Métodos de Preservação

Têm como objetivo manter as culturas num estado viável sem mudança morfológica, sem
alteração fisiológica ou genética. Para se obter um bom resultado na aplicação de um método
de preservação, a cultura deve estar em ótimas condições, deve-se respeitar as condições
ótimas de crescimento, temperatura, umidade, aeração, iluminação e meio de cultivo.

Repique

Agente solidificante: agar

É o método mais tradicional de preservação de culturas (transferência periódica da cultura

para um novo meio de cultivo sólido). O intervalo entre cada transferência varia com o
microrganismo, meio de cultivo e condição ambiental (dura geralmente de 3 a 6 meses – curto
prazo).

Preservação sob Óleo Mineral

Muitas espécies de microrganismos podem ser preservadas por meses ou até anos
(geralmente um ano) através deste método simples e fácil. O óleo deve ser esterilizado por
aquecimento em forno Pasteur a 170°C por uma ou duas horas ou autoclavagem dupla por
15min a 121°C. Após o crescimento adequado, colocar assepticamente o óleo mineral estéril
se o método de preservação for em placa, colocar uma camada de 1 a 2cm de óleo mineral.
Isso impede a desidratação e reduz a atividade metabólica, assim como a velocidade de
crescimento.

Blocos de Agar em Água (Técnica de Castellani)

O método consiste em cultivar o microrganismo em uma placa de Petri após crescimento

vigoroso o agar é cortado com uma lâmina estéril em blocos de aproximadamente 4 a 6mm. O
tubo de ensaio contendo água deve ter de 10 a 15ml de água estéril. Restrição: somente para
microrganismos que possuem grade aderência ao agar (fungos filamentosos e leveduras).

Secagem

Secagem em suportes inertes (areia estéril, solo estéril, sílica gel, pérolas de vidro, pérolas de
porcelana, sabugo de milho, papel de filtro). É considerada como um bom método de
conservação. Pode ser realizada através de uma secagem simples ou em secadores com ou
sem vácuo. Tempo máximo de estocagem: 6 a 10 anos.

Passos

1. Suporte esterilizado
 2. Inoculação com suspensão de esporos
3. Incubação em estufa
4. Secagem em estufa por duas a três semanas
5. Armazenamento em geladeira (pelo menos 4°C)

Essa técnica é mais empregada para esporos de fungos filamentosos e de Clostridium e

Bacillus.

Liofilização

A liofilização é um dos métodos mais econômicos, mais eficientes e que ocupa o menor
espaço. É um dos métodos mais eficientes de conservação a longo prazo. Ele permite a
produção de um grande número de liofilizado porque o uso de pequenas ampolas facilita a
estocagem. Enquanto o procedimento da liofilização é relativamente simples, o aspecto
teórico é bastante complexo, pois a liofilização envolve a remoção de água de uma suspensão
de microrganismos congelados por sublimação sob pressão reduzida, isto é, a água evaporada
sem passar pela fase líquida.

OBS.: as células liofilizadas podem ser estocadas por longos períodos, desde que mantidas
longe do oxigênio, umidade e luz.

 Requisitos básicos para a liofilização:

1. Meio de suspensão externo para congelamento (álcool metílico ou etílico+gelo
seco)
2. Gerador e mantenedor de vácuo (bomba)
3. Absorvente do vapor d’água (dissecante, condensador, líquido refrigerante)

 Parâmetros de liofilização
 Tipo de célula
 Crescimento e idade da cultura
 Concentração celular
 Meio de suspensão (crioprotetores)
 Velocidade de resfriamento
 Método de secagem
 Condição de estocagem
 Método de constituição e análise (medidas de viabilidade celular, injúria e morte)

 Crioprotetores são materiais proteicos, carboidratos, aminoácidos, leite desnatado e

outros.

 Meio de suspensão
 Leite desnatado 10% + Inusitol 5%
 Sacarose 7% + Peptona 7%
 Inusitol 5% + Soro de Sangue de Cavalo ou outros animais
  Método da Liofilização
1. Pré-congelamento + vácuo (umidade residual de no máximo 1 a 2%)
2. Centrifugação + vácuo
3. Congelamento (0 a -20°C) ou congelamento direto em nitrogênio líquido

 Tempo de estocagem: 10 a 20 anos

Estocagem em baixa temperatura e congelamento

Nitrogênio líquido: -20 a -196°C

Crioprotetores:

São adicionados ao meio para que haja proteção do microrganismo durante os processos de
congelamento, nitrogênio líquido, ultrafreezer, liofilização e nas etapas de descongelamento.
Podem ser divididos em duas categorias: intracelulares (ou penetrantes) e extracelulares (ou
não penetrantes).

Crioprotetores intracelulares: substâncias de baixo peso molecular como alcoóis (glicerol,

DMSO, etilenoglicol, etanol e 1,2-propanodiol. Possuem ação hidrofílica elevada, devido à
presença de grupos químicos formados por um hidogênio forte, especialmente os formados
pelos grupos que contêm hidroxila, amida, sulfóxidos e, em menor intensidade, grupos
carboxila e amina).

Crioprotetores extracelulares formam uma camada viscosa na superfície celular, causando o

influxo parcial da água e impedindo a formação de cristais de gelo.

Os crioprotetores intracelulares possuem habilidade de reduzir a concentração de eletrólitos

extracelulares. O glicerol, um crioprotetor de baixo peso molecular, penetra nos blastômeros
promovendo a saída de água, minimizando, desta forma, a formação de gelo intracelular e
estabilizando a membrana celular.

Crioprotetores extracelulares: incluem os açúcares (galactose, glicose, trealose, manitol,

sorbitol, sacarose), funcionam isoladamente apresentando efeito estabilizador sobre as
membranas, porém, não apresentam efeito de crioproteção tão eficaz quanto os
intracelulares, sua principal utilização é em associação com os intracelulares, por possuírem
alto peso molecular, permanecendo no meio extracelular promovendo um período inicial de
saída de água, um posterior ingresso dos protetores intracelulares.