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PROGRAMA DE PÓS-GRADUAÇÃO STRICTO SENSU MESTRADO

EM SAÚDE E PRODUÇÃO ANIMAL

CAROLINE STEPHANIE DE SOUZA

OCORRÊNCIA DE EHRLICHIA SPP. EM CÃES

DOMICILIADOS NO NORTE DO PARANÁ

Arapongas
2023
 CAROLINE STEPHANIE DE SOUZA

OCORRÊNCIA DE EHRLICHIA SPP. EM CÃES

DOMICILIADOS NO NORTE DO PARANÁ

Dissertação apresentada à Universidade

Pitágoras Unopar, como requisito
parcial para a obtenção do título de
Mestre em Saúde e Produção Animal

Orientador: Prof. Dr. João Luiz Garcia

Prof. Dr. Sérgio Tosi
Cardim

Arapongas
2023
 CAROLINE STEPHANIE DE SOUZA

OCORRÊNCIA DE EHRLICHIA SPP. EM CÃES DOMICILIADOS NO

NORTE DO PARANÁ

Dissertação apresentada à Universidade Pitágoras Unopar, no curso de Mestrado

em Saúde e Produção Animal, área de concentração em Saúde Animal, como
requisito para a obtenção do título de Mestre conferida pela banca examinadora
formada pelos professores:

BANCA EXAMINADORA

Prof. Dr. Sérgio Tosi Cardim

Universidade Pitágoras Unopar

Prof. Dr. João Luis Garcia

Universidade Estadual de Londrina

Prof. Luiz Daniel de Barros

Universidade Estadual de Londrina

Arapongas, 15 de junho de 2023.

Dedico este trabalho a minha mãe, mulher forte e
intensa, que me criou com todo carinho e respeito
que pôde, sem seu apoio não conseguiria alcançar e
finalizar mais essa etapa da vida acadêmica.
 AGRADECIMENTOS

Agradeço a todos os professores que me acompanharam ao longo de minha trajetória

acadêmica e que, com empenho, se dedicam à arte de ensinar. Um agradecimento especial aos
meus orientadores professor João Luis e professor Sérgio Tosi por compartilhar conhecimento
e me guiar durante este período.
Agradeço a todos os privilégios que tive para que pudesse ter chegado até aqui e a todos
que estiveram presentes nesse trajeto direta ou indiretamente por menor que seja essa
participação, a todos que em algum momento torceram para que eu conseguisse alcançar mais
uma conquista.
A minha família por sempre me tratar com respeito, confiança e carinho, confiando que
eu era capaz de alcançar tudo que me propus a realizar.
Aos meus amigos por estarem comigo e deixar essa caminhada mais leve.
A todos os integrantes da minha banca deixo meu agradecimento, grata por terem
aceito.
SOUZA, Caroline Stephanie de. Ocorrência de Ehrlichia spp. em cães
domiciliados no norte do Paraná 2023. 36p. Dissertação (Mestrado em Saúde e
Produção Animal) – Universidade Pitágoras Unopar, Arapongas, 2023.

RESUMO

A erliquiose monocítica canina (EMC), causada pela Ehrlichia spp, e transmitida

principalmente pelo Rhipicephalus sanguineus é uma doença presente na rotina clínica de
cães, e frequentemente ocasiona grandes prejuízos à saúde e qualidade de vida dos
pacientes. A doença apresenta três fases, e seus sinais clínicos variam de acordo com as
fases. Os sinais clínicos apresentados variam de acordo com as três fases existentes na
doença, sendo elas fase aguda, subclínica e crônica. Os cães infectados por Ehrlichia
frequentemente apresentam alterações como letargia, anorexia, febre, linfadenomegalia,
esplenomegalia, trombocitopenia, distúrbios hemorrágicos e hipergamaglobulinemia. O
diagnóstico da EMC é baseado na junção do histórico, sinais clínicos, alterações
laboratoriais e testes diagnósticos sorológicos, moleculares ou de observação direta do
agente. O objetivo do presente estudo foi determinar a ocorrência de Ehrlichia spp. em
amostras de sangue de cães domiciliados no norte do Paraná. As amostras de sangue com
EDTA foram obtidas em clínicas e laboratórios veterinários presentes nos municípios de
Apucarana e Arapongas situados no norte do Paraná. As amostras de sangue foram
submetidas a uma extração de DNA utilizando o kit comercial PureLink™ Genomic DNA
Mini Kit (Invitrogen) e amplificação por PCR com uso de primers específicos para o agente.
Os resultados apontaram que 10 dos 179 animais (5,58%) testaram positivo para Ehrlichia
spp. Conclui-se que se trata de uma doença presente na região, apresentando grande
importância para a saúde dos cães e dos humanos, visto que se trata de uma Zoonose
emergente. Com este estudo conclui-se que a região estudada apresenta uma baixa
frequência de infecção por Ehrlichia spp. em cães, porém estudos mais amplos da
população canina local são importantes para melhor elucidar a epidemiologia do parasita.

