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PROGRAMA DE PÓS-GRADUAÇÃO STRICTO SENSU MESTRADO

EM SAÚDE E PRODUÇÃO ANIMAL

CAROLINE STEPHANIE DE SOUZA

OCORRÊNCIA DE EHRLICHIA SPP. EM CÃES

DOMICILIADOS NO NORTE DO PARANÁ

Arapongas
2023
 CAROLINE STEPHANIE DE SOUZA

OCORRÊNCIA DE EHRLICHIA SPP. EM CÃES

DOMICILIADOS NO NORTE DO PARANÁ

Dissertação apresentada à Universidade

Pitágoras Unopar, como requisito
parcial para a obtenção do título de
Mestre em Saúde e Produção Animal

Orientador: Prof. Dr. João Luiz Garcia

Prof. Dr. Sérgio Tosi
Cardim

Arapongas
2023
 CAROLINE STEPHANIE DE SOUZA

OCORRÊNCIA DE EHRLICHIA SPP. EM CÃES DOMICILIADOS NO

NORTE DO PARANÁ

Dissertação apresentada à Universidade Pitágoras Unopar, no curso de Mestrado

em Saúde e Produção Animal, área de concentração em Saúde Animal, como
requisito para a obtenção do título de Mestre conferida pela banca examinadora
formada pelos professores:

BANCA EXAMINADORA

Prof. Dr. João Luis Garcia

Universidade Estadual de Londrina

Prof. Dr. Fernando de Souza Rodrigues

Universidade Estadual de Londrina

Prof. Luiz Daniel de Barros

Universidade Estadual de Londrina

Arapongas, 27 de julho de 2023.

Dedico este trabalho a minha mãe, mulher forte e
intensa, que me criou com todo carinho e respeito
que pôde, sem seu apoio não conseguiria alcançar e
finalizar mais essa etapa da vida acadêmica.
 AGRADECIMENTOS

Agradeço a todos os professores que me acompanharam ao longo de minha trajetória

acadêmica e que, com empenho, se dedicam à arte de ensinar. Um agradecimento especial aos
meus orientadores professor João Luis e professor Sérgio Tosi por compartilhar conhecimento
e me guiar durante este período.
Agradeço a todos os privilégios que tive para que pudesse ter chegado até aqui e a todos
que estiveram presentes nesse trajeto direta ou indiretamente por menor que seja essa
participação, a todos que em algum momento torceram para que eu conseguisse alcançar mais
uma conquista.
A minha família por sempre me tratar com respeito, confiança e carinho, confiando que
eu era capaz de alcançar tudo que me propus a realizar.
Aos meus amigos por estarem comigo e deixar essa caminhada mais leve.
A todos os integrantes da minha banca deixo meu agradecimento, grata por terem
aceito.
SOUZA, Caroline Stephanie de. Ocorrência de Ehrlichia spp. em cães
domiciliados no norte do Paraná 2023. 36p. Dissertação (Mestrado em Saúde e
Produção Animal) – Universidade Pitágoras Unopar, Arapongas, 2023.

RESUMO

A erliquiose monocítica canina (EMC), causada pela Ehrlichia spp, e transmitida

principalmente pelo Rhipicephalus sanguineus. É uma doença presente na rotina clínica de
cães, e frequentemente ocasiona grandes prejuízos à saúde e qualidade de vida dos
pacientes. A doença apresenta três fases, sendo elas fase aguda, subclínica e crônica. Os
cães infectados por Ehrlichia frequentemente apresentam alterações como letargia,
anorexia, febre, linfadenomegalia, esplenomegalia, trombocitopenia, distúrbios hemorrágicos
e hipergamaglobulinemia. O diagnóstico da EMC é baseado na junção do histórico, sinais
clínicos, alterações laboratoriais e testes diagnósticos sorológicos, moleculares ou de
observação direta do agente. A região estudada apresenta escassez de informações a
respeito da ocorrência do agente na população canina, portanto, o objetivo do presente
estudo foi determinar a ocorrência de Ehrlichia spp. em amostras de sangue de cães
domiciliados no norte do Paraná. As amostras de sangue com EDTA foram obtidas em
clínicas e laboratórios veterinários presentes nos municípios de Apucarana e Arapongas
situados no norte do Paraná. As amostras de sangue foram submetidas a uma extração de
DNA utilizando o kit comercial e amplificação por PCR com uso de primers específicos para
o agente. Os resultados apontaram que 10 dos 179 animais (5,58%) testaram positivo para
Ehrlichia spp. Com este estudo conclui-se que a região estudada possui a presença da
infecção por Ehrlichia spp. em cães, porém estudos mais amplos abordando a epidemiologia
relacionada a doença são importantes para trazer mais informações a respeito do parasita.

