Modalidades de detecção de apoptose: uma breve revisão

Resumo
A apoptose ou morte celular programada é um evento celular específico com características morfológicas,
histológicas, moleculares e bioquímicas distintas. Ela desempenha um papel importante na rotatividade
normal da célula, no desenvolvimento e em sua função. A apoptose inadequada é uma das principais causas
de várias patologias, como distúrbios neurodegenerativos, doenças isquêmicas, autoimunes e várias formas
de câncer. Uma vez que programas apoptóticos controlados podem produzir mudanças no padrão de morte
celular, os genes e proteínas que regulam a apoptose são alvos futuros potenciais de drogas. Assim, a
detecção de células apoptóticas abrirá um novo caminho para o diagnóstico, prognóstico e terapia do câncer.
O objetivo deste artigo de revisão é discutir vários métodos de detecção de apoptose, desde abordagens
tradicionais até métodos moleculares avançados recentes.

Introdução
O câncer oral é um dos principais problemas de saúde em países em desenvolvimento,
como a Índia. Segundo as estatísticas, na Índia, o câncer relacionado à cavidade oral é mais
comum em homens e o terceiro mais comum em mulheres. [1] A maioria dos cânceres orais são
de origem epitelial (carcinoma de células escamosas) e estão associados ao hábito de mastigar
tabaco. O diagnóstico precoce do câncer aumenta muito a taxa de cura, com menos
comprometimento e deformidade. [2] A palavra apoptose significa "cair" ou "cair", que é derivado
da palavra grega, que se refere às pétalas caindo das flores ou folhas das árvores. Kerr FR, em
1972, primeiro cunhou o termo “apoptose” para descrever “morte celular programada”. É um
processo de morte celular que está envolvido no processo normal de desenvolvimento celular e
envelhecimento, que é distinto da necrose. [3] Pesquisas atuais nos ajudaram a entender melhor a
apoptose. O comprometimento no mecanismo de apoptose pode causar doenças auto-imunes,
doença cardíaca isquêmica e doença cerebral, além do câncer. Identificar e compreender a
apoptose tornou-se importante, além de sua importância prognóstica. [2]
Vários métodos de detecção de apoptose são:
1. microscopia de luz
2. Manchas especiais / manchas fluorescentes
3. Imunohistoquímica (IHC)
4. microscopia eletrônica
5. Reação em cadeia da polimerase (PCR)
6. Mediação da desoxinucleotidil transferase terminal rotulagem de ponta nick-biotina dUTP
(TUNEL)
7. Eletroforese em gel de agarose de DNA
8. Citometria de fluxo (FCM)
9. In situ3 - método de rotulagem final (ISEL)
10. Ensaio colorimétrico de Western blotting e Caspase;
11. Ensaio de nuclease.

Luz do microscópio
A apoptose geralmente envolve células únicas ou pequenos aglomerados de células. Isto
pode ser apreciado em tecidos corados com coloração de hematoxilina e eosina de rotina. O
material da cromatina é condensado em massas granulares que são acentuadamente delineadas ao
longo do invólucro nuclear, encolhimento das células, contornos celulares e nucleares ficam
complicados e fragmentação nuclear pode ser vista. A célula apoptótica se rompe em corpos
ligados à membrana que contêm apenas remanescentes nucleares. [4].
Manchas Especiais / Manchas Fluorescentes
Os novos modos de detecção apoptótica incluem corantes fluorescentes, tais como
brometo de etio-laranja de acridina (EB / AO), DAPI (4, 6-diamidino-2-fenilindole), iodeto de
próprio (PI), colorao com Hoechst e colorao com Anexina V. Eles se ligam ao DNA de uma
maneira específica e fornecem uma análise definitiva da condensação da cromatina por
microscopia fluorescente. Ambos vivem e morrem as células podem ser coradas por corantes
vitais como a coloração AO. O EB mancha apenas as células que perderam a coerência da
membrana. [5]
Em corante EO / AO:
• As células vivas aparecerão uniformemente verdes devido à cromatina normal presente nos
núcleos.
• Células apoptóticas têm cromatina condensada / fragmentada em seus núcleos. Essas células em
estágios iniciais irão manchar a cor verde com pontos verdes brilhantes nos núcleos devido à
cromatina condensada e núcleos fragmentados. Células apoptóticas nos estágios finais mancham
laranja após incorporar EB.
• O PI mancha apenas as células que interromperam / perderam a integridade da membrana.
