PROGRAMA DE EDUCAÇÃO CONTINUADA A DISTÂNCIA

Portal Educação

CURSO DE
EMBRIOLOGIA HUMANA

AN02FREV001/REV 4.0

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 CURSO DE
EMBRIOLOGIA HUMANA

MÓDULO III

Atenção: O material deste módulo está disponível apenas como parâmetro de estudos para este
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do mesmo sem a autorização expressa do Portal Educação. Os créditos do conteúdo aqui contido
são dados aos seus respectivos autores descritos nas Referências Bibliográficas.

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 MÓDULO III

8 CRIOPRESERVAÇÃO

A palavra “criobiologia” tem origem do termo grego “kruos” (exprime a

ideia de frio) e é definida como o estudo da vida a temperatura extremamente baixa.
Dessa maneira, fica claro que os termos criopreservação e congelação não são
sinônimos. O primeiro significa preservar células, guardando-as a baixas
temperaturas, enquanto o segundo é a mudança do estado líquido para sólido
(BONHO, 2009).
A criobiologia tem permitido a preservação de células por tempos
prolongados, geralmente com a manutenção de suas propriedades biológicas, uma
vez descongeladas. Todas as células dos mamíferos funcionam com uma pequena
variação de temperatura, que vai de 37ºC a 39ºC, e todas contêm água, tornando
possível a criopreservação se forem resfriadas em nitrogênio líquido a 196º C. Isso
significa que as células toleram a exposição a temperaturas não fisiológicas e a
mudança do estado líquido para o sólido, já que o gelo se forma em uma
temperatura pouco abaixo de 0º C. Os danos sofridos pelas células dos mamíferos
durante a criopreservação estão diretamente ligados à velocidade de resfriamento e
aquecimento das células (CONEL et al., 2014).
Com o desenvolvimento das técnicas de reprodução assistida, a
criobiologia passou a despertar grande interesse, pois exerce papel essencial na
manutenção da fertilidade. Participa diretamente na criopreservação de
espermatozoides, óvulos, embriões, tecidos testiculares e ovarianos. A
criopreservação tem como principal objetivo: manter a integridade estrutural e
viabilidade celular após submeter essas células a baixas temperaturas por um
determinado período. Esse processo produz danos celulares conhecidos como
crioinjúrias (BONHO, 2009).

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 Vários fatores interferem no aparecimento dessas crioinjúrias: o tipo de
célula criopreservada, os reagentes utilizados (crioprotetores), a velocidade de
queda da temperatura, o local onde a célula foi armazenada e a forma de
descongelamento das amostras.
Atualmente, existe um bom conhecimento na criopreservação de sêmen e
de embriões, com a obtenção de ótimos resultados. Porém, os estudos se
concentram na busca de melhores técnicas de criopreservação de tecidos ovarianos
e de óvulos, já que os resultados de fertilização e gestação utilizando essas células
criopreservadas ainda são pouco animadores.
O principal objetivo de um programa de congelamento é causar o mínimo de
dano possível no momento em que os gametas, embriões e tecido germinativo
estiverem expostos a uma temperatura muito baixa não fisiológica. Quando os
espermatozoides, os ovócitos, os zigotos e os pré-embriões estão expostos às
soluções hipermolares, reagem a elas perdendo água. Quando alguns componentes
são adicionados ao meio de criopreservação, a relação entre sobrevida e
temperatura pode ser drasticamente alterada. A sobrevida das células e tecidos
vivos criopreservados depende em grande parte do meio crioprotetor. Dessa
maneira, a utilização de agentes crioprotetores adequados é indispensável para
prevenir danos às células e tecidos germinativos (CORNEL et al., 2014).
Os protocolos usados hoje em dia envolvem, essencialmente, técnicas que
permitem a desidratação da célula, prevenindo a formação de gelo intracelular, que
pode causar danos pelo arrebentamento e dispersão das organelas celulares, ou por
provocar quebras da membrana citoplasmática. Quando os gametas ou embriões
são colocados em um meio contendo um agente de crioproteção intracelular, a água
sai da célula devido à alta concentração extracelular de crioprotetores. Isso causa o
encolhimento da célula até o equilíbrio osmótico ser atingido pela difusão lenta dos
crioprotetores para o interior celular (CORNEL et al., 2014).
Para prevenir o super-resfriamento durante o congelamento, um cristal de
gelo é introduzido num processo controlado chamado "seeding". Isso contribui para
a desidratação intracelular. Um correto equilíbrio entre a velocidade de
congelamento e a concentração do crioprotetor diminui os danos que o
congelamento pode causar nas estruturas celulares no processo de desidratação.
Se a taxa de resfriamento é muito rápida, a água não pode sair suficientemente

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rápido da célula e, ocorre a formação intensa de cristais de gelo (SOCIEDADE
BRASILEIRA DE REPRODUÇÃO HUMANA, 2006).
A taxa de penetração dos crioprotetores depende da temperatura; o
equilíbrio é ativado rapidamente em altas temperaturas. Por essa razão, ovócitos e
embriões são usualmente colocados no meio de crioproteção em temperatura
ambiente. Entretanto, como alguns crioprotetores, como o dimetilsulfóxido (DMSO),
são tóxicos em elevadas concentrações, esse é frequentemente usado em baixas
temperaturas para reduzir os efeitos adversos.
Se o resfriamento final ocorre a uma temperatura relativamente alta (>
30°C), a célula carrega mais gelo intracelular do que se o resfriamento for mais
demorado, com baixas temperaturas (< 80°C). Assim, para proteger a célula
naquela situação, o descongelamento deve ser realizado rapidamente, induzindo a
uma rápida dispersão do gelo. Inversamente, amostras resfriadas a < 80°C devem
ser descongeladas mais lentamente para permitir a reidratação gradual e evitar o
risco de arrebentamento da célula. Dessa maneira, amostras descongeladas são
usualmente expostas progressivamente em diluições mais baixas de crioprotetores
para removê-los da célula gradativamente (SOCIEDADE BRASILEIRA DE
REPRODUÇÃO HUMANA, 2006).