Palavras-chave:. Cães, Erliquiose, PCR, Ehrlichia, Carrapato

SOUZA, Caroline Stephanie de. Occurrence of Ehrlichia spp. in domesticated dogs in

northern Paraná 2023. 36p. Dissertation (Master´s in Health and Animal Production) –
University Pitágoras Unopar, Arapongas, 2023.

ABSTRACT
Canine monocytic ehrlichiosis (CME), caused by Ehrlichia spp, and transmitted mainly by
Rhipicephalus sanguineus. It is a disease present in the clinical routine of dogs, and often
causes great damage to the health and quality of life of patients. The disease has three
phases, namely the acute, subclinical and chronic phase. Dogs infected by Ehrlichia
frequently presented alterations such as lethargy, anorexia, fever, lymphadenopathy,
splenomegaly, thrombocytopenia, hemorrhagic disorders and hypergammaglobulinemia. The
diagnosis of CME is based on the interaction of the history, clinical signs, laboratory
alterations and serological, molecular or direct observation diagnostic tests of the agent. The
observed region presents restriction of information regarding the occurrence of the agent in
the canine population, therefore, the objective of the present study was to determine the
occurrence of Ehrlichia spp. in a blood sample from domiciled dogs in the north of Paraná.
Blood samples with EDTA were awaited at veterinary clinics and laboratories in the
municipalities of Apucarana and Arapongas located in northern Paraná. Blood samples were
observed for DNA capture using a commercial kit and PCR amplification using specific
primers for the agent. The results showed that 10 of the 179 animals (5.58%) tested positive
for Ehrlichia spp. With this study it is concluded that the region studied has the presence of
infection by Ehrlichia spp. in dogs, but broader studies addressing the epidemiology related
to the disease are important to bring more information about the parasite.

Keywords: Dogs, Ehrlichiosis, PCR, Ehrlichia, Ticks

 LISTA DE TABELAS

CAPITULO II

Tabela 1. Comparativo de números de amostras positivas para PCR de Ehrlichia spp entre os
municípios de Arapongas e Apucarana.
 LISTA DE FIGURAS

CAPITULO I

Figura 1. Macrófago de um cão infectado contendo uma mórula de Ehrlichia canis após
coloração de Giemsa.

Figura 2. Larva, ninfa e adulto (fêmea e macho) do Rhipicephalus sanguineus.

Figura 3. Ciclo biológico do Rhipicephalus sanguineus.

 LISTA DE ABREVIATURAS

DNA Ácido desoxirribonucleico

PCR Reação em Cadeia pela Polimerase

EMC Erlichiose Monocítica Canina

 SUMÁRIO

CAPÍTULO I
1 INTRODUÇÃO 13
2 REFERENCIAL TEÓRICO 13
2.1 Taxonomia e aspectos fisiopatológicos do agente
13
2.2 Aspectos históricos e taxonomia do vetor 14
2.3 Patogenia 17
2.4 Sinais Clínicos 17
2.5 Diagnóstico 18
2.6 Controle e Profilaxia 19
2.7 Potencial Zoonótico 19

3 REFERÊNCIAS 20
4 OBJETIVOS 24
4.1 Objetivo geral 24

CAPÍTULO II
5 INTRODUÇÃO 28
6 MATERIAL E MÉTODOS 30
6.1 Comitê de ética 30
6.2 Animais, amostras e estudo de área 30
6.3 Amplificação do DNA 31
6.4 Análise estatística 31
7 RESULTADOS E DISCUSSÃO 32
8 CONCLUSÃO 34
9 REFERÊNCIAS 35
10 CONSIDERAÇÕES FINAIS 39
 13

