BOLETIM RELATIVO A ASSUNTOS MÉDICOS/CIENTÍFICOS

Procedimentos de teste de amostras alternativas

Xpert® MTB/RIF e Xpert® MTB/RIF Ultra

Exclusão de responsabilidade: Este documento, elaborado pelo Departamento de Assuntos Médicos/

Científicos da Cepheid, é fornecido aos clientes da Cepheid como cortesia para fornecer orientação
sobre questões relativas ao teste de tipos de amostras alternativos com o Xpert MTB/RIF e, quando
aplicável, com o teste Xpert MTB/RIF Ultra. A Cepheid não recomenda a realização de testes com tipos
de amostras alternativos (ou seja, tipos de amostras não incluídos na documentação do produto) com
ensaios autorizados pela FDA ou pela CE-IVD sem a devida validação, mas reconhece a necessidade
médica desse tipo de teste para alguns pacientes. As orientações seguintes referenciam procedimentos
e estudos publicados que foram validados independentemente pelos autores do estudo. Se optar por
usar o Xpert MTB/RIF com tipos de amostras alternativos, é responsabilidade do seu laboratório validar
o ensaio para cada tipo de amostra alternativo, de acordo com a legislação europeia, nacional e local.*

Contexto

Em seguida, é descrita a sinopse da utilização pretendida dos testes Xpert MTB/RIF e Xpert MTB/RIF Ultra (o
texto varia ligeiramente nas versões CE-IVD e US-IVD):

Os testes Xpert MTB/RIF e Xpert MTB/RIF Ultra executados no sistema GeneXpert® são testes de diagnóstico
in vitro qualitativos, de reação em cadeia da polimerase (PCR) em tempo real nested, destinados à deteção
do ADN do complexo Mycobacterium tuberculosis em expetoração em estado natural ou em sedimentos
concentrados de expetoração preparados a partir de expetoração induzida ou espontânea. Em amostras
onde o complexo M. tuberculosis (complexo MTB) é detetado, os testes Xpert MTB/RIF e Xpert MTB/RIF Ultra
também detetam as mutações do gene rpoB associadas à resistência à rifampicina.

Os testes Xpert MTB/RIF e Xpert MTB/RIF Ultra destinam-se a ser utilizados com amostras de pacientes com
suspeita clínica de tuberculose (TB) e que não tenham recebido terapêutica antituberculose ou com menos de
3 dias de terapêutica. Estes testes destinam-se a servir como um meio auxiliar no diagnóstico da tuberculose
pulmonar quando utilizados em conjunto com resultados clínicos e outros resultados laboratoriais.

Os testes Xpert MTB/RIF devem ser utilizados em conjunto com a cultura de micobactérias para lidar com o
risco de resultados falsos negativos e recuperar organismos quando o complexo de MTB estiver presente,
para posterior caracterização e teste de suscetibilidade a fármacos. Contudo, não é necessário aguardar os
resultados das culturas para tomar decisões relativas à remoção de pacientes do isolamento para infeções
transmitidas por via aérea. A amostra de expetoração espontânea deve ser representativa das secreções do
trato respiratório inferior e devem ter um aspeto purulento (não saliva). A colheita das amostras deve ocorrer sob
supervisão de profissionais de saúde e com participação ativa do paciente para facilitar a colheita de amostras
de qualidade, que são fundamentais para o diagnóstico de tuberculose pulmonar.

CE-IVD. Dispositivo médico para diagnóstico in vitro

US-IVD. Para utilização em diagnóstico in vitro
*Esta orientação aplica-se às versões US-IVD e CE-IVD do Xpert MTB/RIF e à versão CE-IVD do Xpert MTB/RIF Ultra

A better way.
Os testes Xpert® MTB/RIF e Xpert® MTB/RIF Ultra não fornecem confirmação da suscetibilidade à rifampicina,
pois podem existir mecanismos de resistência à rifampicina para além dos detetados por estes dispositivos, os
quais podem estar associados à falta de resposta clínica ao tratamento.