8.1 SAIBA MAIS ...

8.1.1 Quais as vantagens dos crioprotetores?

─ estabilizam proteínas intracelulares;
─ reduzem a formação de gelo intracelular;
─ moderam o impacto da concentração de eletrólitos intra e
extracelulares;
─ são hidrossolúveis;
─ baixa toxicidade mesmo em concentrações elevadas;
─ facilmente permeáveis às membranas da célula.

8.1.2 Quais são os crioprotetores mais usados?

Dimetilsulfóxido (DMSO), Propanodiol (PROH) e Glicerol (GLY) – agentes celulares
com pequenas moléculas – facilmente permeáveis à membrana celular. DMSO e

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PROH são frequentemente usados para congelamento de embriões em estágio de
pouca divisão celular, e o glicerol é sempre usado para blastocistos.
Sacarose – substância extracelular com grandes moléculas não permeáveis.
Apresenta efeito osmótico, acelerando a desidratação da célula. Não pode ser usada
isoladamente, é utilizada junto a crioprotetores intracelulares padrão.

8.1.3 Quais amostras são susceptíveis à criopreservação?

─ espermatozoides;
─ ovócitos;
─ tecido ovariano;
─ pré-zigotos em estágio de pró-núcleo;
─ embriões em estágio clivado;
─ embriões em blastocisto.

8.2 TIPOS DE CRIOPRESERVAÇÃO

8.2.1 Lenta ou Computadorizada

─ interação das amostras com substância crioprotetora – equilíbrio;

─ transferência para recipiente apropriado;
─ colocados na máquina de congelamento computadorizada;
─ programação das rampas de congelamento;
─ “seeding”;
─ decréscimo lento da temperatura (até 30 ou 40°C);
─ transferência para cilindro contendo nitrogênio líquido (-196°C) onde
são armazenados.
─ deve haver um correto equilíbrio entre a velocidade de congelamento e
a concentração do crioprotetor.
A criopreservação lenta é uma técnica amplamente difundida, porém,
apresenta um custo relativamente alto devido à necessidade de equipamentos
sofisticados e, ademais, permite a formação de cristais de gelo intracelulares (CGI),

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que ocorre durante a realização do processo de congelação, responsáveis por
danos celulares irreversíveis durante a criopreservação (CARVALHO et al., 2011).

8.2.2 Ultrarrápida

A criopreservação consiste em colocar a amostra em substância

crioprotetora altamente concentrada por um rápido período e, posteriormente colocá-
la no nitrogênio líquido. Nesse processo, não se formam cristais de gelo, a amostra
não é desidratada e pode ser descongelada quando necessário em banho-maria a
37°C para remover o crioprotetor em um só passo (SOCIEDADE BRASILEIRA DE
REPRODUÇÃO HUMANA, 2006).
Gordts et al. (1990) relataram quatro casos de gravidez após o
congelamento ultrarrápido de embriões. No estudo, alta taxa de sobrevivência foi
observada em embriões congelados em pró-nucleos comparados a embriões
clivados. Em contrapartida, Lai et al. (1996), utilizando técnica de congelamento
ultrarrápido, reportaram taxa de sobrevivência de 83% e de nascidos 16% com
embriões clivados.
A vitrificação é uma técnica ultrarrápida de criopreservação e baseia-se no
contato direto com uma solução que contém crioprotetores altamente concentrados,
portanto, viscosa. Durante esse processo, a amostra é resfriada suficientemente
rápida a temperaturas criogênicas (>10.000ºC/min) e se transforma em um “vidro”
sólido, daí, o nome vitrificação (CARVALHO et al., 2011).
Os protocolos para vitrificação de embriões, espermatozoides e óvulos vêm
sendo muito adotados devido à simplicidade na sua execução, rentabilidade
econômica e velocidade do procedimento de preservação (CARVALHO et al., 2011).

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8.3 CRIOPRESERVAÇÃO DE ESPERMATOZOIDES

A criopreservação é a uma técnica muito antiga e segura de congelamento

de espermatozoides. Os espermatozoides ficam estocados em tanques com
nitrogênio líquido a menos 196°C, por tempo indeterminado para conservar sua
estrutura física e funcional (figura 46).
No início da década de 1950, foi descrito o primeiro caso de gravidez e
nascimento humano, por técnica de inseminação artificial, utilizando sêmen
descongelado, após ter sido estocado por até seis semanas em gelo seco a – 70 C.
Na década seguinte, em 1964, foram descritos nascimentos de humanos por meio
de inseminação artificial, utilizando sêmen congelado e armazenado em nitrogênio
líquido por até cinco meses. Também foi publicado o caso de um paciente que, em
1979, aos dezessete anos, foi submetido a tratamento para um câncer de testículo e
orientado a criopreservar seu sêmen. Em 2002, nasceu seu filho, por meio de
reprodução assistida, utilizando o sêmen criopreservado há 21 anos (BONHO,
2009).