1. INTRODUÇÃO

A erliquiose monocítica canina (EMC), ou como é chamada popularmente

“doença do carrapato”, é uma hemoparasitose causada pela infecção por bactérias do
gênero Ehrlichia. É uma afecção com vasta distribuição mundial, principalmente em
regiões tropicais e subtropicais, esta distribuição geográfica se dá principalmente devido
a presença do principal vetor da doença, o carrapato Rhipicephalus sanguineus que pode
infectar o cão através da sua saliva no momento do repasto sanguíneo (Sainz et al.,
2015).
A EMC é uma das doenças infecciosas mais importantes do Brasil, considerada
endêmica (Vieira et al, 2011) chegando a apresentar 60% de cães infectados em
algumas regiões do país ( Silva, 2020).
Os sinais clínicos incluem febre, apatia, anorexia, perda de peso, petéquias,
equimoses e epistaxe, enquanto nas alterações laboratoriais podem ser evidenciadas
desvio de neutrófilos à esquerda e eosinopenia, além de anemia e trombocitopenia
(Silva, 2020).
O diagnóstico é realizado através da associação dos sinais clínicos e
laboratoriais com métodos sorológicos, incluindo reação em cadeia da polimerase, além
da observação de mórulas em células mononucleares em lâminas de esfregaços
sanguíneos (Megid. et al, 2016).
As cidades de Arapongas e Apucarana possuem estudos escassos sobre a
ocorrência de Ehrlichia em populações caninas, com isso, este trabalho buscou trazer
informações acerca da doença e da presença do agente nessas populações.

2. REFERENCIAL TEÓRICO

2.1 TAXONOMIA E ASPECTOS EPIDEMIOLÓGICOS DO AGENTE

Ehrlichia spp. é uma rickettsia pertencente à família Ehrlichiaceae e ao gênero

Ehrlichia, se trata de uma bactéria gram-negativa, parasita intracelular obrigatório de
células hematopoiéticas maduras ou imaturas, especialmente do sistema fagocitário
mononuclear. Embora o principal agente envolvido em casos de erliquiose canina no
 14
Brasil seja E. canis, bem menos frequentemente E. chaffeensis e E. ewingii também
podem ser capazes de infectar canídeos (Nelson et al., 2015).
O gênero Ehrlichia invade células mononucleares multiplicando-se por fissão
binária formando agrupamentos nomeados corpúsculos que de após alguns dias
incubados aumentam de número formando mórulas, que são caracterizados como
grânulos de coloração rosa e púrpura (Megid. et al, 2016). Estas mórulas podem ser
observadas durante as fases da doença em esfregaços sanguíneos (Liberati et al, 2009).

Figura 1: Macrófago de um cão infectado contendo uma mórula de Ehrlichia

canis após coloração de Giemsa (Vieira et al, 2011).

Fonte: Vieira et al, Erlichiose no Brasil, 2011

A primeira descrição de EMC no Brasil foi feita por Costa et al em 1973 em

Belo Horizonte. Desde então, a E. canis foi encontrada em praticamente todos os
estados brasileiros. Mesmo com a existência de relatos espalhados pelo pais,
informações mais precisas sobre a prevalência da doença nas diversas regiões do Brasil
ainda são escassas (VIEIRA et al., 2011).

2.2 ASPECTOS HISTÓRICOS E TAXONOMIA DO VETOR

O vetor mais importante da EMC é o R. sanguineus pertencente à família
Ixodidae e conhecido popularmente como carrapato marrom do cão (Dagnone, et al
2018). O primeiro relato científico sobre este parasita foi em 1806 com sua antiga
denominação, Ixodes sanguineus (Nava et al., 2015).
 15
A distribuição do carrapato é cosmopolita podendo estar presente em regiões
com temperatura elevada ou em regiões de clima frio apresentando até -25ºC (Hornok et
al, 2017). Tem maior prevalência em regiões de clima temperado, com intensidade nos
meses de primavera e verão (Dantas-Torres et al, 2018).
A predileção de hospedeiro do carrapato é o cão, porém pode se alimentar de
outros mamíferos e até mesmo do ser humano (Dantas-Torres, 2010).
O R. sanguineus apesar de ser capaz de parasitar outros mamíferos incluindo o
ser humano, possui uma alta especificidade parasita-hospedeiro em relação ao cão.
Outros carrapatos como o Dermacentor variabilis e Amblyomma já se
mostraram capazes de realizar a transmissão em ambiente experimental porém ambos
tem maior importância no ciclo de outras hemoparasitoses em outras regiões fora do
Brasil (Taylor et al, 2010), sendo importante enfatizar que o principal vetor envolvido
na transmissão natural da E. canis em cães no país é o R. sanguineus.
O carrapato possui quatro fases de vida (ovo, larva, ninfa e adulto) (Figura 2).
Todos os estágios são considerados móveis e podem ser encontrados tanto no animal
quanto no ambiente, sendo que no cão eles são encontrados apenas transitoriamente
com intuito de se alimentar (Das et al, 2017).

