Preservação de bactérias-

orientações gerais
Importância

 Evitar a formação de mutações sucessivas que

podem alterar as características do micro-
organismo podendo comprometer um processo ou
produto;

 Garantir a máxima preservação da vitalidade das

células e células viáveis.
Qual método utilizar?

 A escolha depende:

 das características do método,

 dos custos da manutenção,
 da importância do acervo,
 da disponibilidade de equipamentos,
 do treinamento da equipe.
Influência de fatores ambientais

 Composição do meio;
 Temperatura;
 pH do meio;
 Aeração;
 Idade de cultura;
 Concentração celular.
 Influência de fatores ambientais
 meio de cultivo

 Recomenda-se um meio pobre em nutrientes para evitar o

crescimento acelerado e geração de mutantes indesejáveis;
 Meio de cultura pobre o metabolismo celular se reorganiza
para estocagem de energia;
 Meio de cultivo rico é recomendado, em alguns casos,
devido a percentagem de células viáveis ser maior em
relação ao meio pobre.
 Influência de fatores ambientais
 Temperatura e pH

 Temperaturas baixas retardam as reações químicas, a ação

das enzimas, e atrasam ou inibem o crescimento dos micro-
organismos. Quanto mais baixa a temperatura mais lenta
serão as reações químicas, as ações enzimáticas e o
crescimento microbiano;
 Recomenda-se conhecer o pH ótimo para crescimento do
micro-organismos e utilizá-lo no cultivo para preservação.
 Influência de fatores ambientais
 Idade da cultura

 Recomenda-se preservar as bactérias no fim da fase

logarítmica ou início da fase estacionária.

 concentração celular

 Recomenda-se manter uma concentração inicial de 108 -

1010 células/mL para preservação.
Resistência celular
 Diferentes grupos de micro-organismos apresentam
diferentes resistências;
 Micro-organismos produtores de esporos apresentam
melhores resultados de viabilidade em todos os métodos
de preservação, devido a baixa quantidade de água nos
esporos, uma forma de preservação natural;
 Procariotos são mais resistentes que os eucariotos;
 Gram positivas mais resistentes que as Gram negativas.
Resistência celular

 Métodos de preservação proporcionam graus

variados de sucesso em diferentes espécies de
bactérias, não existindo ainda um método
universalmente aplicável para o sucesso da
preservação de todas as bactérias (Holland et al.,
2003) .
 Métodos de preservação
 Métodos de curto prazo:
 repique contínuo ou subcultivo.
 Métodos de médio prazo:
 preservação em óleo mineral, preservação em água
esterilizada, congelamento a -20 °C, secagem em
sílica-gel, solo ou papel-filtro.
 Métodos de longo prazo:
 liofilização, congelamento a -80 °C, criopreservação
em nitrogênio líquido.
 Repique contínuo
 O método consiste na inoculação do microrganismo em meio
adequado, incubação em ambiente favorável à multiplicação
e estocagem em baixas temperaturas, após sua
multiplicação.
 Armazenamento de culturas sob refrigeração (5 a 8°C ) para
redução do metabolismo do micro-organismo e o aumento
entre os intervalos de repiques das culturas, proporcionando
a conservação de bactérias em torno de cinco a doze meses.
Repique contínuo
 Não requer reativação celular;
 Não provoca injúria ou estresse celular;
 Não requer equipamentos sofisticados;
 Técnica simples e de baixo custo.

 Risco de contaminação devido a manipulação das

culturas em repiques periódicos;
 Perda das características genéticas decorrentes de
mutações;
 Necessidade de verificação periódicas das
características de cada isolado;
 Maior espaço físico para armazenamento.
 Métodos de preservação
 Métodos de curto prazo:
 repique contínuo ou subcultivo.
 Métodos de médio prazo:
 preservação em óleo mineral, preservação em água
esterilizada, congelamento a -20 °C, secagem em
sílica-gel, solo ou papel-filtro.
 Métodos de longo prazo:
 liofilização, congelamento a -80 °C, criopreservação
em nitrogênio líquido.
 Preservação em óleo mineral
 Método consiste na aplicação de uma camada de óleo mineral
esterilizada de 1 cm de altura sobre uma cultura de micro-organismos
em estado sólido ou líquido.
 A camada de óleo irá limitar a quantidade de oxigênio disponível para
o micro-organismo, causando uma diminuição no crescimento e no
metabolismo microbiano.
 Óleo mais utilizados são a parafina e a vaselina esterilizadas por
autoclavagem a 1 atm por 30 min seguida de secagem a 150 ºC ou
através de aquecimento à 170 °C por 1 h.
 Periodicidade: 1 a 7 anos dependendo da espécie bacteriana.
Preservação em óleo mineral
 Não requer reativação celular;
 Não requer equipamentos sofisticados;
 Técnica simples e de baixo custo;
 Eficaz na longevidade da cultura.