FIGURA 46  CRIOPRESERVAÇÃO DE ESPERMATOZOIDES

FONTE: Disponível em: <http://invida.med.br/tratamento/criopreservacao/>. Acesso em: 03 mar.

2014.

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 Desde a criação do primeiro banco de sêmen, diversos autores publicaram
suas experiências com a criopreservação de espermatozoides. Concluíram que, nas
gestações decorrentes de inseminação artificial com sêmen criopreservado, as taxas
de aborto, de gestação ectópica, de malformações fetais, o peso ao nascimento e a
relação do sexo masculino: feminino foram as mesmas da população em geral.
Com o desenvolvimento da técnica de injeção intracitoplasmática de
espermatozoides (ICSI) em 1992, disponibilizou-se uma nova perspectiva
terapêutica para os casais inférteis devido a um fator masculino grave, pela
utilização de espermatozoides oriundos de programas de doação de sêmen,
ressurgindo a ideia da criação dos bancos de sêmen (BONHO, 2009).
Os bancos de sêmen podem ser classificados em homólogos e heterólogos.
Os homólogos armazenam sêmen para o “uso próprio”, enquanto que os
heterólogos têm a finalidade de doação.
Com o surgimento da AIDS, os bancos de sêmen de doador passaram a ter
grande preocupação com a qualidade e estocagem do sêmen, sendo as amostras
liberadas apenas após um prazo de no mínimo seis meses, período em que se
completa a investigação sorológica do doador (BONHO, 2009).
As indicações da criopreservação de espermatozoides são as seguintes
(CORNEL, 2014):
─ criopreservação terapêutica: manutenção de fertilidade em homens a
serem submetidos à quimio ou radioterapia ou cirurgias que possam
comprometer o potencial fértil (dissecção do retroperitôneo, ressecção
endoscópica da próstata, cirurgias envolvendo o colo da bexiga). A presença
de tumores ou outras neoplasias, aliada às terapias de erradicação podem
ter como resultado a indução de oligozoospermia ou mesmo de
azoospermia, sendo que essas alterações podem ser temporárias ou
definitivas.
─ inseminação artificial ou fertilização in vitro com sêmen de
doador: formação de banco de sêmen.
─ inseminação com sêmen do parceiro: nos casos de ausência
temporária ou definitiva do mesmo, baixa frequência sexual e disfunção erétil
em procedimentos de inseminação intrauterina ou fertilização in vitro.

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 ─ preservação do material genético: pacientes que desejam ser
submetidos à vasectomia poderão guardar amostras de sêmen para serem
utilizadas no futuro procedimentos de reprodução assistida.
─ criopreservação dos espermatozoides obtidos durante
microcirurgias para reconstrução do sistema reprodutivo (reversão de
vasectomia) ou por técnicas cirúrgicas do epidídimo ou do parênquima
testicular (aspiração microcirúrgica do epidídimo; biópsia convencional ou
microcirúrgica do testículo), para futura utilização em micromanipulação de
gametas.
─ criopreservação de sêmen de indivíduos que trabalham em
profissões de alto risco (mergulhadores de elevada profundidade, pilotos,
indústrias químicas, exposição a agrotóxicos e pesticidas e exposição a
radiações ionizantes).
Todos os pacientes que desejam criopreservar amostras seminais devem
realizar, previamente ao procedimento, os seguintes exames: HIV I e II; Grupo ABO;
Fator Rh; Clamídia, Ureaplasma, Micoplasma, Gonorréia, Espermograma,
Espermocultura, entre outros. Os marcadores de hepatite e AIDS devem ser
repetidos após 3 meses da coleta para afastar o risco de resultado falso negativo
devido à janela imunológica (SOCIEDADE BRASILEIRA DE REPRODUÇÃO
HUMANA, 2006).

8.4 CRIOPRESERVAÇÃO DE OVÓCITOS

A criopreservação de ovócitos humanos ainda é uma metodologia em

desenvolvimento, apesar das primeiras gestações pós-descongelamento já terem
sido descritas em meados da década de oitenta (RED LATINOAMERICANA
REPRODUCCÍON ASISTIDA, 2014).
A criopreservação de ovócitos humanos e seu armazenamento por tempo
indeterminado podem beneficiar tanto pacientes com neoplasias que apresentam
risco de tornarem-se estéreis após a terapia quanto mulheres que pretendem
postergar a gravidez.

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 Para que a criopreservação do ovócito seja possível, é feito um estímulo
medicamentoso na paciente; esse estímulo é realizado anteriormente à extração de
seu óvulo - feita por punção transvaginal auxiliada por ultrassom. Algumas vezes é
necessário mais de um ciclo de estimulação ovariana para que seja produzida uma
quantidade mínima necessária que garanta uma coleta bem-sucedida (CLÍNICA DE
REPRODUÇÃO HUMANA, 2014).

