água pura). Quais são as concentrações de
CH3COOH e CH3COO- no equilíbrio? Como você chegou a estas concentrações? Você fez uma aproximação,
simplificação ou pressuposto para chegar nestes valores para estas concentrações? Se sim, explique. Qual é o
pH desta solução tampão? T = 25°C.
Questão 5 (trabalhe em grupo – divida os cálculos entre os membros do grupo)
T = 25°C. O pKa de ácido acético é 4,74. Calcule o pH das seguintes soluções aquosas que contêm
(a) 0,9 mol/L de ácido acético (CH3COOH) e 0,6 mol/L de acetato de sódio (CH3COONa).
(b) 0,09 mol/L de ácido acético (CH3COOH) e 0,06 mol/L de acetato de sódio (CH3COONa).
(c) 0,009 mol/L de ácido acético (CH3COOH) e 0,006 mol/L de acetato de sódio (CH3COONa).
(d) Qual conclusão você pode tirar dos resultados das partes (a), (b) e (c)?

21
Questão 6 (trabalhe em grupo – divida os cálculos entre os membros do grupo)
T = 25°C. Calcule a variação de pH que ocorre quando se adiciona (onde “questão anterior” = “Questão 5”)
(a) 0,005 mol de HCl em 1 litro de H2O
(b) 0,005 mol de HCl em 1 litro de solução tampão (a) da questão anterior
(c) 0,005 mol de HCl em 1 litro de solução tampão (b) da questão anterior
(d) 0,005 mol de HCl em 1 litro de solução tampão (c) da questão anterior (tome cuidado com a precisão!)
(e) 0,05 mol de HCl em 1 litro de solução tampão (a) da questão anterior
(f) 0,5 mol de HCl em 1 litro de solução tampão (a) da questão anterior
(g) 1,0 mol de HCl em 1 litro de solução tampão (a) da questão anterior
(h) Comente nos resultados!
Questão 7
T = 25°C. O aminoácido glicina é frequentemente usado em experimentos bioquímicos como o principal
ingrediente de um tampão. O grupo amino da glicina, que possui um pKa de 9,6, pode existir quer na forma
protonada (–OOC-CH2-NH3+), quer na forma de base (–OOC-CH2-NH2) segundo o equilíbrio
–
OOC-CH2-NH3+  –OOC-CH2-NH2 + H+
(a) Em que região de pH a glicina pode ser usada como um tampão efetivo graças ao seu grupo amino?
(b) Em uma solução 0,1 M de glicina pH 9,0, que fração de glicina possui seu grupo amino na forma -NH3+?
(c) Qual volume de KOH 5,0 M deve ser adicionado a 1,0 litro de glicina 0,1 M em pH 9,0, para trazer o pH
para exatamente para o valor de 10,0?
(d) A fim de ter 99% de glicina na forma em que seu grupo amino esteja protonado, qual deve ser a relação
numérica entre o pH da solução e o pKa do grupo amino da glicina?
Questão 8
Uma quantidade de 0,1 mol de ácido glutâmico foi adicionada a 1 L de água pura e o pH foi ajustado para pH 3
com NaOH (uma solução suficientemente concentrada de NaOH que a mudança no volume da solução foi
desprezível). Depois, “certo volume” de uma solução de 0,2 mol L-1 de KOH foi adicionado para levar o pH
para 5. Durante o experimento inteiro, T = 25°C. Qual foi o “certo volume” de KOH que foi adicionado para
mudar o pH de 3 para 5? Dica: Pense muito, muito cuidadosamente sobre a estratégia apropriada para
resolver esta pergunta antes de começar os cálculos. A questão não é difícil, mas é muito fácil se perder!!!
Questão 9
Ácido benzoico (pKa 4,2) é mais do que 100 vezes mais efetivo como um agente antimicrobiano em pH 5,0 do
que em pH 8,0. Explique. Baseia sua explicação em cálculos.

Questão 10
O que quer dizer “anfipática”? Qual é a forma mais estável para uma solução aquosa de uma molécula
anfipática?

Questão 11
As interações fracas são 1 a 2 ordens de grandeza mais fracas do que as ligações covalentes. Como pode ser
que elas são tão importantes nas estruturas 3D das várias biomoléculas, especialmente macromoléculas como
proteínas e ácidos nucleicos?

Questão 12
Discute o tópico de “lipídeos em sistemas aquosos”. Com a base dada pelo capítulo, quais seriam as
características e propriedades de membranas biológicas? (atenção: vamos ver este tópico em mais profundidade
mais tarde na disciplina).

Questão 13
“O Lehninger” (ou seja, o livro de Nelson e Cox) fala que a adição de solutos hidrofóbicos à água pode
“resultar em um pequeno ganho de entalpia; a quebra de ligações de hidrogênio entre as moléculas de água
retira energia do sistema”. Talvez não seja bem claro o que ele quer dizer. Explique claramente o que ele quer
dizer com a parte sublinhada da frase.

22