Métodos Laboratoriais em Patologia Molecular

Apoptose

Morte Celular Programada

Caspases
Família Bcl-2
Vias que regulam a apoptose
quarta-feira, 2 de Junho de 2010 1
Objectivos

Apoptose

Compreender e contextualizar a morte celular programada.

Descrever e distinguir os diferentes processos de morte celular
necrótica, autofagia e apoptose.

Identificar as situações fisiológicas e patológicas a que a apoptose
pode surgir como resposta.

Identificar as caspases como elementos centrais no processo de
apoptose e compreender o seu funcionamento.

Identificar a família Bcl-2 como elementos centrais no processo de
apoptose e compreender o seu funcionamento.

2
Objectivos

Apoptose

Compreender as vias que induzem apoptose:

quebra de DNA;

via PI 3-quinase;

via TNF.

Compreender e identificar os mecanismos que iniciam a apoptose,
nomeadamente a via intrínseca e extrínseca.

Compreender a fase de execução da apoptose.

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Morte celular programada

Descreve um processo regulado de morte celular

Durante muito tempo foi associada

exclusivamente à apoptose

Hoje descrevem-se 3 processos:

Morte celular necrótica

Autofagia

Apoptose
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Morte celular programada

Morte celular necrótica

Eventos moleculares que levam à morte celular
distinta da apoptose e autofagia.

Necrose tecidular patológica vista ao microscópio
é o produto tanto de morte por autofagia,
apoptose ou morte celular necrótica.

Surge quando o rácio de morte celular excede a
possibilidade das células limparem as células mortas

O somatório das três leva ao surgimento da necrose
tecidular patológica

É um processo irreversível 5
Morte celular programada

Autofagia

É um processo em várias fases que envolve a
captura por vesículas de proteínas citoplasmáticas
e organelos velhos.

A formação de autofagossomas é seguida de
fusão com lisossomas, e através da acção de
enzimas dependentes de acidez é levada a cabo a
degradação do seu conteúdo.

É um processo reversível.

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Morte celular programada

Apoptose

É uma via de morte celular conservada
geneticamente desde C. elegans até aos
mamíferos

Foi descrita pela primeira vez em 1972.

Características comuns:

Diminuição celular

Condensação da cromatina

Formação de corpos apoptóticos

Fagocitose de células apoptóticas
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Figure 17.1 Apoptosis
Apoptose

Células que morrem por apoptose são
rapidamente fagocitadas por macrófagos e
células vizinhas

Esta remoção é levada a cabo pelos sinais
designados “eat me”

Incluem a apresentação no exterior da célula de
fosfatidilserina

Encontra-se normalmente na parte interna da
membrana

Serve de sinalização para receptores das células
fagocíticas 9
Figure 17.2 Phagocytosis of apoptotic cells
Apoptose

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 Apoptose
Features of Necrosis and Apoptosis
Feature Necrosis Apoptosis
Cell size Enlarged (swelling) Reduced (shrinkage)
Nucleus Pyknosis → karyorrhexis → Fragmentation into
karyolysis nucleosome size fragments
Plasma membrane Disrupted Intact; altered structure,
especially orientation of
lipids
Cellular contents Enzymatic digestion; may Intact; may be released in
leak out of cell apoptotic bodies
Adjacent inflammation Frequent No
Physiologic or pathologic Invariably pathologic Often physiologic, means of
role (culmination of irreversible eliminating unwanted cells;
cell injury) may be pathologic after
some forms of cell injury,
especially DNA damage
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Apoptose

Pode surgir como resposta a situações
fisiológicas:

Destruição celular durante a embriogénese

Involução dependente de hormonas (ciclo
menstrual)

Delecção celular em populações celulares em
proliferação (epitélio da cripta intestinal)

Morte de células do hospedeiro que serviram o
seu propósito (final da resposta imune)

Morte celular induzida por células T citotóxicas
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Apoptose

Ou em condições patológicas:

Morte celular induzida por estímulos lesivos

Dano celular provocado por doenças virais
(hepatite)

Atrofia patológica em órgãos parenquimatosos
após obstrução ductal (pâncreas, parótida e rins)

Morte celular em tumores

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Apoptose

Características bioquímicas:

Clivagem proteica

Acção das caspases

Estão inactivas e após activação clivam proteínas
celulares vitais

Quebra de DNA

Reconhecimento fagocítico

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Caspases

São uma família de proteases que possuem
resíduos de cisteína no seu centro activo que
clivam proteínas após o ácido aspártico (Asp)

Têm como alvos perto de 100 proteínas:

Inibidores de DNAses

Lamininas nucleares

Proteínas do citoesqueleto

São classificadas em:

Iniciadoras
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Efectoras
Figure 17.4 Caspase targets
Caspases

