Unidade Didáctica 2: Detecção, identificação e quantificação de

proteínas monoclonais. Interferências analíticas

2. Introdução

Para o estudo das gamopatias monoclonais, a participação do especialista de laboratório

é fundamental, especialmente para a detecção, quantificação e identificação do
componente monoclonal (MC) no soro e na urina. Pode considerar-se que o MC é o que
mais se aproxima de um marcador tumoral ideal, uma vez que podemos ver e quantificar
uma concentração anormal de proteínas, o que nos dará informações muito
importantes sobre a doença, o que permitirá o seu diagnóstico correcto, conhecer o seu
prognóstico e monitorizar a doença ao longo do tempo para estabelecer a eficácia dos
tratamentos.
3. índice. Requisitos laboratoriais

3.1 Fase pré-analítica

3.2 Fase analítica

3.2.1 Quantificação da proteína monoclonal

3.2.2 Identificação da proteína monoclonal

3.3 Fase pós-analítica

• 3. 1 Fase Pré-Analítica

Para o estudo correcto do GM, será necessária uma amostra de soro recente ou então será
necessário congelar a amostra para manter a integridade das proteínas. As amostras
hemolisadas e lipémicas devem ser evitadas, pois podem causar interferências que dificultam
as leituras electroforéticas.

Juntamente com o estudo do soro, será necessário efectuar um estudo da urina de 24 horas,
que nos permitirá quantificar e identificar a MC, como será detalhado mais adiante.

• 3. 2 Fase analítica I

Os métodos a utilizar para a detecção de CM serão a electroforese (gel de agarose ou

electroforese capilar (preferencial)) e, para a identificação de CM, a imunotipagem, a
imunofixação (preferencial) ou a imunossubtracção (quando se utiliza a electroforese capilar),
juntamente com a quantificação das proteínas totais (por métodos colorimétricos ou
turbidimétricos).

Na electroforese em gel de agarose, as proteínas plasmáticas do soro são separadas de acordo

com a sua migração diferencial quando sujeitas a um campo eléctrico. As proteínas, carregadas
negativamente num meio alcalino utilizado como tampão, migram quando sujeitas a uma
corrente eléctrica em direcção ao ânodo (eléctrodo positivo). São então separadas em fracções,

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principalmente de acordo com a sua carga e tamanho (albumina, alfa1, alfa2, beta1, beta2 e
fracção gama). Em seguida, são coradas com corantes com afinidade para as proteínas, da
sensibilidade mais elevada para a mais baixa: violeta ácido, azul brilhante de Coomassie e negro
de amido. As fracções serão medidas utilizando um densitómetro que mede a percentagem de
absorção do corante pelas diferentes fracções no suporte sólido. A área da fracção proteica é
integrada e a percentagem de proteínas totais é calculada utilizando um software específico.

• 3. 2 Fase Analítica II

É importante inspeccionar visualmente o gel para verificar se as bandas electroforéticas ao longo

do gel são uniformes, o que dá uma indicação do correcto funcionamento do processo.

No caso da electroforese capilar, a separação das fracções proteicas presentes no soro é

realizada num meio líquido dentro de um tubo capilar de sílica fundida de baixo diâmetro que é
exposto a tensões muito elevadas. A presença de grupos silanol com carga negativa na superfície
do capilar provoca um elevado fluxo electroendosmótico que excede a mobilidade
electroforética, pelo que as proteínas migram para o cátodo (eléctrodo negativo).

Todas as proteínas migram, a ritmos diferentes em função da sua relação carga/tamanho, para
um detector que mede a absorvância da ligação peptídica a 200 nm. A absorvância é
proporcional ao número de ligações peptídicas. A leitura espectrofotométrica é convertida num
sinal gráfico que é visualizado no ecrã de um computador. Esta medição será, por conseguinte,
mais sensível e precisa do que a obtida por electroforese em gel de agarose e será, portanto, o
método preferido para quantificar a CM. (A sensibilidade da electroforese capilar situa-se entre
0,2-0,5 g/L, ao passo que a da electroforese em gel de agarose é próxima de 0,7 g/L).

• 3. 2 Fase analítica III

A electroforese capilar é um método reprodutível, de alta resolução, totalmente automatizado

e rápido. Requer pequenos volumes de amostra e a detecção de proteínas individuais não está
ligada à sua afinidade por corantes.