Palavras-chave:. Cães, Erliquiose, nested-PCR, Ehrlichia, Carrapato

SOUZA, Caroline Stephanie de. Occurrence of Ehrlichia spp. in domesticated dogs in

northern Paraná 2023. 36p. Dissertation (Master´s in Health and Animal Production) –
University Pitágoras Unopar, Arapongas, 2023.

ABSTRACT
Canine monocytic ehrlichiosis (CME), caused by Ehrlichia spp, and transmitted mainly by
Rhipicephalus sanguineus, is a disease present in the clinical routine of dogs, and often
causes great damage to the health and quality of life of patients. The disease has three
stages, and its clinical signs vary according to the stages. The clinical signs presented vary
according to the three phases of the disease, namely the acute, subclinical and chronic
phases. Dogs infected with Ehrlichia frequently present alterations such as lethargy,
anorexia, fever, lymphadenopathy, splenomegaly, thrombocytopenia, bleeding disorders and
hypergammaglobulinemia. The diagnosis of CME is based on the combination of history,
clinical signs, laboratory alterations and serological, molecular or direct observation
diagnostic tests of the agent. The aim of the present study was to determine the occurrence
of Ehrlichia spp. in blood samples from domesticated dogs in northern Paraná. Blood
samples with EDTA were obtained from veterinary clinics and laboratories located in the
municipalities of Apucarana and Arapongas located in the north of Paraná. Blood samples
were subjected to DNA extraction using the commercial PureLink™ Genomic DNA Mini Kit
(Invitrogen) and PCR amplification using specific primers for the agent. The results showed
that 10 of the 179 animals (5.58%) tested positive for Ehrlichia spp. It is concluded that this is
a disease present in the region, with great importance for the health of dogs and humans,
since it is an emerging Zoonosis. With this study it is concluded that the region studied has a
low frequency of infection by Ehrlichia spp. in dogs, but broader studies of the local canine
population are important to better elucidate the epidemiology of the parasite.

Keywords: Dogs, Eherlichiose, nested-PCR, Ehrlichia, Ticks

 LISTA DE TABELAS

CAPITULO II

Tabela 1. Comparativo de números positivos para PCR de E. canis entre os municípios de

Arapongas e Apucarana.
 LISTA DE FIGURAS

CAPITULO I

Figura 1. Ciclo biológico do Rhipicephalus sanguineus.

Figura 2. Larva, ninfa e adulto (fêmea e macho) do Rhipicephalus sanguineus

Figura 3. Mapa Topográfico de Arapongas

Figura 4. Mapa Topográfico de Apucarana

 LISTA DE ABREVIATURAS

DNA Ácido desoxirribonucleico

PCR Reação em Cadeia pela Polimerase

EMC Erlichiose Monocítica Canina

 SUMÁRIO

CAPÍTULO I
1 INTRODUÇÃO 13
2 FUNDAMENTAÇÃO TEÓRICA 13
2.1 Aspectos históricos e taxonomia 13
2.2 Ciclo biológico 15
2.3 Patogenia 15
2.4 Sinais Clínicos 16
2.5 Diagnóstico 17
2.6 Controle e Profilaxia 18
2.7 Potencial Zoonótico 18

3 REFERÊNCIAS 19
4 OBJETIVOS 23
4.1 Objetivo geral 23
4.2 Objetivos específicos 23

CAPÍTULO II
5 INTRODUÇÃO 27
6 MATERIAL E MÉTODOS 29
6.1 Comitê de ética 29
6.2 Animais, amostras e estudo de área 29
6.3 Extração de DNA 31
6.4 Amplificação nested-PCR 31
7 RESULTADOS E DISCUSSÃO 32
8 CONCLUSÃO 34
9 REFERÊNCIAS 35
10 CONSIDERAÇÕES FINAIS 39
 13

