Universidade de Trs-os-Montes e Alto Douro

2 Ciclo em Gentica Molecular Comparativa e Tecnolgica

GENTICA MICROBIANA

Gentica Microbiana

INTRODUO
Vrios foram os modelos de classificao de seres vivos que foram surgindo ao longo dos anos.

Lineu
- estabeleceu a nomenclatura binomial (animalia e
plantae);
- estabeleceu a hierarquia de 7 nveis, desde Reino at
espcie.
Nota: nos MO o conceito de espcie no to concreto, mais diludo.

Haekel
- em animalia, plantae e protista.

Copeland (baseado no conhecimento da estrutura celular

microscpica, nos constituintes qumicos,)
- em quatro grupos.

Wittaker (1969)
- estabeleceu um sistema baseado nos diferentes nveis de
organizao e tipos de nutrio.

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Extremfilos: inicialmente pensava-se que seriam apenas procariotas, mas eram diferentes das
bactrias (ao nvel das caractersticas estruturais e genticas). Contudo, existem eucariotas
extremfilos.

Aspectos gerais das molculas hereditrias dos vrus, bactrias, arqueas e leveduras
- Os cidos nucleicos esto sempre presentes, embora evidenciando grande variabilidade
(RNA e/ou DNA). Os pries so a nica excepo: multiplicam-se sem possurem um
cido nucleico.

Estruturas moleculares e sequncias gnicas demonstraram ser mais reveladoras das relaes
evolutivas que os clssicos fentipos (sobretudo entre microrganismos).

A base para a definio dos taxa mudou progressivamente do nvel organismal para o
celular e depois para o molecular.

Woese (1977)
- atravs da anlise filogentica de genes rRNA (um gene), sugere que as Archea
constituem um grupo separado, cuja constituio gentica , apenas distantemente, relacionada com
bactria e eucarya. Criou os 3 Domnios de Woese: evidenciando a existncia de maior
diversidade entre os microrganismos, do que entre os animais e plantas.

Os 3 domnios tem um ancestral comum;

As arqueas so mais prximas dos eucariotas do que das bactrias (as suas protenas
ribossomais so mais prximas dos eucariotas);

H mais diversidade entre os microrganismos do que entre animais e plantas;

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Archea apresenta centenas de genes sem equivalncia entre bactrias ou Eucariotas,

confirmando a distino do domnio, porm mais semelhantes com eucariotas.

Sequenciao de genomas em Archea

- A sequenciao veio confirmar a distino deste domnio, existem centenas de genes sem
equivalncia entre Bactria e Eucarya.
- Protenas ribossomais de Archea eram mais prximas de Eucarya do que de Bacteria.
Archea e Eucarya so mais relacionadas do que Archea e Bacteria.
- uma coisa estarem mais prximos, outra coisa termos animais (a nvel de genoma) mais
relacionados com bactrias, quanto mais no seja, as mitocndrias.

Transferncia horizontal de genes

As trocas de genes entre organismos, geralmente no exibidos nos eucariotas, so bem
conhecidos entre bactrias e entre archea. (Plantas tambm apresentam THG)
Existem evidncias de que houve trocas de genes entre organismos muito distantes (entre
domnios diferentes). Este facto constitui um problema construo da rvore universal da vida.

Verificou-se a transferncia horizontal de genes entre os trs domnios:

Trocas de genes entre organismos muito distantes;

As trocas de genes entre organismos geralemente no exibidas em Eucariotas so

conhecidas em Bactrias e tambm nas archeas;

Os genes nucleares de eucariotas derivam de bactrias e no de archeas.

Eucarya adquiriu mtDNA e cpDNA de bactria

Genes nucleares de eucariotas derivam de bactria

24% do genoma da bactria Thermeotoga martima contem DNA de archae

Archae Archaeoglobus fulgidus possui numerosos genes bacterianos

Assim, uma comunidade diversa de clulas primitivas ter dado origem aos 3 domnios

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Iwabe et al. (1989) Demonstraram que Archea e Eucarya so grupos irmos:

- A similaridade de sequncias de DNA dos dois genes que codificam para as duas
subunidades e ATPase, sugere fortemente que os dois genes derivam de uma duplicao gnica.