8.4.1 Criopreservação de tecido ovariano

Enquanto a criopreservação do sêmen está disponível para homens, os

protocolos de preservação de ovócitos permanecem aquém do desejado e ainda
não há método apropriado para crianças pré-púberes.
As vantagens da criopreservação do tecido ovariano no lugar dos ovócitos
incluem a abundância de ovócitos disponíveis numa fase de maturação em que são
menos susceptíveis aos danos potenciais do procedimento, além de dispensar o uso
de técnica de reprodução assistida (SOCIEDADE BRASILEIRA DE REPRODUÇÃO
HUMANA, 2014).
Uma desvantagem a ser considerada é a possibilidade de se reimplantar
células cancerosas em pacientes já tratadas. Dessa forma, a criopreservação de
tecido ovariano, embora promissora, precisa ser mais bem estudada antes de ser
oferecida como alternativa para preservação da fertilidade (SOCIEDADE
BRASILEIRA DE REPRODUÇÃO HUMANA, 2014).

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8.5 SAIBA MAIS ...

Criopreservação de Gametas - Uma Esperança para Pacientes com Câncer. Relatos

de Casos

Caso 1
Um jovem de 20 anos de idade se apresentou em 1990 com câncer de
testículo que apresentava 2 componentes, 60% carcinoma embrionário e 40%
teratoma maduro/imaturo, sendo realizada orquiectomia inguinal esquerda. Seis
meses depois, uma metástase pulmonar foi detectada e quimioterapia (carboplatina,
ciclofosfamida e etoposide) foi prescrita. Seu sêmen foi criopreservado antes da
quimioterapia no Idant Laboratories (New York, EUA), demonstrando uma análise
seminal básica pré-congelamento adequada (concentração 40x106/ml, motilidade
progressiva 40% e morfologia normal 30%). O sêmen foi congelado usando-se
glicerol como crioprotetor, e assim mantido por 12 anos. Uma análise seminal foi
realizada antes que sua esposa fosse submetida à estimulação ovariana e mostrou
azoospermia completa após centrifugação em alta velocidade.
Sua esposa, de 32 anos, foi estimulada com uma combinação de agonista
do hormônio liberador de gonadotrofina (aGnRH), gonadotrofinas (rFSH) e
gonadotrofina coriônica humana, sendo a seguir realizadas aspiração folicular
transvaginal e cultura embrionária. Após descongelamento do sêmen, os
espermatozoides com alta motilidade foram isolados pela separação por gradiente
descontínuo e depois lavados com fluido tubário humano (HTF, Irvine Scientific,
Santa Ana, EUA) suplementado com proteína. A ICSI foi realizada apenas em
ovócitos em metáfase II. Dois embriões foram transferidos, usando cateter macio,
através do colo uterino no terceiro dia após a aspiração ovocitária guiada por
ultrassonografia transabdominal. Uma gravidez única se desenvolveu e um bebê do
sexo feminino nasceu (peso de 3480 g e altura de 50 cm) após cesariana com 39
semanas de gestação.
Caso 2

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 Um paciente com 33 anos foi encaminhado para esta unidade antes de
iniciar quimioterapia (regime baseado em vincristina, ciclofosfamida, adriamicina,
ifosfamida e etoposide) e radioterapia (2.100 cGy, divididos em 26 seções) por
apresentar tumor neuroectodérmico primitivo em couro cabeludo. Seu sêmen foi
criopreservado na Androlab (Curitiba, Brasil), demonstrando uma adequada análise
seminal básica pré-congelamento (concentração 278x106/ml, motilidade progressiva
30%). O sêmen foi congelado usando um tampão com gema de ovo (TEST Yolk
Buffer, Irvine Scientific, EUA) como crioprotetor e mantido congelado por 16 meses.
Sua esposa, com 32 anos, teve sua estimulação ovariana realizada com
uma combinação de agonista do hormônio liberador de gonadotrofinas (aGnRH),
gonadotrofinas (rFSH) e gonadotrofina coriônica humana. Um total de 18 ovócitos
em metáfase II foram aspirados e submetidos à ICSI, sendo formados 15 embriões.
Três embriões foram transferidos três dias após a aspiração ovocitária guiada por
ecografia transabdominal usando cateter macio. Os doze embriões restantes foram
criopreservados. Uma gravidez única se desenvolveu e um bebê do sexo feminino
nasceu (peso de 2750 g e altura de 48 cm) após cesariana com 39 semanas de
gestação.

Discussão
Estes relatos demonstram que a criopreservação de sêmen permite ao
homem portador de neoplasia se tornar pai, até mesmo se submetido a tratamentos
agressivos, como orquiectomia, quimioterapia e radioterapia, ainda que os
espermatozoides permaneçam congelados por longo período. Todo esforço deve ser
feito para encaminhar pacientes com câncer para a criopreservação de sêmen antes
de se iniciar a quimio e radioterapia.
A criopreservação do sêmen antes do início de um tratamento que provoque
esterilidade permite o emprego de técnicas de reprodução assistida, especialmente
a micromanipulação de gametas, bastando que uma amostra com pequeno número
de espermatozoides esteja disponível.
Uma preocupação no manejo dos pacientes com câncer é que até 90%
deles terão azoospermia poucas semanas após o início da quimioterapia, e apenas
20-50% reassumem a espermatogênese dois a três anos após término do
tratamento.

