PURIFICAÇÃO DE IgG ATRAVÉS DE

CROMATOGRAFIA DE TROCA IÔNICA EM

DEAE -CELULOSE
• Os assuntos abordados nessa aula são:

- Dosagem de proteínas
- Métodos cromatográficos para separação de
proteinas e para a separação de imunoglobulinas
 Métodos de Isolamento de Biomoléculas

O isolamento ou purificação de uma proteína é uma etapa que precede

os estudos de suas características físico-químicas, de sua estrutura 3D
e a compreensão de suas propriedades biológicas.

Inicialmente, a estratégia de purificação de uma proteína é empírica, ou

seja, baseada em tentativa-erro, e deve ser desenhada para cada proteína
individualmente. Não há como prever quais métodos serão os mais
eficientes para se purificar uma proteína pela primeira vez.

Métodos de 1 proteína
purificação isolada

Proteínas de uma célula

 Métodos de Isolamento de Biomoléculas

Existe uma grande variedade de métodos visando a separação de biomoléculas.

Como na maioria das vezes o que se pretende purificar é uma proteína, o grupo
de moléculas com maior diversidade, as metodologias de separação de proteínas
tiveram um grande desenvolvimento, com muitas opções disponíveis.

Os métodos de separação de biomoléculas são agrupados em duas categorias:

Métodos baseados em características físico-químicas das biomoléculas:

1. Tamanho – Massa – Densidade (ex: centrifugação, diálise, gel-filtração)

2. Carga elétrica (ex: cromatografia de troca iônica, eletroforese)
3. Solubilidade ou hidrofobicidade (ex: cromatografia em papel, fase reversa)

Métodos baseados em afinidade biológica, que exploram a interação entre duas

moléculas:

4. Cromatografia de afinidade (pressupõe que uma das moléculas do par que

interage é um “reagente” de fácil obtenção, disponível comercialmente)
MATERIAL BIOLÓGICO DE PARTIDA: (100g)
O fluxograma ao lado representa a
Lisossomos
Lisossomos
“marcha” de purificação de uma proteína,
Mitocôndria
Mitocôndria
SOBRENADANTE ORGANELAS mostrando as etapas sucessivas, cada
Golgi
Golgi
Núcleo
Núcleo
uma consistindo de método, que levam ao
Precipitação com Sal/Solvente isolamento de uma proteína presente
numa mistura complexa.
Observe a quantidade de proteínas
F1 F2 F3 F4 (100g) presente no material inicial e
quanto da proteína purificada se obtém no
Precipitação com Sal/Solvente
final (0,001g). Esses números são típicos
para a purificação da maioria das
F 2 .1 F 2 .2 F 2 .3 proteínas, em especial enzimas.
Cromatografia Troca Iônica
Em cada etapa, a proteína de interesse é
F 2 .3.1 F 2 .3.2 . . . . . . F 2. 3.N
separada das demais com base em uma
Cromatografia Troca Iônica propriedade diferente. Consequente-
(pH ou resina diferente) mente, as proteínas ainda misturadas com
aquela que está sendo isolada são cada
F 2 .3.N.X
vez mais semelhantes em suas
Gel Filtração
características físico-químicas, exigindo
métodos cada mais sensíveis, capazes
de explorar pequenas diferenças, para se
1 Proteína apenas
chegar à proteína pura.
(0.001g) - 0.1 a 0.5% total
Métodos para medida do conteúdo de proteína:

Reagente de Biureto: sulfato de Cu2+ em tartarato

Cu2+ reage com as ligações peptídicas e produz um
complexo púrpura com absorção máxima em 540 nm

1. Cu2+ é quelado pela proteína Reagente Bradford

[Cu2+-proteina]
2. Reação redox
Cu2+ + (ligações peptídicas) —> [Cu+ -proteína]
Método de Lowry
Ìons Cu2+ reduzidos a Cu+ em presença de
proteínas e cadeias laterais de aminoácidos
aromáticos, Tyr e Trp, e de Cys, reduzem o
reagente de Folin-Ciocalteu (ácido fosfo-
mobidênio-tungstênio), dando um composto
de cor azul.
= Coomassie
Brilliant Blue G-250
Método baseado em uma mudança espectral do
reagente, em que dá absorção máxinma a 595 nm (cor
azul), quando interage com proteínas.
Interação com proteínas se dá através de
forças de Van der Waals e ligações iônicas,
especialmente com arginina, mas também com
resíduos de histidina, lisina, tirosina, triptofano e
fenlialanina.