Figura 2. Larva, ninfa e adulto (fêmea e macho) do Rhipicephalus sanguineus

Fonte: http://www.tickencounter.org/tick_identification/brown_dog_tick

A primeira descrição relacionando o carrapato à doença foi em 1935 por

Donatien e Lestoquard, ao observarem organismos nas células mononucleares de cães
parasitados por carrapatos (Silva et al., 2010).
Além da erliquiose, o R. sanguineus é vetor de outras doenças como babesiose
e anaplasmose, além de quando encontrado em grande quantidade pode ocasionar
condições como anemia e debilidade do sistema imunológico devido aos hábitos
 16
hematófagos (Dantas-Torres et al, 2017).

Figura 3. Ciclo biológico do Rhipicephalus sanguineus.

Fonte: Modificado de https://hillviewvet.com

O carrapato se infecta com a bactéria após realizar hematofagia em cães que

apresentam uma infecção e consequente presença da bactéria no sangue (Souza, 2010).
O carrapato infectado transmite a bactéria para o cão da mesma forma que ele próprio se
infecta, através do ato hematófago, assim que ingerido, o agente contido em leucócitos
parasitados, se multiplica em tecidos do vetor. No carrapato ocorre a transmissão
transestadial porém não transovariana (Megid et al, 2016). A distribuição geográfica e
ocorrência da doença está intimamente ligada à prevalência do vetor nas áreas afetadas.
Regiões tropicais e subtropicais possuem maiores incidências, e períodos de verão com
altas temperaturas e umidade são períodos onde há maior casuística da doença (Taylor
et al, 2010).
 17

2.3 PATOGENIA

Após a infecção no cão, a bactéria entra na corrente sanguínea e linfática e

parasita principalmente macrófagos circulantes e presentes em órgãos como baço e
fígado onde realizam multiplicação por fissão binária e atingem os demais sistemas
orgânicos através da disseminação pelos macrófagos. (Taylor et al, 2010).
Uma vez presente nos tecidos a Ehrlichia invade as demais células e busca se
replicar. As células infectadas que se mantêm circulantes podem induzir uma vasculite
que juntamente com uma alteração da imunidade mediada por célula culmina em uma
destruição das plaquetas levando a um quadro de trombocitopenia. Um processo
semelhante acontece com leucócitos e eritrócitos, resultando em leucopenia e anemia
respectivamente (Taylor et al, 2010).
A doença possui três fases, sendo elas: fase aguda; fase subclínica; e fase
crônica (Megid et al, 2016).
O período de infecção pode durar de 8 a 20 dias e é seguido da primeira fase da
doença, considerada fase aguda que pode durar de 2 a 4 semanas e se não tratada pode
culminar na fase subclínica e posteriormente na fase crônica (Taylor et al, 2010).
Cães em fase subclínica podem continuar portadores da bactéria por meses ou
anos. Nem todos os cães desenvolvem a fase crônica e os fatores relacionados a este
fato não estão ainda muito bem descritos (Harrus et al., 2002).
No organismo, a infecção acarreta destruição de plaquetas e diminuição das
demais células sanguíneas, além de queda na produção de plaquetas. Pode ocorrer
meningite e meningoencefalite associadas a infiltração linfoplasmocitária e monocítica
extensa, alterações perivasculares e gliose. (Taylor et al, 2010).
O desenvolvimento de alterações renais em cães acometidos pelo hemoparasita
acontece devido ao acúmulo de imunocomplexos em capilares glomerulares levando a
uma glomerulonefrite associada a proteinúria ( Figueiredo, 2011).

2.4 SINAIS CLÍNICOS

A EMC é uma doença que não apresenta predileção por raça ou idade e ambos
os sexos são acometidos igualmente. Os sinais clínicos são amplos e variados e se
 18
alteram de acordo com a fase da doença (Taylor et al, 2010). A doença possui três fases,
sendo elas fase aguda, fase subclínica, e fase crônica (Megid et al, 2016).
Durante a fase aguda os sinais clínicos podem ser discretos e inespecíficos ou
graves e potencialmente fatais. Dentre os sinais comumente observados nesta fase
podemos citar depressão, letargia, anorexia, êmese, pirexia e perda de peso. Sinais mais
específicos que podem ser observados são linfadenomegalia, esplenomegalia, petéquias,
equimose cutânea e epistaxe (SAINZ et al., 2015). Icterícia é uma condição que pode
estar presente em alguns casos devido ao potencial de lesão hepática do agente
(Andrade et al.,2020)
Na fase crônica da doença os sinais tendem a ser os mesmos da fase aguda
porém mais graves. Durante o curso da doença há a possibilidade de infecções
secundárias que terão seus sinais de acordo com o local e tipo de infecção (Harrus e
Waner, 2011).
Ocasionalmente a infecção acomete o sistema nervoso, ocasionando sinais
clínicos como ataxia, convulsões, paresia, hiperestesia e andar em círculos (Taylor et
al, 2010).
Em alguns casos sinais oculares também podem ser observados nas fases aguda
e crônica. As manifestações observadas podem ser conjuntivites, petéquias e equimoses
da conjuntiva e da íris, edema de córnea e panuveíte (Harrus et al., 2002).