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 Outro importante aspecto é a necessidade do congelamento de
ovócitos/tecido ovariano em mulheres jovens que se apresentam com câncer,
oferecendo a possibilidade de elas terem sua fertilidade restaurada após terapias
esterilizantes. Algum sucesso tem sido relatado usando-se esta técnica. O
entendimento da criopreservação de ovócitos e tecido ovariano é desejável para se
oferecer essa tecnologia também a pacientes com risco maior de falência ovariana
prematura. Existe uma preocupação legítima no que diz respeito ao risco potencial
de se reintroduzir células malignas com o transplante ovariano, dependendo do tipo
de câncer. No entanto, há um interesse grande no desenvolvimento de técnicas de
maturação in vitro de ovócitos, para que não haja necessidade de se transplantar o
tecido ovariano para o organismo da mulher para esse fim.
Sendo assim, com os recentes desenvolvimentos nas tecnologias de
reprodução assistida, as pacientes com câncer devem ser encorajadas a
preservarem seu potencial reprodutivo. Atualmente, um ou dois ciclos de fertilização
in vitro pré-tratamento com a criopreservação de embriões é a melhor opção. A
criopreservação de tecido ovariano, ovócitos imaturos ou maduros é uma técnica em
desenvolvimento e pode ser considerada para algumas pacientes. Se a falência
gonadal é um resultado provável, as esperanças recaem sobre as intensas
evoluções na estocagem de tecido ovariano. Em vista disso, o desenvolvimento
dessa nova tecnologia é muito desejável pela sua alta aplicabilidade em pacientes
jovens que venham a ser submetidas, com sucesso, a tratamentos agressivos contra
as mais diversas neoplasias.
O ressurgimento da indicação de criopreservação ovariana se deve à
melhoria da taxa de sobrevivência a longo prazo em pessoas jovens, portadoras de
doenças malignas, as quais são submetidas a tratamentos agressivos com terapias
oncológicas modernas, incluindo quimioterapia e radioterapia. Como resultado, um
grande número de pacientes jovens tem sido curado de suas neoplasias, mas
permanecem com a falência ovariana.
É importante salientar que mesmo com sêmen criopreservado por longo
período é possível conseguir-se uma gravidez viável. É importante oferecer aos
pacientes que serão submetidos à quimio e/ou radioterapia esta possibilidade,
embora eles possam não estar pensando em se tornar pais naquele momento.

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 A criopreservação de sêmen deve ser, portanto, parte de uma rotina no
manejo terapêutico para preservar a fertilidade em homens jovens com doenças
neoplásicas.

FONTE: Schuffner et al., 2004.

8.6 CRIOPRESERVAÇÃO DE EMBRIÕES

A criopreservação de embriões é indicada nos seguintes casos, segundo

Cornel et al. (2014):

− preservar os pré-embriões formados após ciclos de fiv/icsi, reduzindo

o risco de gravidez múltipla e aumentando a chance de gravidez por ciclo;
− aumentar a possibilidade de concepção em pacientes que não
apresentem endométrio adequado após indução;
− permitir posterior transferência embrionária em pacientes com
hiperestimulação ovariana;
− permitir a posterior transferência em casos de não sincronia dos
ciclos de doadora e receptora;
− permitir a doação de embriões a casais impossibilitados de produzir
seus próprios embriões;
− possibilitar o armazenamento de embriões para pacientes a serem
submetidas à quimio/radioterapia ou cirurgia ginecológica radical.

8.6.1 Pré-zigotos

O pré-zigoto, estágio de desenvolvimento do óvulo após a penetração do

espermatozoide, caracteriza-se pela presença, no centro da célula, de dois
corpúsculos separados, que representam as cargas cromossômicas provindas do
óvulo e do espermatozoide, os pró-núcleos.
Quando congelados pré-embriões em estágio de pró-núcleo, a seleção pode
ser feita unicamente por meio da classificação baseada na posição, no alinhamento
e no número de nucléolos, por isso a maioria dos centros prefere efetuar o

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congelamento após clivagem. A vantagem da criopreservação nesse estágio
consiste no fato dos pró-núcleos não apresentarem a decondensação dos núcleos,
na qual um novo ser geneticamente identificado é formado, portanto diminui
questões éticas associadas ao congelamento embrionário (CORNEL et al., 2014).
É de extrema importância congelar o pré-zigoto antes do desaparecimento
dos pró-núcleos, para garantir melhores resultados. A morfologia dos pré-zigotos
descongelados é, geralmente, semelhante a sua aparência pré-congelamento,
porém, ocasionalmente, o citoplasma é mais claro e há reduzido número de
organelas em torno das estruturas pró-nucleares (SOCIEDADE BRASILEIRA DE
REPRODUÇÃO HUMANA, 2006).
Após o descongelamento os nucléolos são frequentemente vistos
espalhados dentro dos pró-núcleos apesar de seu prévio alinhamento nas junções
pró-nucleares antes do congelamento. Pode ocorrer a condensação de dois pró-
núcleos em um grande pró-núcleo durante o processo de criopreservação. Deixado
em cultura por 15-24 horas, o pró-núcleo saudável completa o processo de
fertilização, e prossegue para primeira clivagem, o que indica verdadeiramente a
sobrevivência após o descongelamento; < 5% dos pré-zigotos que parecem estar
saudáveis após o descongelamento falham no seguimento deste padrão.