1. INTRODUÇÃO
A erliquiose monocítica canina (EMC), ou como é chamada popularmente
“doença do carrapato”, é uma afecção com vasta distribuição mundial, principalmente
em regiões tropicais e subtropicais, esta distribuição geográfica se dá principalmente
devido a presença do principal vetor da doença, o carrapato Rhipicephalus sanguineus
que infecta o cão através da sua saliva no momento do repasto sanguíneo (Sainz et al.,
2015).
A EMC é uma das doenças infecciosas mais importantes do Brasil, considerada
endêmica (Vieira et al, 2011) chegando a apresentar 60% de cães infectados em
algumas regiões do país ( Silva, 2020).
Esta doença é causada pela Ehrlichia spp. pertencente da ordem das
Rickettsiales, da família Ehrlichiaceae e ao gênero Ehrlichia, que é uma bactéria gram-
negativa, parasita intracelular obrigatório de células hematopoiéticas maduras ou
imaturas, especialmente do sistema fagocitário mononuclear. Embora o principal agente
envolvido na EMC seja E. canis, cães também podem se infectar com E. chaffeensis e
E. ewingii (Nelson et al., 2015).
A caracterização clínica da doença inclui febre, apatia, anorexia, perda de
peso, petéquias, equimoses e epistaxe, enquanto nas alterações laboratoriais podem ser
evidenciadas desvio de neutrófilos à esquerda e eosinopenia, além de anemia e
trombocitopenia (Silva, 2020).
O diagnóstico é realizado através da associação dos sinais clínicos e
laboratoriais com métodos sorológicos, incluindo reação em cadeia da polimerase, além
da observação de mórulas em células mononucleares em lâminas de esfregaços
sanguíneos (Megid. et al, 2016).

2. REFERENCIAL TEÓRICO

2.1 ASPECTOS HISTÒRICOS E TAXONOMIA DO VETOR

O vetor mais importante da EMC é o R. sanguineus pertencente à família
Ixodidae e conhecido popularmente como carrapato marrom do cão (Dagnone, et al
2018). O primeiro relato científico sobre este parasita foi em 1806 com sua antiga
denominação, Ixodes sanguineus (Nava et al., 2015).
A distribuição do carrapato é cosmopolita podendo estar presente em regiões
 14
com temperatura elevadas ou em regiões de clima frio apresentando até -25ºC (Hornok
et al, 2017). Tem maior prevalência em regiões de clima temperado, com intensidade
nos meses de primavera e verão (Dantas-Torres et al, 2018).
A predileção de hospedeiro do carrapato é o cão, porém pode se alimentar de
outras espécies mamíferas e até mesmo do ser humano (Dantas-Torres, 2010).
Outros carrapatos como o Dermacentor variabilis já se mostraram capazes de
realizar a transmissão em ambiente experimental e outros como Amblyomma e
Anocentor também possuem importância no ciclo desta e de outras hemoparasitoses.
(Taylor et al, 2010).
A primeira descrição relacionando o carrapato à doença foi em 1935 por
Donatien e Lestoquard, ao observarem organismos nas células mononucleares de cães
parasitados por carrapatos (Silva et al., 2010).
Este ixodida possui quatro fases de vida sendo elas ovo larva, ninfa e adulto.
Todos os estágios são considerados móveis e podem ser encontrados tanto no animal
quanto no ambiente, sendo que no cão eles são encontrados apenas transitoriamente
com intuito de se alimentar (Das et al, 2017).
Além da erlichiose, o R. sanguineus é vetor de outras doenças como babesiose
e anaplasmose, além de quando encontrado em grande quantidade pode ocasionar
condições como anemia e debilidade do sistema imunológico devido aos
hábitos hematófagos (Dantas-Torres et al, 2017).
Figura 1. Ciclo biológico do Rhipicephalus sanguineus.

