UNIVERSIDADE FEDERAL DO TOCANTINS

PROGRAMA DE PÓS-GRADUAÇÃO EM CIÊNCIAS DA SAÚDE

Mestrado Profissional em Ciências da Saúde PPGCS: Universidade Federal

do Tocantins 2020

Sara do Nascimento Lemus

PALMAS - TO

2020
 SARA DO NASCIMENTO LEMUS

OCORRÊNCIA E CARACTERIZAÇÃO MOLECULAR DE

CRYPTOSPORIDIUM EM FEZES DE CÃES SOROPOSITIVOS
PARA LEISHMANIA SPP.

Dissertação apresentada ao Mestrado

Profissional em Ciências da Saúde da
Universidade Federal do Tocantins para
a obtenção do título de Mestre.

Orientador: Dr. Raphael Sanzio Pimenta

Co-Orientador: Dr. Luiz da Silveira Neto

PALMAS - TO

2020
 DEDICATÓRIA
Dedico a Deus, porque Dele e por Ele, para Ele são todas as coisas.
Á minha família, minha fortaleza.
 AGRADECIMENTOS

Agradeço a Deus primeiramente, pela minha vida, pelas oportunidades, por me

capacitar e me abençoar em mais um ciclo.
Aos meus pais Eduardo Andrea Lemus e Carmem Luiza Lemus, pelo amor,
paciência e por sempre acreditar em mim e apoiar meus sonhos.
Aos meus irmãos Jonas e Tarsila pela paciência, força e coragem que sempre me
deram mesmo não estando perto fisicamente.
A todos do grupo de pesquisa do Laboratório de Microbiologia Geral e Aplicada
(LMGA UFT-Campus Palmas) e do Laboratório de Imunologia e Parasitologia
(IMMUNOPAR UFT-Campus Gurupi), em especial aos meus colegas de laboratório
Luís Paulo Mourão e Paloma Ximenes.
A todos do grupo de pesquisa do Laboratório de Enfermidades Parasitárias dos
Animais, Faculdade de Medicina Veterinária (FMV) Universidade Estadual Paulista
(UNESP) Campus de Araçatuba – SP, e Laboratório de Ornitopatologia (FMV/UNESP)
Campus de Araçatuba – SP, em especial à Dra. Elís Domingos Ferrari, à Profa. Dra.
Katia Denise Saraiva Bresciani e ao Prof. Dr. Marcelo Vasconcelos Meireles;
Aos funcionários, o coordenador Henrique, o técnico Manoel e o médico
veterinário responsável Pedro, do Centro de Controle de Zoonoses de Gurupi pela
parceria e viabilizar a realização desse trabalho.
Ao meu orientador Raphael Sanzio Pimenta por me acolher, confiar e acreditar
em mim.
Ao meu co-oritador Luiz da Silveira Neto por aceitar me ajudar nessa trajetória,
pela paciência, por transmitir o seu conhecimento ao longo da realização do trabalho,
pela amizade, e por sempre acreditar em mim.
A professora Dra. Juliana Fonseca pelos ensinamentos e por me acolher tão bem
no LMGA.
A professora Me. Adriana Miranda Terra por me ceder sua residência em Gurupi
todas as vezes que precisei me hospedar.
A minha colega Marcela Marcondes Fiuza por receber minha amostra e leva-la
com segurança ao Laboratório de Enfermidades Parasitárias dos Animais
(FMVA/UNESP).
 A Universidade Federal do Tocantins e ao programa de pós-graduação em
Ciências da Saúde pela oportunidade da realização de um curso de pós-graduação.
“Aquele que é bom em dar desculpas
raramente é bom em qualquer outra coisa.”
(Benjamin Franklin)
 RESUMO

Resumo. Neste estudo, nós investigamos a ocorrência e caracterizamos

molecularmente oocistos de Cryptosporidium spp. em cães soropositivos para
Leishmania spp. Estudos de caracterização molecular contribuem para o melhor
entendimento da taxonomia do parasito e epidemiologia da doença. Amostras fecais de
101 cães soropositivos para Leishmania spp. pelo teste imunocromatográfico Dual-Path
Platform (DPP) e/ou ELISA (Biomanguinhos) foram concentradas por centrifugo-
sedimentação em água-acetato de etila, coradas por verde malaquita e observadas ao
microscópio óptico (400x). Uma amostra foi positiva por microscopia com confirmação
pela nested-PCR (nPCR) para amplificação de fragmento do gene da subunidade 18S do
RNA ribossômico (18S RNAr), seguida de sequenciamento. A espécie identificada foi
Cryptosporidium canis. O cão apresentava os seguintes sinais clínicos sugestivos de
leishmaniose visceral: caquexia, alopecia generalizada, mucosa gengival de coloração
pálida, esplenomegalia e onicogrifose. Concluímos que os médicos veterinários devam
alertar os tutores de cães sobre a possibilidade de transmissão zoonótica por C. canis,
ainda que C. parvum e C. hominis sejam as principais espécies causadoras de
criptosporidiose em humanos.
Palavras-chave: Leishmaniose. Criptosporidiose. Zoonose. Epidemiologia.
Protozoário.
 ABSTRACT

Abstract. In this study, we investigated the occurrence and characterized molecularly

