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Revendo Cincias Bsicas
O objetivo desta subseo apresentar revises concisas
sobre temas relacionados com as cincias bsicas, ou seja,
procurar rever as bases da prtica mdica. A justificativa para
a incluso de tpicos dessa natureza relaciona-se com os
significativos progressos dessas cincias nas ltimas dcadas
e necessidade absoluta de atualizao por parte da equipe de
sade, para o benefcio dos pacientes.
Magda M. S. Carneiro-Sampaio
Editora Associada da einstein
Srie - Biologia molecular
Atualizao
Parte 2 - Uso das tcnicas de biologia
molecular para diagnstico
Adriana Lopes Molina1, Patrcia Renovato Tobo2
1
Pesquisadoras do Centro de Pesquisa Experimental do Instituto de Ensino e Pesquisa do
Hospital Israelita Albert Einstein - So Paulo (SP).
2
Pesquisadoras do Centro de Pesquisa Experimental do Instituto de Ensino e Pesquisa do
Hospital Israelita Albert Einstein - So Paulo (SP).
As tcnicas hoje utilizadas na gentica molecular tm sido
desenvolvidas a partir da pesquisa acadmica bsica, em
diferentes campos da atividade cientfica(1-3). O trabalho
de Watson e Crick, em 1953, onde foi proposta a estrutura
de dupla-fita do DNA, marcou a revoluo molecular.
Em 1975, Nathans e Smith purificaram enzimas de
restrio, ferramentas essenciais para a manipulao
in vitro do DNA. Estas foram de fundamental
importncia para o isolamento e amplificao de
fragmentos especficos de DNA para a clonagem in
vivo, tecnologia desenvolvida a partir das tcnicas de
DNA recombinante descritas por Berg em 1972.
Tambm em 1975 uma nova metodologia, denominada
Southern blotting, comeou a ser usada para investigar
a localizao de genes e marcou o incio da aplicao
destas tecnologias no estudo das doenas genticas.
Em 1977, tcnicas de seqenciamento permitiram a
identificao de alteraes especficas na seqncia de DNA
e a associao destas com diferentes doenas genticas.
Depois disso, o principal marco no desenvolvimento das
tcnicas de diagnstico molecular foi a tcnica da reao
em cadeia da polimerase (PCR), um mtodo de clonagem
in vitro proposto por Kary Mullis em 1987.
Desde a introduo da tcnica de PCR, rpidos
avanos nas tcnicas de gentica molecular tm
revolucionado a prtica da patologia, anatomia e anlises
clnicas. As tcnicas moleculares so agora aplicveis a
todas as reas do laboratrio clnico. Na anatomia
patolgica, apesar das anlises morfolgicas ainda serem
a principal ferramenta de trabalho, resultados dos estudos
de gentica molecular tm integrado, cada vez mais, os
diagnsticos nas anlises cirrgicas(3-5).
Os estudos genticos moleculares utilizam uma
variedade de tcnicas para analisar os cidos nuclicos
(DNA e RNA). Dentre estas tcnicas destacam-se:
tcnica de hibridizao do tipo dot ou blot, Southern e
Northern, e hibridizao in situ; tcnicas de amplificao
de alvos-especficos como a PCR, PCR competitiva,
PCR-transcriptase reversa (RT-PCR) e a PCR em
tempo-real; mtodos de amplificao de sinal, como
por exemplo branched DNA (bDNA); tecnologia de
arrays. Os resultados destes ensaios podem ser teis
no diagnstico, prognstico, determinao da terapia
a ser utilizada, e at mesmo na avaliao da
suscetibilidade a doenas.
As principais reas de aplicao das tcnicas
moleculares de diagnstico so: doenas infecciosas,
cncer, doenas genticas, transplantes e patologia
clnica(4-8). Estes estudos podem ser realizados no sangue
perifrico, fluidos corporais, materiais obtidos atravs de
puno, tecidos frescos e tecidos embebidos em parafina.
Na rea de doenas infecciosas, a deteco rpida de
microrganismos de crescimento lento, ou daqueles no
cultivveis, se torna possvel atravs das tcnicas de biologia
