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UNINASSAU
BIOMEDICINA

SILVIA MARIA PINTO BORGES

TRABALHO DE CONCLUSÃO DE CURSO

AVALIAÇÃO DA EFICÁCIA E POTENCIAL CITOTÓXICO DO

DIMETILSULFÓXIDO (DMSO) NA CRIOPRESERVAÇÃO DE
CÉLULAS DA LINHAGEM NCTC CLONE 929

CAMPINA GRANDE

2019
 1

SILVIA MARIA PINTO BORGES

AVALIAÇÃO DA EFICÁCIA E POTENCIAL CITOTÓXICO DO

DIMETILSULFÓXIDO (DMSO) NA CRIOPRESERVAÇÃO DE
CÉLULAS DA LINHAGEM NCTC CLONE 929

Trabalho de Conclusão de Curso

apresentado como requisito parcial
para conclusão do curso de
Biomedicina da UNINASSAU- CG.

CAMPINA GRANDE
2019
 2

AVALIAÇÃO DA EFICÁCIA E POTENCIAL CITOTÓXICO DO

DIMETILSULFÓXIDO (DMSO) NA CRIOPRESERVAÇÃO DE
CÉLULAS DA LINHAGEM NCTC CLONE 929
Silvia Maria Pinto Borges1
Igor Prado de Barros Lima2

RESUMO
De acordo com a ABNT 6028:2003, o resumo deve ressaltar o objetivo, o
método, os resultados e as conclusões do documento. Deve ser composto de
uma sequência de frases concisas, afirmativas e não de enumeração de
tópicos. Recomenda-se o uso de parágrafo único, com espaçamento simples
entre as linhas. A primeira frase deve ser significativa, explicando o tema
principal do documento. A seguir, deve-se indicar a informação sobre a
categoria do tratamento (memória, estudo de caso, análise da situação etc.).
Deve-se usar o verbo na voz ativa e na terceira pessoa do singular. As
palavras-chave devem figurar logo abaixo do resumo, antecedidas da
expressão Palavras-chave, separadas entre si por ponto e finalizadas também
por ponto. A sua extensão deve ter de 100 a 250 palavras.

Palavras-chave: devem ser apresentadas 5 palavras, como a primeira letra

maiúscula, separadas entre si por ponto e finalizadas também por ponto.

TÍTULO E SUBTÍTULO (QUANDO HOUVER) EM LÍNGUA ESTRANGEIRA

ABSTRACT/ RESUMEN / RÉSUMÉ

Mesmo resumo em português, porém em língua estrangeira (inglês, espanhol

ou francês).

Keywords/ Palabras clave/ Mots-clés: As mesmas palavras-chave do resumo

em português, porém em língua estrangeira (inglês, espanhol ou francês).

1 INTRODUÇÃO

A criobiologia, que estuda os efeitos das baixas temperaturas em

sistemas biológicos, teve o seu grande impulso em 1949 quando Polge
comprovou que a adição de glicerol prévia ao congelamento protegia

1
Graduanda do curso de Biomedicina pela UNINASSAU-CG.
2
Professor Orientador Dr. do Curso de Farmácia da UNINASSAU-CG.
 3

espermatozóides de galinha da criolesão (FULLER et al., 2017). Desde então

vários métodos de criopreservação têm sido desenvolvidos para vários tipos de
células, tecidos e órgãos, sendo o armazenamento em nitrogênio líquido o mais
comum. No entanto, todos eles possuem o mesmo objetivo: cessar
reversivelmente as funções biológicas da célula, independentemente do
período de armazenamento (SILVA et al., 2017).
Quando uma célula é mantida em cultura durante longos períodos de
tempo, a sua susceptibilidade a eventos indesejáveis como transformação,
instabilidade fenotípica, senescência ou ainda contaminação microbiológica
aumentam exponencialmente. Para preservar as suas características
biológicas, é então importante que a célula seja criopreservada, e
descongelada apenas quando a sua utilização se fizer necessária (OCK; RHO,
2011). No entanto, o stress osmótico e choque térmico resultantes do
congelamento celular, podem levar ao desenvolvimento de lesões irreversíveis
que eventualmente culminam na morte celular.
Para mitigar o nível de criolesão provocada pela formação de gelo e
prevenir a morte celular, a adição de agentes crioprotetores (ACP’s) à
suspensão celular é uma etapa imprescindível durante o congelamento
(HRISTOVA et al., 2017). Um ACP é um soluto que quando presente promove
uma sobrevivência celular pós-descongelamento superior àquela obtida na sua
ausência (ELLIOT et al., 2017).
Um dos ACP’s mais comumente utilizados, o dimetilsulfóxido (DMSO),
foi descoberto em 1867 e inicialmente utilizado no setor industrial (CAPRIOTTI;
CAPRIOTTI, 2012), tendo a sua introdução na medicina em 1964 quando a sua
capacidade de penetração cutânea foi descoberta (JACOB et al., 1964). Na
criobiologia, o DMSO foi utilizado pela primeira vez como ACP em 1959
(LOVELOCK; BISHOP, 1959), e desde então a sua presença nesta área tem
sido constante.
A sua capacidade de modular a formação de gelo, explicada pela sua
ação coligativa com moléculas de água; as suas pequenas dimensões, que
permitem a sua rápida difusão através da membrana celular; e a sua
capacidade de estabilização desta membrana durante a diminuição da
temperatura, fazem do DMSO um ACP bastante efetivo (FULLER et al., 2017;
HEBLING et al., 2015; NAALDIJK et al., 2016).
 4

Apesar das suas propriedades crioprotetoras, quando utilizado em

concentrações elevadas, o DMSO possui atividade citotóxica num padrão
dose-dependente (HRISTOVA et al., 2017). Diversos estudos reportaram já
estas propriedades indesejáveis, tendo sido descritos eventos como ruptura da
membrana celular (CHENG et al., 2015), dano mitocondrial, potencial
apoptótico (YUAN et al., 2014), desestabilização e desnaturação protéica
(TUNÇER et al., 2018), alteração da expressão gênica (VERHEIJEN et al.,
2019) e genotoxicidade (ALSALIM et al., 2019).
Neste contexto, a utilização de uma concentração de DMSO
inadequadamente elevada durante a criopreservação, pode resultar numa
sobrevivência celular reduzida, e as células que sobreviverem ao
congelamento podem sofrer lesões irreversíveis durante e/ou após o processo,
o que eventualmente resultará na sua morte in vitro.
Este estudo visa então averiguar a citotoxicidade de diferentes
concentrações de DMSO utilizadas na criopreservação, adotando-se como
modelo a linhagem celular NCTC clone 929, uma linhagem de fibroblastos de
camundongo isolada a partir de tecido conjuntivo e adiposo subcutâneos. O
seu objetivo principal será determinar qual a concentração de DMSO ideal para
a criopreservação, isto é, uma concentração que resulte numa sobrevivência
celular máxima após descongelamento, e que não produza efeitos citotóxicos
significativos num ambiente in vitro.

