Composição química da célula

Do que as células são compostas?

A substância de maior quantidade numa célula é a água. São 70% de água nas células,
seguidos de 15% de proteínas, 6% de RNA, 4% de micromoléculas e íons, 2% de
polissacarídeos, 2% de fosfolipídeos e porfim, 1% de DNA.

Principais moléculas das células

Açúcares

A unidade mínima de açúcar é o monossacarídeo (CH2On).

Os monossacarídeos podem se juntar formando:

Dissacarídeo - dois monossacarídeos
Oligossacarídeo - mais de dois monossacarídeos
Polissacarídeo - grande quantidade de monossacarídeos juntos

Os açúcares podem ainda serem isômeros. E o que é isômero?

Quando a fórmula química é a mesma mas o arranjo das moléculas é
diferente. Isso torna a função dessas substâncias diferente.
Ex.: Glicose, frutose e galactose.
*Pentoses, hexoses

Lipídeos
Lipídeos são caracterizados por serrem insolúveis em água e pela

presença de longas cadeias de ácidos graxos (não ocorre em todos

os lipídeos, mas serve comoreferência para identificação).

Esse tipo e molécula é o mais eficiente para a reserva energética e

está presente na membrana das células.

 Ácidos nucleicos

São moléculas formadas pela junção de nucleotídeos.

RNA e DNA > se diferem pelo açúcar que os compõem.
DNA - desoxirribose
RNA - ribose

Nucleotídeo X Nuclesídeo

É formado pela junção Base nitrogenada + açúcar

de um nuclesídeo + grupo fosfato

Ex.: Uracila + ribose + 1 fosfato = Uridina monofosfato

Nucleosídeo Nucleotídeo

Proteínas
São polipeptídios formados pela junção de vários aminoácidos.

A produção das proteínas ocorre por meio da transmissão de informações

enviadas pelo DNA, que são traduzidas pelo RNA, que posteriormente obedece
aos comandos de produção do DNA.

Nos aminoácidos há dois terminais que indicam onde está a amina (terminal N)
e a carboxila (terminal C).
 Processo de síntese de uma proteína
I - Estrutura primária
Sequência simples de
aminoácidos
III - Estrutura terciária
Cadeia de aminoácido se enrola
em si mesma. Essa é um das
duas fases mais importantes
para a função da proteína.
II - Estrutura secundária
Conformações folha beta (
rotação sentido anti-horário) e
alfa hélice (rotação sentido
horário)
IV - Estrutura quaternária
Junção de cadeias polipeptídicas
diferentes ou iguais. Há nessa
fase várias conformações. Essa é
a outra estrutura importante
para a função da proteína.
 Cultura de células
É um método utilizado para fazer estudos de células.
Os estudos podem incluir câncer, patógenos intracelulares, fatores de
crescimento, expressões gênicas, cultura de células-tronco e produção de
anticorpos monoclonais.

Etapas para fazer cultura de células

I - Isola o tecido que contém as células que se quer cultivar;

II - Esteriliza superficialmente com 80%etanol ou hipoclorito;

III - Dissocia as células por meio de centrífuga para retirar enzimas como tripsina ou
colagenase. Pode ser necessário levar células dissociadas para fracionamento para
maior especificidade ou pureza;

IV - Por fim, a amostra é levada para meio de cultura.

Na virologia o uso de cultura de células é essencial para multiplicar vírus e é a

técnica mais acessível nessa área. Para não ocorrer contaminação na amostra, a
cultura pode ser feita em fluxo laminar.

Linhagem contínua X Cultura de células primárias

Repetitividade; Não precisa fazer manutenção de
Homogeneidade; meio de cultura;
Salvo exceções, somente células- Uso imediato;
tronco e cancerígenas atingem Células saudáveis são mais
linhagem contínua. adequadas.

> Linhagens contínuas são estabelecidas, em média, dentro de um ano. Deve haver manutenção
semanal do meio de cultura.
 Meio de cultura complexo
Composição química do meio de
cultura já pronta. Nesse caso não se
sabe exatamente quais componentes
químicos estão no meio de cultura.
X Meio de cultura definido
Composição química do meio de
cultura definida substância por
substância. Nesse caso se sabe cada
componente desse meio.
Esse tipo de meio de cultura é mais
caro e tem crescimento celular lento.

Fatores físicos necessários para o crescimento celular

Temperatura - Há temperatura mínima, ótima e máxima. A temperatura ideal para

atingir o ponto ótimo, é a temperatura em que a enzima do organismo específico tem
melhor funcionamento.

pH - O pH ótimo, em geral, é neutro. Mesmo que as células estejam inseridas em um

ambiente ácido ou básico, o interior da célula permanece com o pH neutro.
Por meio de Vermelho fenol é possível identificar nível de pH. Se a coloração for vermelha, o
pH está neutro, e se a coloração ficar amarela o pH está ácido, indicando contaminação.