A electroforese capilar é cada vez mais utilizada nos laboratórios clínicos e está a substituir a
electroforese em gel de agarose na maioria dos grandes hospitais.

A separação electroforética das proteínas plasmáticas no soro é considerada adequada para fins
de diagnóstico quando são cumpridos os requisitos mínimos de qualidade de resolução no perfil
electroforético obtido. Estes requisitos incluem: visualização da banda fraca da pré-albumina,
detecção de determinados estados heterozigóticos da α-1-antitripsina (clivagem da região α-1),
visualização dos dois componentes principais da região da β-globulina (β-1 e β-2), possibilidade
de detectar componentes monoclonais de concentração igual ou inferior a 1 g/L e de identificar
um perfil oligoclonal na região da γ-globulina.

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 • 3. 2 Fase analítica IV

Estes requisitos de qualidade são cumpridos tanto pela electroforese em gel de agarose como
pela electroforese capilar, pelo que ambos os métodos são aceites para a gestão clínica dos
doentes.

Quadro 1. Comparação dos métodos de electroforese e dos critérios de qualidade.

• 3. 2 Fase analítica V

Com base nos dados de variabilidade biológica, foram estabelecidas especificações de qualidade
analítica para a imprecisão das diferentes fracções do proteinograma. Os valores desejáveis de
imprecisão, expressos como coeficientes de variação, para as diferentes fracções são 1,6 % para
a albumina, 5,7 % para as α-1-globulinas, 5,2 % para as α-2-globulinas, 5,1 % para as β-globulinas
e 7,3 % para as γ-globulinas. Para a fracção de albumina, dada a dificuldade em cumprir as
especificações desejáveis, podem ser escolhidas as especificações mínimas (2,3 %).

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Para a medição do componente monoclonal, os dois métodos de electroforese dão resultados
comparáveis, não se observando diferenças clinicamente relevantes. No entanto, para a
monitorização da GM, recomenda-se que seja sempre utilizado o mesmo método.

Utilidade clínica e interpretação do proteinograma:

Classicamente, o proteinograma tem sido utilizado para múltiplas utilizações clínicas; no

entanto, existe actualmente um elevado grau de concordância entre a maioria das sociedades
científicas internacionais de que a utilização do proteinograma deve ser limitada ao diagnóstico,
acompanhamento e monitorização de gamopatias monoclonais, e em todas as outras situações
clínicas deve ser utilizada a medição de proteínas específicas. Da mesma forma, recomenda-se
evitar a sua utilização em situações de fase aguda (inflamação pós-cirúrgica, infecções, etc.) ou
durante a gravidez, pois dificultam a sua interpretação.

As possíveis interferências na interpretação do proteinograma são listadas a seguir:

A utilização crescente de tratamentos à base de imunoglobulinas (principalmente anticorpos

monoclonais do isótipo IgG, tais como Daratumumab, Isatuximab, Elotuzumab, etc.) coloca uma
dificuldade acrescida na interpretação do proteinograma, uma vez que podem ser detectados
no traçado electroforético como pequenas bandas monoclonais quando a sua concentração
sérica é próxima de 1 g/L. Este aspecto será abordado mais pormenorizadamente na unidade 4.

• 3. 2 Fase analítica VI

Para a correcta interpretação do proteinograma será necessário fornecer um mínimo de

informação sobre o diagnóstico suspeito, e os resultados do proteinograma devem ser
interpretados em conjunto com o resto dos resultados analíticos actuais e históricos do
paciente. De seguida, descrevem-se algumas alterações que podem ser encontradas no perfil
do proteinograma:

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Figura 1. Alteraciones en fracción albúmina.

Figura 2. Alteraciones en fracción alfa 1.

Figura 3. Alteraciones en fracción alfa 2.

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Figura 4. Alteraciones en beta.

Figura 5. Alteraciones a nivel de gamma.

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A presença de CM situa-se habitualmente na zona gama, embora também se possa observar em
alfa1, alfa2 ou beta (especialmente nos isótipos de Ig A), o que dificulta a sua quantificação.
Deve prestar-se especial atenção às elevações da fracção beta, verificando o resto dos exames
laboratoriais do doente (níveis normais de transferrina e complemento C3) e, se houver suspeita
de gamopatia, deve realizar-se uma imunofixação.