Cryptosporidium spp. oocysts in dogs Leishmania spp. Seropositive. Studies on
molecular characterization contribute to a better understanding of parasites taxonomy
and epidemiology of diseases. Fecal samples from 101 dogs seropositive for
Leishmania spp. by immunochromatographic test Dual-Path Platform (DPP) and/or
ELISA (Biomanguinhos) were concentrated by centrifugation-sedimentation in water-
ethyl acetate, stained with malachite green and observed under an optical microscope
(400x). One sample was positive by microscopy and confirmed by nested-PCR (nPCR)
for amplification of a fragment of 18S subunit ribosomal RNA gene (18S RNAr),
followed by sequencing. Only the especies Cryptosporidium canis was found. The dog
showed clinical signs suggestive of visceral leishmaniasis as follow: cachexia,
generalized alopecia, pale-colored gingival mucosa, splenomegaly and
onychoglyphosis. We conclude that veterinarians prectioners should alert dog guardians
about the possibility of zoonotic transmission by C. canis, even though C. parvum and
C. hominis are the main causative species of cryptosporidiosis in humans.
Keywords: Leishmaniasis. Cryptosporidiosis. Zoonosis. Epidemiology. Protozoan.
 SUMÁRIO

CAPÍTULO 1 .............................................................................................................................. 11
1 Referencial teórico .............................................................................................................. 11
1.1 Taxonomia................................................................................................................... 11
1.2 Epidemiologia e saúde pública .................................................................................... 12
1.3 Patogenia e sinais clínicos ........................................................................................... 14
1.4 Diagnóstico ................................................................................................................. 16
1.5 Tratamento .................................................................................................................. 17
1.6 Prevenção .................................................................................................................... 18
REFERÊNCIAS ...................................................................................................................... 19
CAPÍTULO 2 .............................................................................................................................. 25
2 Ocorrência e caracterização molecular de Cryptosporidium spp. em fezes de cães
soropositivos para Leishmania spp. ............................................................................................ 25
2.1 Introdução ................................................................................................................... 25
2.2 Material e métodos ...........................................................Erro! Indicador não definido.
2.3 Resultados ........................................................................Erro! Indicador não definido.
2.4 Discussão..........................................................................Erro! Indicador não definido.
2.5 Conclusão .........................................................................Erro! Indicador não definido.
REFERÊNCIAS ...........................................................................Erro! Indicador não definido.
 LISTA DE FIGURAS

FIGURA 1 - Detecção de amplicons do gene da subunidade 18S do RNA ribossômico (18S

RNAr) de Cryptosporidium spp. obtidos por nPCR. Marcador de peso molecular (MM); coluna
1: controle positivo; coluna 2: amostra positiva; coluna 3: controle negativo. ........................... 28
FIGURA 2 - Alterações macroscópicas em cão com anticorpos anti-Leishmania spp. detectáveis
por Dual-Path Platform (DPP®) e infectado por Cryptosporidium spp. A) caquexia e rarefação
pilosa em tórax; B) Mucosa gengival pálida; C) Esplenomegalia com hiperplasia da polpa
branca; D) Onicogrifose. ............................................................................................................. 29
 CAPÍTULO 1

1 Referencial teórico

1.1 Taxonomia

Compreender a posição taxonômica do patógeno Cryptosporidium spp.

possibilita entender características sobre ele como sua evolução, patogênese,
diagnóstico e tratamento. Graças aos estudos genômicos comparativos foi possível
classificar este patógeno, uma vez que por microscopia a morfologia dos oocistos é
muito similar, distinguindo-se apenas aqueles com oocistos menores e quase esféricos
(4-6 mm de diâmetro), como o Cryptosporidium hominis daqueles com oocistos
maiores e mais ovais (7-5 mm), como Cryptosporidium muris (CHALMERS;
KATZER, 2013).
Pertence ao filo Apicomplexa, que inclui outros patógenos importantes para
Saúde Única, como Plasmodium spp., Toxoplasma gondii, e Eimeria spp. agentes
etiológicos da malária, toxoplasmose e eimeriose, respectivamente (RYAN; HIJJAWI,
2015). Antes pertencia a subclasse Coccidia, porém foi transferido para nova subclasse
chamada Cryptogregaria, sendo considerado um gregarino, para a maioria dos
pesquisadores (RYAN et al., 2016). Ele difere de outros coccídeos por apresentar
características únicas como a presença de dois tipos de oocistos de paredes espessas
responsáveis pela autoinfecção no indivíduo e de paredes finas, o pequeno tamanho do
oocisto, como citado anteriormente, a localização do Cryptosporidium no hospedeiro,
intracelular e extracitoplasmatica, e a presença de um vacúolo parasitóforo que facilita a
absorção de nutrientes da célula hospedeira (RYAN et al., 2016).
Com cerca de 40 espécies descritas, e mais de 40 genótipos, para identificação
das espécies o gene mais utilizado é o RNA ribossômico (rRNA) 18S e o gene da
glicoproteína de 60 kDa (gp60) (FENG; RYAN; XIAO, 2018). Em mamíferos podemos
citar 19 espécies: C. muris, Cryptosporidium parvum, Cryptosporidium wrairi,
Cryptosporidium felis, Cryptosporidium andersoni, Cryptosporidium canis, C. hominis,
Cryptosporidium suis, Cryptosporidium bovis, Cryptosporidium fayeri,
Cryptosporidium macropodum, Cryptosporidium ryanae, Cryptosporidium xiaoi,
Cryptosporidium ubiquitum, Cryptosporidium cuniculus, Cryptosporidium tyzzeri,
Cryptosporidium viatorum, Cryptosporidium scrofarum e Cryptosporidium erinace
(FAYER, 2010), em peixes temos duas espécies (Cryptosporidium molnari e
Cryptosporidium huwi), em anfíbio foi descrito uma espécie Cryptosporidium fragile,
duas (Cryptosporidium serpentis e Cryptosporidium varanii) são espécies em répteis,
em aves foi descrito Cryptosporidium meleagridis (RYAN; XIAO, 2013; RYAN;
HIJJAWI, 2015) e Cryptosporidium baileyi e Cryptosporidium galli (XIAO et al.,
2004).
As principais espécies patogênicas encontradas em humanos são C. hominis e C.
parvum (FENG; RYAN; XIAO, 2018), porém mais de 20 espécies e genótipos já foram
relatas em humanos, dentre elas: C. meleagridis, C. felis, C. canis, C. cuniculus, C.
ubiquitum, C. viatorum, C. muris, C. suis, C. fayeri, C. andersoni, C. bovis, C.
scrofarum, C. tyzerri e C. erinacei, visto que a maioria não apresenta especificidade
parasitária pelos hospedeiros (MEIRELES, 2010; RYAN; FAYER; XIAO, 2014).