- rvores similares foram obtidos com outros pares de genes duplicados

Em suma, Woese tinha razo!

A transferncia horizontal de genes afecta a evoluo de todos os organismos.

MAS, existem fragilidades dos modelos apresentados:

- a rvore do RNA erra ao mostrar os eucariotas como irmo das arqueas;
- a colocao da raiz da rvore entre bactrias e arqueas baseou-se num modelo matemtico,
sem testar posies alternativas;
- a anlise com um par antigo de protenas relacionadas mostrou que, ainda, no possvel
saber onde colocar a raiz da rvore;
- a comparao de genomas mostrou que os eucariotas possuem mais genes bacterianos que
arqueanos, em oposio rvore do RNA (que apenas utiliza um gene);
- ainda que apresente a diviso natural entre os procariotas e eucariotas ao nvel da
organizao celular, e a diviso entre bactrias e arqueas, um modelo muito simplista (Nota: h
eucariotas que no tm histonas);
- a transferncia horizontal de genes impregna toda a evoluo dos procariotas, logo no h
nenhum genoma inicial;
- Logo, a estrutura em rvore bifurcada deve ser abandonada.

Actualmente, tambm no se sabe onde os diferentes domnios derivam.

Todos os dados mostram que possivelmente a transferncia horizontal de genes entre organismos
deu origem a uma rvore de vida maior, que se assemelha a um arbusto com ligao a conectar os
genes (partilha de genes).

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Rivera e Lake (2004)

Modelo que resolve algumas questes em aberto:
- incluiu a anlise de centenas de genes (grande vantagem);
- coloca os eucariotas num plano e os procariotas noutro;
- tem em conta a transferncia horizontal de genes (crculo e a separao das setas);
- recupera as ligaes entre procariotas e eucariotas.

Ring of life

Mas, este modelo tambm est de longe

de

solucionar

todas

as

questes

biolgicas! O artigo que critica este

modelo data de 2010.

Vantagens da utilizao dos microrganismos na anlise gentica

- relativamente fcil obter dados em elevado nmero de indivduos;
- replicao ou multiplicao muito rpida e produo de descendncia numerosa;
- relativamente fcil trabalhar com as pequenas quantidades de DNA exibidas por esses
grupos;
- a diviso em clulas filhas idnticas leva produo de clones, simplificando o isolamento
de estirpes geneticamente idnticas;
- o crescimento em laboratrio fcil e requer pouco espao;
- possuem importncia na sade humana, animal e vegetal;
- podem ser geneticamente manipuladas para funcionar como biofbricas;
- relativamente fcil trabalhar com as quantidades de DNA exibidas;
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- bactria e archea possuem cerca de 1/1000 do DNA das clulas humanas;

- um vrus tipicamente tem 1/100 do DNA de uma bactria;
- Existem tcnicas para manipular e isolar os genes;
- os vrus e procariotas so geralmente haploides, tornando a anlise gentica mais fcil
(apenas so diploides antes e depois da recombinao), permitindo assim a explicao directa das
mutaes;
- as levedura permitem combinar as vantagens da utilizao de bactrias com a vantagem
adicional de serem eucariotas
- os genomas so pequenos e por isso so rapidamente sequenciados. Em novembro de 2011
haviam 2815 genomas sequenciados, sendo 149 arqueas e 2666 bactrias.

Bactrias:
- crescem rapidamente (E. coli duplica a cada 20 min);
- podem adquirir novos genes por vrios processos;
- permitem obter numerosos mutantes auxotrficos.

Leveduras:
- Sistema e mtodo gentica/bioqumico bem caracterizados;
- Sistema de transformao de DNA muito verstil;
- ~6000 genes estudados;
- teis para estudar pries;
- Existem bases de dados do RNA e protenas (til para o estudo de caractersticas de
procariotas);
- crescimento rpido (tempo de gerao de 90 min/colnias em 48h).

Vrus:
- so constitudos por cido nucleico e algumas protenas;
- alguns infectam as clulas mas a replicao s se d em curtas condies;
- reproduzem-se rapidamente aps infeco do hospedeiro;
- podem replicar-se ainda mais rapidamente que as bactrias;
- os vrus no so procariotas, mas parasitas intracelulares que apenas se podem produzir no
interior das clulas vivas.