Quando as células foram duplamente coradas com coloração de Hoechst e PI, quase todas as
células foram classificadas em:
a. Células vivas com núcleos intactos que é positivo para a coloração de Hoechst;
b. Células necrosadas com coloração positiva de núcleos com PI;
c. Células de estágio inicial apoptótico com núcleo fragmentado positivo para coloração de
PI;
d. Células do estágio terminal apoptótico com núcleos fragmentados que é positivo para a
coloração do IP. [6,7]
IHC
A detecção de células apoptóticas imuno-histoquímicas utiliza anticorpos contra substratos
como. (1) Caspases 3, (2) M30, (3) Anexina V e (4) p53. [8]
1. Caspases 3
A caspase3 é muito essencial para a execução da apoptose, pois é responsável (parcialmente
/ totalmente) pela quebra de muitas proteínas-chave conhecidas como clivagem proteolítica. A
caspase 3 desempenha um papel importante na mediação da apoptose. A caspase 3 ativa sofre
clivagem que, por sua vez, ativa outras caspases. Os neo-epitopos são formados pela ativação
enzimática de pró-caspases que são usadas como antígenos para gerar anticorpos específicos. O
produto final clivado pode ser imunodetectado. [9] A detecção ativa de caspase 3 in situ é
considerada indicador sensível, direto e específico, e um método confiável para detectar e
quantificar a apoptose. Isso é mais preciso do que técnicas de detecção mais antigas baseadas na
fragmentação do DNA ou na clivagem do substrato da caspase. A inibição da atividade da caspase
para tratar uma variedade de doenças relacionadas à apoptose é considerada uma nova estratégia
terapêutica. [8]
2. M30
O neoantígeno M30 é um neoepitopo na citoqueratina 18 (CK18), que está disponível durante
a clivagem do evento da caspase. O M30 é específico para apoptose, não detectado em células
normais ou necrosadas. É um anticorpo monoclonal e um fragmento de CK18 clivado em Asp396
(neoantigénio M30) é especificamente reconhecido. Nas glândulas salivares, no tecido
trofoblástico, tanto in vitro como in vivo, este marcador é validado. O M30 pode ser verificado
em amostras de tecido fresco, bem como tecidos embebidos em parafina fixados em formalina. O
M30 pode ser considerado um marcador preciso de detecção de apoptose. [8,10]
 3. Annexin V
As alterações da membrana plasmática são uma das primeiras características do apoptose
detectado em células vivas. A fosfatidilserina (PS) está presente na face citoplasmática da
membrana plasmática. A detecção de PS é uma característica muito significativa que é
normalmente usada para detectar apoptose. Durante o processo apoptótico, há translocação de PS
para a superfície externa da membrana plasmática. Annexin V atua como uma membrana
extrínseca que detecta superfícies celulares expostas ao PS, tanto in vitro como in vivo. Este é um
detector precoce que é observado antes de outros processos apoptóticos, como perda da
integridade da membrana plasmática com cromatina e quebras de DNA. A apoptose em curso é
melhor detectada pela Anexina V. Quando combinada com outros métodos, como o isotiocianato
fluorescente (FITC), pode-se estudar a microscopia de fluorescência usando a distribuição
topográfica de DNA do TUNEL-FITC. [11,12]
4. p53 p53 é um gene supressor de tumor localizado no cromossomo 17pl3. Ela restringe o
crescimento celular aberrante e perturbado, que ocorre devido a danos no DNA, ativação de
oncogenes, condições hipóxicas e perda normal de contato célula a célula. Ele remove o excesso
de células infectadas ou danificadas por apoptose, portanto chamado de regulador do ciclo celular.
As funções deste gene podem ser dificultadas durante o câncer por vários mecanismos, que
incluem:
• Prevenção da ativação do p53
• Mutações no gene p53
• Mutações de funções associadas a mediadores p53
A expressão de p53 mutante nos espécimes tumorais geralmente indica mau prognóstico.
é usado para suprimir o crescimento do tumor, prevenir a quimiorresistência e a morte celular
induzida pela quimioterapia induzindo a apoptose às células tumorais. [13-16]
Recursos microscópicos eletrônicos
A microscopia eletrônica detecta as mudanças no nível subcelular, como a condensação
da cromatina, a formação de bolhas citoplasmáticas que se agregam perifericamente sob a
membrana nuclear. Durante a apoptose, as membranas plasmáticas permanecem intactas até os
últimos estágios. O espaço previamente ocupado pela célula apoptótica será substituído pelas
células saudáveis adjacentes. [4] O microscópio eletrônico de varredura (SEM) ou o microscópio
eletrônico de transmissão (TEM) podem ser usados para estudar a apoptose. O TEM detecta
condensação e convulsões da cromatina dentro e ao redor da membrana nuclear que precede a
fragmentação nuclear. A condensação do citoplasma com o desaparecimento das
microvilosidades, bolhas na superfície celular e perda de junções celulares podem ser observadas.