Os resultados de amostras que contenham ADN do complexo MTB e mutações do gene rpoB associadas à
resistência à rifampicina detetados pelos testes Xpert MTB/RIF devem ser confirmados por um laboratório de
referência e podem requerer testes de suscetibilidade a fármacos adicionais. Se for confirmada a presença de
mutações do gene rpoB associadas à resistência à rifampicina, as amostras devem ser igualmente testadas
relativamente à presença de mutações genéticas associadas à resistência a outros fármacos.

O teste Xpert MTB/RIF só deve ser executado em laboratórios que sigam as práticas de segurança de acordo
com as publicações “CDC Biosafety in Microbiological and Biomedical Laboratories and Guidelines for Safe
Work Practices in Human and Animal Medical Diagnostic Laboratories”1 e os regulamentos nacionais ou
regionais aplicáveis ou os recomendados pela Organização Mundial de Saúde no “Tuberculosis laboratory
biosafety manual.”2

Orientações para os testes

Esta orientação está dividida em duas secções: a primeira fornece tabelas de resumo do desempenho dos
testes Xpert MTB/RIF e Xpert MTB/RIF Ultra utilizando vários tipos de amostras, conforme descrito na literatura,
e para tuberculose extrapulmonar. Para a maioria dos estudos, os dados de desempenho são fornecidos
utilizando a cultura como padrão de referência ou um padrão de referência clínica composto, quando aplicável
ou largamente aceite pela comunidade médica. Alguns estudos incluídos eram meta-análises e podem
incluir o padrão de referência clínica e os testes microbiológicos como padrão de referência. Os leitores são
incentivados a consultar as notas de rodapé e as referência bibliográficas para obter informações detalhadas
sobre os estudos incluídos.

A segunda secção fornece informações sobre o processamento de amostras que não são de expetoração
utilizando o ensaio Xpert MTB/RIF. Deve salientar-se novamente que os leitores são incentivados a consultar as
notas de rodapé e as referências bibliográficas relativas aos tipos de amostras e estudos específicos para obter
mais informações.

Nota: Todas as manipulações de amostras “não de expetoração” que contenham microrganismos viáveis
devem ser efetuadas numa câmara de segurança biológica.

Secção 1: Tabelas de resumo do desempenho do Xpert MTB/RIF e Xpert MTB/RIF Ultra

AVALIAÇÃO DO XPERT MTB/RIF EM AMOSTRAS “NÃO DE EXPETORAÇÃO”
Condição ou tipo de Sensibilidade/Especificidade
amostra* Comentários (com referências)
Causa mais comum de tuberculose extrapulmonar.3 Nos
estudos foram utilizados aspirados de tecidos e gânglios Sensibilidade: 84%-96%
Tuberculose ganglionar
linfáticos. A descontaminação rigorosa pode produzir Especificidade: 70%-99%3-12
resultados de culturas negativos.3
A segunda causa mais comum de tuberculose
extrapulmonar.3 É frequentemente utilizado um padrão de
referência composto. Nos estudos foram utilizados líquido Sensibilidade: 15%-63,6%
Tuberculose pleural
pleural e tecido pleural; a OMS recomenda amostras de Especificidade: 97%-100% 3, 4, 6, 13-21
biopsia/tecido; não se recomendam testes de rotina de
líquido pleural.4