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Archea:
- o tamanho do genoma semelhante ao das bactrias;
- o aparelho de expresso gnica assemelha-se ao dos eucariotas;
- o aparelho de diviso celular assemelha-se ao dos procariotas;
- alguns grupos tm sido cultivados em laboratrio mas a maioria no;
- alguns possuem sistemas enzimticos nicos.

A facilidade de uso das bactrias e vrus na investigao em gentica impulsionou

fortemente a gentica e a biologia molecular nos ltimos 50 anos.

Procariotas e vrus:
- continuam a desempenhar um papel fundamental como ferramenta biotecnolgica na
compreenso (gentica procariota e eucariota);
- tm um importante papel ecolgico, sobretudo nos ciclos biogeoqumicos, devido sua
versatilidade metablica (importncia ao nvel do pool enzimtico);
- constituem importantes desafios sade humana.

Facilidade de cultura
- Podem ser facilmente cultivados em meios slidos, lquidos e semi-slidos;
- Para o isolamento de mutantes auxotrficos recorre-se ao isolamento de rplicas.

Muitas bactrias podem desenvolver-se tanto em meio rico e complexo (meio completo) como num
meio de composio definida (meio mnimo). As linhagens que crescem nos dois meios so
chamadas de selvagens ou prototrficas, em contraste com os auxotrficos que so incapazes de
crescer em meio mnimo por no serem capazes de sintetizar uma ou mais substncias essenciais.

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Alternativa s culturas recalcitrantes

Considera-se uma cultura recalcitrante quando os M.O. j no podem ser isolados.
Os mtodos de cultura tradicionais revelaram falhas na representao da diversidade microbiana na
natureza, pois apenas uma pequena fraco de mic. viveis numa amostra so recolhidos pelas
tcnicas de cultura.

METAGENMICA
estudo compreensivo de sequncias nucleotdicas, estrutura, regulao e funo

Pode estudar-se o mais pequeno componente do sistema ambiental extraindo o DNA dos
organismos nesses sistemas e inserindo-o depois no organismo-modelo. Este expressa o DNA, o
qual pode ser depois estudado utilizando as tcnicas laboratoriais padro.
A METAGENMICA permite a identificao de genes e enzimas sem a necessidade dessas
culturas de microrganismos em laboratrio.

Etapas bsicas da anlise metagenmica:

1. Isolamento de DNA a partir de amostra ambiental;
2. Manipulao do DNA (fragmento DNA metagenmico + BAC);
3. Ligao dos fragmentos com vectores (DNA metagenmico clonado);
4. Construo da livraria (cultura de E. coli);
5. Anlise (expresso de diferentes protenas).

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Vantagens da Metagenmica:
- Providencia dados filogenticos baseados na anlise das sequncias do gene 16S RNA;
- Enumera a extenso da diviso microbiana;
- Toda a informao vai para uma livraria metagenmica, para se puder identificar novos
genes de microrganismos no cultivados;
- Permite o acesso informao gentica de microrganismos no cultivados.

Organismos modelo
Qualidades desejveis:
- Histria gentica bem conhecida
- Curto ciclo de vida, para que muitas geraes sejam estudadas num curto perodo de tempo
- Produo de uma elevada descendncia
- Facilidade de crescimento e manipulao do crescimento
- Variao gentica acentuada na populao
Microrganismos so haploides (vantagem especfica).
Leveduras no ciclo so haploides ou diploides, alm de que apresentam modificao pstranscripcional.

Bacterifagos

Tm sido um importante sistema gentico modelo porque:

- Pequenos genomas
- Curto ciclo de vida
- Produzem muita descendncia, a partir de uma nica clula infectada.

Providenciam um meio muito eficiente de transferncia de DNA para ou entre clulas;

A elevada descendncia permite quantificar eventos de recombinao muito raros;

A propagao dos fagos muito simples, originando stocks com elevados ttulos de fagos,
quantificados de forma muito simples;

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Curva de Crescimento

Os fagos mais utilizados na investigao em biologia molecular apresentam

forma complexa (tipo mdulo de aterragem lunar).
Ex. fago T4, lambda, Mu e P1.