2.5 DIAGNÓSTICO

O diagnóstico da doença consiste na associação da apresentação clínica,

anamnese e achados laboratoriais com confirmação sorológica. Pacientes visivelmente
infestados pelo vetor ou residentes de áreas endêmicas devem aumentar a suspeita da
infecção (Taylor et al, 2010).
Em exame de hemograma pode se observar leucopenia e anemia, além de
comumente apresentar trombocitopenia. Este quadro de pancitopenia acontece devido a
fatores que tanto destroem células sanguíneas intravasculares quanto por supressão da
medula óssea (Liberati et al, 2009).
Deve-se considerar que mesmo a trombocitopenia sendo uma condição
associada a EMC isto não pode ser critério para diagnóstico da doença por se tratar de
uma condição que pode ser ocasionada por outros parasitas (Sales, 2012).
 19
A pesquisa de mórulas do agente em leucócitos parasitados através de lâminas
de esfregaço sanguíneo é uma técnica barata, rápida e de fácil acesso, porém é um teste
com baixa sensibilidade carecendo correlação do resultado com sinais clínicos e
histórico do paciente (Liberati et al, 2009). Sangue periférico, capa leucocitária e
aspirado de linfonodo são materiais que podem ser utilizados para visualização das
mórulas de Ehrlichia em microscopia direta (Ramirez, 2021).
Testes comerciais utilizando imunofluorescência indireta e kits comerciais para
diagnóstico (Snap 4DX) fazem uso de reagentes capazes de detectar anticorpos contra
E. canis no soro de animais infectados. Estes testes são usados como triagem para cães
que apresentem sinais clínicos compatíveis com EMC, porém deve se atentar para as
possíveis reações cruzadas entre os anticorpos para E. canis, N helminthoeca e Cowdria
ruminatium, além do aspecto subclínico da doença, portanto o resultado positivo destes
testes isoladamente não é o suficiente para considerar um diagnóstico definitivo para
EMC (Nelson e Couto, 2010).
A Reação em Cadeia da Polimerase (PCR) é um método molecular utilizado
para detecção de Erhlichia em cães e que auxilia de maneira precisa a detecção precoce
de infecção, juntamente com a identificação de novas cepas ou variantes da espécie. A
PCR para detecção do agente pode ser realizada utilizando materiais biológicos como
sangue total, frações celulares, tecidos, medula óssea e carrapatos (Stein et al., 1992;
Bonila et al, 2012).

2.6 CONTROLE E PROFILAXIA

Ainda é inexistente a comercialização de vacinas para EMC, sendo necessário

o uso de estratégias de controle relacionadas ao vetor (R. sanguineus). Sendo assim, a
utilização de carrapaticidas é empregada tanto nos animais quanto no ambiente, já que
cerca de 95% da população dos carrapatos é encontrada no ambiente (Megid. et al,
2016).

2.7 POTENCIAL ZOONÓTICO

Embora não ocorra a infecção de humanos ocasionada por manipulação de cães

doentes, os caninos podem desempenhar um papel de reservatório da doença,
 20
veiculando vetores para o ambiente humano (Megid, et al,. 2016).
DNA de E. canis foi isolado a partir de amostras de sangue de seis pessoas que
apresentavam episódios febris e sinais clínicos compatíveis com erliquiose monocítica
humana na Venezuela em 2006 (Perez et al., 2006). Outro episódio em Botucatu, no
estado de São Paulo, Brasil, identificou através de PCR que o DNA encontrado em
amostras de sangue de cães infectados era idêntico ao encontrado em humanos na
Venezuela (Diniz et al., 2007).
É importante ressaltar que a infecção em humanos por E. canis não é comum e
que os principais agentes envolvidos em casos de erliquiose em humanos são E.
chafenensis e E. ewingii que raramente são identificados em cães no Brasil. Alem disso,
o principal vetor responsável pela erliquiose humana é do gênero Amblyomma, que
possui pouca importância no ciclo natural da doença em cães (Bakken et al, 2006)
Sendo assim, a erliquiose é considerada uma zoonose, carecendo de atenção do
ponto de vista epidemiológico.

