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Citologia e Histologia Básica

➢ Planejamento

➢ Planejamento
➢ Planejamento
➢ Planejamento
➢ Planejamento → Temas para trabalho TEMA 2
1) Sistema digestório e alterações histopatológicas

2) Sistema circulatório de alterações histopatológicas

3) Sistema respiratório e alterações histopatológicas

4) Sistema tegumentar (pele e anexos) e alterações histopatológicas

5) Sistemas Fotorreceptor e Audiorreceptor e alterações histopatológicas

6) Glândulas endócrinas e alterações histopatológicas

7) Sistema urinário e alterações histopatológicas

8) Sistema reprodutor masculino e feminino e alterações histopatológicas


➢ Introdução
➢ HISTOLOGIA é o estudo das células (citologia) e dos tecidos
do corpo e de como essas estruturas se organizam para
constituir os órgãos.
➢ Em razão das pequenas dimensões das células, seu estudo é
realizado com auxílio de MICROSCÓPIOS
➢ Preparação de espécimes para exame microscópico
➢ No microscópio óptico são visíveis células vivas, camadas muito
delgadas de células ou de tecidos, membranas transparentes de
animais vivos (ex.: cauda de um girino, a parede de uma bolsa
existente na bochecha de hamsters) podem ser observadas
diretamente ao microscópio.
➢ Preparação de espécimes para exame microscópico
➢ Os tecidos e órgãos são espessos e NÃO possibilitam a
passagem adequada da luz para a formação de uma imagem, e
por isso antes de serem examinados ao microscópio eles devem
ser fatiados em SECÇÕES OU CORTES HISTOLÓGICOS
muito delgados que são colocados sobre lâminas de vidro.

➢ Inicialmente é feito um corte em BISTURI de no máximo 3mm


e então os tecidos e órgãos necessitam passar por uma série
de tratamentos que podem demorar de 12h à 2 dias.
➢ Preparação de espécimes para exame microscópico
➢ Fixação:

➢ Logo após a coleta, as células ou fragmentos de tecidos e


órgãos devem ser submetidos a um pro cesso chamado
fixação, que tem várias finalidades visando preservar em
grande parte a estrutura e a composição molecular dos
tecidos:

➢ Evitar a digestão dos tecidos por enzimas existentes nas


próprias células (autólise) ou em bactérias;

➢ Endurecer os fragmentos;
➢ Preparação de espécimes para exame microscópico
➢ Fixação:

➢ A fixação pode ser feita por métodos químicos ou, menos


frequentemente, por métodos físicos (ver mais adiante).

➢ Na fixação QUÍMICA os tecidos são imersos em soluções de


agentes desnaturantes ou de agentes que estabilizam as
moléculas ao formar pontes com moléculas adjacentes,

➢ Essas soluções são chamadas de FIXADORES.


➢ Preparação de espécimes para exame microscópico
➢ Fixação:

➢ Como demora algum tempo para que o fixador se difunda de


maneira rápida e completa pelo interior dos fragmentos, um
grande fragmento deve ser cortado em outros menores antes
de ser imerso no fixador, dessa maneira, torna-se mais fácil a
penetração do fixador no fragmento e garante-se melhor
preservação da sua estrutura
➢ Preparação de espécimes para exame microscópico
➢ Fixação:

➢ Também é possível, em alguns casos, realizar a perfusão


intravascular do fixador, o qual alcança o interior dos tecidos
rapidamente pelos vasos sanguíneos, resultando em uma
fixação melhor.
➢ Preparação de espécimes para exame microscópico
➢ Fixação:

➢ Um dos fixadores mais usados para micros copia de luz é uma


solução de FORMALDEIDO a 4%;

➢ Outro fixador bastante utilizado é o GLUTARALDEÍDO


➢ Preparação de espécimes para exame microscópico
➢ Fixação:

➢ A fixação química é um processo complexo e não


completamente esclarecido.

➢ Formaldeido e glutaraldeido são conhecidos por reagir com


os grupos amina (NH2) das proteínas

➢ A ação fixadora do GLUTARALDEIDO é reforçada pelo fato


de ser um dialdeído que promove a formação mais eficiente
de ligações cruzadas entre proteínas das células e da
matriz extracelular.
➢ Preparação de espécimes para exame microscópico
➢ Fixação:

➢ Para microscopia eletrônica é necessário um cuidado muito


maior na fixação para mais bem preservar detalhes da ultra
estrutura das células e da matriz

➢ É realizada uma DUPLA FIXAÇÃO usando uma solução de


glutaraldeido tamponado, seguida por uma segunda
fixação em tetróxido de ósmio, que preserva e fornece
CONTRASTE aos lipídios e proteínas.
➢ Preparação de espécimes para exame microscópico
➢ Inclusão:

➢ Para obter secções delgadas com o micrótomo os


fragmentos de tecidos e órgãos devem, após a fixação, ser
infiltrados/incluídos com substâncias que lhes proporcionem
uma consistência rígida.