Fonte: Modificado de http://aclyscursosdeveterinaria.com

Figura 2. Larva, ninfa e adulto (fêmea e macho) do Rhipicephalus sanguineus
 15

Fonte: http://www.tickencounter.org/tick_identification/brown_dog_tick

2.2 CICLO BIOLÓGICO

A infecção por Ehrlichia spp depende de um vetor, sendo o carrapato vermelho

do cão, R. sanguineus o mais importante a se considerar no ciclo da doença. Ele que se
infecta com a bactéria após realizar hematofagia em cães que apresentam uma infecção
e consequente presença da bactéria no sangue (Souza, 2010). O carrapato infectado
transmite a bactéria para o cão da mesma forma que ele próprio se infecta, através do
ato hematófago, assim que ingerido, o agente contido em leucócitos parasitados, se
multiplica em tecidos do vetor. No carrapato ocorre a transmissão transestadial porém
não transovariana (Megid et al, 2016). A distribuição geográfica e ocorrência da doença
está intimamente ligada à prevalência do vetor nas áreas afetadas. Regiões tropicais e
subtropicais possuem maiores incidências, e períodos de verão com altas temperaturas e
umidade são períodos onde há maior casuística da doença (Taylor et al, 2010).

2.3 PATOGENIA

Após a infecção no cão, a bactéria entra na corrente sanguínea e linfática

e parasita principalmente macrófagos circulantes e presentes em órgãos como baço e
fígado onde realizam multiplicação por fissão binária e atingem os demais sistemas
orgânicos através da disseminação pelos macrófagos. (Taylor et al, 2010).
Uma vez presente nos tecidos a Ehrlichia invade as demais células e busca se
replicar. As células infectadas que se mantêm circulantes podem induzir uma vasculite
que juntamente com uma alteração da imunidade mediada por célula culmina em uma
destruição das plaquetas levando a um quadro de trombocitopenia. Um processo
semelhante acontece com leucócitos e eritrócitos, resultando em leucopenia e anemia
 16
respectivamente (Taylor et al, 2010).
A doença possui três fases, sendo elas: fase aguda; fase subclínica; e
fase crônica (Megid et al, 2016).
O período de infecção pode durar de 8 a 20 dias e é seguido da primeira fase
da doença, considerada fase aguda que pode durar de 2 a 4 semanas e se não tratada
pode culminar na fase subclínica e posteriormente na fase crônica (Taylor et al, 2010).
Cães em fase subclínica podem continuar portadores da bactéria por meses ou
anos. Nem todos os cães desenvolvem a fase crônica e os fatores relacionados a este
fato não estão ainda muito bem descritos (Harrus et al., 2002).
No organismo, a infecção acarreta destruição de plaquetas e diminuição das
demais células sanguíneas, além de queda na produção de plaquetas. Pode ocorrer
meningite e meningoencefalite associadas a infiltração linfoplasmocitária e monocítica
extensa, alterações perivasculares e gliose. (Taylor et al, 2010).
O desenvolvimento de alterações renais em cães acometidos pelo hemoparasita
acontece devido ao acúmulo de imunocomplexos em capilares glomerulares levando a
uma glomerulonefrite associada a proteinúria ( Figueiredo, 2011).

2.4 SINAIS CLÍNICOS

A ehrlichiose não apresenta predileção por raça ou idade e ambos os sexos são
acometidos igualmente. Os sinais clínicos são amplos e variados e se alteram de acordo
com a fase da doença (Taylor et al, 2010). A doença possui três fases, sendo elas fase
aguda, fase subclínica, e fase crônica (Megid et al, 2016).
Durante a fase aguda os sinais clínicos podem ser discretos e inespecíficos ou
graves e potencialmente fatais. Dentre os sinais comumente observados nesta fase
podemos citar depressão, letargia, anorexia, êmese, pirexia e perda de peso. Sinais mais
específicos que podem ser observados são linfadenomegalia, esplenomegalia, petéquias,
equimose cutânea e epistaxe (SAINZ et al., 2015). Icterícia é uma condição que pode
estar presente em alguns casos devido ao potencial de lesão hepática do agente
(Andrade et al.,2020)
Na fase crônica da doença os sinais tendem a ser os mesmos da fase aguda
porém mais graves. Durante o curso da doença há a possibilidade de infecções
secundárias que terão seus sinais de acordo com o local e tipo de infecção (Harrus e
 17
Waner, 2011).
Ocasionalmente a infecção acomete o sistema nervoso, ocasionando sinais
clínicos como ataxia, convulsões, paresia, hiperestesia e andar em círculos (Taylor et
al, 2010).
Em alguns casos sinais oculares também podem ser observados nas fases aguda
e crônica. As manifestações observadas podem ser conjuntivites, petéquias e equimoses
da conjuntiva e da íris, edema de córnea e panuveíte (Harrus et al., 2002).