A clivagem do DNA genômico que se divide em múltiplos fragmentos de 180-200 pares de bases
(pb) é a característica mais característica. Alterações na superfície das células cancerígenas, como
o alisamento, perda estrutural de microvilos, blebbing / shrinking pode ser estudado por SEM.
[17-19]
PCR
O padrão de clivagem de DNA apoptótico pode ser estudado usando a técnica de PCR.
Tem melhor sensibilidade do que o ensaio de escada de DNA comumente usado. É eficaz na
detecção, mesmo em casos esparsos que tem <1% de células apoptóticas. É uma técnica semi
quantitativa que estima e compara a fragmentação do DNA em amostras investigadas.
Coloração TUNEL (terminal desoxinucleotidil transferase dUTP nick end
rotulagem) TUNEL é um dos melhores métodos para detectar a fragmentação do DNA que
ocorre durante os mecanismos apoptóticos. Isso identifica os defeitos presentes no DNA de cada
célula ou TdT, a adição (2'-desoxiuridina 5 'trifosfato) que são rotulados secundariamente usando
um marcador específico. Células danificadas por DNA também podem ser marcadas usando o
método TUNEL. Pode ser aplicado em células cultivadas, tecidos, amostras de sangue, materiais
que contenham poucas células apoptóticas. [22]
Método de eletroforese em gel de DNA agarose
A apoptose é detectada pela fragmentação do DNA, caracterizada pela ativação da
endonuclease com clivagem do DNA da cromatina em múltiplos fragmentos internucleossômicos
de aproximadamente 180 pb e seus múltiplos (360, 540, etc.). A eletroforese em gel usa esse
método para detecção de apoptose. Este método separa as substâncias com base no seu peso
molecular e taxa de movimento sob a influência de um campo elétrico. A eletroforese em gel de
DNA de agarose detecta DNA fragmentado de baixo peso molecular em células apoptóticas que
são analisadas por numerosas técnicas de eletroforese em gel como.
Eletroforese em gel convencional: Este método separa o DNA com baixo peso molecular. Um
padrão característico de “escada” que representa fragmentos de DNA descontínuos será visto.
Eletroforese em gel de campo pulsado: Detecta fragmentação de DNA de alto peso molecular na
faixa de quilo a megabases, ou seja, 50kb com comprimento de até 10 Mbp em células
apoptóticas. Quando o campo elétrico entre os pares de eletrodos é alterado, o DNA apoptótico
pode ser separado, à medida que eles se movem de uma maneira específica através de poros de
gel de agarose após serem reorientados.
Eletroforese em gel de inversão de campo (FIGE): Para obter uma migração líquida, um campo
elétrico constante é periodicamente invertido com o pulso de direção “para frente” do campo
superior por mais tempo período (ou ambos). A FIGE permite a separação de DNA, assim como
misturas de proteínas com base em faixas de tamanho que não são alcançadas por eletroforese
comum. Pequenas amostras de DNA podem ser analisada, integridade verificada pela FIGE, ao
contrário da eletroforese em gel convencional, onde apenas grandes amostras podem ser
analisadas.
Ensaio Cometa de Eletroforese em Gel de Célula Única (SCGE): SCGE é um método preciso de
medição de morte celular, visto que visualiza danos no ADN de células individuais. Como o DNA
que se degrada lembra a forma de um cometa quando visto nos eletroferogramas, eles são
chamados de ensaio do cometa. A quantidade de DNA presente no núcleo ou "cabeça", a parte do
DNA que se afastou do núcleo que forma a cauda, fica embebida na fina camada de gel de agarose
durante a separação eletroforética, formando um padrão de cometa. Isto detecta a ruptura da
cadeia de DNA dependente do pH. Em condições alcalinas, este ensaio detecta tanto a ruptura
simples como a de cadeia dupla, o local de reparação da excisão e os locais lábeis alcalinos.
Detecta quebra de DNA de cadeia dupla, principalmente em condições neutras que são
consideradas adequadas para detecção apoptótica. A viabilidade da célula pode ser avaliada como
morta ou viva, e o tipo de morte celular pode ser interpretado como apoptose ou necrose. [23]
Células apoptóticas e células viáveis podem ser distinguidas, pois as células apoptóticas exibem
grandes caudas e cabeças pequenas, ao contrário das células vivas, com cabeça grande e cauda
pequena. As células necrosadas apresentam remanescentes nucleares com caudas mínimas.