BCA = ácido 2,2'-Bicinchonínico ou

4,4'-Dicarboxy-2,2'-biquinoline

Ìons Cu2+ reduzidos a Cu+ em presença de

proteínas reagem fortemente com o BCA
formando um composto azul,
2.- Materiais e Método para preparação da coluna deDEAE–celulose
para a separação de Ig G bovina

2.1.- Materiais
2.1.1- DEAE – celulose previamente embebido e carregado por tratamento
com soluções de ácido (HCl) em seguida álcali (NaOH).
2.1.2- Fração gamaglobulina previamente precipitada com sulfato de
amônio e dialisada com o mesmo tampão de eluição a ser usado na coluna
de DEAE – celulose. A concentração protéica dessa coluna deve ser
previamente determinada.
2.1.3.- Coluna cromatográfica pequena (seringa de 10ml) já montada e
preparada para ser preenchida com DEAE-celulose e acompanhada de
cânulas de pequenas pinças para regulagem do fluxo da coluna.
2.1.4.- Tampão fosfato 0,01M pH 8,0.
2.1.5.- Frascos pequenos de coleta (frascos do tipo penicilina), rotulados
com a numeração de 1 a 15.
2.2.- Método:-

2.2.1.- Deixe o volume de tampão imediatamente acima da coluna abaixar

abrindo cuidadosamente a coluna, e aproveite para regular o fluxo da coluna
para 12 gotas por minuto. Quando não houver mais tampão acima da resina e
com a coluna fechada, deve ser adicionada a solução de gama globulina, com
muito cuidado e com o auxílio da micropipeta. Em seguida, abrir vagarosamente
a coluna para deixar a solução de gama globulina entrar na resina, fechando a
coluna quando isso ocorrer. Adicionar, a seguir, com muito cuidado, um volume
de tampão de eluição. Conectar com o frasco de tampão com cânula e sifonado
de modo a permitir um fluxo continuado de tampão para a coluna de resina. Abrir
o fluxo da coluna, começar a colher as frações de 3 ml cada uma, aferindo o
fluxo novamente para 12 gotas por minuto.
2.2.2.- Testar de cada fração colhida, por coloração rápida e com reativo
apropriado em uma microplaca, a presença de proteína, misturando-se l da
fração com l do reativo.
2.2.3.- Faça a leitura das frações colhidas em espectrofotômetro UV, no
comprimento de onda de 280nm, contra um branco de tampão fosfato 0,005M
pH 8,0.
2.2.4.- Faça um pool das frações com maior concentração proteíca e armazene
a -20ºC para ser testada na próxima aula, por imunoeletroforese.
 Gama-Globulina

12 gotas/min
Assunto 04- figura 01

3ml
Proteínas também podem ser precipitadas com adição de solventes ao meio ou
quando colocadas em meio com pH próximo ao seu ponto isoelétrico.

Proteína P.I.
Proteínas colocadas em meio com pH igual ao seu PI
Pepsina <1,0 tendem a precipitar, pois tendo carga neutra, apresentam
Ovalbumina galinha 4,6 a camada de solvatação menos organizada.
Albumina sérica humana 4,9
Tropomiosina 5,1
Insulina bovina 5,4
Fibrinogênio humano 5,8
Constante Momento
Gama-globulina 6,6
Solvente
Dielétrica Dipolar
Colágeno 6,6 Água 78.5 1.85
Mioglobina equina 7,0 Dimetilformamida 48.9 3.96
Hemoglobina humana 7,1
Metanol 32.6 1.66
Etanol 24.3 1.68
Ribonuclease A bovina 7,8
Acetona 20.7 2.72
Citocromo C equino 10,6
Clorofórmio 4.8 1.15
Histona bovina 10,8 Benzeno 2.3 0.00
Lisozima, galinha 11,0
Salmina, salmão 12,1
Solventes miscíveis com a água diminuem a constante
Ponto Isoelétrico de algumas Proteínas dielétrica do meio e desorganizam a camada de solvatação
das proteínas.