1.2 Epidemiologia e saúde pública

A criptosporidiose é uma doença infecciosa causada pelo protozoário

Cryptosporidium spp., descrita no mundo inteiro. Tornou-se relevante a partir da década
de 80 com o surgimento da Síndrome da Imunodeficiência adquirida (HIV/SIDA),
sendo que nestes pacientes ocorria uma diarreia crônica e difícil de ser controlada,
muitas vezes levando a óbito (ASSIS et al., 2013). Crianças com faixa etária inferior a
cinco anos (LOUREIRO; LINHARES; MATA, 1989) e pacientes transplantados que
estão imunocomprometidos (CASTILHO; GONÇALVES, 2009) também representam
grupos de risco, trata-se, portanto é uma enfermidade oportunista e emergente.
Animais e humanos se infectam principalmente ao ingerirem água e alimentos
contaminados com os oocistos do protozoário (PUMIPUNTU; PIRATAE, 2018). Entre
2004 e 2010 Cryptosporidium sp. foi considerado a causa mais comum de surtos de
doenças transmitidas pela água e alimentos (BALDURSSON; KARANIS, 2011).
Segundo a Organização Mundial da Saúde (OMS) em 2010, houve 8,6 milhões de casos
de criptosporidiose transmitidos por alimentos levando a 3.759 óbitos, ocupando assim
o quinto lugar entre 24 microrganismos em termos de importância de patógeno de
origem alimentar (FAO/OMS, 2014).
Em países desenvolvidos a prevalência estimada é de 1 a 4,5% e em
desenvolvimento pode atingir 30% (TAGHIPOUR et al., 2020). No Brasil entre 1980 e
1997 foram detectados 2.842 casos de criptosporidiose em pacientes imunodeprimidos,
particularmente portadores de SIDA. Entre esses pacientes a prevalência de
criptosporidiose varia de 6,4%-9,1%, sendo que os estado do Nordeste e do Sudeste os
mais afetados (MINISTÉRIO DA SAÚDE 2004).
No sudeste, especificamente no estado de São Paulo vários surtos de
criptosporidiose foram relatados na literatura acometendo crianças que frequentavam
creches, principalmente entre um a cinco anos de idade (FRANCO; CORDEIRO, 1996;
MASCARINE; DONALÍSIO, 2006). Estes surtos estão relacionados com as condições
de higiene, a aglomeração em um espaço fechado e o estado imunológico desses
pacientes (CIPOLARI et al., 2010).
Os surtos de criptosporidiose estão relacionados principalmente a água
contaminada (RYAN; HIJJAWI; XIAO, 2018). Por exemplo, na cidade de Skelleftea,
na Suécia foi relatado um surto em 2011 aonde aproximadamente 18.500 pessoas foram
infectadas. De Maio a Junho de 2012 foram registrados 267 casos de criptosporidiose
no Reino Unido (North East, Yorkshire, West e East Midlands) (SMITH, 2012). A
infecção pode ocorrer também pela água de piscinas que contenham oocistos do
protozoário, como em Duluth no Minissota, em dois parques aquáticos, no Edgewater
Resort e no Water Park (COLLINS, 2012).
Os oocistos de Cryptosporidium são resistentes a desinfetantes como:
formaldeído, fenol, etanol e lisol, em determinadas concentrações e tempo de exposição
(SCORZA; TANGTRONGSUP, 2010), e a tratamentos de água como cloração e
filtração, este último pelo fato do reduzido tamanho do oocisto e sua capacidade de
flutuar, o que facilita a propagação ambiental e explica os surtos decorrentes
principalmente pela ingestão de água e alimentos contaminados (LIMA; STAMFORD,
2003; MANTILLA; FRANCO, 2007). A agua fervente é um método eficaz e barato
(SCORZA; TANGTRONGSUP, 2010), o peróxido de hidrogênio 6-7% por 20 minutos
é capaz de reduzir a concentração de oocistos na água (BARBEE et al., 1999). Outro
meio para inativa-lo seria a esterilização do material na autoclave ou o uso de óxido
etileno, sabe-se ainda que no ambiente os oocistos são sensíveis aos raios ultravioletas
(ROCHELLE et al., 2005).
No Brasil, apenas 38% do esgoto produzido no país é tratado, o resto é
devolvido a natureza sem nenhum tratamento. Além disso, não ocorre a fiscalização da
qualidade da água. Dos 5.570 municípios brasileiros, 2.659 não monitoram a qualidade
da água e quase a metade, 2.676, também não possui plano de saneamento básico, dados
preocupantes em relação a saúde pública e a propagação de patógenos transmitidos pela
água (IBGE, 2013). O esgoto que é tratado no Brasil utiliza-se predominante iodo
ativado que é capaz de diminuir a densidade de oocisto, de 28,9 oocistos/L para 1,05
oocistos/L (RAZZOLINI; DA SILVA SANTOS; BASTOS, 2010), mesmo assim
representa um problema para saúde pública pois este protozoário possui baixa dose
infecciosa, alta persistência no ambiente e é resistentes a métodos convencionais de
desinfecção (TONANI et al., 2013).
Como dito anteriormente, as espécies mais comuns responsáveis por causar
infecção em humanos são C. parvum e a C. hominis. Com o diagnóstico molecular foi
possível identificar C. parvum em cerca de 155 espécies de outros mamíferos, como em
cães, gatos, roedores e bovinos (XIAO; FAYER, 2008; SLAPETA, 2013), dessa forma
trata-se de um protozoário com caráter zoonótico e antropozoonótico (XIAO et al.,
2007; SLAPETA, 2013). A fonte de transmissão da espécie C. parvum para os humanos
ocorre pincipalmente pelas fezes de bovinos recém-nascidos que contaminam o meio,
esses mamíferos representam, portanto os maiores reservatórios de C. parvum no
ambiente (MEIRELES, 2010; RYAN; FAYER; XIAO, 2014).
Os animais de companhia representam um risco potencial de transmissão
zoonótica. Cães são hospedeiros específicos da espécie C. canis, porém ocasionalmente
podem estar infectados com C. parvum ou C. muris (LUCIO-FORSTER et al., 2010).
Assim como o homem pode se infectar com C. canis, o cão é um risco de contaminação
devido à proximidade com o ser humano (XIAO et al., 2007), esse tipo de transmissão
zoonótica pode ocorrer de forma direta pela ingestão de oocisto pela via fecal oral ou
indireta por meio da contaminação ambiental como vista anteriormente, o contato com
oocistos de Cryptosporidium spp. irá depender da área geográfica e da condição
socioeconômica de cada país (XIAO et al., 2004).