2 FUNDAMENTAÇÃO TEÓRICA

2.1 TRANSIÇÃO ÁGUA-GELO

Nenhum tipo de reação química, processo biológico ou atividade celular

ocorrem à temperatura criogênica (< -150 ˚C). Assim sendo, o principal desafio
da criopreservação não é a capacidade das células suportarem o
armazenamento prolongado, mas sim a letalidade de uma faixa intermediária
de temperatura (entre - 15˚C e - 60˚C) que elas devem atravessar duas vezes
(congelamento e descongelamento) (FULLER et al., 2017).
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Como ilustrado na Figura X, durante o congelamento, quando a

temperatura chega até aproximadamente -5˚C, as células e o ambiente
extracelular encontram-se ainda descongelados e em sobrefusão. Entre os -
5˚C e -15˚C, inicia-se a formação de cristais de gelo no meio extracelular, o que
resulta na remoção de água deste meio, na sua concentração, e por
consequência, no progressivo desenvolvimento de um gradiente osmótico. Os
conteúdos celulares, no entanto, permanecem descongelados e em
superfusão, pelo que a água intracelular começa neste ponto a abandonar a
célula e a congelar no seu exterior (FULLER et al., 2017).

Figura X: Célula sujeita a diferentes velocidades de congelamento.

Fonte: Fuller et al. (2017, p.365).

A formação de gelo é um processo rápido, mas o transporte de água

através da membrana celular é um processo relativamente lento, já que a
membrana atua como uma barreira de resistência. O que acontece de seguida
depende da velocidade de congelamento (CURTIS et al., 2015).
Se a célula for congelada a uma velocidade demasiado elevada não
conseguirá perder água o suficientemente rápido para manter o equilíbrio
osmótico. Este equilíbrio será eventualmente atingido pelo congelamento da
água no meio intracelular, o que resultará em dano mecânico às estruturas
intracelulares. Pelo contrário, se a célula for congelada lentamente terá tempo
para perder água de forma progressiva, na tentativa de concentrar os solutos
intracelulares, o que resultará na sua desidratação e perda de volume. No
 6

entanto, a desidratação excessiva e a exposição prolongada às altas

concentrações de solutos extracelulares, podem provocar danos à membrana,
desnaturação protéica, distorção da morfologia, e lesão celular irreversível
(CURTIS et al., 2015).
Fica assim claro que para sobreviver à criopreservação a célula
necessita de ser desidratada até um limite reversível que previna a
cristalização intracelular de água. Isso é, conseguido através de velocidades de
congelamento lentas, porém rápidas o suficiente para evitar o stress
hiperósmotico e consequente desenvolvimento de lesões celulares
irreversíveis.
A velocidade de congelamento ideal é dependente de vários fatores
como, por exemplo, o tipo de célula, a permeabilidade da sua membrana e a
sua tolerância à desidratação. Células diferentes possuem diferentes
parâmetros de permeabilidade de membrana, pelo que são esperadas
variações na resposta de diferentes tipos celulares a determinada velocidade
de congelamento. Como reportado por Curtis et al. (2015), a velocidade de
congelamento ideal é variável, e pode chegar até aos -1000°C/min para
eritrócitos humanos. No entanto, para a maioria das células animais nucleadas,
a taxa ideal de congelamento ronda os -1°C/min (FULLER et al., 2017).
Existem várias estratégias para se conseguir uma velocidade de
congelamento de -1°C/min. A mais eficaz consiste na utilização de um
ultrafreezer programável, acoplado e controlado por um sistema informático
que rigorosamente mantém a temperatura de congelamento no valor desejado.
Outra forma menos dispendiosa é a utilização de um recipiente de
congelamento internamente preenchido por um álcool, geralmente o
isopropanol.
Independentemente da velocidade de congelamento adotada, quando a
temperatura ronda os - 80˚C, a solução intra e extracelular remanescente,
altamente concentrada e viscosa, começa a transformar-se numa matriz vítrea.
Nesta matriz todo o movimento de água cessa, pelo que cessa então o efluxo
de água através da membrana e a sua cristalização no meio extracelular
(FULLER et al., 2017).
 7

2.2 AGENTES CRIOPROTETORES

Como descrito anteriormente, a sobrevivência da célula submetida ao

congelamento depende da sua capacidade de resistir a dois eventos
potencialmente lesivos: a desidratação, provocada por velocidades de
congelamento demasiado lentas; e o dano mecânico associado à formação de
cristais de gelo intracelulares, provocado por velocidades de congelamento
demasiado elevadas. Para além da adequação da velocidade de
congelamento, é prática comum a utilização de ACP’s na tentativa de minimizar
os referidos efeitos deletérios (LAUTERBOECK et al., 2017).
Os ACP’s são solutos que quando adicionados à suspensão celular
previamente ao congelamento, promovem uma sobrevivência celular pós-
descongelamento superior àquela obtida na sua ausência (ELLIOT, et al.,
2017). Eles apresentam ação coligativa com as moléculas de água, sendo
capazes de estabelecer pontes de hidrogênio com estas moléculas, o que lhes
confere a capacidade de modular a formação de gelo. Quer isto dizer que, a
uma dada temperatura negativa, a quantidade de gelo no meio intra e
extracelular vai ser menor na presença de ACP’s do que na sua ausência
(FULLER et al., 2017). Isto significa que quando se ultrapassam os - 80˚C e se
caminha para a temperatura criogênica em que todo o movimento de água
cessa; a célula não só desenvolveu uma menor quantidade de gelo no seu
interior, como também foi exposta a menores concentrações de solutos, pelo
que sofreu uma menor desidratação e redução de volume (ELLIOT et al.,
2017).
Apesar da sua atividade crioprotetora, a maioria dos ACP’s possuem
efeitos citotóxicos, especialmente a elevadas concentrações e temperatura. Os
ACP’s podem ser considerados tóxicos se a membrana celular for lesada, se
as atividades enzimáticas forem prejudicadas, se o desenvolvimento celular for
diminuído, se a função mitocondrial for reduzida ou ainda se o DNA, proteínas
ou outras macromoléculas forem danificados (BEST, 2015). Os mecanismos da
toxicidade variam consoante o ACP e embora não sejam ainda compreendidos
na sua totalidade, é sabido que é fundamental o balanceamento entre os seus
efeitos crioprotetores e citotóxicos para uma criopreservação bem-sucedida
(HRISTOVA et al., 2017).
 8

2.3 DIMETILSULFÓXIDO

O DMSO é um composto organossulfurado polar, de fórmula química

C2H6SO e peso molecular de 78,13 g/mol. Tal como ilustrado pela Figura X, o
DMSO é composto por um grupo sulfóxido hidrofílico e dois grupos metil
hidrofóbicos.

