Observao de Bactrias Fluorescentes Resumo: este trabalho tem como finalidade esclarecer o conceito de tcnica do ADN recombinante e de como

esta permite induzir novas caractersticas fenotpicas em bactrias Escherichia Coli, utilizando como vector, geneticamente modificado atravs de enzimas de restrio, o plasmdeo pGLO; e o gene responsvel pela fluorescncia. Utilizando esta tcnica foi possvel a observao de bactrias fluorescentes quando em contacto com a luz ultravioleta, sendo este o principal objectivo da actividade laboratorial. Esta permitiu, ento, clarificar os seguintes conceitos: Tcnica do ADN Recombinante, Caractersticas Fenotpicas, Bactria, Escherichia Coli, Enzimas de Restrio, pGLO e Gene GFP.

1.

Representao do Plasmdeo recombinante pGLO

Mtodo: Colocou-se, num microtubo, 250l de soluo de transformao (CaCl2) [uma soluo bsica para estabilizar o ADN depois de este estar alterado). Recolheu-se uma pequena poro de Bactrias da espcie Escherichia Coli com uma ansa descartvel e inseriu-se a mesma no microtubo. Identificaram-se, posteriormente os microtubos com +pGLO ou pGLO (o microtubo que continha plasmdeos pGLO foi identificado com um + (=mais), enquanto que os que no continham DNA plasmdico foram identificados com um (=menos)). Recolheu-se uma pelcula de plasmdeos com outra ansa descartvel e inseriu-se os mesmos no microtbulo assinalado com +pGLO. Incubaram-se os microtubos em gelo, aps a devida identificao, durante aproximadamente 5 minutos. Posteriormente os mesmos foram colocados num bloco trmico a 42C durante 1 minuto. Novamente os mesmos foram colocados no gelo durante 2 minuto. Finalmente, adicionou-se 250l de meio LB a cada um dos microtubos e foram deixados temperatura ambiente durante 3 minutos. Agitaram-se os microtubos e adicionaram-se 100 l de cada microtubo s placas de Petri correspondentes. Dispersou-se uniformemente com uma ansa esterilizada. Incubaram-se as placas de Petri em posio invertida, a 37C durante 12 horas. Observaram-se as placas de Petri sob a luz ultravioleta. Resultados:

Discusso de resultados: aps observao dos resultados, podemos afirmar que o nico meio de cultura em que os genes presentes no plasmdeo recombinante se expressam na totalidade o que constitudo por LB (meio nutritivo), Ampicilina e Arabinose. Foi possvel observar que, no seu genoma natural, as Escherichia Coli , no possuem o gene que lhes confere resistncia Ampicilina, sendo que na caixa de Petri que continha meio nutritivo LB e Ampicilina no se verificou alterao no crescimento. Como no meio de cultivo que apenas continha LB se deu crescimento e formao de colnias, a morte da outra montagem ter sido, inequivocamente, devida presena de Ampicilina no meio. Por outro lado, ambas as montagens que continham as clulas modificadas, tinham presente Ampicilina, e em ambas se verificou o crescimento populacional das bactrias, formando colnias. Estes resultados permitem concluir que as bactrias modificadas atravs da incorporao do plasmdeo pGLO adquirem resistncia Ampicilina. A ltima observao feita das caixas de Petri precisamente a expresso, ou no, do gene GFP. No se esperava que nenhum dos meios que contm as bactrias no modificadas evidenciasse fluorescncia, e assim se verificou. No entanto, ambos os meios com bactrias modificadas, ou seja, portadoras no plasmdeo recombinante pGLO, dariam resposta s hipteses propostas anteriormente. A nica diferena entre os dois meios era a presena ou ausncia de Arabinose. Ao serem observadas luz ultravioleta, verificou-se que apenas o meio que continha Arabinose emitia fluorescncia. Isto veio provar outro facto: a expresso do gene GFP depende do opero Arabinose. Se este ltimo for transcrito (arabinose presente no meio) o gene GFP transcrito e a protena sintetizada conferindo Escherichia Coli uma fluorescncia esverdeada que no caracterstica do seu genoma natural; no caso de este opero no ser transcrito (ausncia de arabinose no meio) o gene GFP tambm no o , no havendo sntese da GFP. Desta forma as bactrias no emitem fluorescncia.

Concluso: Conclui-se que a tcnica do DNA recombinante muito utilizada em engenharia gentica para possibilitar a criao de novos fentipos numa determinada espcie. Aps todo o estudo das bactrias, e usando esta tcnica, formularam-se duas hipteses: - As bactrias geneticamente modificadas, ou seja, que incorporaram o plasmdeo recombinante, emitem fluorescncia quando observadas luz Ultra Violeta se estiverem na presena de Arabinose; expostas ao antibitico (Ampicilina), estas bactrias sobrevivem. - As bactrias que no foram postas em contacto com o plasmdeo recombinante, no o incorporaram, logo no sobrevivero em meios de cultura onde esteja presente o antibitico Ampicilina. Da mesma forma, no apresentaro fluorescncia devido ausncia do GFP.

Nota: os passos marcados a cinzento no foram possveis de serem feitos. 3