2.5 DIAGNÓSTICO

O diagnóstico da doença consiste na associação da apresentação clínica,

anamnese e achados laboratoriais com confirmação sorológica. Pacientes visivelmente
infestados pelo vetor ou residentes de áreas endêmicas devem aumentar a suspeita da
infecção (Taylor et al, 2010).
Em exame de hemograma pode se observar leucopenia e anemia, além de
comumente apresentar trombocitopenia. Este quadro de pancitopenia acontece devido a
fatores que tanto destroem células sanguíneas intravasculares quanto por supressão da
medula óssea (Liberati et al, 2009).
Deve-se considerar que mesmo a trombocitopenia sendo uma condição
associada a EMC isto não pode ser critério para diagnóstico da doença por se tratar de
uma condição que pode ser ocasionada por outros parasitas (Sales, 2012).
O gênero Ehrlichia invade células mononucleares multiplicando-se por fissão
binária formando agrupamentos nomeados corpúsculos que de após alguns dias
incubados aumentam de número formando mórulas, que são caracterizados como
grânulos de coloração rosa e púrpura (Megid. et al, 2016). Estas mórulas podem ser
observadas durante as fases da doença em esfregaços sanguíneos (Liberati et al, 2009).
A pesquisa de mórulas do agente em leucócitos parasitados através de lâminas
de esfregaço sanguíneo é uma técnica barata, rápida e de fácil acesso, porém é um teste
com baixa sensibilidade (Liberati et al, 2009). No entanto, chegar a um diagnóstico
definitivo de infecção por E. canis requer técnicas moleculares, como PCR (Harrus et
al. 2011).
Testes comerciais utilizando imunofluorescência indireta e kits comerciais para
diagnóstico (Snap 4DX) fazem uso de reagentes capazes de detectar anticorpos contra
 18
E. canis no soro de animais infectados. Estes testes são usados como triagem para cães
que apresentem sintomatologia compatível com EMC, porém deve se atentar para as
possíveis reações cruzadas entre os anticorpos para E. canis, N helminthoeca e Cowdria
ruminatium, além do aspecto subclínico da doença, portanto o resultado positivo destes
testes isoladamente não é o suficiente para considerar um diagnóstico definitivo para
EMC (Nelson e Couto, 2010).
A Reação em Cadeia da Polimerase (PCR) é um método molecular utilizado
para detecção de Erhlichia spp. em cães e que auxilia de maneira precisa a detecção
precoce de infecção, juntamente com a identificação de novas cepas ou variantes da
espécie. A PCR para detecção do agente pode ser realizada utilizando materiais
biológicos como sangue total, frações celulares, tecidos, medula óssea e carrapatos
(Stein et al., 1992; Bonila et al, 2012).

2.6 CONTROLE E PROFILAXIA

Ainda é inexistente a comercialização de vacinas para EMC, sendo necessário

o uso de estratégias de controle relacionadas ao vetor (R. sanguineus). Sendo assim, a
utilização de carrapaticidas é empregada tanto nos animais quanto no ambiente, já que
cerca de 95% da população dos carrapatos é encontrada no ambiente (Megid. et al,
2016).

2.7 POTENCIAL ZOONÓTICO

Embora não ocorra a infecção de humanos ocasionada por manipulação de cães
doentes, os caninos podem desempenhar um papel de reservatório da doença,
veiculando vetores para o ambiente humano (Megid, et al,. 2016).
DNA de E. canis foi isolado a partir de amostras de sangue de seis pessoas que
apresentavam episódios febris e sinais clínicos compatíveis com Erlichiose monocítica
humana na Venezuela em 2006 (Perez et al., 2006). Outro episódio em Botucatu, no
estado de São Paulo, Brasil, identificou através de PCR que o DNA encontrado em
amostras de sangue de cães infectados era idêntico ao encontrado em humanos na
Venezuela (Diniz et al., 2007).
Sendo assim, a erliquiose é considerada uma zoonose emergente, carecendo de
atenção do ponto de vista epidemiológico
 19
3. REFERÊNCIAS

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 23
4. OBJETIVOS

4.1 Objetivo geral

Determinar a ocorrência de Ehrlichia spp. em amostras de sangue de cães de Arapongas

e Apucarana.

4.2 Objetivo específico

Avaliar a diferença estatística entre os municípios.