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 24
4. OBJETIVOS

4.1 Objetivo geral

Determinar a ocorrência de Ehrlichia spp. em amostras de sangue de cães de Arapongas

e Apucarana.
 25

CAPÍTULO II
ARTIGO CIENTÍFICO
 26
Ocorrência de Ehrlichia spp. em cães domiciliados no norte do Paraná

RESUMO

A erliquiose monocítica canina, causada pelo agente Ehrlichia, e transmitida

principalmente pelo ectoparasita Rhipicephalus sanguineus é uma doença muito vista na
clínica de cães, e frequentemente ocasiona grandes prejuízos à saúde e qualidade de
vida dos pacientes. Tendo isto em vista, este trabalho tem como objetivo trazer mais
informações sobre a ocorrência da doença na região a fim de contribuir para o cenário
científico da área. Para execução do presente trabalho foram coletadas 179 amostras de
sangue de cães atendidos em municípios da região norte do Paraná, sem distinção de
raça, sexo ou idade e que tinham ou não alterações clinicas ou laboratoriais sugestivas
da doença. As amostras de sangue foram submetidas a uma extração de DNA utilizando
o kit comercial e amplificação por PCR com uso de primers específicos para o gene dsb
de Ehrlichia. Do total de 179 amostras obtidas 24,02% (43/179) foram provenientes de
clínicas veterinárias de Arapongas, 37,43% (67/179) de laboratórios de Arapongas, e
38,54% (69/179) de laboratórios de Apucarana. Os resultados dos exames mostraram
que 10 (5.58%) das 179 amostras de sangue de cães testaram positivos para Ehrlichia
spp. Com este estudo conclui-se que a região estudada possui a presença da infecção por
Ehrlichia spp. em cães, porém estudos mais amplos abordando a epidemiologia
relacionada a doença são importantes para trazer mais informações a respeito do
parasita.

Palavras-chave: PCR, Ehrlichia, cão

 27

Occurrence of Ehrlichia spp. in domesticated dogs in northern Paraná

ABSTRACT

Canine monocytic ehrlichiosis, caused by the agent Ehrlichia, and transmitted mainly
by the ectoparasite Rhipicephalus sanguineus, is a disease that is often seen in the clinic
of dogs, and often causes great damage to the health and quality of life of patients. With
this in mind, this work aims to bring more information about the occurrence of the
disease in the region in order to contribute to the scientific scenario of the area. To carry
out this work, 179 blood samples were collected from dogs treated in municipalities in
the northern region of Paraná, without distinction of breed, sex or age and that had or
did not have clinical or laboratory alterations suggestive of the disease. Blood samples
were subjected to DNA extraction using a commercial kit and PCR amplification using
specific primers for the Ehrlichia dsb gene. Of the total of 179 samples obtained,
24.02% (43/179) came from veterinary clinics in Arapongas, 37.43% (67/179) from
laboratories in Arapongas, and 38.54% (69/179) from laboratories of Apucarana. Test
results showed that 10 (5.58%) of 179 blood samples from dogs tested positive for
Ehrlichia spp. With this study it is concluded that the region studied has the presence of
infection by Ehrlichia spp. in dogs, but broader studies addressing the epidemiology
related to the disease are important to bring more information about the parasite.