molecular. As tcnicas moleculares tambm podem ser
empregadas na determinao de resistncia antimicrobiana,
no monitoramento de doenas atravs da quantificao
da infeco e em estudos epidemiolgicos(4).
Na rea de gentica humana, a biologia molecular
tornou-se ferramenta fundamental no diagnstico das
doenas monognicas, permitindo no s a identificao
do gene afetado, mas tambm da mutao responsvel
pela doena. A disponibilidade dos mtodos diagnsticos
tem possibilitado tambm a identificao de portadores
heterozigotos, o diagnstico pr-natal e a triagem
populacional para estas doenas.
Embora a maioria dos testes genticos ainda se
destine ao diagnstico e preveno de doenas raras,
os avanos tecnolgicos tm permitido o uso destes
testes para a avaliao de risco de doenas como cncer
e doenas cardiovasculares (9-11). A correlao entre
mutaes gnicas e suscetibilidade a doenas
particularmente importante no cncer, sendo que cerca
de 5% a 10% do casos ocorrem em indivduos que
herdaram alguma predisposio a essa doena. Dentre
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os genes mais estudados de predisposio ao cncer polimerase tambm bastante flexvel, permitindo uma
esto o BRCA1 e BRCA2, nos cnceres de mama e srie de modificaes que possibilitam o seu emprego
ovrio hereditrios e os genes de reparo do DNA, na anlise de uma grande variedade de amostras.
MLH1 e MSH2, para os tumores colorretais. Para a realizao da PCR, utiliza-se uma enzima
Assim, entre as diversas possibilidades de aplicaes da termoestvel (DNA polimerase) que, na presena de
biologia molecular no diagnstico, os testes moleculares um par de oligonucleotdeos iniciadores (primers) e dos
mais comumente empregados so: os de avaliao de carga nucleotdeos que compem a molcula de DNA,
viral para HIV e hepatite C, testes para trombofilia amplifica a regio de interesse a partir de uma pequena
hereditria, testes para mutaes genticas nos casos de quantidade de DNA. Esta amplificao ocorre durante
cncer familial, hibridizao in situ fluorescente (FISH) repetidos ciclos de temperatura, a saber: 94C para
para estudos das trissomias mais comuns no lquido desnaturao do DNA, 45C a 70C para hibridizao
amnitico, para a amplificao do gene HER-2 em cncer dos oligonucleotdeos s seqncias-alvo e 72C para
de mama, alm de numerosos testes genticos disponveis a sntese do DNA, em equipamentos chamados de
para a avaliao de doenas hematolgicas. termocicladores. O DNA amplificado pode, ento, ser
separado e visualizado em gis de agarose ou poliacrilamida
e utilizado para diversos fins (figura 1).
Tcnicas de amplificao do sinal (hibridizao)
Esta tecnologia, introduzida primeiramente por
Southern em 1975, emprega sondas de DNA com
homologia seqncia do DNA-alvo em estudo.
Atualmente, apesar da disponibilidade de diversas
outras tcnicas mais rpidas, o Southern blotting
continua a ser muito utilizado.
As sondas de DNA podem ser usadas para
identificar seqncias especficas de DNA ou RNA em
diversas amostras, sendo empregadas tanto em ensaios
de deteco como de atividade. As sondas podem ser
marcadas com radioatividade ou com quimiofluores-
cncia. Uma vez hibridizada amostra de DNA, que
est imobilizada numa membrana de nitrocelulose ou
nylon, a sonda poder ser detectada por exposio a
um filme de raio X.
Mais recentemente, em 1995, foi introduzida por
Schena e colaboradores outra tecnologia baseada na
amplificao de sinal, a tecnologia de microarrays. So
lminas com uma alta densidade de seqncias de DNA
que permitem estudos de nveis de expresso gnica,
analisando-se uma grande quantidade de genes ao
mesmo tempo, utilizando sondas de cDNA.
Figura 1. Esquema representativo da reao da PCR