A atitude pró-activa do analista é de especial importância também no caso de detectar

diminuições acentuadas da fracção alfa1, onde seria indicado acrescentar a quantificação da
alfa1-antitripsina.

O perfil OLIGOCLONAL é identificado quando aparecem 3 ou mais bandas pequenas, compostas

principalmente por imunoglobulinas Ig G-Kappa e pode corresponder a: auto-anticorpos,
anticorpos contra proteínas virais, resposta auto-imune em doentes transplantados sob
tratamento imunossupressor, mesmo em indivíduos saudáveis que reflectem resposta
imunitária (1-5%). Este perfil é frequente em doentes com mieloma transplantado (10-70%), e
os doentes em tratamento com os novos fármacos também podem gerar esta resposta, que é
perceptível no proteinograma e é considerada de bom prognóstico. É importante não confundir
com uma possível recidiva, uma vez que as bandas são diferentes do CM original, pelo que o
perfil observado deve ser monitorizado de perto.

3.2.1 Quantificação da proteína monoclonal

O melhor método para monitorizar um doente com Gamopatia Monoclonal será através de
medições seriadas da sua MC, uma vez que será o parâmetro que melhor reflecte as alterações
do estado de saúde do doente, já que apresenta a menor variação biológica (7,8% CV biológico)
relativamente a outros parâmetros como Igs (12,3% CV biológico) ou FLCs (27,8% CV biológico).

Para medir o CM, a área sob a curva do pico correspondente à proteína monoclonal é delimitada
no gráfico do proteinograma, seleccionando até à linha de base (medição perpendicular) ou
apenas a parte superior da curva acima da fracção policlonal (medição longitudinal ou
tangencial, que é realizada automaticamente pelo software). É desejável que isto seja feito
sempre da mesma forma para garantir medições exactas e uma monitorização adequada.
Quando a MC migra numa zona diferente da gama (especialmente na zona beta), a medição da
proteína monoclonal será imprecisa e sobrestimada pela presença de outras proteínas
altamente concentradas que migram nessa zona (transferrina e complemento C3). Nestas
situações, a medição do CM longitudinalmente ou tangencialmente (i.e. paralela à linha de base)
pode dar resultados mais próximos dos reais, mas há que ter o cuidado de medir sempre da
mesma forma no seguimento dos doentes, pois a proteína monoclonal migrará sempre na
mesma zona.

Apenas em situações em que a MC é mascarada por outras bandas (como na zona beta), seria
adequado fazer o seguimento através da quantificação de Igs, frequentemente Ig A (como neste
caso, tanto a Ig monoclonal como a policlonal são quantificadas).

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A medição exacta da MC será de grande importância na gestão clínica do doente, uma vez que
definirá os critérios de resposta ao tratamento, bem como a identificação de recaídas, como
será discutido no próximo tópico. Alguns autores propuseram o cálculo do valor de referência
de mudança (RCV%) da MC para detectar com maior precisão e precocidade estas alterações
(considerando assim a variação biológica juntamente com a variação analítica). Assim, Katzmann
et al. calcularam este valor em doentes com gamopatia estável e obtiveram RCV 20,1% (p=0,95),
o que seria considerado a alteração mínima para ser significativa. Outros autores, como
Salamatmanesh et al, obtiveram valores mais elevados para RCV (27,5%, P=0,95), chegando a
36,7% (em baixa concentração de CM) e 39,6% (em concentração mais elevada de CM). Estes
dados dependem da metodologia utilizada (CV analítico) e, por conseguinte, devem ser
calculados em cada laboratório específico, o que poderia fornecer informações muito mais
completas ao relatório do proteinograma.

Nos últimos anos, está a ser desenvolvida a quantificação da MC por espectrometria de massa.
Esta técnica é altamente sensível e específica, o que promete mudar completamente a forma
como as proteínas são caracterizadas e medidas. M. Mills et al. demonstraram que a
cromatografia líquida de microfluxo utilizada em conjunto com a ionização por electrospray e a
espectrometria de massa quadrupolar de tempo de voo podia detectar relações carga-massa
únicas para identificar e medir as proteínas M. A tecnologia miRAMM tem um limite de detecção
de cerca de 0,005 g/L de proteínas M, muito inferior ao da imunofixação e muito inferior ao da
electroforese de proteínas séricas. Este facto faz com que a sensibilidade requintada deste
método possa ser a melhor forma de detectar a doença residual mínima.