Figura X: Estrutura química do DMSO.

Fonte: Gurtovenko e Anwar (2007, p. 10453).

Este composto foi descoberto pela primeira vez pelo químico russo
Alexander Saytzeff em 1867 como um subproduto da extração da celulose. A
sua notável capacidade como solvente polar aprótico, miscível em água e
capaz de dissolver uma enorme variedade de moléculas polares e apolares,
impulsionou a sua aplicação no ramo industrial (CAPRIOTTI; CAPRIOTTI,
2012). A partir da década de sessenta do século XX, Jacob et al. (1964)
introduziram o DMSO na medicina como agente farmacológico e terapêutico,
após constatarem que este composto possuía a capacidade de penetração
cutânea. Desde então o DMSO tem sido amplamente utilizado como solvente
na indústria farmacêutica, e embora os seus efeitos biológicos não sejam ainda
compreendidos na sua totalidade, inúmeras propriedades vantajosas têm sido
descritas ao longo do tempo, como a sua capacidade anti-inflamatória,
imunomoduladora, antimicrobiana, vasodilatadora e antioxidante (AHN et al.,
2014).
Na criobiologia, o DMSO foi utilizado como ACP pela primeira vez por
Lovelock e Bishop (1959), que reportaram o congelamento bem sucedido de
sémen de touro e eritrócitos humanos e bovinos na presença deste composto.
Eles demonstraram que mediante a adição de DMSO à suspensão celular,
 9

seria possível diminuir o ponto de congelamento da solução, diminuindo-se

assim a exposição das células a um ambiente extracelular hiperosmótico. Para
além disso, Lovelock e Bishop (1959) sugeriram ainda que o DMSO teria a
capacidade de atravessar a membrana celular e proteger os compartimentos
intracelulares.
De fato, estas propriedades são o resultado da natureza polar do DMSO
e a sua capacidade de estabelecer pontes de hidrogênio não só com a água
como também com proteínas, carboidratos, ácidos nucleicos, compostos
iônicos e outros constituintes dos sistemas biológicos. Isso, associado à sua
estrutura relativamente pequena e compacta (78,13 g/mol), confere ao DMSO a
capacidade única de atravessar membranas celulares rapidamente (HEBLING
et al., 2015).

2.3.1 Efeitos crioprotetores do DMSO

Tal como já descrito, o DMSO, à semelhança da generalidade dos

ACP’s, é estruturalmente eficaz no estabelecimento de pontes de hidrogênio; o
que significa que este composto interage reversivelmente com as moléculas de
água pelo desenvolvimento destas ligações eletrostáticas. Este fato confere ao
DMSO a propriedade de modular cineticamente a formação de gelo (FULLER
et al., 2017). Porém, é cada vez mais claro que as propriedades crioprotetoras
do DMSO vão muito além da sua ação coligativa com a água.
Notman et al. (2006), Gurtovenko e Anwar (2007), e mais tarde Hughes
et al. (2012) e Cheng et al. (2015), reportaram que o DMSO tem a capacidade
de modular a permeabilidade das membranas celulares, atuando de formas
distintas na bicamada lipídica consoante a sua concentração. Estes
pesquisadores constataram que o DMSO facilmente penetra a membrana
celular, alojando-se logo abaixo das cabeças hidrofílicas dos fosfolipídios; já
que graças aos seus grupos metil este composto possui uma grande afinidade
pela cauda hidrocarbonada. Desta forma, a adição de uma pequena
quantidade de DMSO (até 10%) a uma bicamada fosfolipídica, levou a um
aumento na área livre entre fosfolipídios vizinhos, com consequente diminuição
da espessura da membrana e aumento da sua fluidez. Esta fluidez acrescida é
vantajosa para a célula no momento do congelamento, já que a sua membrana
 10

se torna mais apta a acomodar o stress osmótico e mecânico durante o

processo, sem sofrer lesões irreversíveis como resultado.
Com a adição de concentrações intermediárias de DMSO (10-20%) os
autores verificaram um progressivo afastamento dos fosfolipídios, acumulação
de água nestas áreas livres, e como resultado, redistribuição das cabeças
hidrofílicas para o interior da bicamada. Formaram-se assim, poros transientes
que aumentam a permeabilidade da membrana celular, o que não só é
vantajoso durante o congelamento, já que a água pode abandonar a célula
mais facilmente, como também durante o descongelamento. No decorrer desse
processo, com o descongelamento da água, o meio extracelular vai se
tornando progressivamente mais hipotônico em comparação com o meio
intracelular, o que pode ocasionar um influxo de água muito rápido, resultando
em dano osmótico e lise celular. O aumento da permeabilidade da membrana
associado ao DMSO permite uma rápida movimentação de solutos, o que se
traduz num rápido estabelecimento de um equilíbrio osmótico entre os
compartimentos intra e extracelular no momento em que a célula é
descongelada (NOTMAN et al., 2006; GURTOVENKO; ANWAR, 2007;
HUGHES et al. ,2012; CHENG et al., 2015).
O levantamento bibliográfico demonstra que não existe um consenso
relativamente à concentração precisa de DMSO a utilizar durante o
congelamento celular, em grande parte porque diferentes tipos de células
reagem de forma diferente à exposição a este ACP. É, no entanto, amplamente
aceite que a concentração de DMSO deve ser suficientemente elevada para
que os seus efeitos crioprotetores se manifestem, e ao mesmo tempo o mais
baixa possível para que não se desenvolvam mecanismos citotóxicos.