1.3 Patogenia e sinais clínicos

O hospedeiro ao ingerir os oocistos, seja de forma direta ou indireta, sofrera uma

interação parasita-hospedeiro, pois durante todo ciclo as diferentes formas do
microrganismo vão estar na superfície apical das células intestinais do hospedeiro, já
que o Cryptosporidium forma um vacúolo parasitóforo com a célula hospedeira (a
membrana da célula hospedeira reveste o parasito) que o protege do ambiente intestinal
e uma organela alimentadora a qual fornece nutrientes para completar sua biologia
(BOUZID et al. 2013).
O ciclo de vida deste protozoário é dividido em seis fases. A primeira se incia
quando a parede do oocisto é rompida com liberação de quatro esporozoítos na
passagem do sistema digestivo, chamada excistação. Logo os esporozoítos livres
invadem a célula hospedeira do intestino (enterócitos) de modo intracelular, mas
extracitoplasmática, ou seja, epicelular. Neste local forma-se o vacúolo parasitóforo
como mencionado anteriormente. Quando o esporozoíto se converte em trofozoíto,
inicia-se então a segunda fase chamada merogonia, multiplicação assexuada dentro das
células hospedeiras, gerando os merontes do tipo I com vários merozoítos do tipo I,
estes podem infectar novos enterócitos repetindo a fase de reprodução assexuada, como
também podem realizar a reprodução sexuada. Quando os merozoítos se convertem em
merontes do tipo II que liberam os merozoítos do tipo II, inicia-se a gametogonia, a
formação de macro e microgametas. A união destes corresponde à fase de fertilização e
formará um zigoto este sofrerá meiose gerando quatro esporozoítos. Os zigotos se
encistam e se converterem em oocistos, corresponde à quinta fase. Aqueles de paredes
espessas, serão eliminados no ambiente, somente 20% irão se converter em oocisto de
parece fina responsável pela autoinfecção e manutenção da infecção crônica no
indivíduo. Na esperogonia, o esporoblasto forma esporozoíto infeccioso, podendo o
oocisto excistar no lúmen intestinal ou mesmo, relatado por alguns pesquisadores, no
ambiente externo (BOUZID et al., 2013; RYAN e HIJJAWI 2015; TOMAZIC;
GARRO; SCHNITTGER, 2018).
A maioria das infecções por Cryptosporidium são autolimitantes e de curta
duração, em média duas semanas, podendo ser ainda assintomáticas em indivíduos
imunocompetentes, mas com a liberação fecal de oocistos que contribuem para
contaminação ambiental e propagação da doença (SCORZA; LAPPIN, 2011; RYAN;
FAYER; XIAO, 2014). Os sinais clínicos tanto em humanos como em animais são
variados (RYAN; FAYER; XIAO, 2014), com principalmente infecção intestinal
induzindo a diarreia, devido aos danos que o protozoário ocasiona nas células junto com
a produção de quimiocinas e o recrutamento exacerbado de células inflamatórias na
lâmina própria do intestino como resposta ao agente (LAURENT et al., 1999).
A severidade dos sinais clínicos bem como a duração da doença irá depender dos
seguintes fatores: espécie e variante genética infectante de Cryptosporidium, por
exemplo, em humanos é mais comum a infecção por C. parvum subtipo IIa e IIc, e de
fatores ligados ao hospedeiro como idade e estado imunológico (BOUZID et al., 2013).
Os pacientes imnucomprometidos e portadores da Síndrome da
Imunodeficiência Adquirida (SIDA) apresentam sinais clínicos mais severos, diarreia
crônica e persistente, náuseas, vômitos e febre de baixa intensidade, assim como
sintomas inespecíficos como mialgia (dor muscular), fraqueza, mal-estar, cefaleia (dor
de cabeça) e anorexia (falta de apetite), podendo levar a morte (ROJAS et al., 1999;
CASTILHO; GONÇALVES, 2009).

