Diagnóstico de Neoplasias

Hematopoieticas: Citogenética,
Imunofenotipagem e
Eletroforese de Proteínas
Thayne Woycinck Kowalski
Retomando a Biologia Tumoral

Carcinogênese tem, especialmente, três fases de evolução:

Iniciação: primeiro passo para tumorigênese, mutação no DNA irreversível.

Promoção: agentes promotores que não possuem capacidade de iniciação,

mas contribuem com a proliferação celular. Carcinógenos muitas vezes
biológicos (hormônios e fatores de crescimento).

Progressão: desenvolvimento tumoral, surgimento de novas mutações e

consequentes subclones tumorais.
Biologia Tumoral Diferentes tipos de
mutações podem atingir
os proto-oncogenes,
tornando-os oncogenes.
Porém, em neoplasias
hematológicas, as quebras
cromossômicas são as
mais comuns, em especial
as translocações, que
produzem proteínas
modificadas, denominadas
oncoproteínas.

Dois tipos de genes estão envolvidos no

processo da tumorigênese: proto-oncogenes
(proliferação) e genes supressores tumorais
(apoptose).
Translocação Recíproca
Translocações recíprocas ocorrem
quando não há perda de material
genético, sendo, portanto, consideradas
translocações balanceadas. Podem
interferir na meiose.

As translocações podem quebrar genes

ao meio, alterando a expressão
(exemplo 1), gerando proteínas
quiméricas (exemplo 2) ou levando à
perda de função da proteína (exemplo 3)
Etiologia das Neoplasias Hematológicas

Alta heterogeneidade justifica a necessidade de classificação

Desde 2008: OMS em associação às Sociedades de Hematologia sustentam uma
classificação baseada em:
Achados morfológicos e contagem de blastos
Provas citoquímicas
Imunofenotipagem
Citogenética
Apresentação clínica
Imunofenotipagem

Identificação de antígenos leucocitários específicos, associados à linhagem e ao

grau de maturação e diferenciação das células sanguíneas

Técnica se baseia no uso de anticorpos monoclonais conjugados a fluorocromos

Células são lidas, uma a uma, no citômetro de fluxo

Células em suspensão passam por um laser

Excita os fluorocromos conjugados

Populações celulares reconhecidas pelo desvio do feixe

de luz e medida do comprimento de onda

Citometria de Fluxo

Recomendada na classificação das leucemias agudas, sendo

também aplicada para avaliação de prognóstico e avaliação de
doença residual mínima (marcadores preliminares → específicos)
Ângulos de Dispersão

FSC: ângulo de dispersão frontal → detecta o tamanho celular

SSC: ângulo de dispersão lateral → detecta a composição, a complexidade celular

Exemplo - Diferenciação do Neutrófilo
Exemplo - Linfócito CD4+ e CD8+

Das células avaliadas, qual o percentual de células

CD4+, CD8+ e CD4+/CD8+?

Qual o percentual de células que não possui nenhuma

das duas imunofenotipagens? Pode se afirmar qual o
tipo celular desse percentual?
Imunofenotipagem Preliminar e Complementar
Citogenética

Avaliação citogenética permite mais

informações sobre prognóstico
Verificação da remissão completa ou
parcial
Doença residual mínima
Melhor material: aspirado de medula
óssea
Sangue periférico pode ser utilizado
se > 10% de blastos
Citogenética - Classificações

Clone: duas metáfases analisadas com a mesma alteração estrutural (se

hiperploidia) ou três metáfases, se hipoploidia → difícil na LLC

Alterações primárias: originam as neoplasias hematopoiéticas

Exemplo: Cromossomo Philadelphia

Alterações secundárias: auxiliam a avaliar o prognóstico ou tratamento

Exemplo: trissomia do 8 ou 19 na LMC

Cariótipo
FISH
Citogenética + Imunofenotipagem
Leucemia Mieloide Aguda

Apesar de características clínicas similares,

as LMAs possuem causas citogenéticas e
alterações morfológicas distintas

Geralmente os genes afetados são fatores

de transcrição

Em virtude do alto número de rearranjos,

indica-se realização de RT-PCR e FISH (55%
dos casos)

GATA1: associado à Síndrome de Down

Leucemia Mieloide Aguda
Cromossomo Philadelphia (t9:22)

Causa citogenética da Leucemia Mieloide Crônica

Translocação recíproca entre 9q34 e 22q11.

Formação de proteínas quiméricas BCR-ABL com alta proliferação (oncogenes),

conforme o sítio de quebra:

p190: Leucemia Linfoblástica Aguda

p210: Leucemia Mieloide Crônica

p230: Leucemia Neutrofílica Crônica

Outras Classificações
LLA: t12;21(12p13;21q22), gene TEM-AML1 → 25% dos casos de crianças
LLC: não se caracteriza por anormalidades citogenéticas
Translocações também vistas em Linfoma Não-Hodgkin
Neoplasmas mieloproliferativos:
Se positivo para Ph (BCR-ABL1): LMC
Se positivo JAK2 V617F: neoplasma mieloproliferativo JAK2
Se negativo para ambos: testar exon 12 de JAK2 (policitemia vera) e MPL
(trombocitopenia essencial e mielofibrose)
Mieloma Múltiplo

Neoplasia dos plasmócitos

Causa desconhecida, porém diversas alterações
citogenéticas já visualizadas: del13q14, del17p13,
anormalidades 11q, t(11;14)(q13;q32) e t(4;14)(p16;q32)
Alterações de expressão de MYC e RAS, além de
mutações em p53 e pRb-1
Células do mieloma múltiplo são hiperprodutoras de
imunoglobulina monoclonal denominada proteína M
Pico de imunoglobulinas na eletroforese de proteínas
Eletroforese de Proteínas

Método diagnóstico que separa as proteínas plasmáticas em frações

Tal como na eletroforese de ácidos nucleicos, consiste na aplicação da amostra

(soro) em matriz sólida (celulose ou agarose) e submissão à potencial elétrico

Conforme a característica de cada proteína (peso molecular e carga elétrica), a

distância percorrida será diferente

Forma bandas: albumina, alfa-1-globulina, alfa-2-globulina, betaglobulina e

gamaglobulina

Bandas são quantificadas

Eletroforese de Proteínas
Eletroforese de Proteínas
Pico Policlonal X Pico Monoclonal
Pico policlonal - representa resposta imunológica
simultânea de diversos clones plasmocitários a
determinado estímulo antigênico, seja inflamatório,
imune ou infeccioso. Curva de base larga,
demonstrando a produção de todas as classes de
imunoglobulinas
Pico monoclonal - consiste no aumento
homogêneo e fusiforme da fração gama,
que representa a produção por um único
clone plasmocitário de um tipo específico
de imunoglobulina. Esse padrão está
associado às gamopatias monoclonais.