Bactrias

clulas muito simples que podem ser crescidas e manipuladas com facilidade;

() a atraco das bactrias como E.coli ou B.subtillis como sistemas experimentais devese ao facto de serem muitos simples e podem ser crescidas e manipuladas com facilidade
comparvel;
Curva de crescimento

Providenciam vrios sistemas genticos: mutantes; cruzamentos; mapas genticos; etc.;

E. Coli uma Gram- com um cromossoma circular de 4,6 Mb (presentes no intestino

humano);

Bacillus subtilis uma Gram+, ubqua no solo, capaz de formar esporos:

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- cromossoma circular de 4,2 Mb;

- naturalmente competente para transformao, pelo que mais difcil de
manipulao em laboratrio;
- das mais utilizadas na produo de qumicos especiais e enzimas industriais.

Pseudomonas putida uma Gram- que vive livremente na gua:

- cromossoma circular de 6,1 Mb;
- bactria usada em estudos ambientais (degradao compostos aromticos);
- bactria certificada como hospedeira biosegura para a clonagem de genes.

Leveduras (exs. Sacharomyces cerevisiae)

eucariotas unicelulares;

primeiro eucariota a ser sequenciado;

estveis na fase haploide e diploide;

eficiente na recombinao homloga;

6000 genes, 182 similares em humanos;

so unicelulares mas podem apresentar caractersticas de grupo;

sistema de transferncia altamente verstil;

muitas vias metablicas;

tem material que permitem despistagem fenotpica, despistagem de letalidade sinttica e

anlise de haploinsuficincia;

serve de auxlio deteco de pries.

Utilizao na Indstria Biotecnolgica

- Indstria qumica e alimentar (aromatizantes, enzimas, ...);
- Investigao Biolgica (Biologia celular, gentica, ...)
- Indstria farmacutica (medicamentos, vacinas, ...)
- Indstrias fermentativas
- Tecnologias ambientais
- Investigao biomdica (cancro, sida, drogas, ...)

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M.O.: excelente material de estudo

Possuem uma estrutura genmica relativamente simples;

Genomas microbianos podem providenciar dados para a compreenso da genmica dos

organismos superiores;

A anlise de genomas inteiros providencia uma panormica inteira da evoluo microbiana

e da diversidade que ultrapassa os dados da filogenia de protenas simples ou genes;

Ferramenta importante na identificao de novas aplicaes para a biotecnologia;

novas abordagens no tratamento e controlo de organismos patognicos.

Diferenas entre Eubactria e Archea na estrutura da parede celular

A sequenciao de genomas de Arqueas confirma a distino deste domnio: contm centenas de
genes sem equivalncia em Bactria e Eucarya.
Possuem diferenas em as eubactrias:
- nas paredes celulares e lpidos das membranas;
- numerosas diferenas bioqumicas;
- estruturas e funes nas arqueas mais similares aos eucariotas;
- a nvel de lise celular, esta problemtica nas arqueas: requer lise especfica.

Semelhanas e diferenas entre Arqueas, Bactrias e Eucariotas

as arqueas so mais evoludas que as bactrias, sendo mais prximas do domnio Eucarya;

so semelhantes s bactrias no que diz respeito estrutura celular (tambm no possuem

ncleo diferenciado) e metabolismo;

os processos de transcrio do DNA e da sntese proteica so idnticos aos dos eucariotas;

Cromossoma: semelhante ao cromossoma bacteriano, nico e na maioria dos casos

circular; a sua organizao semelhante dos eucariotas, uma vez que se observam
protenas do tipo histonas associadas ao DNA;

Transcrio: os promotores so mais semelhantes aos eucariotas; a RNA polimerase mais

complexa que a das bactrias, podendo ser composta por 8 subunidades, enquanto que nas
bactrias apenas uma enzima com 4 subunidades;

Traduo: diferente das bactrias, assemelhando-se mais aos eucariotas; a toxina difteria
que inibe a traduo de clulas eucariotas tambm inibe o processo em Arqueas.