➢ As substâncias mais utilizadas para esse fim são a PARAFINA


e algumas resinas de plástico.

➢ A parafina é habitualmente utilizada para microscopia de luz,


e as resinas, para microscopia de luz e eletrônica.
➢ Preparação de espécimes para exame microscópico
➢ Inclusão:

➢ O processo de impregnar os tecidos com PARAFINA é


precedido por duas etapas: desidratação e clareamento.
➢ Preparação de espécimes para exame microscópico
➢ DESIDRATAÇÃO:

➢ A amostra passa por diversos banhos em soluções de


concentrações crescentes de etanol (normalmente desde
etanol 70% em água até etanol 100%).
➢ Preparação de espécimes para exame microscópico
➢ Inclusão:

➢ CLAREAMENTO:

➢ Após a desidratação o corte passa por substâncias


intermediárias, SOLVENTES ORGÂNICOS, sendo o XILOL
e o TOLUOL os mais utilizados → semelhantes aos
detergentes

➢ Quando os fragmentos de tecidos são embebidos no


solvente orgânico, eles ficam transparentes ou
translúcidos.
➢ Preparação de espécimes para exame microscópico
➢ Inclusão:

➢ CLAREAMENTO:

➢ Em seguida, são colocados em PARAFINA derretida (56 a


60ºC) e mantidos em estufa.

➢ O calor causa a evaporação do solvente orgânico, e os


espaços existentes dentro dos tecidos tornam-se
preenchidos com parafina.
➢ Preparação de espécimes para exame microscópico
➢ Inclusão:

➢ CLAREAMENTO:

➢ Depois de os fragmentos serem retirados da estufa, a


parafina solidifica e eles se tornam RÍGIDOS.

➢ Os BLOCOS DE PARAFINA que contem os tecidos são


então levados a um MICRÓTOMO
➢ Preparação de espécimes para exame microscópico
➢ MICRÓTOMO MANUAL
➢ Preparação de espécimes para exame microscópico
➢ MICRÓTOMO MANUAL
➢ Preparação de espécimes para exame microscópico
➢ MICRÓTOMO MANUAL
➢ Preparação de espécimes para exame microscópico
➢ MICRÓTOMO ROTATIVO
➢ Preparação de espécimes para exame microscópico
➢ MICRÓTOMO ROTATIVO
➢ Preparação de espécimes para exame microscópico
➢ Inclusão:

➢ O corte histológico:

➢ No micrótomo as amostras são seccionadas por uma


lâmina de aço ou de vidro, de modo a fornecer cortes de 1
a 10 micrômetros (µm) de espessura.
➢ Preparação de espécimes para exame microscópico

➢ O corte histológico:

➢ Um micrômetro (1 µm) = 0,001 mm = 10-6 m;

➢ Um nanômetro (1 nm) = 0,001 µm = 10-6 mm = 10-9 m.


➢ Preparação de espécimes para exame microscópico
➢ Inclusão:

➢ O corte histológico:

➢ Após serem seccionados, os cortes são colocados para


flutuar sobre uma superfície de água aquecida e, depois,
sobre lâminas de vidro, onde aderem e serão, em seguida,
corados.
➢ Preparação de espécimes para exame microscópico
➢ Fixação FÍSICA por congelação/congelamento:

➢ Um modo completamente diferente de preparar secções de


tecidos ocorre após submeter os tecidos a um
congelamento rápido;

➢ Os tecidos são então fixados por congelação


(“congelamento”), um MÉTODO FÍSICO de fixação,
tornando-se rígidos prontos para serem seccionados.
➢ Preparação de espécimes para exame microscópico
➢ Fixação FÍSICA por congelação/congelamento:

➢ Um micrótomo para tecidos congelados - o CRIOSTATO ou


CRIOMICRÓTOMO - foi desenvolvido para a produção de
cortes de tecidos congelados

➢ O método apresenta a vantagem de ser mais rápido pois não


passa pelas etapas de desidratação, clareamento e inclusão e
por isso é habitualmente utilizado em hospitais para que seja
possível analisar amostras obtidas durante procedimentos
cirúrgicos.
➢ Preparação de espécimes para exame microscópico
➢ Fixação FÍSICA por congelação/congelamento:

➢ Congelar tecidos é também muito útil para o estudo


histoquímico de enzimas e de outras proteínas em cortes
histológicos porque o congelamento, ao contrário da fixação
química, NÃO INATIVA a maioria das enzimas e mantém
muitas proteínas em suas conformações naturais e em
seus locais originais.
➢ Preparação de espécimes para exame microscópico
➢ Fixação FÍSICA por congelação/congelamento:

➢ Quando se deseja estudar LIPÍDIOS contidos nos tecidos,


aconselha-se o uso de secções congeladas, já que a imersão
de tecidos em solventes como xilol dissolve essas
substâncias.
➢ Preparação de espécimes para exame microscópico
➢ Coloração:

➢ Com poucas exceções, os tecidos são incolores e por isso


foram desenvolvidos métodos de coloração que tornam
evidentes os vários componentes dos tecidos, das células
e da MEC.