Os mais utilizados são etanol e acetona.

 Para obter as proteínas precipitadas em solução novamente, é
necessário reverter as condições que levaram à precipitação.

Aos precipitados obtidos com sal ou

Membrana
de celofane solvente, adiciona-se água.

solvente
Ao precipitado obtido com variação
de pH, retornar ao pH original.
solução a
ser dialisada

início final
Dt
Para remover o excesso de sal ou do solvente no precipitado, utiliza-se a diálise.

-amostra é colocada dentro de um saco feito com uma membrana de celofane com poros
tratados, que permite a passagem de moléculas até 10,000 d.
- o saco contendo a amostra é imerso em um recipiente contendo o solvente que se deseja
- excesso de sal ou de solvente se difunde para o solvente
- após várias trocas de solvente, todo o excesso de sal/solvente terá sido retirado.
Funcionamento Básico de uma Coluna Cromatográfica
Uma coluna é um tubo cilindríco aberto nas duas extremidades e preenchido com a resina ou
matriz ou gel cromatográfico. A coluna é constantemente alimentada com líquido (tampão),
banhando a resina e forçando o contacto desta e as moléculas que estão sendo analisadas.
Abaixo está representado o esquema geral de uma cromatografia:
Tempo zero Tempo 1 Tempo 2 Tempo n
Amostra com
diferentes Líquido
componentes Componentes da que sae
Mais tampão é
amostra se da coluna
colocado na
Resina separam e saem é
coluna,
embebida da coluna com recolhido
forçando os
em componentes diferentes em tubos
tampão volumes de de um
da amostra a
tampão coletor de
interagirem
frações
com a resina

Os componentes da mistura são

separados por interação diferenciada
com a resina, com base em
propriedades moleculares como: Coletor de
frações

Concentração
• massa molecular
• carga elétrica Um cromatograma, como o
• solubilidade gráfico ao lado, é a maneira
• afinidade usual de se representar o
resultado de uma
cromatografia. Tempo ou volume
Que características devem ter as resina cromatográficas para possibilitar
separações de moléculas baseadas em diferentes propriedades ?

Cromatografia de permeação em gel ou gel-filtração:

separação de moléculas pela massa molecular
géis são porosos, funcionando como peneiras ou filtros

Cromatografia de troca iônica:

separação de moléculas pela carga elétrica
géis apresentam grupos carregados positiva- ou negativamente

Cromatografia de partição (fase reversa ou hidrofóbica):

separação de moléculas pela solubilidade relativa em meio aquoso
géis possuem carácter hidrofóbico

Cromatografia de afinidade:
separação de moléculas pela capacidade de interagir com um ligante
géis possuem ligante específico ligado covalente à resina
 Cromatografia de gel filtração ou peneira molecular
Moléculas com massas diferentes
proteína grande

proteína pequena
Fluxo do tampão
Tampão
“empurra”
moléculas
através da
resina

grão da resina poroso grãos (beads) da

tubos resina com poros

Na gel-filtração, as proteínas que penetram nos poros da resina precisam diferentes

volumes de tampão para saírem da coluna, conforme suas massas moleculares, percorrendo os
canais internos dos grãos. Quanto maior o número de grãos que cada molécula entrar durante o
percurso através da coluna, maior o volume necessário para sua saída.
Proteínas maiores que o diâmetro dos poros não são separadas e saem da coluna com
pouco tampão, correspondente apenas ao volume da coluna externo aos grãos, também chamado de
volume morto (Vo).
Proteínas menores que o diâmetro dos poros não são separadas e saem da coluna com um
volume de tampão correspondente ao volume interno (Vi, volume total menos o volume do próprio gel).
A cromatografia de gel-filtração possibilita estimar a massa molecular de
uma proteína em seu estado nativo
Além de purificar, por ser realizada em condições de pH, força iônica
e temperatura que preservam a atividade biológica da proteína, a
Curva de calibração
gel-filtração fornece a Mr do seu estado nativo.
Observa Para isso, é necessário “calibrar” a coluna com proteínas de massa
ra
escala molecular conhecida, construindo-se uma curva de calibração.
log
O volume de saída (eluição) de uma proteína numa coluna de gel-
Massa molecular (kD)

filtração é proporcional ao logaritmo de sua massa molecular.