 24

CAPÍTULO II
ARTIGO CIENTÍFICO
 25
Ocorrência de Ehrlichia spp. em cães domiciliados no norte do Paraná

RESUMO

A erliquiose monocítica canina, causada pelo agente Ehrlichia spp, e transmitida

principalmente pelo ectoparasita Rhipicephalus sanguineus é uma doença muito vista na
clínica de cães, e frequentemente ocasiona grandes prejuízos à saúde e qualidade de
vida dos pacientes. Tendo isto em vista, informações sobre a ocorrência da doença
podem ser ferramentas auxiliares de suma importância para contribuir com o cenário
científico da área. Para execução do presente trabalho foram coletadas 179 amostras de
sangue de cães atendidos em municípios da região norte do Paraná, sem distinção de
raça, sexo ou idade e que possuam ou não alterações clinicas ou laboratoriais sugestivas
da doença. As amostras de sangue serão submetidas a uma extração de DNA utilizando
o kit comercial QIAmp DNA Blood Mini Kit e amplificação por PCR com uso de
primers específicos para o agente. Do total de 179 amostras obtidas 24,02% (43/179)
foram provenientes de clínicas veterinárias, 37,43% (67/179) de laboratórios de
Arapongas, e 38,54% (69/179) de laboratórios de Apucarana. Os resultados dos exames
mostraram que 10 (5.58%) das 179 amostras de sangue de cães testaram positivos para
Ehrlichia spp. Com este estudo conclui-se que a região estudada apresenta uma baixa
frequência de infecção por Ehrlichia spp. em cães, porém estudos mais amplos da
população canina local são importantes para elucidar melhor a epidemiologia do
parasita.

Palavras-chave: PCR, ehrlichia, cão

 26

Occurrence of Ehrlichia spp. in domesticated dogs in northern Paraná

ABSTRACT

Canine monocytic ehrlichiosis, caused by the agent Ehrlichia spp, and transmitted
mainly by the ectoparasite Rhipicephalus sanguineus, is a disease that is often seen in
the clinic of dogs, and often causes great damage to the health and quality of life of
patients. With this in mind, information about the occurrence of the disease can be very
important auxiliary tools to contribute to the scientific scenario of the area. To carry out
this work, 179 blood samples were collected from dogs treated in municipalities in the
northern region of Paraná, without distinction of breed, sex or age, and whether or not
they had clinical or laboratory alterations suggestive of the disease. Blood samples will
be tested for DNA inheritance using the commercial QIAmp DNA Blood Mini Kit and
PCR amplification using agent-specific primers. Of the total of 179 samples, 24.02%
(43/179) came from veterinary clinics, 37.43% (67/179) from laboratories in
Arapongas, and 38.54% (69/179) from laboratories in Apucarana. The test results
amazed that 10 (5.58%) of the 179 blood samples from dogs tested positive for
Ehrlichia spp. With this study, it is concluded that the region served has a low frequency
of infection by Ehrlichia spp. in dogs, but broader studies of the local canine population
are important to better elucidate the epidemiology of the parasite.