Portanto, esse conceito tem sido utilizado em estudos de apoptose. [24,25]
FCM
É uma técnica de escolha para a quantificação apropriada de apoptose, um procedimento
que separa células apoptóticas e outras não apoptóticas, colorindo o material do DNA. Esta análise
multiparamétrica pode contar, examinar e classificar partículas microscópicas que estão
suspensas em um fluxo de fluido. Um aparato de detecção eletrônica que registra a dispersão
direta e a dispersão lateral permite o estudo das características físicas e químicas das células,
distinguindo células apoptóticas de outras células. [26-29]
ISEL
A técnica ISEL permite a identificação precisa de células apoptóticas simples nas
extremidades livres do DNA usando marcação radioativa ou não radioativa. A quantificação da
apoptose é feita pela detecção da fragmentação do DNA numa base célula a célula que preservará
a informação topológica mesmo em freqüências muito baixas. [8]
Ensaio colorimétrico de Western blotting e Caspase
Western blotting (immunoblotting, blotting) é uma técnica central em estudos moleculares que
reconhece proteínas específicas de misturas complexas de células extraídas.
Os três fatores principais do Western blotting:
• Eletroforese em gel que separa as misturas de proteínas;
• As proteínas separadas que serão eficientemente transferidas para um suporte sólido;
• A detecção de proteína alvo específica, combinando os anticorpos adequadamente.
A visualização da proteína alvo observada na membrana de transfercia, pelula de raios X ou num
sistema de imagiologia como uma banda. A expressão de Bcl-2 e Bax pode ser examinada e
analisada por análise de western blot. A atividade da caspase pode ser detectada na presença ou
ausência de inibidores de caspases por análise de western blot e ensaio de atividade de protease
fluorométrica.
O ensaio de protease colorimétrica Caspase-3 quantifica as caspases com base na
sequência de aminoácidos. Este é um meio simples e eficiente para analisar a atividade da caspase.
Este kit é baseado na detecção do cromoforo p-nitroanilida (pNA), após clivagem do substrato
marcado DEVD-pNA (DEVD é uma sequência de de aminoácidos Asp-Glu-Val-Asp).
Espectrofotômetro ou um leitor de placas de microtitula�o a 400 nm ou 405 nm podem ser
utilizados para quantificar o pNA. A determinação do aumento efetivo da atividade da caspase-3
pode ser obtida pela comparação da quantidade de pNA absorvida de uma amostra apoptótica.
[30,31]
Ensaio de nuclease
A técnica de ensaio de nuclease detecta cada molécula de RNA a partir de uma amostra
de RNA heterogêneo. Moléculas de RNA de qualquer sequência conhecida podem ser detectadas
mesmo em concentrações muito baixas usando esta técnica. A degradação da cromatina
representa um compromisso claro com a morte, numerosos ensaios foram desenvolvidos para
avaliar as nucleases relevantes envolvidas.
Estes ensaios se enquadram em duas categorias principais:
1. Aqueles independentes da estrutura da cromatina
2. Aqueles dependentes da estrutura da cromatina.
Os ensaios independentes de cromatina (ensaio de degradação de plasmídeos e ensaio de
gel radioativo) examinam a capacidade para degradar ADN nu s vantajosos devido sua
simplicidade e velocidade e capacidade para analisar nucleases isoladas ou misturas de nucleases.
No entanto, estes ensaios não imitam as condições presentes nas células normais e não avaliam a
capacidade de uma enzima para funcionar na apoptose. Em contraste, ensaios dependentes de
cromatina (autodigestão nuclear e ensaio de núcleos HeLa) apresentam cromatina intacta para
enzimas endógenas ou exógenas e avaliam a capacidade de degradar a cromatina de uma maneira
que recapitula a destruição genômica observada in vivo e ajuda a estudar a apoptose. [32]
 Conclusão
Várias modalidades de detecção de apoptose estão atualmente disponíveis. Detecção,
quantificação, determinação do estágio e validar as observações é o principal requisito para
detectar e analisar a apoptose. A determinação do índice apoptótico é um bom marcador
prognóstico para o câncer. A compreensão profunda das interligações moleculares entre
tumorigênese, apoptose e alvos de drogas fornecerá uma base sólida para a terapia de câncer
individualizada de nova era.