Keywords: PCR, Ehrlichia, dog

 28
5. INTRODUÇÃO

A erliquiose monocítica canina (EMC) é uma doença causada pela bactéria

Ehrlichia, um organismo pleomórfico gram negativo, pertencente ao grupo das
ricketisias. Elas são encontradas no hospedeiro de maneira isolada ou agrupadas em
colônias dentro do citoplasma, principalmente de monócitos após coloração de Giemsa
(Silva et al., 2010).
A doença é transmitida ao cão através de um vetor, sendo o de maior
importância o Rhipicephalus sanguineus conhecido também como carrapato marrom do
cão. Este vetor tem capacidade de transmissão da doença em todos os seus estágios
hematófagos, podendo transmitir a bactéria para o hospedeiro por até cinco meses após
a infecção (Dagnone et al, 2018).
A patogênese da ECM é descrita em três fases, sendo elas a fase aguda, fase
subclínica e fase crônica (Silva, 2015). Os sinais clínicos observados variam de acordo
com as fases da doença, imunidade do animal, carga parasitária e virulência da cepa
(Silva et al., 2010). Frequentemente é observado sinais mais brandos durante a fase
aguda, ausentes durante a fase subclínica e intensificados durante a fase crônica. Os
principais sinais clínicos e alterações laboratoriais observados são letargia, anorexia,
febre, linfoadenomegalia, esplenomegalia, trombocitopenia, distúrbios hemorrágicos e
hipergamaglobulinemia (Sainz et al, 2015).
O diagnóstico da ECM é alcançado através da combinação de sinais clínicos,
histórico, alterações hematológicas e achados citológicos, a confirmação do diagnóstico
deve ser feita com a utilização de testes sorológicos ou moleculares (Harrus et al.,
2011).
Um teste frequentemente utilizado é a observação direta do parasita em
lâminas de esfregaço sanguíneo, por ser acessível e barato, no entanto é um teste que
apresenta baixa sensibilidade (HARRUS et al., 1997). Já a reação em cadeia da
polimerase (PCR) é citada como um teste molecular capaz de diagnosticar a EMC com
alta sensibilidade (Bonila et al, 2012) possibilitando inclusive a identificação da espécie
de Ehrlichia pelo sequenciamento (Souza et al 2011).
Trabalhos observando a ocorrência de Ehrlichia na região norte do Paraná são
escassos e possuem limitações em relação a população avaliada. Estudos anteriores
realizados em cidades próximas trouxeram informações a respeito da ocorrência de
 29
Ehrlichia na região, apresentando 15,1% de animais positivos em 2020 (Paschoal, et al,
2020), porém a população canina avaliada apresentava suspeita de hemoparasitose.
Estudos abordando amplamente a população canina não foram realizados na região
utilizando a técnica de PCR.
A erliquiose é de grande interesse na comunidade científica tanto para estudos
veterinários quanto para estudos em saúde pública (STICH et al., 2008); Portanto o
presente trabalho teve como objetivo avaliar a ocorrência da infecção por Ehrlichia spp
em cães domiciliados na região Norte do Paraná por meio da PCR.
 30
6. MATERIAL E MÉTODOS

6.1 COMITÊ DE ÉTICA

Todos os procedimentos para realização do presente estudo foram autorizados

pelo Comitê de Ética para o Uso de Animais da Universidade Pitágoras UNOPAR,
Arapongas, sob o protocolo número 03/22.

6.2 ANIMAIS, AMOSTRAS E ESTUDO DE ÁREA

Para o presente trabalho foram utilizadas 179 amostras de sangue total colhidas
com ETDA e armazenadas em microtubos de 1,5 ml a -20ºC até posterior
processamento.
Foram escolhidas uma clínica e um laboratório veterinários em Arapongas e
um laboratório veterinário em Apucarana devido a abertura desses locais para ceder
amostras para o trabalho, sendo uma amostragem por conveniência. O número de
amostras foi coletado nos períodos de junho a novembro de 2022.
Não houve nenhuma pré seleção em relação a características, manifestações
clinicas ou laboratoriais dos animais utilizados para o presente trabalho.
A área urbana de Arapongas pertence a uma zona de transição climática, entre
os climas tropical e subtropical a partir da classificação de Köppen. Situada a 804
metros de altitude, Arapongas tem as seguintes coordenadas geográficas: Latitude: 23°
25' 12'' Sul, Longitude: 51° 25' 31'' Oeste, e de acordo com o senso de 2021 possui
123.027 habitantes. O município se estende por 381,1 km², e se situa a 15 km a Norte-
Leste de Apucarana.
O município de Apucarana está situado a 863 metros de altitude, possui
134.996 habitantes de acordo com o último censo e tem as seguintes coordenadas
geográficas: Latitude: 23° 33' 5'' Sul, Longitude: 51° 27' 41'' Oeste.
 31
6.3 AMPLIFICAÇÃO DO DNA