Schroeder et al. propuseram recentemente um método alternativo para estas situações em que
a MC migra na zona beta, que consistiria em quantificar a fracção correspondente por
electroforese capilar e calcular a diferença após a imunossubtracção, correspondendo esta
diferença à concentração da MC.

Figura 6: Método de purificação e preparação de imunoglobulinas, seguido de cromatografia

líquida de microfluxo e ionização por electrospray com espectrometria de massa de tempo de
voo quadrupolar. Na fase reduzida e enriquecida, são purificadas as cadeias leves. A proteína
monoclonal é representada pelo grande pico único observado no painel inferior esquerdo na
região λ. Este método foi designado por "medição rápida e exacta da massa de imunoglobulina

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monoclonal" (miRAMM). Imagem adaptada de Detecting monoclonal immunoglobulins in
human serum using mass spectrometry. Methods 2015;81:56-65.

Actualmente, o equipamento de medição disponível ainda não é muito prático para analisar um
grande número de amostras, mas, nos próximos anos, os fabricantes farão certamente um
esforço para desenvolver esta tecnologia com um rendimento rápido e eficiente, uma vez que é
a que dará as medições mais precisas da proteína M a baixas concentrações.

3.2.2 Identificação de proteínas monoclonais

A imunofixação (IFE) será o método de referência para a confirmação de qualquer componente

detectado na electroforese. Consiste na identificação da cadeia pesada e/ou da cadeia ligeira da
MC através de anticorpos específicos (contra as cadeias pesadas G,A,M,D,E, cadeias ligeiras
Kappa e Lambda) e subsequente coloração (negro de amida, violeta ácido). O método de
imunotipagem correspondente à electroforese capilar é a imunossubtracção (em que se observa
o desaparecimento da CM durante o processo), mas muito semelhante à IFE em termos de
desempenho, embora careça de anticorpos Ig D e Ig E, com a vantagem da automatização
completa de todo o processo e da sua rapidez.

A IFE deve ser realizada em casos de hipogamaglobulinemia se houver suspeita de uma

gamopatia, como ocorre frequentemente no MM de cadeia leve, ou se houver suspeita clínica
de MM ou de discrasia plasmocitária, mesmo que a electroforese seja normal. Se existir um
componente monoclonal no proteinograma com IF negativo ou apenas positivo para a cadeia
leve, deve suspeitar-se de MM de cadeia leve ou MMIgD ou IgE. Neste caso, deve ser efectuada
primeiro a imunofixação para as cadeias leves "livres" kappa e Lambda, uma vez que esta é a
mais frequente, e para a cadeia pesada IgD ou IgE, e só se for positiva é que a IgD ou IgE deve
ser quantificada posteriormente por nefelometria (esta abordagem elimina a necessidade de
quantificar a IgD ou IgE em todas as circunstâncias).

Algumas dificuldades que podem ser encontradas na interpretação do IFE são, por exemplo, a
polimerização de Igs, como no exemplo em anexo:

Figura 7. Ejemplos de polimerización de inmunoglobulinas.

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O estudo da urina será necessário sempre que for detectada uma gamopatia monoclonal e será
um exame complementar ao estudo do soro, sendo incluído dentro dos critérios de resposta ao
tratamento como será visto no tópico seguinte. O objectivo principal é a detecção de proteinúria
de Bence-Jones, que são proteínas compostas por cadeias leves livres monoclonais ou seus
fragmentos, capazes de produzir alteração renal em diferentes níveis. É detectada em até 80%
dos doentes com MM e, em até 20% dos casos, será a única CM detectada (cadeias leves do
MM). Será também essencial detectar a "fuga de cadeias leves" que podemos encontrar
frequentemente após o tratamento do MM e que consiste na identificação de uma cadeia leve
monoclonal na urina, diferente da patológica, devido à incapacidade do tumor para sintetizar a
cadeia pesada original, e que seria então uma progressão ou recaída da doença.