1.4 Diagnóstico

Em relação aos métodos de diagnóstico, o exame parasitológico de fezes por

microscopia óptica é muito empregado para pesquisa de oocistos de Cryptosporidium
sp. pois é de fácil execução e de custo baixo. A desvantagem é que pelo fato dos
oocistos serem pequenos e muito semelhantes em suas características morfológicas e de
coloração, o profissional pode às vezes diagnosticar infecções equivocadamente,
gerando resultados falso-positivos ou mesmo não diagnosticar (FAYER; MORGAN;
UPTON, 2000).
Para visualização no microscópio é possível observar os oocistos após processar
a amostra fecal por métodos de concentração por sedimentação como Sheather
(SHEATHER, 1923), Faust (FAUST et al., 1938), Hoffman (HOFFMAN et al., 1934) e
Ritchie (RITCHIE et al., 1948), e métodos de coloração como Kinyoun (GONZÁLEZ-
RUIZ; BENDALL, 1995), Ziehl Neelsen (MUNDIM et al., 2001), verde malaquita
(ELLIOT et al., 1999), entre outros.
Embora a microscopia não permita a identificação das espécies de
Cryptosporidium sp., os métodos moleculares fundamentados na reação em cadeia da
polimerase (PCR) são capazes de diferenciar as espécies e genótipos e contribuem para
estudos epidemiológicos de Cryptosporidium sp. por serem mais sensíveis
(THOMPSON et al., 1997; SCORZA; TANGTRONGSUP, 2010.)
O uso técnicas de sequenciamento permite melhorar a compreensão da
taxonomia, a transmissão de espécies de Cryptosporidium, e monitorar os subtipos
emergentes e virulentos. O gene mais utilizado para determinação da espécie ou
genótipo é o 18S RNA ribossômico, pois é o gene mais sensível para Cryptosporidium
spp. (RYAN; FAYER; XIAO, 2014), porém quando se tem um grande número de
amostras, como por exemplo, em inquéritos epidemiológicos, a PCR não é muito
indicada por ser trabalhosa, sendo assim o exame mais indicado nesses casos é o ELISA
por ser um método automatizado (DE SOUZA GOMES et al., 2004).
O ELISA é um método imunologico direto realizado com as fezes, corresponde
a um ensaio imunoenzimático que pesquisa coproantígeno para Cryptosporidium, a
sensibilidade pode chegar a 100% e especifidade 96%. A desvantagem é que para sua
realização é necessário o uso de um equipamento chamado leitor de ELISA, além disso,
a ELISA não é capaz de identificar a espécie como a PCR (CIRAK; BAUER, 2004; DE
SOUZA GOMES et al., 2004).
Outros testes imunologicos diretos são a RIFD (reação de imnufluorescencia
direta) e os testes rápidos (ensaios de imunocromatografia). A RIFD utiliza anticorpos
monoclonais anti-Cryptosporidium marcados com isotiocianato de fluoresceína, como
vantagem essa técnica é capaz de detectar oocistos mesmo quando estes estão em
pequenas quantidades na amostra e são facilmente visualizados, porém para realização é
necessário um microscópio para imunofluorescência (TEIXEIRA et al., 2011). O teste
rápido pode ser feito com fezes frescas ou descongeladas, o resultado é rápido e pode
ser lido por uma pessoa não especializada, esse teste usa anticorpos monoclonais
direcionados contra membrana específica proteínas de Cryptosporidium (PAPINI;
CARDINI, 2006; WEITZEL et al., 2006)
Por sua vez os métodos imunologicos indiretos utilizam o soro para detectar
anticorpos circulando, são tecnicas menos utilizadas, se faz ELISA ou RIFI, a RIFI é
uma técnica 100% específica e sensível e não apresenta reação cruzada com qualquer
outro agente (CARNEIRO et al., 1995; PUMIPUNTU; PIRATAE, 2018).

1.5 Tratamento

O tratamento torna-se difícil, pois esses protozoários são intracelulares e

extracitoplasmáticos dificultando a ação do sistema imune do hospedeiro e de drogas
terapêuticas, além disso, os sinais clínicos, quando ocorrem, costumam ser
autolimitantes em hospedeiros imunocompetentes. Alguns pacientes com sinais clínicos
como febre, diarreia aquosa, náusea, dores no estômago e desidratação são tratados com
terapia de suporte como fluidoterapia, drogas antieméticas, antidiarreicos, analgésicos
suporte nutricional para severa desidratação, antibioticoterapia para infecções
secundarias entre outros medicamentos (GARGALA 2008).
Em humanos, a única droga antiparasitária aprovada para uso em infecções por
cryptosporidium é a Nitazoxanida, porém em pacientes gravemente
imunocomprometidos como soropositivos para SIDA, pacientes transplantados e
crianças mal nutridas não é tão eficaz, deve-se reestabelecer o sistema imune desses
pacientes para que haja resposta à terapia medicamentosa (SPARKS et al., 2015), pois
esse composto interfere na multiplicação do parasito, mas não é parasiticida para
Cryptosporidium spp. (BROEKHUYSEN et al., 2000).
O Nitazoxanida é um composto de nitrotiazol benzamida, usa-se também outros
medicamentos contendo o princípio ativo a base de paromomicina e a azitromicina,
porém assim como o nitazoxanida eles são parcialmente eficazes, pois não levam a uma
cura definitiva, somente reduzem os sinais clínicos, bem como não previnem
reincidências (THEODOS et al., 1998; ALLAN; SHEHAB, 2002).