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Algumas particularidades de Procariotas

- Os procariotas tem evoludo muito rapidamente: tem um perodo de vida muito pequeno;
- Existem em todos os habitats da Terra;
- Afectam a diversidade e profundamente o nosso meio ambiente;
- Foram as criaturas melhor sucedidas na Terra;
- Desempenham papis muito crticos na biosfera, interagindo entre si e com outros organismos
(ciclo do enxofre, carbono, etc.);
- Os procariotas podem agrupar-se;
- A maior parte do procariotas so unicelulares;
- Todos os procariotas apresentam a mesma estrutura bsica;
- O nucleide contm o DNA;
- Na maioria existe uma parede celular protectora;
- Tambm podem ter plasmdeos;
- No possuem mitocndrias, Complexo de Golgi, etc.;
- Sem citosqueleto proteico, sem mitose ( por cissiparidade);
- Uma minoria das bactrias patognica.

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Novos dados sobre os genomas microbianos

Elementos Genticos Microbianos

1. Genomas virais

2. Genomas procariotas
- Cromossomas circulares e lineares
- Outros elementos genticos :
Plasmdeos circulares e lineares
Cromdeos
Sequncias de insero
Transposes
Integres e cassetes gnicas
Elementos ISCR
Intres
Profagos
PAIS e GEIS
sRNA

3. Genomas eucariotas unicelulares (o exemplo de S. cerevisaea)

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1. Genomas Virais
O que so vrus?
- so agentes infecciosos no celulares que se proliferam apenas no interior da clulas;
- possuem DNA ou RNA (nunca os dois);
- possuem cpside proteica;
- so 100x mais pequenos que a clula que infecta;
- so apenas visveis ao M.E.;
- so funcionalmente activos ou inactivos;
- parasitas intracelulares obrigatrios;
- no possuem genes que codifiquem protenas como mquinas metablicas (possuem apenas os
genes necessrios sua replicao).

Estrutura bsica dos Vrus

A. cido nucleico

Apenas um tipo de cido nucleico

- DNA ou RNA
- cadeia dupla ou simples
- linear, circular ou com cortes
- segmentado ou no segmentado
- Se RNA cadeia simples - ssRNA (+RNA ou RNA, neste ltimo tem que se
produzir a cadeia + para que possa servir de mRNA)
dsDNA: T4, 29, , Mu, fagos temperados como Bacillus subtilis.
ssDNA: M13, x174.

B. Composio nucleotdica

a habitual, mas existem algumas variaes, sendo que algumas bases so substitudas;

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DNA de alguns fagos: Algumas bases invulgares, como Uracilo ou hidroximetiluracilo (em
vez de Timina) e hidroximetilcitosina (em vez de Citosina);

Fagos T: C- Hidroximetilcitosina, associada glucose ou gentobiose

Maior parte do DNA viral possui molculas parcialmente metiladas.

C. Outras caractersticas

1. Presena de extremidades coesivas em genomas lineares de DNA de cadeia dupla.

Constitudos por regies complementares que permitem a formao dos concatmeros;

2. Existncia de redundncia terminal nos genomas lineares de DNA (os 1s genes de uma
extremidade esto presentes na outra extremidade). Permite que o genoma viral adopte a
configurao circular necessria replicao pelo mecanismo do crculo rolante (rolling circle).

3. Existncia de redundncia terminal invertida: a ordem dos elementos genticos no

mantida no mesmo sentido. A circularizao do genoma conseguida pela existncia de elos de
ligao proteicos.
4. Ligao covalente dos extremos de uma molcula de DNA linear de cadeia dupla
(permite proteco contra algumas enzimas). Aps desnaturao origina uma molcula linear de
cadeia simples;
5. Modificaes nas extremidades 3 e 5 dos genomas de alguns vrus de RNA.
Aparecimento de 5cap e 3poliA semelhante s encontradas em mRNA de eucariotas (ex. togavrus
e coronavrus);

6. Ocorrncia de zonas extensas de emparelhamento nos RNAs dos virides de plantas;

7. Extensa sobreposio de ORFs correspondentes a diferentes

genes (aumenta

substancialmente o potencial codificante de genomas de tamanho reduzido). Esta caracterstica

encontrada em numerosos vrus e bactrias (economia do uso do DNA). Ex: retrovrus,
hepadnavrus

8. Ocorrncia de genomas segmentados em diversos grupos. Os segmentos podem estar na

mesma partcula viral (animais) ou no (plantas), contudo, todos os segmentos so necessrios para
a aco viral.
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Um Vrus com grandes ambies

Mimivirus (o maior vrus actualmente conhecido o Megavirus)

Descoberto em Acanthamoeba polyphaga em Inglaterra.

o maior vrus de DNA conhecido (era!)

