PRÁTICA 6: Preparo e esterilização de meios de cultura

I. INTRODUÇÃO

Os microrganismos tais como outros organismos vivos necessitam de obter os

nutrientes apropriados do seu meio ambiente. Assim se queremos cultivar e manter
microrganismos vivos em laboratório, necessitamos de colocá-los em meios de cultura,
contendo os nutrientes apropriados para o seu crescimento.

Os meios de cultura dividem-se primeiramente em meios sólidos, aqueles que

contêm ágar (agente solidificante), e meios líquidos, sem ágar. Ambos os meios são
preparados com água destilada, aquecidos até que se dissolvam completamente e
posteriormente esterilizados por autoclavagem a 121ºC (calor úmido).

O Agar possui a propriedade de fundir a 96ºC e solidificar a 45ºC. Isto mostra sua
capacidade de suportar temperaturas mais elevadas de incubações.

Nos meios sólidos o crescimento pára por exaustão de nutrientes, devendo realizar-
se a transferência de colônias para novo meio. No entanto estes meios permitem a
individualização das colônias. Os meios líquidos permitem melhor difusão de metabólitos,
mas não o isolamento de colônias.

Após autoclavagem, os meios sólidos vertem-se em placas de petri de forma a

cobrir uniformemente o fundo da placa e após solidificação podem ser utilizados. Os
meios sólidos podem também ser vertidos em tubos de ensaio de vidro. Os meios líquidos
são mantidos em tubos de ensaio de vidro (os meios ditos sólidos estão líquidos quando
saem da autoclave e solidificam após o resfriamento).

Algumas denominações especiais dos meios de cultura relacionadas à sua

composição ou função são:

• Meio Mínimo: é sintético e fornece somente os nutrientes essenciais ao

desenvolvimento da célula;
• Meio diferencial: contém substâncias químicas mais complexas e permite
diferenciar os microrganismos quanto a seu crescimento e/ou morfologia;
• Meio de enriquecimento: favorece o crescimento de determinada população,
enquanto o
• Meio seletivo: inibe o crescimento de determinada população.

Esterilização é o processo de destruir ou eliminar todas as formas vivas presentes em

um material ou ambiente. A esterilização pode ser realizada pelo calor, radiação,
filtração e agentes químicos. Esses processos destroem células microbianas numa
progressão geométrica, portanto quanto menor a população inicial mais eficiente é a
esterilização.

II. Objetivos

• Preparar os meios de cultura: caldo nutriente e Agar nutriente;

• Mostrar o procedimento de esterilização em autoclave (calor úmido) dos meios de
cultura.

III. Materiais
 • Reagentes: Na2HPO4 (monoidrogenofosfato de sódio), NaCl, extrato de carne,
peptona (proteínas que têm sido parcialmente degradadas, tais como o hidrolisado
de caseína do leite e hidrolisado de proteínas de soja); água destilada.
• Equipamentos e utensílios: espátulas, vidrarias (pipetas, provetas, Beckers, bastão
de vidro, Erlenmeyers, tampões de algodão), filtro Milipore, autoclave.

IV. Procedimento

Preparo De Meios De Cultura

A técnica empregada para reidratar os meios desidratados tem decisiva
importância na obtenção de um meio de boa qualidade. De maneira geral, convém:

Caldos – meios líquidos

1. Pese, isoladamente, nos Beckers, os componentes do meio de cultura para o

volume final de 100mL de caldo nutrientes:

COMPOSIÇÃO QUANTIDADE
Na2HPO4 0,2 g
NaCl 0,3 g
Extrato de carne 0,3 g
Peptona 0,5 g
Água destilada 100 mL

2. Dissolver o meio (quantidade especificada pelo fabricante e conforme a

necessidade de uso) ou os componentes acima, apenas numa parte do volume
total de água destilada em um Becker;
3. Homogeneizar, evitando a formação de bolhas e de espuma, utilizando bastão de
vidro;
4. Transferir para um Erlenmeyer e adicionar o restante da água destilada (até
100mL), lavando as paredes do recipiente;
5. Transfira 50mL desta mistura para um outro Erlenmeyer, obtendo assim 2 volumes
de 50mL de caldo nutriente.
6. Acondicionar corretamente um dos frascos e levar à esterilização em autoclave.
7. Com o outro Erlenmeyer de 50mL faça os passos que se seguem.

Meios Solidificados

A formulação do meio sólido é a mesma do caldo nutriente, porém acrescenta-se o

Agar nutriente (Agar-ágar) a 1,5% (p/v) ou seja, 1,5g para 100mL de meio. Veja os passos
a seguir:

1. Adicione a um dos Erlenmeyers contendo 50mL de caldo nutriente 0,75g de Agar

(quantidade para obter uma concentração de 1,5% (p/v).

Esterilização dos meios de cultura:

1. Complete o nível de água da autoclave;

2. Introduza o material a ser esterilizado na autoclave;
3. Feche a autoclave conforme recomendação do fabricante;
4. Inicie o aquecimento;
 5. Abra a válvula de equalização para remoção de ar, o que se garante deixando o
vapor sair continuamente por 5 minutos, assim obtemos vapor saturado;
6. Feche a válvula de equalização;
7. Verifique pelo manômetro, a elevação da pressão da autoclave. Após atingir 15
lb/pol2 , comece a contar o tempo de esterilização que será de 15 minutos;
8. Terminado o tempo de esterilização, desligue o aquecimento e espere a
autoclave esfriar até que o manômetro alcance o valor zero, só então abra a
tampa da autoclave. Os meios que contêm Agar devem ser misturados na saída
da autoclave para garantir a completa dissolução e homogeneização dos
mesmos.

V. Resultados

Construa um infográfico, iniciando com o preparo do meio, incluindo a esterilização e

terminando com a distribuição do Agar em placas, após sua saída da autoclave.
Mencione detalhadamente todos os cuidados para que seu material não se contamine.