1.6 Prevenção

O Cryptosporidium é transmitido principalmente pela via fecal-oral, portanto

para o controle e profilaxia preconizam-se boas condições de higiene e sanitárias, a
lavagem das mãos deve ser feita principalmente em estabelecimentos de cuidados à
saúde e creches, a contaminação cruzada com alimentos também ocorre, assim
alimentos crus devem ser adequadamente limpos, lavados, aquecidos, cozidos ou
fervidos antes do consumo, a água deve ser adequadamente filtrada e evitar engolir
água que possa estar contaminada, como a que vem de piscinas, corrente, parques
aquáticos ou lagos ou em uma área com más condições sanitárias, bem como o
paciente com diarreia não deve nadar em piscinas públicas, parques aquáticos públicos
ou rio para impedir uma transmissão para outras pessoas (PEARSON, 2018).
Em um rebanho, animais portadores assintomáticos são reservatórios e fonte de
infecção do meio ambiente, por isso devem ser estabelecidas medidas preventivas para
disseminação entre eles como, por exemplo, manter os jovens ou hospedeiros
suscetíveis separados dos adultos, os animais jovens doentes representam a maior
fonte de contaminação, isolar aqueles que estiverem doentes com sinais clínicos de
diarreia e evitar a introdução da doença na propriedade levando em consideração que
outras espécies, como por exemplo, o cachorro e o gato, podem contaminar os animais
de produção, outra questão é cuidar a fonte de água e comida oferecida (de GRAAF et
al., 1999).
A investigação epidemiológica tem como objetivo o conhecimento, a detecção e
a prevenção da doença. A notificação deve ocorrer quando existe evidência
epidemiológica de uma fonte comum de água ou alimento que originou o surto. A ação
de investigação epidemiológica de surto de doenças transmitidas por alimento é de
responsabilidade do órgão municipal de saúde e tem como objetivo, além dos citados
anteriormente a coleta de informações básicas necessárias ao controle do surto,
diagnosticar a doença e identificar os agentes etiológicos relacionados, identificar os
fatores de risco associados, propor medidas de intervenção, prevenção e controle, e por
fim divulgar os resultados da investigação epidemiológica às áreas envolvidas e à
comunidade (MINISTÉRIO DA SAÚDE, 2010).

REFERÊNCIAS

ALLAM, A. F.; SHEHAB, A. Y. Efficacy of azithromycin, praziquantel and mirazid in

treatment of cryptosporidiosis in school children. Journal of the Egyptian
Society of Parasitology, v. 32, n. 3, p. 969-978, dez. 2002.

ASSIS, D. C. et al. Prevalence and genetic characterization of Cryptosporidium spp. and

Cystoisospora belli in HIV-infected patients. Revista do Instituto de Medicina
Tropical de São Paulo, v. 55, n. 3, p. 149-54, 2013.

BALDURSSON, S.; KARANIS, P. Transmissão por água de parasitas protozoários:

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 CAPÍTULO 2

2 Ocorrência e caracterização molecular de Cryptosporidium spp. em fezes de

cães soropositivos para Leishmania spp.

2.1 Introdução

Cryptosporidium é um protozoário do gênero Apicomplexa e infecta células do

epitélio do trato gastrintestinal de diversos hospedeiros(FAYER; MORGAN; UPTON,
2000). Os principais sinais e sintomas de criptosporidiose em humanos são diarreia, dor
abdominal e êmese. O quadro clínico pode ser fatal em pacientes imunossuprimidos
(NAVIN; JURANEK, 1984).
O parasito é transmitido por via fecal-oral (XIAO; FAYER, 2008). Em 2012,
Cryptosporidium spp. foi classificado como a quinta zoonose veiculada por alimentos
no mundo (RYAN; FAYER; XIAO, 2014). No Brasil, a contaminação por oocistos do
parasito em águas e esgoto parece ser elevada no Brasil (DA SILVEIRA NETO;
INÁCIO; BRESCIANI, 2015).
Até agora, somente a caracterização molecular é eficaz na diferenciação de
espécies de Cryptosporidium spp. Os principais genes-alvo são subunidade 18S do
RNA ribossômico (18S RNAr), proteína da parede do oocisto (COWP), proteína de
choque térmico de 70 kDa (HSP-70) e actina (XIAO et al., 2004). A grande semelhança
morfológica e a presença de antígenos preservados impossibilitam a distinção das
espécies do parasito por microscopia e testes imunológicos, respectivamente (FAYER,
2008).
As espécies mais prevalentes no hospedeiro humano são Cryptosporidium
hominis e Cryptosporidium parvum, mas infecções causadas por Cryptosporidium
canis, cujo principal hospedeiro são os cães já foram relatadas (FENG; RYAN; XIAO,
2018). Por isso, o nosso objetivo foi avaliar a ocorrência e caracterizar molecularmente
oocistos de Cryptosporidium spp. em cães para contribuir para o melhor entendimento
da epidemiologia do parasito.