- cpside isosahdrica
- genoma com 1,2 Mbp
- cerca de 1262 genes (previstos)
- cerca de 2,5x mais genes que o menor procariota conhecido.

Numerosos genes nunca anteriormente descritos em vrus:

- envolvidos na sntese de nucletidos e reparao do DNA;
- envolvidos na traduo de protenas e vias enzimticas;
- 3 topoisomerases, que s foram descritas em bactrias e leveduras;
- possui genes responsveis pelo metabolismo de aucares, lpidos, aminocidos, e

produo de sintetizadores de tRNA;

- tem capacidade de produzir protenas pelos seus prprios meios e a capacidade de
reparao do seu prprio genoma.

Todas as caractersticas parecem negar o dogma: os vrus so completamente dependentes

do seu hospedeiro para a sntese de macromolculas.

Mas , indiscutivelmente, um vrus:

- clssica simetria viral icosahdrica;
- no sofre diviso mas montagem de subunidades pr-formadas.

Embora possua numerosos genes ligados traduo de protenas:

- no possuem aparelho de traduo (ribossomas).

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Aparecimento de novos vrus

H 3 componentes principais no aparecimento de novos vrus:

A) Mutaes de doenas existentes:

- vrus de RNA tm altas taxas de mutaes (a polimerase no tem proof-reading);
- os indivduos podem no ter imunidade a novas estirpes (vrus da gripe).

B) Disseminao a partir de diferentes espcies de hospedeiros:

- Surto de vrus Hanta em 1993 passou de roedores para humanos;
- Resultou de populaes muito grandes de roedores.

C) Disseminao de vrus de uma populao isolada:

- viagens internacionais e turismo;
- SIDA.

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2. Genomas Procariotas
Cromossomas:

Lineares

Circulares

Agrobacterium: 1 cromossoma linear e 1 cromossoma circular

Outros elementos genticos

Plasmdeos

Cromdeos

Sequncias de insero

Transposes

Integres e cassetes gnicas

Elementos ISCR

Nota: Alguns elementos mveis no so exclusivos dos procariotas

Cromossomas
O que diferencia os cromossomas dos plasmdeos?

Presena de genes essenciais sobrevivncia em todas as situaes

Ex: genes de rRNA

H 2 grandes problemas quanto ao tamanho

1. Arrumar o DNA dentro da clula

2. Diviso celular
a. Replicao do DNA
b. Segregao dos cromossomas filhos

Cromossoma circular / nucleide

Ocupam 1/3 da clula

Tm ncleo:
o Est muito organizado
o Compactado: Associao do DNA (carga -) com protenas (carga +)
o Protenas bsicas ricas em lisina e arginina
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Podem possuir mais do que um cromossoma (chegam a ter 3);

Pode ser linear ou circular;

comum a transferncia horizontal.

Por vezes usado o termo genforo para o material gentico dos procariotas e vrus, nos
eucariotas cromossoma.

A maior parte possui apenas um cromossoma, e circular;

A estrutura do DNA primria (sequncia nucleotdica), secundria (dupla hlice) e

terciria (enrolamento do DNA);

O superenrolamento s ocorre quando a molcula est sujeita a tenso;

A maioria do DNA enrolado negativamente (ocupa menos espao e facilita a separao

das duas cadeias na replicao e transcrio).

Cromossoma circular/nucleide
- ~1/3 da clula
- Sem ncleo

Como que o cromossoma cabe na clula?

Compactao do DNA
- Bactrias com protenas;
- Arqueas com histonas.