 Risco de contaminação devido a manipulação das

culturas em repiques periódicos;
 Risco de contaminação do próprio óleo mineral;
 Provoca injúria ou estresse celular;
 Perda das características genéticas decorrentes de
mutações;
 Necessidade de verificação periódicas das
características de cada isolado;
 Maior espaço físico para armazenamento.
 Preservação em água ou salina
 O método resulta na diminuição do metabolismo e formação de
estado latente da célula devido à falta de fontes nutritivas.
 Consiste de uma suspensão celular ou bloco de ágar com
crescimento microbiano adicionado a uma solução de água ou
salina esterilizada e conservado a baixas temperaturas ou
temperatura ambiente.
 Bons resultados com bactérias fitopatogênicas.

 Periodicidades 1 a 2 anos.
Preservação em água ou salina
 Armazenamento à temperatura ambiente;
 A solução não é atacada por ácaros;
 Aplicada a muitos gêneros de bactérias;
 Não requer equipamentos sofisticados;
 Técnica simples e de baixo custo.

 Risco de contaminação devido a manipulação das

culturas em repiques periódicos;
 Perda das características genéticas decorrentes de
mutações;
 Necessidade de verificação periódicas das
características de cada isolado.
 Congelamento a – 20 °C

 O método consiste na preservação de micro-organismos a – 20

°C em freezers comuns.
 A suspensão microbiana é adicionada a uma solução de
glicerol de 10 a 20% e mantida a temperatura – 20 °C.
 Preserva diversos micro-organismos por períodos de três
meses a dois anos, devido a uma redução significativa no
metabolismo celular.
Congelamento a – 20 °C
 Aplicada a muitos gêneros de bactérias;
 Não requer equipamentos sofisticados;
 Técnica simples e de baixo custo.

 Risco de diminuição da viabilidade em função dos

danos causados às células em decorrências da
formação de cristais de gelo e da variação
eletrolítica na faixa de temperatura utilizada.
 Secagem
 O método consiste na suspensão do micro-organismo que é derramada
sobre carregadores como areia, lama, solo, carvão ativado, grãos de trigo,
esferas de vidro, grânulos gelatinosos ou sintéticos, papel-filtro, entre
outros.
 Estes elementos são considerados efetivos no processo preservação dos
micro-organismos devido a grande superfície e a capacidade de absorver
parte da umidade celular.
 A secagem pode ser a temperatura ambiente ou em aquecimento de 36-40
ºC com ou sem o uso de compostos hidrofílicos como a sílica-gel.
 Boa aceitação para actinomicetos, leveduras e alguns anamórficos.
Secagem
 Período de preservação em média de 5 ou mais anos;
 Modificações morfológicas ou fisiológicas são reduzidas ou
praticamente eliminadas, pois são utilizados formas de
resistência como esporos.

 Aplicável apenas para micro-organismos com capacidade

de produzir esporos resistentes ou outras formas de
resistência;
 Dificuldade em perceber contaminações, as quais são
notadas apenas durante a repicagem.
 Métodos de preservação
 Métodos de curto prazo:
 repique contínuo ou subcultivo.
 Métodos de médio prazo:
 preservação em óleo mineral, preservação em água
esterilizada, congelamento a -20 °C, secagem em
sílica-gel, solo ou papel-filtro.
 Métodos de longo prazo:
 liofilização, congelamento a -80 °C, criopreservação
em nitrogênio líquido.
 Liofilização ou freeze drying
 O método consiste na remoção de água intracelular de material
biológico congelados, por sublimação, evitando a formação de cristais
de gelo capazes de provocar danos às estruturas celulares e
degradação de enzimas, seguindo-se de secagem sob pressão à
vácuo.
 No congelamento ocorre a inércia do material liofilizado gerando a
interrupção das reações químicas e atividades biológicas.
 Método mais empregado nas coleções de culturas.
 Periodicidade da preservação de 17 a 20 nos para a maioria dos micro-
organismos.
 Liofilização ou freeze drying
 Taxa de viabilidade

+
Bactérias formadoras de esporos
Gram positivas

- Gram negativas

 Avaliação do período de estocagem

 Algumas espécies se mantem enquanto outras caem a viabilidade
nos primeiros anos e depois estabilizam.
 Liofilização ou freeze drying
 Desidratação a partir do estado de congelamento, (possibilitando
a remoção da água de estruturas rígidas mantidas pelo
congelamento);
 Manutenção da viabilidade de vários micro-organismos por
muitos anos sem alterações de suas características genéticas;
 Não requer manutenção frequente;
 Pouco espaço para armazenamento;
 Facilidade de transporte das amostras liofilizadas.