2.3.2 Efeitos citotóxicos do DMSO

Retomando a análise dos trabalhos de Notman et al. (2006), Gurtovenko

e Anwar (2007), Hughes et al. (2012) e Cheng et al. (2015); com a adição de
concentrações elevadas de DMSO (25-100%) os autores verificaram a
destruição da estrutura de bicamada das membranas. Os poros aumentaram
em número e tamanho, as cadeias acil tornaram-se totalmente desordenadas,
as cabeças hidrofílicas dos fosfolipídios perderam a sua capacidade de
 11

orientação e verificou-se a dessorção de fosfolipídios individuais, com

consequente ruptura da membrana.
Fica assim claro que com o progressivo aumento da concentração de
DMSO, verificam-se efeitos indesejáveis e potencialmente lesivos. Na verdade,
apesar da sua atividade crioprotetora amplamente comprovada, a maioria dos
ACP’s – DMSO incluso – possuem atividade citotóxica, que depende
principalmente da sua concentração, tempo de exposição, tipo de célula e seu
nível de desenvolvimento e diferenciação (HRISTOVA et al., 2017).
Os mecanismos de toxicidade do DMSO, porém, não são
compreendidos na sua totalidade (BROCKBANK, 2016), tendo por isso sido
alvo de estudo ao longo do tempo por vários pesquisadores. Yuan et al. (2014)
demonstraram que em astrócitos, os mecanismos citotóxicos do DMSO se
devem à sua ação sob as mitocôndrias. Com concentrações de 1% e 5% de
DMSO os autores verificaram inchaço e disrupção mitocondrial, o que resultou
na liberação de citocromo c no citosol. Eles verificaram ainda uma diminuição
no potencial de membrana destas organelas, que por sua vez levou à redução
do metabolismo aeróbio com produção de espécies de oxigênio reativas. Para
além disso, e já que a liberação de citocromo c e produção de espécies de
oxigênio reativas possuem um papel crucial no desencadear da apoptose,
estes autores verificaram uma simultânea diminuição na expressão da proteína
anti-apoptótica Bcl-2 e aumento na expressão de caspase-3, o que sugere que
o DMSO é um indutor da apoptose em astrócitos.
Estudos anteriores sustentam a noção deste potencial apoptótico do
DMSO em outros tipos celulares. Em células do hipocampo de camundongo, o
DMSO levou à apoptose num padrão dose-dependente com concentrações
entre 0,5 % e 1% (HANSLICK et al., 2009). O mesmo se verificou em linhagens
celulares de linfoma com concentrações superiores a 6% (LIU et al., 2001); em
células cocleares de camundongo com concentrações entre 0.5% e 6% (QI et
al., 2008); em células de retina de camundongo com concentração de apenas
0.1% (GALVÃO et al., 2014); e em fibroblastos com concentração de 1%
(MORLEY; WHITFIELD, 1993).
Para além das mitocôndrias, as proteínas celulares foram também
apontadas como alvo do DMSO. Estudos sugerem que embora o DMSO seja
preferencialmente excluído das proteínas a baixas temperaturas (o que resulta
 12

na estabilização proteica durante o congelamento), a temperaturas fisiológicas

este ACP interage hidrofobicamente com elas, levando a sua desestabilização
ou desnaturação. Tal mecanismo pode levar ao desenvolvimento de lesões
celulares irreversíveis, não só no momento em que o DMSO é adicionado à
suspensão celular a congelar, como também durante o descongelamento
dessa suspensão (ELLIOT et al., 2017). Para além disso, o DMSO pode ainda
atuar como um pró-oxidante, promovendo a oxidação de grupos tiol de
proteínas, e, portanto, comprometendo a sua função (BEST, 2015).
Tunçer et al. (2018), analisaram os efeitos de baixas doses de DMSO na
estrutura protéica. Os pesquisadores verificaram que concentrações de 0,1%,
0,5% e 1% convertem aproximadamente 15%, 30% e 40% das α-hélices para
folhas-β respectivamente. Concluíram assim, que baixas concentrações de
DMSO têm a capacidade de alterar a estrutura secundária das proteínas, e que
esta alteração vai-se tornando progressivamente mais acentuada com o
aumento da concentração de DMSO.
Nos dias que correm muita da pesquisa acerca da citotoxicidade
associada ao DMSO está voltada para os mecanismos ao nível molecular da
célula. Verheijen et al. (2019), analisaram os impactos de uma baixa
concentração de DMSO (0.1%) no proteoma, transcriptoma e epigenoma,
utilizando microtecidos 3D humanos de modelos cardíacos e hepáticos. Os
autores verificaram que o DMSO tem a capacidade de afetar negativamente
processos celulares pela alteração da expressão gênica, e que os processos
celulares afetados não aparentam ser tecido-específicos. Eles constataram que
foram afetados o metabolismo celular, o transporte mediado por vesículas, o
ciclo celular, a reparação do DNA, a biogênese de organelas e a organização
da cromatina.
Alsalim et al. (2019) investigaram os possíveis efeitos epigenéticos do
DMSO na metilação do DNA de fibroblastos de búfalo. Após a incubação
destas células com DMSO a concentrações de 0,5%, 1% e 2% durante 24h,
estes pesquisadores observaram que a intensidade de 5-metilcitosina
aumentou de uma forma dose-dependente. Concluíram assim, que a metilação
do DNA aumenta com o aumento da concentração do DMSO, pelo que este
composto possui efeitos epigenotóxicos em fibroblastos de búfalo.
 13

3 MATERIAL E MÉTODOS

3.1 TIPO DE ESTUDO

O estudo desenvolvido trata-se de uma pesquisa experimental básica,

exploratória e de natureza quantitativa.

3.2 LOCAL DE ESTUDO

O componente prático deste estudo foi realizado no Laboratório de

Ensaios Biológicos do Laboratório de Desenvolvimento e Avaliação de
Biomateriais do Nordeste (CERTBIO), localizado na Universidade Federal de
Campina Grande (UFCG, Campina Grande - PB), mediante autorização prévia
(Apêndice A).

3.3 LINHAGEM CELULAR

Para a execução deste estudo, e tal como recomendado pela EN ISO

10993-5:2009, foram utilizadas como modelo as células da linhagem NCTC
clone 929  [L cell, L929, derivative of Strain L] (ATCC® CCL1™), adquiridas ao
Banco de células do Rio de Janeiro – BCRJ (Anexo X); uma linhagem de
fibroblastos isolada do tecido conjuntivo subcutâneo de camundongos mus
musculus. Estas células foram cultivadas em RPMI (Rosewell Park Memorial
Institute) 1640 (Gibco®), suplementado com 2,0 g/L de Bicarbonato de Sódio
(Sigma-Aldrich), 2,38 g/L de HEPES (Sigma-Aldrich ®), 10% de Soro Fetal
Bovino (SFB, Gibco®) e 1% de Antibiótico-Antimicótico (Anti-Anti 100x, Gibco ®).
Foram estabelecidas 8 culturas celulares em placa de petri (87mm,
TPP®), e incubadas em atmosfera úmida com 5% de CO 2 e a 37˚C. A
manipulação das culturas celulares foi em todo o momento realizada sob
condições assépticas em câmara de fluxo laminar A1 classe II (BioGreen).
Antes de iniciar os experimentos as culturas foram testadas para a presença de
micoplasma através de ensaio de bioluminescência (Apêndice X), e rejeitadas
em caso de eventual positividade. Apenas culturas livres de micoplasma foram
utilizadas no decorrer deste estudo.
 14