Procedimentos de teste de amostras alternativas Xpert® MTB/RIF e Xpert® MTB/RIF Ultra | PÁGINA 2
 Condição ou tipo de
amostra*
Meningite tuberculosa
Tuberculose geniturinária/
Urina
Fluido/aspirado
broncoalveolar (Nota: os
lavados brônquicos não são
uma amostra adequada)
Tuberculose
musculoesquelética
Aspirados gástricos
Fezes
Tecido fixado com formalina e
embebido em parafina
AVALIAÇÃO DE XPERT MTB/RIF ULTRA EM AMOSTRAS “NÃO DE EXPETORAÇÃO”*
Condição ou tipo de amostra
LCR prospetivo
Amostras respiratórias (inclusive lavado
broncoalveolar) e não respiratórias
(gânglios linfáticos, biopsias, fluido
cavitário, aspirado gástrico e urina)
congeladas sem identificação
Amostras frescas, “não de
expetoração”
Amostras de tuberculose
extrapulmonar armazenadas
*Aquando da redação deste documento, os estudos que tinham utilizado o ensaio MTB/RIF Ultra eram limitados. São aqui fornecidos
os dados de estudos publicados e, quando relevante, comparações com o ensaio MTB/RIF.
Sensibilidade/Especificidade
Comentários (com referências)
Doença paucibacilar devastadora. Maiores volumes Sensibilidade: 55%-88%
de LCR e amostras concentradas melhoram o Especificidade: 93%-99%3, 4, 6, 11, 16, 20,
desempenho.3 22-27
Sensibilidade: 48%-95% (menor
sensibilidade quando utilizado para
Pode utilizar-se urina para identificar a tuberculose
identificar a tuberculose pulmonar
geniturinária ou ajudar no diagnóstico de tuberculose
em pacientes VIH+ com contagens
pulmonar em casos de coinfeção pelo VIH.3
elevadas de CD4)
Especificidade: 86%-99%3, 16, 28-33
Pode ser utilizado em pacientes com pouca expetoração,
Sensibilidade: 60%-93%
pacientes negativos para AFB ou cuja expetoração não
Especificidade: 73%-98% 6, 34-39
seja considerada uma amostra ideal.3, 34
Pode ser utilizado em amostras de osso, ou tecido ou Sensibilidade: 67%-97%
líquido articular. Especificidade: 83%-100%3, 40, 41
Sensibilidade: 22%-100%
Utilizados para identificar a tuberculose pulmonar em (desempenho inferior em crianças
crianças. com menos de 4 anos)42
Especificidade: 70%-99%42-47
Utilizadas para identificar a tuberculose pulmonar
em crianças. Estão disponíveis muitos métodos de Sensibilidade: 81%-86%
processamento, que, provavelmente, influenciam o Especificidade: 94%-100%48-51
desempenho.
Antes de testar, é necessário remover a parafina, o
Sensibilidade: 30%-35%
que pode ser tecnicamente difícil. Utilizado em várias
Especificidade: 78%-94%52
condições.
Sensibilidade/Especificidade
Comentários (com referências)
Adultos infetados pelo VIH; o Sensibilidade: 70% para meningite tuberculosa
volume de amostra preferido foi provável ou definitiva; Especificidade: 95% com um
6 ml. padrão de referência composto53
Todas as amostras foram negativas Melhoria global de 45,6% na sensibilidade utilizando
no Xpert MTB/RIF e positivas na Xpert MTB/RIF Ultra vs. Xpert MTB/RIF. Melhoria de
cultura. Amostras armazenadas 40,6% com Xpert MTB/RIF Ultra em amostras não
durante um período de 4 anos. respiratórias.54
Resultados de amostras com cultura positiva:
A sensibilidade do Xpert MTB/RIF Ultra vs. Xpert
São fornecidos apenas os dados de
MTB/RIF foi de 83,7% e 67,4%, respetivamente. A
amostras com cultura positiva.
especificidade do Xpert MTB/RIF Ultra e Xpert MTB/
RIF foi de 92,0% e 96,0%, respetivamente.55
Foram incluídas amostras com
cultura positiva. Para a análise
da especificidade foram incluídas
amostras clínicas com cultura Sensibilidade de 75,9% e especificidade de 100%.56
negativa (40) e amostras positivas
para micobactérias não causadoras
de tuberculose (20).
Procedimentos de teste de amostras alternativas Xpert® MTB/RIF e Xpert® MTB/RIF Ultra | PÁGINA 3
Secção 2. Protocolos de processamento de amostras revistos por pares

Esta secção fornece informações sobre o processamento de amostras “não de expetoração” utilizando
apenas o ensaio Xpert® MTB/RIF. Devido à literatura limitada sobre a utilização do ensaio Ultra com amostras
“não de expetoração”, não são fornecidos neste documento procedimentos específicos para o ensaio Ultra.

2.1 Protocolo para LCR57

O método ideal para o processamento de LCR utilizando o Xpert MTB/RIF depende do volume da amostra
disponível para teste. Amostras de LCR sanguinolentas e xantocrómicas podem produzir resultados
falsos negativos no Xpert MTB/RIF devido à inibição da PCR. Sempre que possível, as amostras devem
ser transportadas e armazenadas entre 2 °C e 8 °C antes do processamento. O tempo máximo para
armazenamento e processamento é de sete dias.

