Seminário II - Preparo de amostras para análise proteômica

Para analisar completamente todas as proteínas intracelulares, as células devem

ser efetivamente rompidas. A escolha do método de ruptura depende se a amostra é
derivada de suspensões de células, tecido sólido ou outro material biológico e se a análise
visa todas as proteínas ou apenas uma fração subcelular específica.
No processo de ruptura celular, as células devem ser efetivamente rompidas.
Deve ser realizado em baixas temperaturas em contato com solução fortemente
desnaturante (proteção à proteólise). Os métodos são:
• Método de lise suave: são geralmente empregados quando a amostra de interesse
consiste em células facilmente lisadas (como células de cultura de tecidos, células
sanguíneas e alguns microrganismos). Podem ser empregados lise osmótica, lise
congelar-descongelar, lise detergente e lise enzimática.
• Método de lise mais vigorosos: são empregados quando as células são menos
facilmente rompidas, ou seja, células mais resistentes. Resultarão em ruptura
completa das células. Podem ser empregados sonicação, célula de pressão
francesa, moagem, homogeneização mecânica e homogeneização de esferas de
vidro.
Quando as células são lisadas, as proteases são frequentemente liberadas. A
degradação das proteínas pela ação da protease complica muito a análise portanto devem
ser utilizados inibidores de proteases. Podem ser empregados no processo de preparação
da amostra Tris, carbonato de sódio ou misturas de anfólitos transportadores básicos.
Estudos de proteoma requerem métodos para separação altamente reprodutível
de extratos de proteínas celulares ou teciduais, que pode ser eletroforese 2-D. A vantagem
é que é um método comprovado para separação simultânea de misturas de proteínas
altamente complexas e apresenta resolução alta em relação aos métodos de separação de
proteínas disponíveis. A precipitação de proteínas é uma etapa opcional na preparação de
amostras para eletroforese 2-D. A precipitação é geralmente empregada para separar
seletivamente as proteínas na amostra de espécies contaminantes, como sais, detergentes,
ácidos nucleicos, lipídios, etc., que de outra forma interfeririam no resultado 2-D.