3.4 PLANO DE AÇÃO

3.4.1 Experimento 1: Criopreservação com diferentes concentrações de DMSO

As culturas de NCTC clone 929 em fase exponencial (fase log) de

crescimento foram tripsinizadas (Trypsin-EDTA 0,25%, Gibco®) ao ser atingida
uma confluência de 70-80%.
As suspensões celulares foram então acondicionadas em tubos Falcon
de 12 mL e centrifugadas a 1500 rpm e 4˚C durante 5 minutos (Heraeus
Multifuge X1R, ThermoFisher Scientific®), descartando-se os sobrenadantes e
ressuspendendo-se os precipitados celulares em 3 mL de SFB (Gibco ®),
previamente filtrado em filtro de seringa com poro de 0,22 μm. Em seguida foi
realizada uma contagem das células vivas na suspensão celular de cada um
dos 8 tubos pelo método de exclusão por Azul de Tripan (Anexo X) utilizando-
se um contador celular automatizado (Countess™ automated cell counter,
Invitrogen®).
O conteúdo de cada tubo foi então manipulado para se satisfazerem as
condições de concentração celular de 1x10 6 cel/mL e concentração de DMSO
(D2650, Sigma-Aldrich®) destinada a esse tubo Falcon (Tabela X), adicionando-
se por fim SFB até se completar um volume final de 3 mL em cada tubo.

Tabela X: Concentração de DMSO em cada tubo.

Concentração de Concentração Nº de
Tubo Falcon
DMSO celular inicial criotubos
A 0% 1 x 106 cel/mL 3
B 1% 3
C 2% 3
D 3,5% 3
E 5% 3
F 6,5% 3
G 8% 3
H 10% 3
 15

Total 24

FONTE: Autoria própria (2019).

O conteúdo de cada um dos 8 tubos Falcon foi dividido em 3 criotubos,

perfazendo-se um total de 24 criotubos com 1 mL cada (Tabela X). Estes
criotubos foram em seguida acondicionados em recipiente de congelamento
(Mr Frosty® Cryo 1˚C Freezing Container, Nalgene ®), devidamente preenchido
com isopropanol. O recipiente de congelamento foi então colocado em
Ultrafreezer a -80˚C (Tectalmaq), onde permaneceu por 24h, conseguindo-se
assim uma taxa de congelamento de aproximadamente de -1 ˚C/min.
Terminadas as 24h, os 24 criotubos foram removidos do recipiente de
congelamento e colocados em container de nitrogênio líquido (BioCane 34,
ThermoFisher Scientific®), onde permaneceram criopreservados por um
período de 48h. Passadas 48h, os criotubos foram retirados um a um do
container de nitrogênio líquido, e rapidamente descongelados em banho
termostático (BM-02, Kacil) a 37˚C.
Foi então efetuada a contagem das células vivas em suspensão em
cada um dos criotubos criopreservados, mais uma vez pelo método de
exclusão por Azul de Tripan (Anexo X). A sobrevivência celular ao
congelamento foi então estimada levando-se em consideração a concentração
celular inicial de 1x 106 cel/mL em todos os 24 criotubos.
Na Figura X encontra-se sumarizado o resumo do fluxo de trabalho
referente ao congelamento, criopreservação e descongelamento.

Figura X: Fluxo de trabalho do Experimento 1.

Congelamento Criopreservação Descongelamento

Ultrafreezer Nitrogênio Líquido Contagem celular

-80˚C, 24h -196˚C, 48h

FONTE: Autoria própria (2019).

 16

3.4.2 Experimento 2: Viabilidade Celular após tratamento com diferentes

concentrações de DMSO

Os procedimentos realizados durante o experimento 2 tiveram como

base as orientações da EN ISO 10993-5:2009 para testes de citotoxicidade in
vitro e EN ISO 10993-12:2012 para preparação de amostras. Relativamente à
BS EN ISO 10993-5:2009, foi realizado o ensaio de MTT [Brometo de 3-(4,5-
dimetiliazol-2-il)-2,5-difeniltetrazólio], um dos vários ensaios de citotoxicidade
por ela descritos.
Este ensaio foi realizado em microplacas de 96 poços, nas quais os
controles e concentrações de DMSO em estudo foram distribuídos tal como
ilustrado pela Figura X.

Figura X: Esquematização das microplacas.

FONTE: Autoria própria (2019).

Tal como demonstrado pela Figura X, em cada uma das 4 microplacas

foram testadas duas das concentrações em estudo no Experimento 1 (M1 e
M2), adicionando-se a quantidade necessária de DMSO em RPMI 1640
(Gibco®), para se obter 200 µL de solução na concentração de DMSO
desejada.
Os controles negativos (C’-) consistiram em extrato de polietileno de alta
densidade (PEAD) (Apêndice X) e tapete celular em meio de cultura (C’’-). Já
os controles positivos consistiram em extrato de látex natural (Apêndice X) em
duas concentrações diferentes (C’+ a 0,2 g/mL, e C’’+ a 0,4 g/mL). A periferia
 17

das microplacas foi destinada ao branco (B), onde foi adicionado apenas RPMI
1640 (Gibco®).
O fluxo de trabalho do experimento 2 encontra-se descrito na Tabela X.

Tabela X: Fluxo de trabalho do Experimento 2.

Tempo
Procedimento
(h)
 Plaqueamento das microplacas com 1x105 cel./100μL
00:00 RPMI/poço;
 Incubação (37˚C/5% CO2/24h);
 Aspiração do RPMI e adição de 200 μL de RPMI;
24:00  Adição dos controles;
 Incubação (37˚C/5% CO2/24h);
 Aspiração do RPMI dos poços destinados ao DMSO;
 Adição de 200 μL de solução de DMSO em RPMI na
48:00 concentração em teste;
 Repouso das microplacas à temperatura ambiente, na câmara
de fluxo laminar;
 Aspiração do conteúdo de todos os poços;
 Adição de 100 μL de solução de MTT a 1mg/mL a todos os
48:30
poços;
 Incubação (37˚C/5% CO2/24h);
 Aspiração da solução de MTT;
52:30  Adição de 100 μL de Isopropanol/poço;
 Leitura da absorvância a 570 nm (filtro de referência 650 nm).