Keywords: PCR, ehrlichia, dog

 27
5. INTRODUÇÃO

A erliquiose monocítica canina (EMC) é uma doença causada pela bactéria

Ehrlichia spp, um organismo pleomórfico gram negativo, pertencente ao grupo das
ricketisias. Elas são encontradas no hospedeiro de maneira isolada ou agrupadas em
colônias dentro do citoplasma, principalmente de monócitos após coloração de Giemsa
(Silva et al., 2010).
A doença é transmitida ao cão através de um vetor, sendo o de maior
importância o Rhipicephalus sanguineus conhecido também como carrapato marrom do
cão. Este vetor tem capacidade de transmissão da doença em todos os seus estágios
hematófagos, podendo transmitir a bactéria para o hospedeiro por até cinco meses após
a infecção (Dagnone et al, 2018). Outros carrapatos como o Dermacentor variabilis já
se mostraram capazes de realizar a transmissão em ambiente experimental e outros
como Amblyomma spp. e Anocentor também possuem importância no ciclo desta e de
outras hemoparasitoses. (Taylor et al, 2010). Segundo Isola et al (2012), a EMC é uma
doença que possui ocorrencia idependente de raça, sexo ou idade.
A patogênese da ECM é descrita em três fases, sendo elas a fase aguda, fase
subclínica e fase crônica (Silva, 2015). Os sinais clínicos observados variam de acordo
com as fases da doença, imunidade do animal, carga parasitária e virulência da cepa
(Silva et al., 2010). Frequentemente é observado sinais mais brandos durante a fase
aguda, ausentes durante a fase subclínica e intensificados durante a fase crônica. Os
principais sinais clínicos e alterações laboratoriais observados são letargia, anorexia,
febre, linfoadenomegalia, esplenomegalia, trombocitopenia, distúrbios hemorrágicos e
hipergamaglobulinemia (Sainz et al, 2015).
O diagnóstico da ECM é alcançado através da combinação de sinais clínicos,
histórico, alterações hematológicas e achados citológicos, a confirmação do diagnóstico
deve ser feita com a utilização de testes sorológicos ou moleculares (Harrus et al.,
2011).
Um teste frequentemente utilizado é a observação direta do parasita em
lâminas de esfregaço sanguíneo, por ser acessível e barato, no entanto é um teste que
apresenta baixa sensibilidade (HARRUS et al., 1997). Já a reação em cadeia da
polimerase (PCR) é citada como um teste molecular capaz de diagnosticar a EMC com
alta sensibilidade (Bonila et al, 2012) possibilitando inclusive a identificação da espécie
 28
de Ehrlichia pelo sequenciamento (Souza et al 2011).
A erliquiose é de grande interesse na comunidade científica tanto para estudos
veterinários quanto para estudos em saúde pública (STICH et al., 2008); Portanto o
presente trabalho teve como objetivo avaliar a ocorrência da infecção por Ehrlichia spp
em cães domiciliados na região Norte do Paraná por meio da PCR.
 29
6. MATERIAL E MÉTODOS

6.1 COMITÊ DE ÉTICA

Todos os procedimentos para realização do presente estudo foram autorizados

pelo Comitê de Ética para o Uso de Animais da Universidade Pitágoras UNOPAR,
Arapongas, sob o protocolo número 03/22.

6.2 ANIMAIS, AMOSTRAS E ESTUDO DE ÁREA

As amostras de foram provenientes de cães atendidos em clínicas veterinárias e

laboratórios clínicos localizados nos municípios de Arapongas e Apucarana e foram
coletadas no período de junho a novembro de 2022. As amostras de sangue foram
colhidas com ETDA e armazenadas em microtubos de 1,5 ml a -20ºC até posterior
processamento.
A área urbana de Arapongas pertence a uma zona de transição climática, entre
os climas tropical e subtropical a partir da classificação de Köppen. Situada a 804
metros de altitude, Arapongas tem as seguintes coordenadas geográficas: Latitude: 23°
25' 12'' Sul, Longitude: 51° 25' 31'' Oeste, e de acordo com o senso de 2021 possui
123.027 habitantes. O município se estende por 381,1 km², e se situa a 15 km a Norte-
Leste de Apucarana.
O município de Apucarana está situado a 863 metros de altitude, possui
134.996 habitantes de acordo com o último censo e tem as seguintes coordenadas
geográficas: Latitude: 23° 33' 5'' Sul, Longitude: 51° 27' 41'' Oeste.
 30
FIGURA 1: Mapa Topográfico de Arapongas

fonte: https://pt-br.topographic-map.com/map-3rvnh/Arapongas/?center=-23.41423%2C
-51.43509&zoom=12

FIGURA 2: Mapa topográfico de Apucarana.

fonte : https://pt-br.topographic-map.com/map-3rvnh/Arapongas/?center=-23.5609%2C
-51.45547&zoom=13
 31

6.3 EXTRAÇÃO DE DNA

A extração de DNA de sangue total foi realizada com kit comercial QIAmp
DNA Blood Mini Kit (Quiagen, São Paulo, Brasil), seguindo as recomendações do
fabricante . O DNA extraído será identificado e armazenado a -20°C, até a realização da
PCR.