Entre as principais tcnicas resultantes de

Reao em cadeia da polimerase (PCR)
A reao em cadeia da polimerase (PCR) uma das
tcnicas mais empregadas nas diversas reas do
diagnstico molecular. A sua introduo resultou em
grande revoluo tecnolgica, permitindo a
amplificao de uma seqncia de interesse contida
em uma amostra complexa de DNA e possibilitou a
adoo de mtodos automatizados para a anlise do
genoma. A tecnologia da reao em cadeia da
modificaes da reao em cadeia da polimerase,
podemos citar o RT-PCR, nested PCR, multiplex PCR,
PCR a partir de primers randmicos e PCR em tempo
real. O RT-PCR utiliza uma enzima chamada
transcriptase reversa para converter uma amostra de
RNA em cDNA antes da etapa de amplificao por
PCR, permitindo estudo de vrus de RNA e anlises
de expresso gnica. O nested PCR, que emprega uma
segunda etapa de amplificao com um par de primers

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internos aos utilizados na primeira etapa e visa mutantes, durante os ltimos ciclos podero se formar
aumentar a sensibilidade e especificidade do mtodo. heteroduplexes entre essas duas espcies de molculas
J PCR multiplex uma reao de amplificao e que estes tero um padro de migrao eletrofortica
desenhada para detectar mltiplas seqncias-alvo diferente dos homoduplexes (figuras 2 e 3).
numa mesma amostra. PCR a partir de primers
randmicos utiliza seqncias curtas de oligonucleotdeos
para amplificar regies repetitivas do DNA genmico
e bastante empregado em estudos epidemiolgicos.
Finalmente, PCR em tempo real permite que a
amplificao e a deteco ocorram simultaneamente,
num sistema fechado, sendo necessrio para isto um
termociclador que possua sistema de monitoramento
de emisso de fluorescncia. Esta tcnica empregada
para quantificao de amostras, como para testes de carga
viral e monitoramento de doena residual mnima.

Tcnicas de deteco de mutaes em genes conhecidos

Existem diversas tcnicas para deteco de mutaes em
genes conhecidos, sendo o seqenciamento o gold standard.
Ele o mtodo com maior nvel de resoluo, permitindo Figura 2. Esquema do mtodo de SSCP, mostrando que diferentes seqncias
podem apresentar conformaes especficas possibilitando a identificao de
analisar cada uma das bases de determinada seqncia de
diferentes alelos quando submetidos a uma corrida eletrofortica
DNA. Atualmente, as tcnicas de escrutnio de mutaes
tm, cada vez mais, sensibilidade e especificidade para
detectar alteraes de uma nica base na seqncia de DNA.
Uma vez identificada a regio do gene que contm uma
alterao, esta ser confirmada pela tcnica de seqenciamento.
Existem vrias tcnicas descritas para escrutnio de
mutaes de ponto em fragmentos de DNA que
utilizam a tcnica da PCR. Algumas destas tcnicas
baseiam-se nas diferenas de mobilidade eletrofortica
de fragmentos com seqncias de DNA selvagens e
mutantes: DGGE (Denaturing Gradient Gel
Electrophoresis); SSCP (Single Strand Conformation
Polymorphism); HA (Heteroduplex Analysis); CSGE
(Conformation Sensitive Gel Electrophoresis). Existem
ainda outras tcnicas que se baseiam na clivagem de
bases no pareadas em heteroduplexes: (CCM
Chemical Cleavage Method e EMC Enzyme Mismatch
Cleavage), ou utilizam a deteco de alteraes na Figura 3. Esquema representativo da anlise de heteroduplexes. a) Produtos de
PCR referentes aos dois alelos de um indivduo heterozigoto (+/-) para uma
protena transcrita por um determinado fragmento de mutao ponto (-). Aps a denaturao e renaturao dos produtos de PCR,
DNA (PTT Protein Truncation Test). molculas homoduplexes (azuis) e heteroduplexes (rosas) so formadas. b) Os
Uma das tcnicas mais empregadas o SSCP e o heteroduplexes tendem a migrar mais em um gel de poliacrilamida (banda superior)
do que as homoduplexes (inferior)
HA. A tcnica de SSCP baseia-se no fato de que a
conformao tridimensional de fragmentos de DNA Atualmente, outra tcnica que tem sido empregada
simples-fita depende da seqncia de nucleotdeos, na anlise de heteroduplexes a DHPLC (Denaturing
sendo que a diferena de um nucleotdeo altera o padro high-performance liquid chromatography). O escrutnio
de migrao eletrofortica. Por sua vez, a tcnica de de mutaes atravs da DHPLC baseia-se na diferena
HA baseia-se no fato de que se numa reao de PCR de afinidade dos heteroduplexes e homoduplexes, de
estiverem presentes molculas de DNA selvagens e um determinado fragmento amplificado de DNA, pela

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fase slida da cromatografia, em condies parcialmente
denaturantes. Esta tcnica tem sensibilidade e
especificidade estimada entre 96% e 100% e tem sido
empregada com sucesso na deteco de mutaes em
diferentes genes de interesse mdico, mostrando-se
mais eficiente do que outras tcnicas rotineiramente
utilizadas para este fim. Alm da alta sensibilidade na
deteco de mutaes, esta tcnica permite um alto
grau de automao e no requer nenhum tratamento
especial ao produto de PCR. Desta forma, facilita a
anlise de um grande nmero de amostras, bem como
de genes com vrios xons (figura 4).
Figura 4. Cromatograma representativo da anlise de heteroduplexes por
dHPLC
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