FONTE: Autoria própria (2019).

4 RESULTADOS E DISCUSSÃO

4.1 CRIOPRESERVAÇÃO COM DIFERENTES CONCENTRAÇÕES DE DMSO

No Gráfico 1 encontram-se apresentados os valores médios da

sobrevivência de células L929 após a criopreservação com diferentes
 18

concentrações de DMSO, medidos pelo método de exclusão por Azul de

Tripan. Pela análise deste gráfico fica claro que a sobrevivência celular ao
congelamento se demonstrou diretamente proporcional à concentração de
DMSO utilizada no processo.
A sobrevivência celular foi de apenas 0,38% na ausência de DMSO, o
que sustenta a ideia de que a utilização de um ACP é imprescindível. Com as
concentrações de 1%, 2% e 3.5% de DMSO a sobrevivência celular, embora
com um aumento progressivo, foi de apenas 1,6%, 8,9% e 23%
respetivamente, o que indica que a quantidade de DMSO presente não foi
suficiente para prevenir a criolesão e consequente morte celular generalizada.
As concentrações de 5%, 6.5%, 8% e 10% de DMSO resultaram numa
sobrevivência celular significativamente mais satisfatória, com uma
recuperação de 47% a 84% das células criopreservadas.

Gráfico 1: Sobrevivência celular média, em suspensões celulares

criopreservadas com diferentes concentrações de DMSO.

1,000,000
900,000 84%
Concentração celular (cel/mL)

800,000
71%
700,000
59%
600,000
47%
500,000
400,000
300,000
23%
200,000
8,9 %
100,000
0,38% 1,6 %
0
Controle 0% 1% 2% 3,50% 5% 6,50% 8% 10%
Concentração de DMSO (%)

FONTE: Autoria própria (2019).

Estudos anteriores demonstraram também esta proporcionalidade direta

entre a concentração e DMSO e a sobrevivência celular ao congelamento.
Picoli et al. (2015) verificaram um aumento progressivo da sobrevivência
de células MDBK em suspensões celulares criopreservadas com
concentrações de DMSO também progressivamente superiores. Na ausência
 19

de DMSO os autores reportaram uma sobrevivência celular de 10,7%, superior

aos 0,38% resultantes deste estudo. A mesma tendência foi observada com as
concentrações de 1% e 5% de DMSO, que resultaram numa sobrevivência
celular de 33,6% e 60%, superiores aos 1,6% e 47% do presente estudo. Desta
forma, embora a sobrevivência celular tenha igualmente aumentado com a
concentração de DMSO utilizada para a criopreservação, a pesquisa de Picoli
et al. (2015) resultou numa recuperação celular superior para as mesmas
concentrações de DMSO.
Fahmy et al. (2014) pelo contrário, relataram uma diminuição
progressiva na sobrevivência celular após a criopreservação de cartilagem
articular humana em concentrações crescentes de DMSO. Ock e Rho (2011)
reportaram uma sobrevivência celular de 83.9 ± 5.8% e 77.6 ± 4.4% em células
tronco mesenquimais suínas criopreservadas com 5% e 10% de DMSO
respetivamente. Nestes estudos, a sobrevivência celular ao congelamento foi
inversamente proporcional à concentração de DMSO utilizada. Tal fato pode
ser atribuído ás diferentes linhagens celulares utilizadas nas referidas e na
presente pesquisa, o que sugere que o protocolo de criopreservação deve ser
optimizado para cada linhagem celular.
Bahari et al. (2018), avaliando o efeito de diferentes concentrações de
DMSO na criopreservação, constataram que a morfologia de células IEC-18
após descongelamento permaneceu de inalterada utilizando-se concentrações
entre 5% e 10% deste ACP. Com concentrações inferiores, porém, foram
observadas alterações significativas. Os autores reportaram que com a
concentração de 2.5% de DMSO a generalidade das células apresentou perda
da sua morfologia redonda típica e irregularidades na membrana celular após
descongelamento. Na ausência de DMSO, todas as células se apresentaram
severamente lesadas e fragmentadas. Os achados de Bahari et al. (2018) vão
de encontro aos resultados do presente estudo, já que a recuperação celular
após descongelamento foi insatisfatória para concentrações de DMSO
inferiores a 5%. Eventos provocados pela insuficiência ou ausência de DMSO,
tais como a perda da integridade da membrana celular sugerida pelos referidos
autores, traduzem-se em lesão celular irreversível e invariavelmente culminam
em morte celular generalizada durante a criopreservação.
 20

4.2 VIABILIDADE CELULAR APÓS TRATAMENTO COM DIFERENTES

CONCENTRAÇÕES DE DMSO

No Gráfico 2 encontram-se apresentados os valores das viabilidades

celulares de células L929 medidas pelo ensaio do MTT e após a tratamento
com diferentes concentrações de DMSO. Pela análise deste gráfico fica claro
que a viabilidade celular se demonstrou inversamente proporcional à
concentração de DMSO utilizada.
De acordo com a BS EN ISO 10993-5:2009, utilizada como diretriz no
decorrer deste trabalho, quanto menor a medida da viabilidade celular, maior
será o potencial citotóxico da amostra em estudo; e se a viabilidade celular for
inferior a 70%, a amostra possui claramente um potencial citotóxico. Desta
forma, concentrações de DMSO que resultaram numa viabilidade celular
inferior a 70% serão consideradas como citotóxicas daqui em diante.

Tabela 2: Viabilidade celular de culturas celulares expostas a diferentes

concentrações de DMSO.

110
100
90
80
Viabilidade Celular (%)

97,2 ± 7,7%
70
90,8 ± 7,2%
60
80,8 ± 8,1%
50
77,8 ± 7,9%
40
64,3 ± 5,8%
30
50,7 ± 4,5%
20
44,5 ± 8,5%
10
0
1 2 3.5 5 6.5 8 10
DMSO (%)

FONTE 1: Autoria própria (2019).