traçado da medida de atividade
biológica nas frações
Moléculas Moléculas

Medida da ativ. biológica

maiores menores

Ler a massa
Absorbância a 280 nm
correspondente

20 40 60 80 100 120 mL
Medir o volume de eluição volume
25 50 75 100 125 mL da fração mais ativa.
volumeKav
de eluição Transportar para a curva de
calibraçao.
 Cromatografia de troca iônica

A resina para cromatografia de troca iônica apresenta carga elétrica, positiva ou

negativa, em uma ampla faixa de pH.

DEAE CM

Trocadora de ânions Trocadora de cátions

Existem dois tipos básicos: resinas trocadoras de ânions (possuem carga positiva),
como o dietilaminoetil (DEAE)-celulose e resinas trocadoras de cátions (possuem
carga negativa), como o carboxi-metil (CM)-celulose
 Como funciona a Cromatografia de Troca Iônica

Adsorção
No exemplo ao lado, como funciona uma resina catiônica ou +
trocadora de ânions, como o DEAE-celulose): +
+ +
+
+
+ + +
A cromatografia de troca iônica compreende duas etapas: ++
1) adsorção das proteínas com carga contrária à
resina, e saída da coluna das proteínas com a Moléculas com a mesma carga,
mesma carga; ou sem carga, não interagem com a resina,
2) eluição das proteínas adsorvidas. sendo as primeiras a sair da coluna

Eluição
Para a eluição, as condições de adsorção da coluna
+
(pH ou força iônica) são alteradas para neutralizar a +
interação entre as proteínas e a resina. +
+
+
Mais frequentemente utiliza-se um aumento da Na+Cl- + +
++
concentração do sal no tampão, pois alterações
de pH podem desnaturar proteínas, levando-as a
precipitar dentro da coluna.
Adição de sal ao tampão resulta em
competição entre os íons em solução
e as moléculas adsorvidas na resina.
 Como funciona a Cromatografia de Troca Iônica

O processo da cromatografia de troca iônica depende da diferença de ponto isoelétrico

das proteínas na amostra e das condições escolhidas de pH e de força iônica.
Proteínas apresentam carga positiva quando em meio
Ponto Isoelétrico de algumas Proteínas ácido em relação ao seu PI, e carga negativa, quando em
meio alcalino em relação ao seu pI.
Proteína P.I. Nesse caso, a referência para se dizer que o meio é ácido
Pepsina <1,0 ou básico é o PI da proteína, e não o pH do meio.
Ovalbumina galinha 4,6
H+
Albumina sérica humana 4,9 -
PI -COOH -COO
Tropomiosina 5,1 ácido básico
Insulina bovina 5,4
+ neutro - +
Fibrinogênio humano 5,8 -NH3 -NH2
Gama-globulina 6,6 H+
Colágeno 6,6
Mioglobina equina 7,0 A carga das proteínas varia em função do pH do meio, pois o
Hemoglobina humana 7,1
pH influencia o estado de dissociação das cadeias laterais dos
aminoácidos ácidos e básicos.
Ribonuclease A bovina 7,8
Citocromo C equino 10,6
Histona bovina 10,8
Lisozima, galinha 11,0
Salmina, salmão 12,1
 Duas Modalidades de Cromatografia de Troca Iônica

Gradientes de sal podem fracionar as proteínas adsorvidas na resina de acordo

com a intensidade de suas cargas, que é dada pela diferença entre seus PIs e o pH do
tampão de eluição.
As proteínas não retidas (com a mesma carga da resina) não são separadas,
sendo simplesmente “arrastadas” pelo tampão (ou seja, não são repelidas pela resina).