Se houver mais de 5 ml de LCR disponível para teste:

• Transfira a amostra de LCR para um tubo de centrífuga cónico e concentre a amostra a 3000x g durante
15 minutos.
• Verta cuidadosamente o sobrenadante através de um funil para um recipiente de eliminação que
contenha fenol a 5% ou outro desinfetante micobactericida. Certifique-se de que deixa aproximadamente
0,5 ml de sobrenadante no tubo para assegurar que o precipitado (“pellet”) se mantenha intacto.

Nota: O LCR concentrado deve ser decantado numa câmara de segurança biológica.

• Ressuspenda o precipitado até um volume final de 2 ml, adicionando o reagente de amostra Xpert
MTB/RIF. Misture a suspensão do precipitado no agitador de vórtex para garantir que nenhuma parte
da suspensão fica aderente aos lados ou ao fundo do tubo. Após sete a oito minutos de incubação à
temperatura ambiente, misture a amostra no vórtex uma segunda vez, conforme indicado no folheto
informativo do Xpert MTB/RIF. Incube durante mais sete a oito minutos (15 minutos de incubação total) à
temperatura ambiente.
• Identifique um cartucho Xpert MTB/RIF com o número de identificação da amostra.
• Utilize uma pipeta de transferência nova para transferir 2 ml da amostra de LCR ressuspendida para o
cartucho Xpert MTB/RIF.
• Coloque o cartucho no sistema GeneXpert®, seguindo as instruções do fabricante.

Se houver 1 ml–5 ml de LCR disponível:

• Adicione um volume igual de reagente de amostra ao LCR. Misture a amostra e o reagente de amostra no
agitador de vórtex, conforme descrito anteriormente. Após sete a oito minutos à temperatura ambiente,
misture a amostra no agitador de vórtex uma segunda vez. Incube durante mais sete a oito minutos
(15 minutos de incubação total) à temperatura ambiente.
• Adicione 2 ml da mistura da amostra diretamente ao cartucho Xpert MTB/RIF.
• Coloque o cartucho no sistema GeneXpert, seguindo as instruções do fabricante.

Procedimentos de teste de amostras alternativas Xpert® MTB/RIF e Xpert® MTB/RIF Ultra | PÁGINA 4
Se houver 0,1 ml–1 ml de LCR disponível
• Adicione reagente de amostra suficiente à amostra de LCR para obter um volume final de 2 ml. Misture
a amostra e o reagente de amostra no agitador de vórtex, conforme descrito anteriormente. Após sete a
oito minutos à temperatura ambiente, misture a amostra no agitador de vórtex uma segunda vez. Incube
durante mais sete a oito minutos (15 minutos de incubação total) à temperatura ambiente.
• Adicione os 2 ml da mistura da amostra diretamente ao cartucho Xpert® MTB/RIF.
• Coloque o cartucho no sistema GeneXpert, seguindo as instruções do fabricante.

Se houver menos de 0,1 ml de LCR disponível

• Esse é um tamanho de amostra insuficiente para teste usando o Xpert MTB/RIF.

2.2 Protocolo para gânglios linfáticos e outros tecidos (colheita estéril)57

Nota: Todas as manipulações devem ser executadas numa câmara de segurança biológica.

• Corte a amostra de tecido em pequenos pedaços num almofariz, homogeneizador ou triturador de tecidos
estéril utilizando pinça e tesoura estéreis.
• Adicione aproximadamente 2 ml de solução salina tamponada com fosfato (PBS) estéril.
• Triture a solução de tecido e PBS com um almofariz e pilão (ou num homogeneizador ou triturador de
tecidos) até obter uma suspensão homogénea.
• Utilize uma pipeta de transferência para colocar aproximadamente 0,7 ml do tecido homogeneizado num
tubo cónico com tampa de rosca estéril.

Nota: Evite transferir quaisquer grumos de tecido que não tenham sido devidamente homogeneizados.