A amplificação do DNA de Ehrlichia sp. foi realizada por PCR. Os primers

que foram utilizados são baseados na sequência parcial do gene dsb Dsb-330 (5‟-GAT
GAT GTC TGA AGA TAT GAA ACA AAT-3‟) e Dsb-728 (CTG CTC GTC TAT
TTT ACT TCT TAA AGT-3‟) (ALVES et al, 2014) e as seguintes condições de
amplificação foram utilizadas: desnaturação a 95 ºC, por 2 minutos, 38 ciclos de 95 °C,
por 15 segundos, anelamento a 56 ºC, por 30 segundos, extensão a 72 ºC, por 30
segundos e extensão final a 72 ºC, por 5 minutos (DOYLE et al., 2005).
Todas as reações de amplificação foram realizadas em volume total final igual
a 25 μL, contendo uma mistura de 2,5 μL do DNA amostra, 2,5 μL de cada
deoxinucleotídeo (2 mM), 1,25 µL de cada oligonucleotídeo iniciador (10 µM), 0,4 µL
de Taq DNA polimerase (1,25 U), 5 μL de tampão da PCR (PCR buffer 5X) e 12,1 μL
de água ultrapura, totalizando 25 μL.
Após amplificação, os fragmentos de DNA foram separados por eletroforese
em gel de agarose a 1%, corados com Sybr™ (Biotium, Hayward, EUA), e visualizados
por luz ultravioleta em transiluminador de UV.

6.4 ANÁLISE ESTATÍSTICA

A diferença estatística entre os municípios foi calculada pelo teste de X 2

considerando-se P-valor < 0,05 como significativo. Utilizou-se o programa OpenEpi.
 32
7. RESULTADOS E DISCUSSÃO:

Do total de 179 amostras obtidas 110 (61,4%) foram de Arapongas e 69

(38,6%) foram de Apucarana. Destas, 24% (43/179) foram provenientes de clínicas
veterinárias, e 37,4% (67/179) de laboratórios de Arapongas, e 38,6% (69/179) de
laboratórios de Apucarana.
Um total de 10 amostras (5,6%) das 179 testaram positivo para Ehrlichia spp.
na PCR, destas 7 foram do município de Arapongas e 3 do município de Apucarana.
Quando comparadas, não houve diferença estatística entre as cidades (p=0,04) (tabela
1).

TABELA 1 - Comparativo de números positivos para PCR de Ehrlichia sp. entre os

municípios de Arapongas e Apucarana.

Positivo Negativo Total

Arapongas 7 (6,4%) 103 (93,6%) 110 (100%)

Apucarana 3 (4,3%) 66 (95,7%) 69 (100%)

Total 10 169 179

X 2= 0,05, p=0,40

As prevalência de erliquiose pela PCR em cães observadas no Brasil

mostraram uma variação de 2,8% a 57% (Costa et al, 2015; Rotondano et al, 2017;
Guedes et al, 2015; Buosi et al, 2010; Menezes et al, 2008; Nakaghi et al, 2008; Ramos
et al, 2009; Piso et al, 2021).
Outros estudos realizados em Pato Branco no Paraná e em Passo Fundo no Rio
Grande do Sul não observaram a presença de E. canis na PCR dos cães avaliados
(Ribeiro, 2017; Gottlieb, 2016).
Em relação a ocorrência de E. canis no mundo, um estudo na África do sul,
apontou 7,5% de cães positivos para na PCR (Kennedy, 2021), números mais altos
foram observados no México com 26% (Merino-Charrez, 2021) e na Venezuela com
45,2% (Martinez, 2015). Na Argentina, os resultados foram negativos, não havendo
 33
cães testados positivos na população avaliada (Martin, 2019).
Comparado a outros trabalhos, vale enfatizar que alguns destes estudos foram
realizados com cães que possuíam alterações hematológicas e/ou manifestações clínicas
compatíveis com EMC. Os resultados observados podem estar diretamente relacionados
à população canina avaliada. Além disso, as amostras foram coletadas nos meses de
junho a novembro, períodos mais secos e frios comparados a outros meses do ano em
que há maior ocorrência da doença (SAINZ et al., 2015).
 34
8. CONCLUSÃO

Conforme resultados obtidos neste estudo, conclui-se que a infecção por

Ehrlichia spp. está presente nas cidades de Arapongas e Apucarana. Este estudo traz
informações inéditas sobre a presença do parasita nas cidades avaliadas utilizando a
técnica da PCR. Mais estudos são necessários para compreensão ampla da ação do
agente nas regiões estudadas.
 35
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10.CONSIDERAÇÕES FINAIS

O presente estudo verificou a presença de Ehrlichia spp. em amostras de

sangue de cães domiciliados nos municípios de Arapongas e Apucarana no norte do
Paraná, trazendo assim informações sobre a presença e distribuição deste agente nos
municípios avaliados.