São sintetizadas como percursores inactivos
designados pro-caspases

São activados por clivagem proteolítica

A activação de uma caspase iniciadora activa

uma reacção em cadeia levando à activação
das caspases efectoras

São centrais para determinar a sobrevivência

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celular
Caspases

Sabe-se que o complexo Apaf-
1 liga-se à pro-caspase 9 e
promove a sua activação

Apoptosis activating factor-1

É um heptâmero que com a
pro-caspase 9 (iniciadora) e
citocromo-c formam o
apoptossoma

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Figure 17.5 Caspase activation
A família Bcl-2

Foi descrito em 1985 como um oncogene que
contribuía para o desenvolvimento de linfoma
das células B

B-cell lymphoma 2

Descobriu-se que inibia a apoptose, quando
activo não permite que esta ocorra

Pertence a uma família com mais de 20
proteínas relacionadas

É dividida em 3 grupos funcionais
21
Figure 17.6 The Bcl-2 family
A família Bcl-2

O destino da célula é determinado pelo
balanço da actividade dos membros da família
pro-apoptóticos e anti-apoptóticos

Proteínas pro-apoptóticas de domínio múltiplo (Bax e
Bak) estão inibidos por proteínas anti-apoptóticas (Bcl-
2 e Bcl-xL)

As proteínas que possuem exclusivamente BH3 (Bid,
Bad, Noxa, Puma, Bim) são activadas apenas mediante
sinais de indução da morte celular

Quando estão activados antagonizam a acção das proteínas
anti-apoptóticas activando as proteínas pro-apoptóticas de
domínio múltiplo
23

Levam à activação das caspases e à morte celular
Figure 17.7 Regulatory interactions between Bcl-2 family members
A família Bcl-2

Estes actuam todos a nível da mitocôndria,
que possui um papel central no controlo da
morte celular programada

Bax e Bak formam oligómeros na membrana
exterior da mitocondria

Levam à libertação de citocromo c do espaço
intermembranar

A libertação do citocromo c leva à activação da
caspase 9 no citoplasma através do apoptossoma

25
Figure 17.8 The mitochondrial pathway of apoptosis
A família Bcl-2

As caspases são também reguladas pelas IAP

Inhibitor of apoptosis

Interagem directamente com as caspases de 2

formas:

Inibindo a sua actividade

Ubiquitinando a caspase e degradando-a através
de proteossoma

27
A família Bcl-2

A acção de Bax e Bak leva também à
libertação da mitocondria de duas proteínas:
Smac/Diablo e Omi/Htr2

Estas inibem a acção das IAP, promovendo a
actividade das caspases

Os IAP e os membros da família Bcl-2 são

alvos das vias que controlam a sobrevivência
das células nos mamíferos
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Figure 17.9 Regulation of caspases by IAPs in Drosophila
Vias que regulam a apoptose

Uma das causas mais frequentes de activação
da apoptose é a quebra de DNA

Esta é mediada pelo factor de transcrição p53

As quinases de proteínas ATM e CHK que são
activadas pela quebra de DNA fosforilam a p53
estabilizando-a

O aumento da p53 leva à activação transcricional
de genes como o inibidor de Cdk p21 (paragem do
ciclo celular) e proteínas da família Bcl-2 pró-
apoptóticas que possuem exclusivamente BH3
(Puma e Noxa) 30
Figure 17.10 Role of p53 in DNA damage-induced apoptosis
Vias que regulam a apoptose

A maioria das células nos animais superiores
está programada para entrar em apoptose a
não ser que esteja activamente suprimida por
sinais provenientes de outras células

A via mais importante é iniciada pela enzima PI 3-
quinase

Por outro lado existem factores que

promovem a morte celular programada

Pertencem à família TNF (tumor necrosis factor) 32
Vias que regulam a apoptose

A PI 3-quinase transforma PIP2 em PIP3
activando a quinase Akt

Esta fosforila um número de proteínas que
regulam a apoptose:

Fosforila Bad (pró-apoptótica) que é recrutada pelo
chaperone 14-3-3

Fosforila FOXO (inactivando-o) que é um factor de
transcrição de Bim (pró-apoptótico)

Regula GSK-3β que por sua vez regula a transcrição de
genes da p53, do NF-кB, da IAP e da família Bcl-2

Promove a via mTOR que leva à transcrição genómica
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Figure 17.11 The PI 3-kinase pathway and cell survival
Vias que regulam a apoptose

A ligação de TNF aos respectivos receptores
(TNFR) sinalizam a apoptose em vários tipos
celulares

Um dos receptores mais bem caracterizado
designa-se TNFR-1

A ligação do ligando promove a trimerização do
receptor

A porção citoplasmática liga-se a moléculas
adaptadoras que se ligam a uma caspase iniciadora
(pró-caspase 8)

A caspase 8 após activação activa as caspases efectoras35
Figure 17.12 Cell death receptors
Figure 17.12 Cell death receptors (Part 1)
Figure 17.12 Cell death receptors (Part 2)
Vias que regulam a apoptose

Em algumas células é necessária amplificação de
sinal

A caspase 8 activa a proteína pro-apoptótica que possui
exclusivamente BH3, Bid.