6.4 AMPLIFICAÇÃO DA NESTED-PCR

A extração de DNA de sangue total foi realizada com kit comercial PureLink™
Genomic DNA Mini Kit (Invitrogen), seguindo as recomendações do fabricante. O
DNA extraído foi identificado e armazenado a -20°C, até a realização da PCR.
A amplificação do DNA de Ehrlichia canis foi realizada por PCR. Os
primers que foram utilizados são baseados na sequência parcial do gene dsb Dsb-330
(5‟-GAT GAT GTC TGA AGA TAT GAA ACA AAT-3‟) e Dsb-728 (CTG CTC GTC
TAT TTT ACT TCT TAA AGT-3‟) (ALVES et al, 2014) e as seguintes condições de
amplificação foram utilizadas: desnaturação a 95 ºC, por 2 minutos, 50 ciclos de 95 °C,
por 15 segundos, anelamento a 58 ºC, por 30 segundos, extensão a 72 ºC, por 30
segundos e extensão final a 72 ºC, por 5 minutos (DOYLE et al., 2005).
Todas as reações de amplificação foram realizadas em volume total final
igual a 25 μL, contendo uma mistura de 2,5 μL do DNA-amostra, 2,5 μL de cada
deoxinucleotídeo (2 mM), 1,25 µL de cada oligonucleotídeo iniciador (10 µM), 0,4 µL
de Taq DNA polimerase (1,25 U), 5 μL de tampão da PCR (PCR buffer 5X) e 12,1 μL
de água ultrapura, totalizando 25 μL.
Após amplificação, os fragmentos de DNA foram separados por
eletroforese em gel de agarose a 1%, corados com Sybr™ (Biotium, Hayward, EUA), e
visualizados por luz ultravioleta em transiluminador de UV.
 32
7. RESULTADOS E DISCUSSÃO:

Do total de 179 amostras obtidas 110 (61,4%) foram de Arapongas e 69

(38,6%) foram de Apucarana. Destas, 24% (43/179) foram provenientes de clínicas
veterinárias, e 37,4% (67/179) de laboratórios de Arapongas, e 38,6% (69/179) de
laboratórios de Apucarana.
Os resultados dos exame mostraram que 10 (5.6%) das 179 amostras de sangue
de cães testaram positivos para Ehrlichia spp. na PCR. Arapongas e Apucarana tiveram
7 (6,4%) e 3 (4,3%) das suas amostras positivas respectivamente, no entanto não houve
diferença estatística (p=0,04) (tabela 1).

TABELA 1.Comparativo de números positivos para PCR de E. canis entre os

municípios de Arapongas e Apucarana.

Positivo Negativo Total

Arapongas 7 (6,4%) 103 (93,6%) 110 (100%)

Apucarana 3 (4,3%) 66 (95,7%) 69 (100%)

Total 10 169 179

X 2= 0,05, p=0,40

As prevalência de erliquiose pela PCR em cães observadas no Brasil

mostraram uma variação de 2,8% a 57% (Costa et al, 2015; Rotondano et al, 2017;
Guedes et al, 2015; Menezes et al, 2008; Nakaghi et al, 2008; Ramos et al, 2009; Piso et
al, 2021).
Outros estudos realizados em Pato Branco no Paraná e em Passo Fundo no Rio
Grande do Sul não observaram a presença de E. canis na PCR dos cães avaliados
(Ribeiro, 2017; Gottlieb, 2016).
Em relação a ocorrência de E. canis no mundo, um estudo na África do sul,
apontou 7,5% de cães positivos para na PCR (Kennedy, 2021), números mais altos
foram observados no México com 26% (Merino-Charrez, 2021) e na Venezuela com
45,2% (Martinez, 2015). Na Argentina, os resultados foram negativos, não havendo
cães testados positivos na população avaliada (Martin, 2019).
 33
O presente trabalho apresentou uma ocorrência Intermediária comparado a
outros trabalhos, valendo enfatizar que alguns destes estudos foram realizados com cães
que possuíam alterações hematológicas e/ou manifestações clínicas compatíveis com
EMC. Os resultados observados podem estar diretamente relacionados à população
canina avaliada. Além disso, as amostras foram coletadas nos meses de junho a
novembro, períodos mais secos e frios comparados a outros meses do ano em que há
maior ocorrência da doença (SAINZ et al., 2015).
 34
8. CONCLUSÃO

Conforme resultados obtidos neste estudo, conclui-se que a infecção por

Ehrlichia spp. está presente na região, porém, em uma baixa frequência, no entanto, um
estudo de prevalência amplo abordando a população canina da região traria mais
informações a epidemiologia desse parasita.
 35
9. REFERÊNCIAS

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10.CONSIDERAÇÕES FINAIS

O presente estudo verificou a presença de Ehrlichia spp. em amostras

de sangue de cães domiciliados nos municípios de Arapongas e Apucarana no
norte do Paraná.
Não foram encontrados estudos observando a ocorrência de Ehrlichia
spp. em cães na região analisada através da técnica de PCR, dessa forma, o
presente estudo traz mais informações sobre a presença e distribuição deste
agente nos municípios avaliados.