Eletroforese Bidimensional

A eletroforese é uma técnica de separação de proteínas, onde ocorre o isolamento

por migração em campo elétrico. É um método analítico utilizado para estimar o número
de proteínas diferentes em uma mistura ou o grau de pureza de uma preparação proteica
específica. Em geral, a eletroforese de proteínas é realizada em géis compostos de
polímeros reticulados de poliacrilamida. O gel de poliacrilamida age como uma peneira
molecular, retardando a migração de proteínas em proporção à sua razão carga-massa.
Um método eletroforético comumente empregado para estimar a pureza e a massa
molecular utiliza o detergente dodecil sulfato de sódio (SDS). A eletroforese na presença
de SDS, portanto, separa proteínas quase que exclusivamente com base em sua massa
molecular, com os peptídeos menores migrando mais rapidamente. As proteínas são
visualizadas pela adição de um corante, como o azul de Coomassie, que se liga às
proteínas, mas não ao gel em si. Dependendo de fatores como espessura do gel e nitidez
de banda, Coomassie pode detectar proteínas de 10 a 50 ng;
A focalização isoelétrica é um procedimento utilizado para determinar o ponto
isoelétrico (pI) de uma proteína. Quando uma mistura de proteínas é aplicada, cada
proteína migra até alcançar o pH correspondente ao seu pI. Proteínas com pontos
isoelétricos diferentes são distribuídas de modo diferente ao longo do gel.
A combinação da focalização isoelétrica com a eletroforese em SDS
sequencialmente em um processo chamado de eletroforese bidimensional (2-D) permite
a resolução de misturas complexas de proteínas. Eletroforese bidimensional separa
proteínas de massa molecular idêntica que diferem em seu pI, ou proteínas com valores
de pl semelhantes, mas com massas moleculares diferentes.
No gel de poliacrilamida, cada spot é uma proteína. Esse spot pode ser cortado
identificado por espectrometria de massa. Mais de 1000 proteínas podem ser “resolvidas”
e identificadas num único gel. Eletroforese 2-D apresenta poder de resolução
relativamente alto, acesso fácil (técnica considerada “barata”) e de uso versátil. Contudo,
existem algumas limitações como reprodutibilidade, tempo de execução, não é
automatizada, é irreversível e proteínas não podem ser recuperadas após fixação no gel.