➢ Os componentes dos tecidos que se coram bem com corantes


básicos são chamados de BASÓFILOS, e os que têm grande
afinidade por corantes ácidos, de ACIDÓFILOS.
➢ Preparação de espécimes para exame microscópico
➢ Coloração:

➢ O azul de toluidina e o azul de metileno são exemplos de


corantes básicos.

➢ Outros corantes, como a hematoxilina, comportam-se como


corantes básicos e se ligam às estruturas basófilas das
células e dos tecidos.
➢ Preparação de espécimes para exame microscópico
➢ Coloração:

➢ Os principais componentes dos tecidos que reagem com


corantes básicos o fazem por CONTER ÁCIDOS NA SUA
COMPOSIÇÃO: ácidos nucleicos, glicosaminoglicanos e
glicoproteínas ácidas.
➢ Preparação de espécimes para exame microscópico
➢ Coloração:

➢ Por outro lado, CORANTES ÁCIDOS (tais como orange G,


eosina, fucsina ácida) coram principalmente os componentes
acidófilos (de composição básica) dos tecidos, como, por
exemplo mitocôndrias, grânulos de secreção, proteínas
citoplasmáticas c colágeno.
➢ Preparação de espécimes para exame microscópico
➢ Coloração:

➢ Dentre todos os corantes, a combinação de hematoxilina e


eosina (HE) é a mais comumente utilizada.

➢ A hematoxilina cora cm azul (corante básico) ou violeta o


núcleo das células e outras estruturas ÁCIDAS (tais como
porções do citoplasma ricas em RNA e a matriz extracelular
da cartilagem hialina).
➢ Preparação de espécimes para exame microscópico
➢ Coloração:

➢ A eosina (corante ácido) cora componentes básicos da célula


como o citoplasma e o colágeno em cor-de-rosa.
➢ Microscopia de luz
➢ Ao MICROSCÓPIO ÓPTICO as preparações coradas são
examinadas por iluminação que atravessa o espécime
(transiluminação).

➢ O microscópio de luz é composto de partes mecânicas e


ópticas
➢ Microscopia de luz
➢ O componente ÓPTICO
consiste em três sistemas de
lentes: condensador,
objetivas e oculares.

➢ O CONDENSADOR concentra
a luz de uma lâmpada e projeta
um feixe luminoso sobre o
espécime.
➢ Microscopia de luz
➢ A OBJETIVA recebe a luz que
atravessou o espécime e
projeta uma imagem
aumentada do espécime em
direção à ocular
➢ Microscopia de luz
➢ A OCULAR amplia novamente
a imagem e a projeta na
retina, em uma tela, em uma
câmera fotográfica ou cm um
detector eletrônico.
➢ No caso das imagens projetadas
na retina, a ampliação total é
calculada multiplicando-se o
aumento da objetiva peio
aumento da ocular,
➢ Resolução
➢ A resolução é definida como a menor distância entre duas
partículas ou entre duas linhas, distância essa que possibilita
que das sejam vistas como dois objetos separados.

➢ O poder de resolução máximo do microscópio de luz (também


chamado de resolução ou limite de resolução) é de
aproximadamente 0,2 µm;

➢ Esta resolução torna possível a obtenção de boas imagens


aumentadas até 1.000 a 1.500 vezes.
➢ Resolução
➢ Objetos menores ou mais delgados que 0,2 µm (como, por
exemplo, a membrana da célula ou um filamento de actina) não
podem ser distinguidos com esse instrumento.

➢ Da mesma maneira, dois objetos, como, por exemplo, duas


mitocôndrias ou dois lisossomos, serão vistos como um só
objeto se eles estiverem separados por menos de 0,2 µm.

➢ Portanto, o que determina a riqueza de detalhes da imagem é o


limite de resolução de um sistema óptico, e não seu poder de
aumento.
➢ Resolução
➢ O aumento só tem valor prático se for acompanhado de
resolução.

➢ A resolução depende essencialmentc da objetiva, pois a lente


ocular apenas aumenta a imagem nela projetada pela objetiva.
➢ Histoquímica e citoquímica
➢ Métodos que identificam e localizam substâncias em células e
matriz extracelular, seja em cortes histológicos ou em células
cultivadas

➢ Há vários procedimentos para obter essas informações, a


maioria baseada em reações químicas específicas ou em
interações de alta afinidade entre moléculas.

➢ Esses métodos normalmente originam substâncias insolúveis


coloridas (para microscopia de luz) ou elétron-densas (para
microscopia eletrônica).
Dúvidas????