• Utilize uma pipeta de transferência para duplicar o volume da amostra com reagente de amostra Xpert
MTB/RIF (ou seja, adicione 1,4 ml do reagente de amostra a 0,7 ml de tecido homogeneizado).
• Agite o tubo vigorosamente 10 a 20 vezes ou leve ao agitador de vórtex durante pelo menos 10 segundos.
• Incube o reagente de amostra durante 10 minutos à temperatura ambiente e depois agite vigorosamente a
amostra mais 10 a 20 vezes ou misture-a no agitador de vórtex durante pelo menos 10 segundos.
• Incube a amostra à temperatura ambiente durante mais cinco minutos.
• Utilize uma pipeta de transferência nova para transferir 2 ml da amostra processada para o cartucho Xpert
MTB/RIF. Coloque o cartucho no sistema GeneXpert, seguindo as instruções do fabricante.

Nota: Para amostras não colhidas da forma estéril, o manual da OMS sugere um protocolo de
descontaminação com NaOH/concentração similar ao utilizado para expetoração.57

2.3 Amostras de osso e articulações40, 58

• Obtenha 1 ml de amostra purulenta e misture-a com 2 ml de reagente de amostra.
• Misture a amostra no agitador de vórtex durante pelo menos 10 segundos e, em seguida, incube à
temperatura ambiente durante 10 minutos. Misture por mais 10 segundos no agitador de vórtex e incube à
temperatura ambiente durante cinco minutos.
• Adicione 2 ml da mistura ao cartucho Xpert MTB/RIF e coloque o cartucho no instrumento de acordo com
as instruções do fabricante.

Procedimentos de teste de amostras alternativas Xpert® MTB/RIF e Xpert® MTB/RIF Ultra | PÁGINA 5
2.4 Aspirados brônquicos obtidos com broncoscópio de fibra ótica ou lavados broncoalveolares36, 38
Com 5 ml-10 ml:
• Descontamine a amostra com N-acetil-cisteína-NaOH a 2% e concentre-a por centrifugação a 3000x g
durante 15-20 minutos. Elimine o sobrenadante, deixando apenas cerca de 0,5 ml, e ressuspenda
o precipitado em 0,5 ml-1 ml de líquido, como PBS.
• Adicione o reagente de amostra numa razão de 2:1 ao precipitado ressuspendido.
• Misture a amostra e o reagente de amostra no agitador de vórtex. Após sete a oito minutos à temperatura
ambiente, proceda a um segundo passo de mistura no agitador de vórtex. Incube durante mais sete a oito
minutos (15 minutos de incubação total) à temperatura ambiente.
• Adicione 2 ml da amostra tratada com reagente de amostra ao cartucho Xpert® MTB/RIF e coloque o
cartucho no instrumento de acordo com as instruções do fabricante.

2.5 Amostras de fezes

Por altura da redação deste documento, vários grupos estavam a avaliar o processamento de amostras de
fezes para diagnóstico de tuberculose pulmonar em crianças. Indicamos aqui um protocolo, mas poderão
existir outros eficazes.50

• Dilua aproximadamente 2 mm3 de fezes em 10 ml de água estéril, tape bem o tubo e misture vigorosamente
no agitador de vórtex para produzir uma suspensão uniforme.
• Deixe a suspensão repousar à temperatura ambiente durante 15 minutos para sedimentação das partículas.
• Aspire a totalidade do sobrenadante para um tubo de centrífuga cónico e centrifugue a 3000x g durante
20 minutos.
• Remova o sobrenadante e ressuspenda o sedimento em 1 ml-3 ml de solução salina tamponada com
fosfato, dependendo do número de testes adicionais a executar na amostra.
• Misture 1 ml do sedimento ressuspendido com 2 ml de reagente de amostra da Cepheid. Misture a
amostra e o reagente de amostra no agitador de vórtex. Após sete a oito minutos à temperatura ambiente,
proceda a um segundo passo de mistura no agitador de vórtex. Incube durante mais sete a oito minutos
(15 minutos de incubação total) à temperatura ambiente.
• Adicione 2 ml da amostra tratada com reagente de amostra ao cartucho Xpert MTB/RIF e coloque o
cartucho no instrumento de acordo com as instruções do fabricante.