O tratamento com DMSO a 10% resultou numa viabilidade celular de

apenas 44.5 ± 8.5%, o valor mais baixo do presente trabalho, o que faz de 10%
a concentração de DMSO mais citotóxica neste estudo. Também na faixa da
citotoxicidade se encontraram as concentrações de 8% e 6,5% de DMSO,
 21

tendo resultado numa viabilidade celular de 50.7 ± 4,5% e 64.3 ± 5.8%

respetivamente.
As concentrações de 5%, 3.5%, 2% e 1% de DMSO podem ser
consideradas como não citotóxicas, tendo resultado em viabilidades celulares
entre 77.8 ± 7.9% e 97.2 ±7.7%.
A tendência da proporcionalidade inversa entre concentração de DMSO
e viabilidade celular observada neste estudo é demonstrada por vários estudos
anteriores.
Hristova et al. (2017), incubando culturas de hAT-MSC (human adipose-
derived mesenchymal stem cells) com diferentes concentrações de DMSO (5%,
7%, 8,5%, 10% e 20%), verificaram uma diminuição da viabilidade celular
inversamente proporcional ao aumento da concentração deste ACP. Picolo et
al. (2015) obtiveram resultados semelhantes utilizando células da linhagem
MDBK (Madin-Darby Bovine Kidney) e concentrações de 0,5%, 1%, 2.5%, 5%,
10% e 20% de DMSO. Yuan et al. (2014) reportaram uma viabilidade celular de
84% e 68% em astrócitos submetidos a concentrações de DMSO de 1% e 5%
respetivamente.
Singh et al. (2017) demonstraram que a exposição de células da
linhagem GSF3.2 (fibroblastos dérmicos caprinos) a concentrações crescentes
de DMSO resultou numa diminuição progressiva da viabilidade celular, tendo
resultado em morte celular generalizada para concentrações superiores a 3%.
O mesmo foi verificado por Hajighasemi e Tajik (2017) em células
hematopoiéticas tumorais humanas para concentrações de DMSO de 5%. Os
resultados destes autores vão contra os resultados do presente estudo.
Embora a mesma tendência de proporcionalidade inversa entre concentração
de DMSO e viabilidade celular tenha sido verificada, nenhuma das
concentrações de DMSO testadas resultou em morte celular generalizada,
tendo a viabilidade celular mais baixa sido de 44.5 ± 8.5% (10% de DMSO).
É já sabido que os efeitos citotóxicos do DMSO aumentam não só com a
concentração, como também com a temperatura e tempo de exposição (BEST,
2015). Deste modo, estas diferenças podem ser explicadas pelo tempo e
temperatura de exposição das culturas celulares ao DMSO. Singh et al. (2017)
realizaram uma incubação de 4 dias a 37˚C e 5% de CO2, e Hajighasemi e
Tajik (2017) de 24, 48 e 72h, também a 37˚C e 5% de CO2. No presente estudo
 22

- na tentativa de se replicar a exposição das suspensões celulares ao DMSO

durante a sua preparação para a criopreservação - foi efetuada uma incubação
de apenas 30 minutos no próprio fluxo laminar (temperatura ambiente). Desta
forma, a análise das referidas diferenças entre os resultados deste estudo e os
resultados de Singh et al. (2017) e Hajighasemi e Tajik (2017), fortalecem a
ideia de que a exposição das células ao DMSO antes do seu congelamento
deve ser o mais breve possível, pelo que, quando em contato com este ACP a
sua manipulação deve ser ágil para que a sua transferência para um
ultrafreezer ocorra no menor tempo possível.

4.3 BALANCEAMENTO ENTRE CRIOPROTEÇÃO E CITOTOXICIDADE

A concentração ideal de DMSO é aquela que seja efetiva na

criopreservação, resultando numa sobrevivência celular pós-descongelamento
máxima, e que simultaneamente não acarrete desenvolvimento de
citotoxicidade in vitro.
No Gráfico 3 encontra-se ilustrado conjuntamente o comportamento das
células L929 à criopreservação e ao ensaio de MTT, quando submetidas a
concentrações de DMSO crescentes.

Gráfico 3: Criopreservação e incubação de células L929 com concentrações de

DMSO crescentes.
Viabilidade/Sobrevivência celular (%)

MTT Criopreservação
100
90 100 % 97,2 % 84 %
80 90,8 %
71 %
80,8 % 77,8% 64,3 %
70
60
47 %
50 59 %
40 50,7 %
23 % 44,5 %
30
20 8,9 %
10 0,38 % 1,6 %
0
0% 1% 2% 4% 5% 7% 8% 10%

[DMSO]
 23

Como referido anteriormente, a BS EN ISO 10993-5:2009 enuncia que

amostras que resultem numa viabilidade celular inferior a 70% são
consideradas citotóxicas. Desta forma, apesar do seu satisfatório desempenho
durante a criopreservação, as concentrações de 6,5%, 8% e 10% levaram ao
desenvolvimento de citotoxicidade in vitro, pelo que de acordo com este estudo
são desaconselhadas para a criopreservação de células da linhagem NCTC
clone 929.
A maior concentração de DMSO não associada a citotoxicidade in vitro
foi a de 5%, tendo resultado numa viabilidade celular de 77,8% e sobrevivência
ao congelamento de 47%. Importa aqui frisar que os fibroblastos são células
com bastante facilidade de multiplicação in vitro, e, desde que em contato com
um meio de cultura adequado e devidamente suplementado, este tipo celular
cresce de forma logarítmica até ser atingida a confluência celular
(ABERCROMBIE, 1978). Deste modo, as 470.000 células L929 vivas após a
criopreservação com 5% de DMSO, não terão dificuldade em iniciar o seu ciclo
replicativo e entrar em fase de crescimento exponencial (fase log).

5 Conclusão

De acordo com Moreira (2014), a conclusão tem por objetivo explicitar se os

objetivos foram alcançados, se as hipóteses foram confirmadas ou rejeitadas.
Essa seção deve ser redigida sem subdivisões, contemplando: uma
recapitulação sumarizadora dos capítulos; as conclusões correspondentes aos
objetivos ou hipóteses; os desdobramentos relativos à importância, síntese,
projeção, repercussão, encaminhamento e outros.

Referências

BAHARI ET AL :
https://journals.plos.org/plosone/article?id=10.1371/journal.pone.0192265
 24

Ock e Rho (2011)

https://journals.sagepub.com/doi/full/10.3727/096368910X552835?url_ver=Z39.88-
2003&rfr_id=ori:rid:crossref.org&rfr_dat=cr_pub%3dpubmed

ABERCROMBIE, 1978
https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pmc/articles/PMC1347118/?page=1

APÊNDICES

APÊNDICE A – Ensaio de Bioluminescência para controle de contaminação por

micoplasma

Preparação de soluções

Ao MycoAlertTM PLUS Reagent e MycoAlertTM PLUS Substrate são

adicionados 5 mL de MycoAlertTM PLUS Buffer. Depois de homogeneização,
cada solução é alíquotada em tubos tipo Eppendorf, colocando-se 100 µL em
cada tubo. Os tubos são então armazenados em ultrafreezer a -80°C.