O tipo de amostra recomendado seria a urina de 24 horas, embora algumas directrizes também
permitam amostras de urina simples. A electroforese tem uma sensibilidade de 100 mg/L,
podendo utilizar-se tanto a electroforese em gel de agarose (utilizando os corantes mais
sensíveis) como a electroforese capilar, que, para além de quantificar a CM, nos permitirá definir
o tipo de proteinúria. Como critério de sensibilidade, deve ter-se em conta que a banda
correspondente à albumina deve ser observada e, se tal não acontecer, será necessário
concentrar a urina e repetir o processo. Para a quantificação da MC, proceder da mesma forma
que para o soro, delimitando a área correspondente no gráfico e expressando os resultados em
relação à proteína total (a quantidade total de MC na amostra de urina é então calculada para
avaliar os critérios de resposta do IMGW em mg/24 horas).

Para a identificação da MC, o método padrão de ouro recomendado é a imunofixação, que tem
uma sensibilidade de cerca de 10 mg/L.

• 3.3 Fase pós-analítica

No relatório do laboratório, é aconselhável incluir as seguintes secções:

- Fracções: albumina, alfa1, alfa2, beta (beta 1 e beta 2), gama e relação albumina/globulina.

- Se for identificada uma MC, esta deve ser expressa em g/L, indicando a fracção em que é
identificada e os resultados anteriores, caso se trate de um seguimento.

- As fracções devem apresentar os valores de referência e, adicionalmente, pode ser

acrescentada a percentagem em relação à concentração total de proteínas.

- As casas decimais podem ser adicionadas conforme apropriado, dependendo da imprecisão

dos métodos (geralmente 1 casa decimal).

- É sempre aconselhável incluir um comentário interpretativo sobre o traçado electroforético,

bem como o gráfico correspondente e quaisquer testes que possam ter sido adicionados para
expandir a informação no proteinograma.

4. Interferências analíticas devidas à proteína monoclonal

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A presença de MC no soro pode causar uma multiplicidade de interferências em testes
analíticos, devido à precipitação da proteína, ao aumento da viscosidade, a interferências
químicas ou ao efeito directo sobre determinados analitos.

Uma das interferências mais frequentes é causada pelo aumento da turvação, especialmente
em MC do tipo Ig M, que pode afectar os métodos turbidimétricos e, em menor grau, os
nefelométricos. São bem conhecidas as falsas reacções de elevação do fósforo devidas à
precipitação de proteínas durante a fase de reacção com o reagente azul de molibdénio. Foi
também observado um efeito sobre a creatinina, que afecta o método Jaffe, com falsas
elevações. Estas interferências podem ser evitadas diluindo adequadamente a amostra para
diminuir a concentração de proteínas.

A medição por potenciometria indirecta, comum nos auto-analisadores, pode provocar uma
falsa hiponatrémia devido à deslocação do volume da fase aquosa provocada pelo excesso de
proteínas e pela diluição da amostra (o que poderia ser evitado utilizando a potenciometria
directa).

A hipervicosidade, devida à presença de crioglobulinas ou à presença de macroglobulinemia de

Waldenstrom, pode também produzir interferências diferentes.

Foi também descrita uma pseudo-hiperfosfatemia devido à capacidade da proteína monoclonal

para se ligar a substratos, incluindo iões como o fósforo. Um fenómeno semelhante pode
ocorrer com a pseudo-hipercalcemia e, neste caso, pode ser testado através da medição do
cálcio iónico.

Também foram descritas macroenzimas, muitas vezes por Ig G monoclonal, que podem afectar
diferentes metabolitos e hormonas, pelo que se deve estar atento a resultados inconsistentes
sempre que a CM esteja presente.

5. Resumo
Para o estudo completo da gamopatia monoclonal, devem ser utilizadas amostras recentes de
soro e de urina de 24 horas. A electroforese capilar é recomendada para a detecção e
quantificação da MC. Para a identificação da CM, o padrão de ouro será a imunofixação, tanto
no soro como na urina. O aparecimento de bandas oligoclonais será frequente com os
tratamentos actuais e será necessário segui-las correctamente e não as confundir com o
aparecimento de uma recaída. A presença de proteínas monoclonais pode provocar uma
multiplicidade de interferências analíticas que devem ser monitorizadas na presença de
resultados incongruentes.

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