Papel da autofagia na senescência celular

lume.ufrgs.br/handle/10183/104795

Papel da autofagia na senescência celular

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Título Papel da autofagia na senescência celular

Autor Chiela, Eduardo Cremonese Filippi

Orientador Lenz, Guido

Data 2014

Nível Doutorado

Instituição Universidade Federal do Rio Grande do Sul. Instituto de Biociências. Programa de Pós-
Graduação em Biologia Celular e Molecular.

Assunto Autofagia
Morte celular
Senescência

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Resumo Autofagia é o processo de degradação de componentes próprios celulares e parece
modular senescência e apoptose induzidas por diferentes tipos de injúria, incluindo dano
ao DNA. Populacionalmente, autofagia ocorre logo após o dano ao genoma, enquanto
senescência é a resposta crônica das células que resistem à morte celular. Até o
momento, nenhum trabalho demonstrou o papel da autofagia na senescência de fato,
principalmente considerando uma análise integrada com morte celular e a ocorrência
destes mecanismos a nível de células únicas. Inicialmente, desenvolvemos uma
metodologia para avaliação do tamanho e forma de núcleos de células eucarióticas em
cultura, a Análise Morfométrica Nuclear, a qual foi validada para análise de apoptose,
senescência e irregularidades nucleares. O segundo objetivo foi avaliar o papel da
autofagia na senescência e morte celular induzidas por dano ao DNA em células de
glioblastoma, e os mecanismos moleculares por trás desta relação. Para isso, células
expressando estavelmente o marcador de autofagia GFP-LC3 foram tratadas com o
indutor de dano ao DNA Temozolomida (TMZ), droga de escolha contra glioblastomas,
por 3h seguido do replaqueamento em meio livre de droga. TMZ induziu autofagia
transiente e ativação de AMPK-ULK1 e p38 MAPK, acompanhado da supressão crônica
da via PI3K/Akt/mTOR. O tratamento com TMZ induziu aumento de vários marcadores de
senescência celular a longo prazo, cuja cinética foi analisada de maneira integrada e
correlativa, bem como aumentou níveis de ROS, os quais mediaram, ao menos
parcialmente, a indução de autofagia e senescência. Considerando a relação entre
autofagia e senescência, observamos uma correlação negativa forte entre os
mecanismos a nível populacional. Por outro lado, a nível de células únicas esta
correlação não foi observada. Através do acompanhamento de células únicas nós
observamos também uma redução orquestrada da autofagia independente da aquisição
de fenótipo senescente. Esta redução ocorreu antes, durante ou após o aumento da área
celular que caracteriza senescência celular, mostrando que a redução da autofagia não é
necessária para aquisição do fenótipo senescente. Finalmente, a ativação da autofagia
aumentou o efeito pró-senescente da TMZ, enquanto a supressão da autofagia induziu
apoptose e reduziu a senescência, sugerindo que a autofagia protege as células da
morte celular e permite a entrada das células em estado senescente após tratamento
com TMZ. Neste sentido, também discutimos aqui a importância da análise completa e
integrada das alterações em mecanismos de proliferação e morte celular induzidas pela
inibição da autofagia. Em conclusão, autofagia e senescência parecem ser repostas
induzidas por um mesmo sinal mas com cinéticas diferentes nas células expostas a dano
ao DNA, estabelecendo uma correlação negativa a nível populacional que não se
confirma a nível de células únicas.

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 Abstract Autophagy is the process of degradation of own cellular components and appears to
modulate senescence and apoptosis induced by different types of injury, including DNA
damage. At a population level, autophagy occurs soon after the damage to the genome,
while senescence is chronic response of cells that resist to cell death. To date , no study
has demonstrated the role of autophagy in senescence indeed, especially considering an
integrated analysis with cell death and the occurrence of these mechanisms at the level of
single cells. This thesis consists of two main objectives. Initially, we developed a method
to evaluate the shape and size of nuclei of eukaryotic cells in culture, called Morphometric
Analysis Nuclear, which was validated for the analysis of apoptosis, senescence and
nuclear irregularities. The second objective was to evaluate the role of autophagy in
senescence and cell death induced by DNA damage in glioblastoma cells, and the
molecular mechanisms behind this relationship. For this, cells stably expressing the
autophagy marker GFP- LC3 were treated for 3h with the DNA alkylating agent
Temozolomide (TMZ), the drug of choice against glioblastomas, followed by replating in
drug-free medium. TMZ induced autophagy and transient activation of AMPK-ULK1 axis
and p38 MAPK, accompanied by chronic suppression of the PI3K/Akt/mTOR pathway.
The treatment with TMZ induced an increase of several markers of cellular senescence at
long term, whose kinetics was analyzed and integrated correlative manner. TMZ also
increased ROS levels which mediated, at least in part, the induction of senescence and
autophagy . Considering the relationship between autophagy and senescence, we
observed a strong negative correlation between the mechanisms at the population level.
On the other hand, at a single cell level this correlation was not observed. Through the
monitoring of single cells we also observed an orchestrated reduction of autophagy,
independently of the senescent phenotype acquisition. This reduction occured before,
during or after increasing the cell area featuring cellular senescence, showing that the
reduction of autophagy is not required for the acquisition of the senescent phenotype.
Finally , activation of the autophagy increased pro- senescent effect of TMZ, while
autophagy inhibition triggered apoptosis and reduced senescence, suggesting that
autophagy protects cells from cell death and allows senescence entry after treatment with
TMZ. In this sense, we also discuss here the importance of comprehensive and integrated
analysis of changes in mechanisms of proliferation and cell death induced by autophagy
inhibition. In conclusion , autophagy and senescence responses appear to be induced by
the same signal but with different kinetics after DNA damage, establishing a negative
correlation at a population level that is not confirmed at the level of single cells.

Tipo Tese

URI http://hdl.handle.net/10183/104795

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Ciências Biológicas
Biologia Celular e Molecular [443]

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