Atmosfera gasosa - Dependendo da demanda da célula, deve-se ajustar a

concentração de CO2 e O2. Há células aeróbias, microaerófilas, facultativas e
anaeróbias.

Pressão osmótica - Esse fator se refere à concentração de água dentro e fora da

célula.

-Hipotônico: pouca água fora da célula. Causa o rompimento da células.

- Hipertônica: muita água fora da célula. Causa a compressão da célula.
- Isotônica - mesma concentração de água dentro e fora da célula.

Outros fatores de crescimento

Tempo ideal de cada tipo de organismo para dobrar população celular

Esse fato varia de organismo para organismo e das suas respectivas condições
ambientais adequadas.
 Curva de crescimento.

Lag - Fase latente. Ainda não há crescimento, mas as células já estão em preparo para se
dividirem.

Log - Fase de crescimento exponencial. Crescimento celular.

Estacionária - Quantidade de células que crescem é a mesma de células que morrem.

Declínio - Células param de crescer e morrem.

Para continuar uma linhagem, de ve-se interomper a curva antes do declínio.

Como reservar o meio de cultura?

Para conservar células (que não sejam de mamíferos) a curto

prazo, o meio de cultura pode ser colocado em geladeira a - 4ºC.
E para mamíferos, coloca-se nitrogênio líquido a -196ºC.
Outras células para serem conservadas a longo prazo devem ser
colocadas a -80ºC no freezer.
 Fracionamento celular
Método utilizado para separar componentes químicos e organelas celulares

Antes do fracionamento, as células devem ser dispostas em um tampão e

rompidas por masseração, ultrassom ou choque osmótico. O nitrogênio líquido
pode ser usado para o rompimento.
O tampão é usado para preservar a estrutura da célula.

Tipos de fracionamento

Fracionamento por centrifugação

A centrifugação possui várias velocidades. Quanto menos densa a partícula

desejada, maior a velocidade da centrifugação. A velocidade inicial é de 5.000r.p.m.
A partir da velocidade 20.000r.p.m. o processo é de ultracentrifugação.

Ultracentrifugação gradiente

Centrifugação zonal X Centrifugação isopícnica

Essa centrifugação utiliza gradiente Essa centrifugação utiliza cloreto de césio
de sacarose e oferece ao e confere maior pureza para o
componente obtido maior componente desejado.
conservação de uma estrutura. Maior pureza e menor conservação da
estrutura.

Amostra colocada Amostra misturada

sobre o gradiente de com sulfeto de césio.
sacarose.

Centrífuga

Captura com a agulha o Centrífuga

componente desejado
Captura com a agulha o
componente desejado
dispostos no gradiente
de césio.
 Cromatografia
São três modos de fazer cromatografia:
Partição - utiliza um papel ou camada fina. Mergulha a fita em amostra
e a separação dos componentes ocorre por pressão osmótica.

Coluna - na coluna a resina é colocada, seguida da amostra. Os

componentes da amostra se separam pela gravidade ou bomba de
vácuo. Pode ser de troca iônica, de afinidade ou filtração em gel
(depende da característica do alvo).

HPLC - máquina que realiza separação de coluna.

Eletroforese

Essa técnica utiliza uma coluna central e dois tampões sobre a cuba de
eletroforese. Na coluna central, o gel de poliacrilamida é adicionado e
posteriormente, a amostra é adicionada.
No tampão superior há corrente elétrica negativa e no inferior há corrente
elétrica positiva.
O alvo migra em direção ao tampão positivamente carregado.
O alvo desse tipo de fracionamento celular geralmente são proteínas e
ácidos nucleicos.
Para eletroforese de DNA e RNA utiliza-se gel de agarose.
 Microscopia de luz
Técnica de visualização de alvos por meio de microscópio de luz

O microscópio de luz permite a observação de estruturas, organelas e

componentes químicos.
Ele possui uma fonte de luz em sua base.

Estrutura do microscópio de luz

Lente ocular
Lente objetiva
Suporte (p/ amostra)
Lente condensadora
Fonte de luz

A lente objetiva pode ser ampliada em 10X, 20X, 40X ou 100X. Quando
utilizada em 100X, é necessário o uso de óleo de imersão na amostra.

Preparação da amostra para usar microscopia de luz

Fixação Desidratação Inclusão Microtomia

''Solidifica'' a amostra com Seccionamento
Preservar a Substitui a água por
parafina ou resina. da amostra em
estrutura. acetona ou álcool.
Antes do processo de inclusão, resina ou
Utiliza-se álcool, o álcool ou acetona podem ser parafina.
aldeído ou ácido evaporados.
 Contraste de fases X Campo escuro

Dois anéis. Um anel anular entre a fonte Um anel anular entre a fonte de luz e a
de luz e a lente condensadora e um anel lente condensadora.
de fases entre a lente objetiva e a lente
ocular.