Material e Métodos
 Comitê de ética
Essa pesquisa foi aprovada pelo Comitê de Ética em Uso Animal da
Universidade Federal do Tocantins (protocolo 23101.002955-2018-0)

Colheita e acondicionamento de amostras

O método de amostragem não-probabilística por conveniência foi usado nesse
estudo. Amostras fecais de 101 cães domiciliados ou errantes entregues ou capturados
pelo Centro de Controle de Zoonoses (CCZ) no município de Gurupi, Tocantins, Brasil
foram coletadas em 2018. O critério de inclusão foi a presença de anticorpos contra
Leishmania spp. detectados pelo teste imunocromatográfico Dual-Path Platform (DPP)
e/ou ensaio imunoenzimático (Biomanguinhos). Os cães soropositivos foram
classificados em dois grupos: oligossintomático (n= 23) e sintomático (n= 78), segundo
critérios de Mancianti et al., (1988). Os seguintes sinais clínicos foram considerados
como sugestivos de Leishmaniose Visceral Canina (LVC): emagrecimento ou caquexia,
mucosas pálidas, linfadenomegalia, esplenomegalia, hepatomegalia, onicogrifose,
alopecia, hiperqueratose, úlceras cutâneas, dermatite seborreica, epistaxe, uveíte e
ceratoconjuntive (KOUTINAS; KOUTINAS, 2014). Todos os animais eram adultos.
O Ministério da Saúde do Brasil recomenda a eutanásia de cães soropositivos ou
infectados por Leishmania spp. Imediatamente após o procedimento, as amostras fecais
foram coletadas diretamente do reto dos animais por enterotomia e separadas de forma
pareada em solução de dicromato de potássio a 5% e mantidas a 4ºC para microscopia e
congeladas a -20ºC em microtubos de 1,5 mL livres de DNAse e RNAse para
caracterização molecular.

Microscopia
As amostras fecais mantidas no dicromato de potássio a 5% foram concentradas
e purificadas por meio da técnica de centrifugação em água-éter (MELONI;
THOMPSON, 1996 - modificado). O éter etílico foi substituído por acetado de etila,
sendo este mais barato e menos tóxico. Posteriormente, para análise microscópica uma
gota do sedimento foi corada por verde malaquita (ELLIOT; MORGAN; THOMPSON,
1999) e observada ao microscópio ótico de luz convencional com aumento de 400x.

Extração de DNA e nested-PCR (nPCR)

 A extração de DNA das amostras foi por kit comercial GenElute™ Stool DNA
Isolation Kit, Sigma-Aldrich (EUA), conforme as recomendações do fabricante. A
nPCR foi usada para amplificação de um fragmento de ~800pb do gene 18S RNAr de
Cryptosporidium sp. (XIAO et al., 2000). Como controles positivo e negativo da reação
foram utilizados, respectivamente, DNA genômico de C. parvum e água ultrapura. Os
fragmentos amplificados foram visualizados por eletroforese em gel de agarose 1,5%
corado com GelRed®, Biotium (EUA). As reações foram realizadas utilizando-se
Platinum PCR Supermix, Invitrogen (USA) adicionando-se 200 nM de cada primer e
2,5 µL de DNA-alvo. As amostras foram submetidas à desnaturação inicial do DNA a
94º C por 3 minutos, seguida de 39 ciclos, cada um consistindo em desnaturação a 94º C
por 45 segundos, 45 segundos de anelamento a 55º C e 60 segundos de extensão a 72º
C, com extensão final a 72º C por 7 minutos.

Purificação de amplicons e caracterização molecular

Os fragmentos resultantes da nPCR foram purificados pelo kit ExoSAP-IT™
PCR Product Cleanup Reagent, Thermo Fisher (EUA) conforme orientações do
fabricante e, posteriormente, sequenciados utilizando-se o ABI Prism® DyeTerminator
3.1, em sequenciador automático ABI 3730XL (Applied Biosystems). As reações de
sequenciamento foram realizadas em uma direção, utilizando-se o primer forward da
reação secundária.

Alinhamento e tradução das sequências de nucleotídeos

As sequências de nucleotídeos foram alinhadas pelos programas Clustal W
(THOMPSON et al., 1997) e BioEdit Sequence Alignment Editor (HALL, 1999),
tomando-se como base sequências homólogas disponíveis no GenBank [GenBank
accession AF112576, FAYER et al., 2001]

Resultados
Os sinais clínicos de LVC mais frequentemente encontrados nos cães
examinados foram linfadenomegalia (89,1%), seguidos de esplenomegalia (68,3%),
hepatomegalia e onicogrifose, ambos com (59,4%), alopecia (52,5%), lesão cutânea
(51,5%), hiperqueratose (40,6%), úlcera de pele (38,6%), lesão ocular (53,6%),
caquexia (30,7%), dermatite seborreica (28,7%) e ceratoconjuntivite (8,9%).
 Oocistos de Cryptosporidium spp. foram encontrados por microscopia e
confirmados por nPCR em apenas uma das 101 amostras fecais colhidas (figura 1). A
sequência do amplicon apresentou 100% de identidade genética com C. canis. O animal
era adulto, fêmea e sintomático e apresentava os seguintes sinais clínicos: caquexia e
rarefação pilosa em tórax, mucosa gengival pálida, esplenomegalia e onicogrifose
(figura 2). A consistência das fezes era pastosa.