Eluição NaCl Eluição NaCl

_
+ 0. 10 M 0. 10 M
(+)
(-)
++ 0. 15 M = 0. 15 M
(+)
CM (-)
+
+ +
0. 20 M DEAE _
(+) =
0. 20 M
(-)

_ (+)
(-) =
+
_ = Não retidas +
Não retidas
+

Carboximetil~celulose Dietilaminoetil~celulose
(trocadora de cátions) (trocadora de ânions)
 Tipos de Resina de troca Iônica
NOME TIPO GRUPO IONIZÁVEL OBSERVAÇÕES
Dowex 1
Tipos de
Fortemente básica
Resina de troca
Ø - CH N (CH )
Iônica
+ Troca aniônica
2 3 3
resina de polistireno
Dowex 50 Fortemente básica Ø - SO 3-H Troca Catiônica
resina de polistireno
DEAE -celulose Básica Dietilaminoetil Fracionamento de proteínas
- CH 2CH 2N+(C2H 5)2 ácidas e neutras
CM -celulose Ácida Carboximetil Fracionamento de proteínas
- CH2COOH básicas e neutras
DEAE -Sephadex Gel de dextrano Dietilaminoetil Combinação de gel filtração
básico - CH 2CH 2N+(C2H 5)2 e troca iônica de proteínas
ácidas e neutras
CM - Sephadex Gel de dextrano Carboximetil Combinação de gel filtração
ácido - CH 2COOH e troca iônica de proteínas
básicas e neutras

* Dowex: Dow Chemical Co.; Sephadex: Amersham Pharmacia Biotech; Bio

- Gel: Bio Rad Laboratories

Existem vários tipos de resinas de troca iônica disponíveis no mercado.

 Cromatografia de afinidade:
Ex: cromatografia de imunoafinidade
Um dos métodos mais
eficientes para a
Adsorção
purificação de proteínas, Mistura de proteínas
possibilitando um alto Eluição
rendimento com número Partículas de Lavagem pH 2,0 ou sal
gel recobertas
reduzido de etapas. de anticorpos
anti-A
A separação de
moléculas tem como
base a interação
específica do analito Complexo
Anti-A
(molécula-alvo) com um Coluna interage Ag-AC é
desfeito
ligante imobilizado na empacotada apenas
com esse gel com a
matriz. Forças proteína A
envolvidas nessa
interação podem ser não Desprezar
proteínas não Antígeno A
covalentes retidas puro -
(eletrostáticas,
hidrofóbica, pontes de H) Eluição: condições que interferem na ligação da proteína ao
ou covalentes (p.e., ligante, como mudanças no pH e/ou força iônica, ou
ponte dissulfeto). por competição com o ligante livre
 Tipo de ligantes em cromatografia de afinidade

1. Mono-específicos - ligação específica da molécula-alvo

- análogos de substratos ou inibidores de enzimas
- agonistas ou antagonistas de receptores
- haptenos ou determinantes antigênicos de anticorpos
- ligantes com “tag” ou “marcação”
- glutationa-S-transferase 8-AEA-cAMP
- poli-Histidina
8-(2-aminoethyl)aminoadenosine-3',5'-cyclic
monophosphate
2. Grupo-específico: ligantes para separação de grupos: (ligante para proteínas com afinidade por cAMP
ou cGMP)
Ligante Especificidade
grupo-específico
Proteína A Região Fc de IgG
Proteína G Região Fc de IgG
Concanavalina A Grupos glicosil- ou manosil-
Cibacron Blue Várias enzimas, albumina
lisina Plasminogênio, RNA ribossomal
arginina proteinases tipo tripsina
benzamidina proteinases tipo tripsina
calmodulina Proteínas reguladas por calmodulina Sítios de ligação das proteínas
heparina Fatores de coagulação, lipases, A, G e L à imunoglobulina, que
hormônios, receptores estoróides, etc permitem a purificação de
anticorpos por cromatografia
Metais de transição Proteínas e peptídeos com resíduos
de His expostos de afinidade
Preparo da resina de afinidade: Estratégias para acoplamento de ligantes à resina
Reagente Alvo no ligante
Passo 1. Ativação da resina

Passo 2. Acoplar
o ligante

Para ligantes pequenos (Mr < 1.000) há o risco de impedimento

estérico entre a matriz e a molécula-alvo, que causa dificuldade
ou impede sua ligação à resina.

A introdução de um braço espaçador (alguns C) diminue o risco.

Braço espaçador covalente entre

a resina e o ligante

Molécula-alvo (analito)
ligante

Ligação reversível não covalente