Há também os microscópios de fluorescência e confocal. O primeiro possui fonte

de luz ultravioleta e local para a inserção de lâminas, permitindo a identificação dos
alvos por meio de proteínas fluorescentes, e o segundo permite a visualização dos
alvos por meio de vários focos de observação, transformando imagens captadas em
imagens 3D. O microscópio confocal possui ainda fonte de laser.
 Citoquímica
Técnica que estuda células e seus componentes por meio de microscopia

A visualização dos alvos pode ser aprimorada por meio de corantes estratégicos para
suas características.

Como ligar corante na amostra?

O alvo é disposto na lâmina e deve ser translucente ou transparente.

Em seguida, o corante ou fluorocromo é adicionado sobre a amostra, e
se liga ao alvo por ligação iônica, covalente ou por interação de
hidrofobicidade.

Na ligação corante-alvo por força iônica, duas

formas são possíveis:

Azul de Toluidina - Parede celular

Corante catiônico - carga positiva
e se liga ao alvo aniônico.
Hematoxilina - Núcleo

Corante aniônico - carga do

Corante Ponceau - Proteína
corante negativa. Se liga à
alvos de carga positiva.
Fast green - Proteína

Interação de hidrofobicidade
- corante hidrofóbico + alvo Sudan - Lipídeos
hidrofóbico

Ligação covalente - interação

covalente entre alvo e corante. Alta Reação de Feulgen - DNA
especificidade e mais trabalhosa.
PAS lectina - açúcares
 Citoquímica enzimática
Detecta enzimas ativas dentro das células por meio de substrato.
Após inserir substrato na amostra, deve-se ajustar pH, favorecendo a
atividade enzimática.

Ex.: Fosfatase ácida (enzima) tem atividade quando o pH é baixo,

portanto, ajusta o pH do tampão para favorecer essa atividade.

Imunocitoquímica
Detecta antígenos em células por meio de anticorpos específicos
marcados com indicadores.

Microscópio de luz - enzima

Microscópio confocal/laser - fluorocromo

MET - Material eletrodenso

Protocolos para imunocitoquímica

I - Antígeno - Anticorpo + marcador -

Coloração
II - Antígeno - Anticorpo primário -
lavagem - anticorpo secundário +
marcador - coloração
III - Antígeno - antic. primário - proteína
com collóide de ouro - coloração
 Hibridização ''in situ''

Método utilizado para localizar sequências de DNA por meio de sondas

(fitas de DNA sintetizadas que possuem marcação).
Essa técnica pode ocorrer entre ácidos nucleicos.

Técnica FISH - utiliza fluorescência como indicador na sonda.

Permite a detecção de doenças genéticas e anomalias em cromossomos.
 Técnicas imunológicas
Identificam anticorpos ou antígenos por meio de suas afinidades específicas.

Detecção de antígenos e anticorpos específicos para eles.

Quantifica anticorpos e antígenos

Quando infectados por algum antígeno, os organismos acionam o sistema imunológico que produz
anticorpos específicos.
Os anticorpos se ligam ao antígenos e o sistema macrófago é acionado.

O sistema macrófago se alimenta do antígeno e os anticorpos impedem que as partículas do

antígeno façam ligações.

Como são os anticorpos?

Os anticorpos possuem formato Y e possuem uma cadeia pesada e uma cadeia

leve que são unidas por ponte dissulfeto.

Os anticorpos se ligam aos antígenos na região variável.

IgG X IgM
Imunoglobulina tipo G Imunoglobulina tipo M

1 anticorpo sozinho 5 anticorpos unidos em uma unidade

 O que acontece com o IgG e o IgM após a vacinação?

IgM aumenta sua concentração e

reduz após a eliminação do antígeno
IgG aumenta após a vacinação, continua
a aumentar após a eliminação do
antígeno. Posteriormente diminui um
pouco e permanece constante. Na
segunda vacinação é perceptível um
grande aumento na concentração do
anticorpo.

Técnicas para diagnóstico

método que utiliza placa de ELISA.

Elisa -

Pode ser feito de duas maneiras:

DAS ELISA - anticorpo primário - amostra (secreção nasal ou saliva) -

lavagem - anticorpo secundário com indicador - anticorpo prim. se liga
ao antígeno e anticorpo sec. se liga ao ant. prim. - se houver
antígeno ocorre coloração.

Antigen coating ELISA - antígeno - soro humano - anticorpo sec. com

indicador - se houver anticorpo específico no soro, o anticorpo sec.
com indicador reage.