Procedimentos

1. Retirar uma alíquota de MycoAlertTM PLUS Reagent e MycoAlertTM

PLUS Substrate do ultrafreezer, e deixar descongelar à temperatura
ambiente;
2. Adicionar 100 µL do líquido que se pretende testar a um tubo de
luminômetro estéril;
3. Ligar o luminômetro, selecionar o programa “RUN MycoAlert” e
pressionar ENTER;
 25

4. Adicionar os 100 µL da alíquota de MycoAlertTM PLUS Reagent ao tubo

de teste;
5. Pressionar DONE.

NOTA: O luminômetro irá fazer uma contagem decrescente de 5 minutos, que

corresponde ao período de incubação necessário.

6. Após o sinal sonoro pressionar CONTINUE, e colocar o tubo no interior

do luminômetro.

NOTA: A leitura de Luminescência – Leitura A - irá iniciar automaticamente 2

segundos após o fecho da porta do aparelho.

7. Observar os valores de RLU/s para a leitura A e pressionar CONTINUE;

8. Adicionar os 100 µL da alíquota de MycoAlertTM PLUS Substrate ao
tubo de teste e pressionar DONE.
NOTA: O luminômetro irá fazer uma contagem decrescente de 10 minutos, que
corresponde ao período de incubação necessário.

9. Após o sinal sonoro, pressionar CONTINUE, e colocar o tubo no interior

do luminômetro.

NOTA: A leitura de Luminescência – Leitura B – irá iniciar automaticamente 2

segundos após fechar a porta do aparelho.

10. Observar os valores de RLU/s para a leitura B e pressionar CONTINUE.

11. O luminômetro irá então indicar no seu painel digital os valores RLU/s
das leituras A e B, a razão B/A, e indicará ainda se a amostra se
encontra contaminada ou não, baseando-se no seguinte:
- Razão B/A > 1.2; amostra contaminada;
- Razão B/A < 0.9; amostra não contaminada;
- Razão B/A 0.9-1.2; amostra borderline.
 26

APÊNDICE B – Preparação dos extratos dos controles

Preparação dos extratos do controle positivo (concentração 0,2 g/mL)

1- Pesar 5 g de luvas de látex natural, cortada em pequenos fragmentos,

em garrafa de 100 mL.
2- Adicionar 25 mL de PBS.
3- Autoclavar durante 1 hora a 121 °C.

Preparação dos extratos do controle positivo (concentração 0,4 g/mL)

1- Pesar 10 g de luvas de látex natural, cortada em pequenos fragmentos,

em garrafa de 100 mL.
2- Adicionar 25 mL de PBS.
3- Autoclavar durante 1 hora a 121 °C.

Preparação dos extratos do controle negativo

 27

1- Pesar 5 g de PEAD, em pellets, em garrafa de 100 mL.

2- Adicionar 25 mL de PBS.
3- Autoclavar durante 1 hora a 121 °C.

APÊNDICE C – Lista de material, reagentes, equipamentos e EPI’s

Materiais
 Ponteiras de 10 µL, 100 µL e 1000 µL autoclaváveis;
 Pipetas graduadas estéreis descartáveis (10 a 1000 µL);
 Micropipetas de 10 µL, 100 µL e 1000 µL (Finnpipette F1, ThermoFisher
Scientific®);
 Pipeta Monocanal 20-200 µL (CappAidTM);
 Pipetador automático (CappAidTM);
 Pinça;
 Borrifador;
 Tubo tipo Eppendorf estéril;
 Tubo Falcon 12 mL estéril;
 Criotubos estéreis;
 Recipiente de congelamento (Mr Frosty® Cryo 1˚C Freezing Container,
Nalgene®);
 Lâmina estéril descartável de contagem celular (Countess TM cell counting
chamber slides, Invitrogen®);
 Microplacas estéreis de 96 poços (TPP®);
 28

 Placas de Petri de cultura celular (87 mm, TPP ®);

 Filtros 0,2 µm estéreis para seringa;
 Unidade de filtração autoclavável;
 Filtros estéreis para unidade de filtração de 0,45 µm e 0,2 µm;
 Garrafas de vidro autoclaváveis;
 Barquinhas autoclaváveis;
 Seringa estéril de 20 mL;
 Gaze estéril;
 Container de Nitrogênio líquido (BioCane 34, ThermoFisher Scientific ®);
 Polietileno de alta densidade (PEAD).

Reagentes
 Soro fetal bovino (FBS, Gibco®);
 Antibiótico-Antimicótico (Anti-Anti 100x, Gibco ®);
 Bicarbonato de Sódio (Sigma-Aldrich®);
 Hepes (Sigma-Aldrich®);
 RPMI 1640 (Gibco®);
 MycoAlertTM PLUS Mycoplasma Detection Kit (Lonza®);
 Trypsin-EDTA 0,25% (Gibco®);
 Trypan Blue stain 0,4% (Invitrogen®);
 Nitrogênio Líquido;
 Isopropanol;
 Álcool etílico a 70%;
 MTT (Thiazolyl Blue Tetrazolium Bromide, Sigma-Aldrich®);
 PBS (Phosphate buffered saline, Sigma-Aldrich®);
 Água para injeção.

Equipamentos
 Câmara de fluxo lâminar A1 classe II (A2, BioGreen);
 29

 Luminômetro ( LonzaTM LucettaTM single tube luminometer);

 Incubadora de CO2 (FormaTM Series 3 water jacketed CO2 incubator,
ThermoFisher Scientific®);
 Aspiramax;
 Microscópio (Eclipse TS100, Nikon®);
 Centrifuga (Heraeus Multifuge X1R, ThermoFisher Scientific®);
 Agitador magnético (AA-2050, Gehaka);
 Contador celular automatizado (Countess™ automated cell counter,
Invitrogen®);
 Espectrofotômetro (Victor X3, PerkinElmer);
 Ultrafreezer (Tectalmaq);
 Banho termostático (BM-02, Kacil);
 Autoclave (Autoclave vertical CS, Prismatec);
 pHmetro (pH 21, Hanna);
 Balança analítica (AG245, Toledo-Mettyer).

EPI’S
 Avental descartável;
 Luva sem pó descartável;
 Touca descartável;
 Máscara descartável;
 Manguitos;
 Propé.
 30

ANEXOS

ANEXO A – Ficha técnica da linhagem celular NCTC clone 929

 31

ANEXO B – Contagem de células vivas pelo método de exclusão pelo Azul de

Tripan
32