FIGURA 1 - Detecção de amplicons do gene da subunidade 18S do RNA ribossômico

(18S RNAr) de Cryptosporidium spp. obtidos por nPCR. Marcador de peso molecular
(MM); coluna 1: controle positivo; coluna 2: amostra positiva; coluna 3: controle
negativo.
FIGURA 2 - Alterações macroscópicas em cão com anticorpos contra Leishmania spp.
detectados por Dual-Path Platform (DPP) e/ou ELISA (Biomanguinhos) e infectado por
Cryptosporidium spp. A) caquexia e rarefação pilosa em tórax; B) Mucosa gengival
pálida; C) Esplenomegalia; D) Onicogrifose.

Discussão

A ocorrência de oocistos de Cryptosporidium sp. obtida em nosso estudo foi

semelhante às encontradas em inquéritos epidemiológicos que utilizaram a técnica de
microscopia em cães no Brasil (BRESCIANI et al., 2008), mas abaixo da média
brasileira de 14%, conforme apresentado em revisão sistemática com meta-análise
(TAGHIPOUR et al., 2020).
Comparações entre diferentes trabalhos devem ser interpretadas com cautela,
porque algumas variáveis podem interferir nos resultados. Embora ainda não haja
consenso, cães jovens (JIAN et al., 2014; TANGTRONGSUP et al., 2020),
imunossuprimidos por coinfecções (MILLER et al., 2003; TURNWALD et al., 1988;
WILLARD; BOULEY, 1999), alimentados por dieta natural (MILLER et al., 2003;
TURNWALD et al., 1988; WILLARD; BOULEY, 1999), criados em canis (ITOH et
al., 2019; OLABANJI; MAIKAI; OTOLORIN, 2016) ou em áreas rurais (FRIZZO et
al., 2016; SEVÁ et al., 2010) podem ser mais suscetíveis à infecção por
Cryptosporidium spp. A vulnerabilidade socioeconômica dos tutores também já foi
relatada como um possível fator de risco de infecção no hospedeiro canino (EDERLI et
al., 2008). Os cães examinados em nosso estudo eram oriundos de um CCZ e não foi
possível obter informações detalhadas sobre as variáveis citadas.
O número de amostras coletadas de um mesmo cão também pode interferir nos
resultados de levantamentos epidemiológicos do parasito, porque oocistos de
Cryptosporidium spp. são excretados intermitentemente. A coleta de três amostras
fecais em dias consecutivos ou alternados pode aumentar a sensibilidade da técnica
diagnóstica (FAYER; MORGAN; UPTON, 2000), porém, este tipo de amostragem
seria inviável em nosso estudo, pois cães soropositivos para Leishmania spp. foram
imediatamente eutanasiados no CCZ, conforme recomendação do Ministério da Saúde
do Brasil (BRAZIL. D A TA NT D I I N IA ID I I A.
2014).
Em estudos em que foram examinadas amostras pareadas por microscopia e
ELISA (BRESCIANI et al., 2008), microscopia e imunocromatografia (SHUKLA et al.,
2006), microscopia e RIFI (MIAMBO et al., 2019) e microscopia e PCR (ALVES et
al., 2018; LALLO; BONDAN, 2006) foram obtidos resultados divergentes entre as
técnicas de diagnóstico empregadas. Por outro lado, segundo uma revisão sistemática
com meta-análise não há discordância significativa entre as técnicas mencionadas
(TAGHIPOUR et al., 2020).
C. hominis e C. parvum são causadores de mais de 90% dos casos de
criptosporidiose em humanos, mas C. canis já foi identificada neste hospedeiro (FENG;
RYAN; XIAO, 2018). A sequência do amplicon encontrada em nosso estudo
compartilha 100% de similaridade genética com oocistos caracterizados
molecularmente em fezes de crianças coletadas no Peru (XIAO et al., 2007) e México
(GONZÁLEZ-DÍAZ et al., 2016) e de pacientes infectados pelo vírus da
imunodeficiência humana (HIV) no Brasil (LUCCA et al., 2009).
A presença de anticorpos contra Leishmania spp. foi usada como critério de
inclusão nesse inquérito epidemiológico feito por amostragem não-probabilística por
conveniência, porque Leishmania infantum pode induzir à imunossupressão no
hospedeiro canino (ALMEIDA et al., 2013; REIS et al., 2009; SILVA et al., 2013),
especialmente em estágios mais avançados da LVC (AYDIN et al., 2004; SCORZA et
al., 2011; THOMAZ et al., 2007). A nossa hipótese era que cães soropositivos
oligossintomáticos e sintomáticos pudessem ter mais chance de excreção de oocistos de
Cryptosporidium, o que, eventualmente, aumentaria a possibilidade de caracterização
molecular do protozoário Contudo, a ocorrência de oocistos do protozoário foi
semelhante ou inferior às obtidas em vários inquéritos epidemiológicos conduzidos em
regiões não endêmicas para LVC (ASANO et al., 2004; EL-AHRAF et al., 1991;
GENNARI et al., 1999; HUBER; BOMFIM; GOMES, 2005; PALMER et al., 2008;
SANTOS et al., 2007; SATOH et al., 2006). Acreditamos que os fatores de risco de
infecção por Cryptosporidium spp. em cães seja multicausal e dependa da interação
entre variáveis relacionadas à contaminação ambiental, espécies do parasito e sanidade
do hospedeiro canino.

Conclusão
Concluímos que os médicos veterinários devam alertar os tutores de cães sobre a
possibilidade de transmissão zoonótica por C. canis, ainda que C. parvum e C. hominis
sejam as principais espécies causadoras de criptosporidiose em humanos.

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