8.6.2 Pré-embriões em clivagem

Como em óvulos em estágio de pró-núcleo, os pré-embriões em clivagem se

desenvolvem após o descongelamento e resultam em taxas aceitáveis de gestação.
São comumente congelados, semelhantemente aos pré-zigotos, em soluções 1,5 M
de propanodiol associadas à sacarose (SOCIEDADE BRASILEIRA DE
REPRODUÇÃO HUMANA, 2006).
Os pré-embriões clivados podem ser congelados quando se encontram com
2 a 8 células, sem necessidade de restrições com relação ao momento da
criopreservação (CORNEL et al., 2014). Além dessa vantagem, o congelamento
nesse estágio permite melhor seleção embrionária, conforme as características
morfológicas e consequentemente permite otimizar as taxas de sobrevivência e

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implantação. Tornou-se mais comum escolher os melhores embriões para
transferência a fresco e congelar todos os outros com boa morfologia somente após
ter sido feita a seleção a fresco.
O descongelamento pode resultar em pré-embriões com blastômeros vivos e
mortos, o que se apresenta como a desvantagem desse processo, já que a
avaliação da viabilidade torna-se mais difícil. Cultivar esse pré-embrião por 18 a 24
horas pode confirmar viabilidade, se ocorrer uma ou duas divisões nesse período.
Em geral, um pré-embrião que possui mais de 50% de blastômeros viáveis no
descongelamento é considerado um sobrevivente (SOCIEDADE BRASILEIRA DE
REPRODUÇÃO HUMANA, 2006).
Não existe evidência convincente de que a perda de um ou dois blastômeros
é claramente danosa para os pré-embriões no seu desenvolvimento inicial. Apesar
disso, tem sido relatado que pré-embriões humanos inteiramente intactos
demonstram uma taxa de implantação mais elevada do que aqueles parcialmente
intactos (CORNEL et al., 2014).
Devem ser congelados nesse estágio os embriões remanescentes, após
transferência, com características morfológicas satisfatórias – zona pelúcida íntegra,
clivados no dia 2 para dia 3, que apresentarem blastômeros simétricos ou com
discreta assimetria e com menos de 50% de fragmentação. Os demais embriões
devem ser mantidos em cultura até dia 5, quando serão congelados somente os
blastocistos viáveis (SOCIEDADE BRASILEIRA DE REPRODUÇÃO HUMANA,
2006).

8.6.3 Blastocistos

A grande maioria dos centros de reprodução assistida prefere implantar

embriões no estágio de mórula, pois, entendem que prolongar o cultivo embrionário
até o estágio de blastocisto e criopreservá-lo pode resultar em problema futuro da
sua implantação devido a blastocele, pois por ser preenchida por água, pode formar
cristais de gelo quando a temperatura é reduzida, causando danos tanto à massa

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interna celular, quanto ao trofoblasto. Para resolver esse problema, muitos
pesquisadores têm colapsado a blastocele por micromanipulação.
Cota et al. (2011) avaliaram 292 ciclos de congelamento e descongelamento
de blastocisto, sendo que a idade média das mulheres de 34,35 anos. Os
pesquisadores obtiveram 604 blastocistos descongelados e desses 482 blastocistos
sobreviveram, sendo a taxa de sobrevivência do blastocisto de 80% e a taxa global
de gravidez por ciclo de descongelamento de 44,5%.
Atualmente, ao descongelar embriões, as taxas de sobrevida flutuam entre
40 e 100%. Essas taxas têm relação, acima de tudo, com o potencial biológico dos
embriões, previamente ao congelamento. É altamente provável que aqueles
embriões que não sobrevivem ao serem descongelados, são os mesmos que não
teriam atingido o desenvolvimento embrionário até a implantação (SOCIEDADE
BRASILEIRA DE REPRODUÇÃO HUMANA, 2006).

8.7 BIÓPSIA DE EMBRIÕES OU DIAGNÓSTICO GENÉTICO PRÉ-

IMPLANTACIONAL (PGD)

O Diagnóstico Genético Pré-Implantacional ou PGD (Preimplantation

Genetic Diagnosis) pode ser feito por retirada de um blastômero do embrião, sem
danificar o mesmo, para analisar doenças genéticas.
O diagnóstico genético pré-implantacional serve para diagnosticar possíveis
alterações cromossômicas como, por exemplo, a Síndrome de Down, síndrome de
Klinefelter, Síndrome de Patau; antes de transferir o embrião para o útero materno.
O PGD também permite identificar o sexo dos pré-embriões, a fim de evitar graves
doenças transmitidas de mãe para filho, como a hemofilia tipo A (CONGRESSO
REPRODUÇÃO, 2014).
Além disso, pode-se realizar biópsia do primeiro corpúsculo polar, também
denominado diagnóstico genético pré-concepcional (Figura 47), a biópsia do
segundo corpúsculo polar (FIGURA 48), a biópsia de blastômeros em estágio de
clivagem (Figura 49) ou a biópsia de células do trofoblasto (CERQUEIRA et al.,
2014).

AN02FREV001/REV 4.0

139
 Teoricamente, o melhor método de biópsia de embriões é utilizar células do
trofoblasto devido à maior quantidade de células para análise genética em
comparação a biópsia do primeiro corpúsculo polar.
Segundo a Resolução nº 2.013/13 do Conselho Federal de Medicina, o
diagnóstico genético pré-implantacional do embrião pode ser utilizado nos seguintes
casos:

[...] diagnóstico de alterações genéticas causadoras de doenças no embrião

e [...] tipagem do sistema HLA do embrião, com o intuito de seleção de
embriões HLA-compatíveis com algum filho(a) do casal já afetado por
doença, doença esta que tenha como modalidade de tratamento efetivo o
transplante de células-tronco ou de órgãos.

FIGURA 47  BIÓPSIA DO PRIMEIRO CORPÚSCULO POLAR (DIAGNÓSTICO

PRÉ-CONCEPCIONAL)

FONTE: Disponível em: <http://www.embryofetus.com.br/diagnosticogenericopreimplantacional >.