2.6 Aspirados gástricos46

• Neutralize 5 ml de aspirado gástrico com um volume igual de bicarbonato de sódio a 1% estéril. Caso a
amostra não vá ser imediatamente testada, congele a uma temperatura ≤ -20 °C.
• Descongele a amostra (se tiver sido previamente congelada), homogeneíze e faça a respetiva digestão em
N-acetil-L-cisteína-NaOH-citrato de Na a 1,5% (concentração final de 1,5%); misture no agitador de vórtex
durante 30 segundos.
• Incube a amostra durante 15 minutos à temperatura ambiente, seguida pela neutralização com solução
salina tamponada com fosfato (PBS); em seguida, centrifugue a 4000x g durante 15 minutos.
• Elimine o sobrenadante e ressuspenda o sedimento em 2 ml de PBS.
• Para testes no Xpert MTB/RIF, adicione 1,5 ml de reagente de amostra a 0,5 ml do sedimento concentrado.

Procedimentos de teste de amostras alternativas Xpert® MTB/RIF e Xpert® MTB/RIF Ultra | PÁGINA 6
 • Misture a amostra e o reagente de amostra no agitador de vórtex. Após sete a oito minutos à temperatura
ambiente, misture a amostra no agitador de vórtex uma segunda vez. Incube durante mais sete a oito
minutos (15 minutos de incubação total) à temperatura ambiente.
• Adicione 2 ml da amostra tratada com reagente de amostra ao cartucho Xpert® MTB/RIF e coloque o
cartucho no instrumento de acordo com as instruções do fabricante.

2.7 Amostras de urina29, 30

• Obtenha 2 ml de urina não diluída e não processada. Centrifugue a urina a 3000x g durante 15 minutos,
remova o sobrenadante e ressuspenda o precipitado em 0,75 ml de solução salina tamponada com fosfato.
• Adicione o reagente de amostra numa razão de 2:1 ao precipitado de urina.
• Misture a amostra e o reagente de amostra no agitador de vórtex. Após sete a oito minutos à temperatura
ambiente, misture a amostra no agitador de vórtex uma segunda vez. Incube durante mais sete a oito
minutos (15 minutos de incubação total) à temperatura ambiente.
• Adicione 2 ml da amostra tratada com reagente de amostra ao cartucho Xpert MTB/RIF e coloque o
cartucho no instrumento de acordo com as instruções do fabricante.
• Para amostras de urina congeladas (30 ml-40 ml de volume), descongele e centrifugue a amostra a
3000x g durante 15 minutos.
• Retire cuidadosamente o sobrenadante, certificando-se de que retém o precipitado; guarde ~1 ml de
sobrenadante.
• Pegue no precipitado e ressuspenda-o em 0,75 ml do sobrenadante guardado.
• Adicione o reagente de amostra numa razão de 2:1 à urina ressuspendida.
• Misture a amostra e o reagente de amostra no agitador de vórtex. Após sete a oito minutos à temperatura
ambiente, misture a amostra no agitador de vórtex uma segunda vez. Incube durante mais sete a oito
minutos (15 minutos de incubação total) à temperatura ambiente.
• Adicione 2 ml da amostra tratada com reagente de amostra ao cartucho Xpert MTB/RIF e coloque o
cartucho no instrumento de acordo com as instruções do fabricante.

2.8 Amostras fixadas com formalina e embebidas em parafina59

• Adicione xileno, seguido por mistura no agitador de vórtice e incubação a 65 °C durante 20 min para
desparafinizar as amostras.
• Centrifugue as amostras a 13 000 rpm durante cinco minutos. Elimine o sobrenadante.
• Ressuspenda os precipitados em tampão de digestão (Tris-HCl 50 mM pH 7,5, EDTA 10 mM,
dodecilssulfato de sódio (SDS) a 0,5%, NaCl 50 mM, 300 mg/ml de proteinase K) e incube a 37 °C em
condições de oscilação durante 24 horas.
• Incube a amostra a 95 °C durante 10 minutos para inativar a proteinase K.
• Combine a amostra com 2 ml de reagente de amostra da Cepheid e incube à temperatura ambiente
durante 15 minutos. Agite duas vezes durante esse período.
• Transfira/pipete o sobrenadante para o cartucho e execute o teste.

Procedimentos de teste de amostras alternativas Xpert® MTB/RIF e Xpert® MTB/RIF Ultra | PÁGINA 7
REFERÊNCIAS
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Procedimentos de teste de amostras alternativas Xpert® MTB/RIF e Xpert® MTB/RIF Ultra | PÁGINA 8
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