 Amostras de ampolas recentemente liofilizadas devem ser

testadas quanto à viabilidade para que se evite o
armazenamento de culturas mortas;
 Substância protetora deve ser devidamente esterilizada, e a
escolha do protetor depende do micro-organismo (sendo
necessário fazer testes empíricos).
 Custo do equipamento é alto.
 Congelamento a – 80 °C

 O método consiste na preservação de micro-organismos a – 80 °C em

ultrafreezers.
 A suspensão microbiana é cultivada até o meio ou final da fase logarítmica
e as células são suspensas em uma solução de glicerol de 10 a 20% e
então, congelado a – 70 °C , com resfriamento de 1 a 2 °C por min.
 Aplicado para a maioria das bactérias.
Congelamento a – 80 °C
 Período de preservação acima de 10 anos;
 Método simples e pouco oneroso.

 Risco de diminuição da viabilidade em função dos danos

causados às células em decorrências da formação de
cristais de gelo e da variação eletrolítica na faixa de
temperatura utilizada;
 Custo elevado do equipamento e sua manutenção;
 Infraestrutura sofisticada (gerador).
 Nitrogênio líquido -180 a -196 °C

 O método consiste na preservação de micro-organismos entre -180 e -196

°C em tanques de nitrogênio.
 A suspensão microbiana é cultivada até o meio ou final da fase logarítmica
e as células são suspensas em uma solução de glicerol de 10 a 20% ou
DMSO e, então, a amostra é resfriada lentamente na razão de 1 ºC por
minuto até -20 °C em freezer comum. Em seguida, é feita uma rápida
transferência para o congelador de nitrogênio líquido para resfriar a amostra
rapidamente até – 180 a -196 °C.
 Aplicado para a maioria das bactérias, leveduras e fungos filamentosos,
vírus, células animais.
Nitrogênio líquido – 180 a 196 °C
 Período de preservação acima de 20 anos;
 Método simples;
 Boa viabilidade após resfriamentos.

 Custo do equipamento;
 Manutenção com reposição do nível de nitrogênio líquido,
pois ele evapora.
 Pessoal treinado para operação e manutenção do
equipamento.
 Considerações sobre os crioprotetores
 Mais comuns:
 glicerol, dimetilsulfóxido (DMSO), soro de sangue, soro de albumina,
leite desnatado, extrato de levedura e sacarose.
 Características:
 não seja tóxico, seja hidrofílico, não seja reativo com a água
facilmente, previna a hiperconcentração na suspensão, estabilize as
pontes de hidrogênio nos cristais, previna a formação de cristais
grandes, e tenha boa penetração celular (somente para crioprotetores
endocelulares).
 Escolha é empírica
Crioprotetores utilizados com bactérias

Espécie do micro-organismo Agente (s) Referência (s)

crioprotetor (es)
Actinomyces noursei Etilenoglicol, PEG Hubálek, 2003, Konev et al., 1975
Aerobacter aerogenes PEG Nash, 1963

Enterobacter aerogenes Sacarose Postgate & Hunter, 1961

Escherichia coli Glicerol, sacarose, Keith, 1913, Ray et al., 1975, Sharp,
DMSO 1984
Lactococcus lactis ssp. lactis Sacarose Chavarri et al., 1988
Lactobacillus bulgaricus Trealose Antoni et al., 1989
Leptospira interrogans Glicerol Stalheim, 1966
Mycoplasma sp Sacarose Jurmanová & Machatková, 1974
Salmonella entérica Sacarose Sola et al, 2012
Spirillum volutans DMSO Pauley & Krieg, 1974

Fonte: Aguiar et al 2012

 Referências bibliográficas

 Aguiar et al (2012). Princípios básicos da criomicrobiologia:

enfoque nos tipos de micro-organismos e nos principais agentes

crioprotetores.
 MORGAN et al (2006). Preservation of micro-organisms by drying
– A review.
 Sola et al (2012). Manutenção de microrganismos: conservação e
viabilidade.