Acesso em: 04 mar. 2014.

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 FIGURA 48  BIÓPSIA DO SEGUNDO CORPÚSCULO POLAR

FONTE: Disponível em: <http://www.embryofetus.com.br/diagnosticogenericopreimplantacional >.

Acesso em: 04 mar. 2014.

FIGURA 49  BIÓPSIA DE BLASTÔMEROS EM ESTÁGIO DE CLIVAGEM

FONTE: Disponível em: <http://www.embryofetus.com.br/diagnosticogenericopreimplantacional>.

Acesso em: 04 mar. 2014.

Até agora, as três maiores aplicações do PGD são (FGO, 2014):

a) determinação do sexo de um pré-embrião por meio da técnica de
FISH (Fluorescent "in situ" Hibridization) usando "probes" (pedaços de
DNA marcados) específicos para os cromossomas X ou Y, ou por
análises de sequências cromossômicas usando a técnica de PCR

AN02FREV001/REV 4.0

141
 (Polymerase Chain Reaction) a fim de se determinar e evitar doenças
ligadas ao sexo;
b) detecção de certas aneuploidias (alterações da quantidade e
constituição dos cromossomos) e anomalias cromossômicas estruturais
em casos de translocações balanceadas no pré-embrião;
c) detecção de defeitos genéticos, envolvendo um único gene (tais
como fibrose cística, anemia falciforme, doença de Tay-Sachs) e outras
doenças comuns com alterações genéticas.

8.8 ASSISTED HATCHING

O procedimento do assisted hatching (AH) foi introduzido no final de 1980 e

consiste da dissecção parcial da zona pelúcida (PZD) – realização de um furo na
zona pelúcida no estágio de pré-embrião antes da transferência intrauterina – a fim
aumentar as chances de implantação (ABDELMASSIH, 2001).
O AH pode ser realizado nos embriões em qualquer estágio de clivagem (de
2 blastômeros até blastocisto), utilizando o ácido de Tyrode’s ou laser.

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142
FIGURA 50  ETAPAS DA TÉCNICA DE ASSISTED HATCHING. NOTAR A ZONA
PELÚCIDA PERFURADA (SETA BRANCA) NA FIGURA E

FONTE: Disponível em: <http://www.ivf-clinic-india.com/Laser-Assisted-Embryo-Hatching.php>.

Acesso em: 10 mar. 2014.

As principais indicações do assisted hatching são (ABDELMASSIH, 2001):

─ pacientes com idade avançada;
─ pacientes com diminuição da reserva ovariana;
─ espessamento da zona pelúcida;

AN02FREV001/REV 4.0

143
 ─ coloração anormal da zona pelúcida;
─ fragmentação citoplasmática excessiva;
─ embriões com morfologia pobre e baixas taxas de crescimento.

8.9 REMOÇÃO DE FRAGMENTOS DOS EMBRIÕES

Os fragmentos citoplasmáticos são componentes da membrana do

citoplasma que foram expelidos das superfícies dos ovócitos fertilizados e
blastômeros dos pré-embriões. Os pré-embriões com excessiva fragmentação (>
20%) têm uma taxa de implantação mais baixa do que aqueles sem fragmentação
Vários fatores podem ser responsáveis pela formação de fragmentos: condições de
cultivo, competência citoplasmática, integridade genética, cromossomos não
balanceados, alterações da cariocinese e citocinese e embriões congelados
(ABDELMASSIH, 2001).
Fragmentos de citoplasma podem ser removidos, por sucção delicada, após
a abertura de um furo na zona pelúcida. Não há evidências de que a remoção de
fragmentos interfere com o subsequente desenvolvimento dos pré-embriões, desde
que realizada de modo adequado; pelo contrário, esse procedimento beneficia os
pré-embriões com fragmentação (ABDELMASSIH, 2001).
A remoção de fragmentos tenta imitar o processo natural de eliminação de
células apoptóticas durante o desenvolvimento embrionário. Na realidade, o papel
dos processos apoptóticos durante o desenvolvimento dos pré-embriões humanos
precisa ser mais bem estudado.

AN02FREV001/REV 4.0

144
9 NORMAS ÉTICAS PARA A UTILIZAÇÃO DAS TÉCNICAS DE REPRODUÇÃO
ASSISTIDA (Resolução do Conselho Federal de Medicina n 2.013/13)

9.1 PRINCÍPIOS GERAIS

Nos princípios gerais dessa resolução são destacados os pontos cruciais

das técnicas de reprodução assistida (RA) no Brasil, objetivando auxiliar a resolução
dos problemas de reprodução humana e facilitando o processo de procriação:

[...] A idade máxima das candidatas à gestação de RA é de 50 anos.

[...] o consentimento informado será obrigatório para todos os pacientes
submetidos às técnicas de reprodução assistida.
[...] as técnicas de RA não podem ser aplicadas com a intenção de
selecionar o sexo (presença ou ausência de cromossomo Y) ou qualquer
outra característica biológica do futuro filho, exceto quando se trate de evitar
doenças ligadas ao sexo do filho que venha a nascer.
[...] o número máximo de ovócitos e embriões a serem transferidos para a
receptora não pode ser superior a quatro. Quanto ao número de embriões a
serem transferidos faz-se as seguintes recomendações: a) mulheres com
até 35 anos: até 2 embriões; b) mulheres entre 36 e 39 anos: até 3
embriões; c) mulheres entre 40 e 50 anos: até 4 embriões; d) nas situações
de doação de óvulos e embriões, considera-se a idade da doadora no
momento da coleta dos óvulos.
[...] em caso de gravidez múltipla, decorrente do uso de técnicas de RA, é
proibida a utilização de procedimentos que visem a redução embrionária.