Imunocromatografia - Detecção de antígeno ou anticorpo por meio

da tira de imunocromatografia.
 Western blotting - eletroforese que identifica presença de
antígenos na proteína.

As camadas resultantes da eletroforese são levadas para a membrana de

nitrocelulose. Se houver antígeno na proteína, ele se une aos anticorpos da solução.
Para visualizar se a ligação ocorreu ou não, adiciona-se substrato.

Anticorpo monoclonal X Anticorpo policlonal

Produzido em camundongos. Produzido em coelhos.

Um anticorpo em cada epítopo do antígeno
Técnica biotecnológica que liga anticorpo a
um epítopo do antígeno. Esse método é de Injeta antígeno em animal
extrema importância para tratamento de Colhe sangue do animal
câncer. Purifica os anticorpos policlonais
produzidos
Injeta antígeno em animal
Colhe linfócitos B
Hibridiza linfócito B com mieloma
Cultiva hibridomas
Colho anticorpos monoclonais
produzidos pelos hibridomas
Humaniza para usar em humanos.

Humanização de anticorpo monoclonal

Região variável do anticorpo

monoclonal produzido pelo
hibridoma substitui região
variável de anticorpo
humano.
 Técnicas moleculares
Importante para pesquisas, detecção de doenças genéticas

Sequenciamneto de DNA

Há duas metodologias:

Método Sanger - síntese de fitas de DNA por meio de polimerização

com dideoxirribose.

As fitas são sintetizadas por meio de um DNA molde. As fitas sintetizadas

são marcadas com fluorocromo nos nucleotídeos com dideoxi. Ao final da
polimerização, as fitas são levada para eletroforese.

I - Entre os nucleotídeos, são dispostos nucleotídeos com dideoxi.

II - Com base em um DNA molde, inicia-se a polimerização.

III - Quando a polimerização coloca (ao acaso) um nucleotídeo com

dideoxi, a fita para de crescer. E assim várias fitas vão se formando.

IV - Ao fim da polimerização, as fitas são levadas para a eletroforese com

o gel de poliacrilamida e são separadas por tamanho.

V - O resultado da eletroforese é levado para a leitora de

fluorescência, que mostra os resultados da sequência obtida.

O sequenciamneto de DNA também é feito pelo Next Generation

Sequencing.
 PCR

Método que faz cópias de trechos de sequências de DNA.

Importância para estudos genéticos, detecção de vírus, genotipagem,
clonagem e sequenciamento de DNA.
O PRC utiliza enzima Taq.

I - ocorre a desnaturação do DNA a 90ºC - 30 seg

II - anelamento a 50ºC a 60ºc - 30 seg
III - polimerização 72ºC 1 min por kb
Esse procedimento deve ser repetido 35 vezes

Clonagem molecular

Para clonar uma molécula deve-se:

Prepara DNA alvo - pode precisar purificar
Prepara vetor plasmidial
Ajusta extremidades para se tornarem compatíveis (DNA e plasmídeo)
Liga plasmídeo e DNA
Injeta DNA alterado no organismo
Cultiva organismo
Extrai plasmídeo alterado
 Após transformação, pode-se obter três resultados:

Célula sem plasmídeo recombinante (apenas DNA e plasmídeo sem incerto),

célula sem plasmídeo (apenas DNA) e célula com plasmídeo recombinante e
DNA.

Para descartar as células sem plasmídeo ou sem plasmídeo recombinante,

usa-se ampicilina (descarta célula sem plasmídeo) e LacZ (torna célula sem
plasmídeo recombinante azul e a célula com plasmídeo recombinante
branca).
 MET e MEV
Microscópio eletrônico de transmissão e microscópio eletrônico de varredura

Microscópios eletrônicos possibilitam visualizar partículas de 1 nanômetro e

ampliar mais a visualização.

MEV - utilizada para a observação da

MET - capta a emissão de elétrons que
atravessam a amostra.
O canhão de elétron (filamento de
tungstênio) emite elétrons.
Em seguida, a lente condensadora
condensa o feixe de elétron.
A amostra recebe o feixe de
elétron que atravessa por ela.
Duas lentes (objetiva e do
projetor) captam a imagem.
Para possibilitar a visualização do
feixe de elétron (que é invisível),
utiliza-se uma tela fluorescência
contendo sulfato de zinco.
Essa tela converte o feixe de
elétrons em fluorescência de cor
verde escura e preta.
superfície de materiais.
Não é muito usado na virologia.
O canhão de elétrons emite os elétrons
na amostra.
Há então as lentes condensadora e
objetivas.
A amostra é localizada na última parte
do microscópio e recebe o feixe de
elétrons.
A amostra então reflete elétrons
secundários que são capturados pelo
detector. O detector forma a imagem.