Bid leva à libertação de citocromo c da mitocôndria e à
consequente activação do apoptossoma e activação da
caspase 9

Levando à amplificação de sinal promovido pela
caspase 8

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Mecanismos da apoptose

O processo pode ser dividido em duas fases:

Fase inicial onde as caspases se tornam
cataliticamente activas

Fase de execução onde as enzimas actuam para
causar a morte celular

Podemos falar em dois mecanismos principais

para iniciar a apoptose:

Via extrinseca (ou iniciada por receptor)

Via intrinseca (ou mitocondrial) 40
Via extrínseca

É iniciada pela presença de receptores de morte
numa variedade de células

Estes receptores da família TNFR possuem um
domínio citoplasmático designado death domain

O receptor Fas é o mais bem descrito

Aquando a ligação de Fas-L o receptor trimeriza e os seus
death domains ligam-se a uma proteína adaptadora, que
se chama FADD (Fas-associated death domain)

Assim activado o FADD liga-se a pro-caspase 8 através do
seu death domain.

Várias pro-caspases 8 são recrutadas promovendo várias
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clivagens gerando caspases 8 activas
Via extrínseca

A caspase 8 activada vai
clivar caspases
efectoras que iniciam o
processo apoptótico
propriamente dito

A proteína FLIP pode
inactivar esta via
ligando-se a pro-
caspase 8 impedindo-a
de clivar

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Via intrínseca

Esta via é o resultado do aumento da
permeabilidade das mitocondrias e libertação
de moléculas pro-apoptóticas

Factores de crescimento e outros sinais de
sobrevivência estimulam a produção de
proteínas anti-apoptóticas da família Bcl-2

Estas proteínas anti-apoptóticas estão
normalmente nas membranas das mitocondrias e
no citoplasma
43
Via intrínseca

Células privadas de sinais de sobrevivência ou
sujeitas a stress

Perdem Bcl-2 e/ou Bcl-xL da membrana da
mitocôndria e são substituídas por proteínas pro-
apoptóticas da mesma familia, Bak e Bax.

Estas proteínas promovem a libertação de
citocromo c que forma o apoptossoma e activa a
pro-caspase 9

Há a libertação de factores de indução da
apoptose que neutralizam inibidores da apoptose
(Smac/Diablo e Omi/Htr2) 44
Via intrínseca

Esta via vive do balanço entre as moléculas
pro-apoptóticas e as moleculas anti-
apoptóticas que influenciam a permeabilidade
mitocondrial

Pode haver sobreposção das duas vias

Nos hepatócitos a sinalização via Fas activa o Bid
que por sua vez activa a via mitocondrial

Não se sabe se estas vias cooperativas estão
activas noutros tipos celulares 45
Via intrínseca

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Fase de execução

A fase final é mediada por uma cascata
proteolítica para a qual os mecanismos
convergem

Estão dependentes de dois tipos de caspases:

Iniciadoras – Caspases 8 e 9

Efectoras – Caspases 3, 6 e 7

Estão no citoplasma na sua forma inactiva de
pro-enzima e podem ser hidrolizadas por
outras caspases ou autocataliticamente
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Fase de execução

As efectoras têm várias funções:

Citoplasma - Cliva as proteínas do citoesqueleto

Núcleo – Cliva proteínas da matriz nuclear,
proteínas de transcrição, replicação e reparação
do DNA

A caspase 3 cliva um inibidor de uma DNAse activando-
a

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Resumo das vias

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Outros esquemas

50
Outros esquemas

51
Outros esquemas

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Bibliografia

Todas as imagens foram retiradas de

Cooper, G.M.; Hausman, R.E. The Cell: A Molecular Approach (4ª ed.).
Sunderland: Sinauer, 2007

Kumar, V.; Abbas, A. K.; Fausto, N. Robbins and Cotran Pathologic Basis of
Disease (7ª ed.). Philadelphia: Elsevier Saunders, 2005

Danial, N. BCL-2 Family Proteins: Critical Checkpoints of Apoptotic Cell
Death. Clin Cancer Res 2007;7263 13(24)

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Síntese

Apoptose

Morte celular programada

Apoptose

Caspases

Bcl-2

Vias que regulam a apoptose: p53, PI3K e TNF

Mecanismos de apoptose: via extrínseca e via
intrínseca

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