9.2 PACIENTES DAS TÉCNICAS DE RA

Essa resolução representou um avanço aos direitos homoafetivos em nosso

país, pois, dispõe do seguinte item: “é permitido o uso das técnicas de RA para
relacionamentos homoafetivos e pessoas solteiras, respeitado o direito da objeção
de consciência do médico.”

AN02FREV001/REV 4.0

145
9.3 REFERENTE ÀS CLÍNICAS, CENTROS OU SERVIÇOS QUE APLICAM
TÉCNICAS DE RA

As clínicas, centros ou serviços que aplicam técnicas de RA são

responsáveis por todas as etapas dessas técnicas, tais como: coleta, manuseio,
conservação, distribuição, transferência e descarte de material biológico humano
para a paciente de técnicas de RA, devendo apresentar como requisitos mínimos:

1 - um diretor técnico responsável por todos os procedimentos médicos e

laboratoriais executados, que será, obrigatoriamente, um médico registrado
no Conselho Regional de Medicina de sua jurisdição;
2 - um registro permanente (obtido por meio de informações observadas ou
relatadas por fonte competente) das gestações, nascimentos e
malformações de fetos ou recém-nascidos, provenientes das diferentes
técnicas de RA aplicadas na unidade em apreço, bem como dos
procedimentos laboratoriais na manipulação de gametas e embriões;
3 - um registro permanente das provas diagnósticas a que é submetido o
material biológico humano que será transferido aos pacientes das técnicas
de RA, com a finalidade precípua de evitar a transmissão de doenças;
4 - Os registros deverão estar disponíveis para fiscalização dos Conselhos
Regionais de Medicina.

9.4 DOAÇÃO DE GAMETAS OU EMBRIÕES

Quanto à doação de gametas, a Resolução CFM nº 2.013/13, adota os

seguintes critérios:

A doação nunca terá caráter lucrativo ou comercial.

Os doadores não devem conhecer a identidade dos receptores e vice-versa.
A idade limite para a doação de gametas é de 35 anos para a mulher e 50
anos para o homem.
[...] Na região de localização da unidade, o registro dos nascimentos evitará
que um(a) doador(a) tenha produzido mais que duas gestações de crianças
de sexos diferentes, numa área de um milhão de habitantes.
[...] Não será permitido ao médico responsável pelas clínicas, unidades ou
serviços, nem aos integrantes da equipe multidisciplinar que nelas prestam
serviços, participarem como doadores nos programas de RA.

AN02FREV001/REV 4.0

146
9.5 CRIOPRESERVAÇÃO DE GAMETAS OU EMBRIÕES

Quanto à criopreservação de gametas e/ou embriões, a Resolução

estabelece que:

As clínicas, centros ou serviços podem criopreservar espermatozóides,

óvulos e embriões e tecidos gonádicos.
[...] no momento da criopreservação os pacientes devem expressar sua
vontade, por escrito, quanto ao destino que será dado aos embriões
criopreservados, quer em caso de divórcio, doenças graves ou falecimento
de um deles ou de ambos, e quando desejam doá-los.
Os embriões criopreservados com mais de cinco anos poderão ser
descartados se esta for a vontade dos pacientes, e não apenas para
pesquisas de células-tronco, conforme previsto na Lei de Biossegurança.

9.6 SOBRE A GESTAÇÃO DE SUBSTITUIÇÃO (DOAÇÃO TEMPORÁRIA DO

ÚTERO)

A gestação de substituição será utilizada desde que exista um problema

médico que impeça ou contraindique a gestação na doadora genética ou em caso de
união homoafetiva, respeitando-se os seguintes princípios:

1 - As doadoras temporárias do útero devem pertencer à família de um dos

parceiros num parentesco consanguíneo até o quarto grau (primeiro grau –
mãe; segundo grau – irmã/avó; terceiro grau – tia; quarto grau – prima), em
todos os casos respeitada a idade limite de até 50 anos.
2 - A doação temporária do útero não poderá ter caráter lucrativo ou
comercial.
3 - Nas clínicas de reprodução os seguintes documentos e observações
deverão constar no prontuário do paciente: termo de consentimento
Informado assinado pelos pacientes (pais genéticos) e pela doadora
temporária do útero, consignado; relatório médico com o perfil psicológico,
atestando adequação clínica e emocional da doadora temporária do útero;
os riscos inerentes à maternidade; a impossibilidade de interrupção da
gravidez após iniciado o processo gestacional, salvo em casos previstos em
lei ou autorizados judicialmente; a garantia do registro civil da criança pelos
pacientes (pais genéticos), devendo esta documentação ser providenciada
durante a gravidez; se a doadora temporária do útero for casada ou viver
em união estável, deverá apresentar, por escrito, a aprovação do cônjuge
ou companheiro.

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9.7 REPRODUÇÃO ASSISTIDA POST-MORTEM

É possível o uso de gametas criopreservados de pacientes falecidos, desde

que tenham deixado uma autorização prévia específica para o uso do material
biológico criopreservado, de acordo com a legislação vigente.

FIM DO MÓDULO III

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