Bactrias

Cromossoma circular/nucleide
- Na realidade, est muito organizado
- Compactado : associao do DNA (-) com protenas (+)
- protenas bsicas ricas em lisina e arginina
- Compactao devida a neutralizao de cargas e superenrolamento negativo
- Actuam 2 enzimas: DNA girase (topoisomerase tipo II) e DNA topoisomerase I
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E.Coli
- Possui a protena HU (heterodmero): Hu- e HU-
- Apresenta semelhana com as histonas (mas sem homologia);
- Trabalha com a topoisomerase I para ligar o DNA e provocar dobras acentuadas no
cromossoma (induzem o enrolamento negativo)
- outras protenas (IHF) podem ligar-se a zonas especficas e acentuar dobras
- O DNA dobrado assume conformaes diversas que superenrolam ao redor de tetrmeros
da protena HU, semelhana do que acontece com nos eucariotas com as histonas.

Arqueas

- Histonas dos membros mesoflicos, termofilicos e hipertermoflicos dos Eucaryarcheamoto

- Tm em comum sequncias primrias; dobras das histonas; estruturas tercirias e formao de
dmeros. Semelhana s histonas H2A, H2B, H3 e H4 que constituem o cerne dos nucleossomas
eucariotas.

Desta forma resolvem o problema de possurem uma grande molcula de

DNA numa clulas pequena.

Os eucariotas possuem as mesmas histonas e enrolamento em nucleossomas. Assim,

presumivelmente evoluram de um ancestral comum.

A resoluo de vrios problemas possivelmente resultou nas protenas de replicao do

DNA, outras protenas e factores de iniciao da transcrio conservados nos eucariotas e
arqueas, mas no encontrados nas bactrias. De facto, as bactrias no foram sujeitas aos
mesmos ambientes que as arqueas (normalmente extremfilas), facto que deve ter levado a
que as arqueas adquirissem caractersticas distintas das bactrias. Assim, a ausncia de
histonas e outros factores de iniciao da transcrio em bactrias pode ser explicado por
divergncia das linhagens bacterianas e arqueanas antes da coevoluo desses sistemas.

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Gentica Microbiana

Contudo,
No explica o porqu de existirem arqueas (Crenarchaeota) sem histonas, mas com
factores de iniciao:
- Ou o sistema de compactao e os factores de iniciaoo evoluram separadamente;
- Ou as histonas foram perdidas e substitudas por protenas de ligao ao DNA no
estruturalmente relacionadas que existem em Crenarchaeota (arquea).

De facto, este assunto no assim to linear. Os dinoflagelados (eucariotas)no tem

histonas, tem factores de iniciao e protenas semelhantes s de bactrias.

Quantos cromossomas surgem nestes genomas?

- Geralmente 1 ou 2 e, mais raramente 3;
- Geralmente circulares, mas tambm aparecem lineares. A. tumefaciens tem 1 cromossoma
circular e 1 linear, alm disso a estirpe natural possui dois plasmdeos.

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Plasmdeos
- DNA extra cromossmico auto-replicativo
- Papel importante na adaptao e sobretudo na evoluo de bactrias;
- Elementos genticos que se podem replicar seja como plasmdeos, seja como parte do
cromossoma bacteriano e epissomas (plasmdeos capazes ou de se replicar livremente ou de se
integrar aos cromossomas bacterianos. O factor F comporta-se como epissoma);
- Nmero de cpias (1-50) e tamanho (1-1000kb) variveis;
- Maioria circular, mas tambm so conhecidos plasmdeos lineares;
- So caracterizados por no possurem genes essenciais (a clula consegue sobreviver na
ausncia deles) e possuem sistemas de replicao prprios, distintos do cromossoma bacteriano;
- Podem ser conjugativos ou no conjugativos;
- Possuem genes de defesa e resistncia a antibiticos;
- So um papel importante na adaptao e evoluo das bactrias.

Plasmdeos Circulares e Lineares

Alguns plasmdeos so crpticos (sem fentipo conhecido) mas conhecem-se vrios tipos:

Circulares:
Fertilidade
Resistncia
Cilianrgico (atacam cl. vizinhas)
Degradativo
Virulncia
Clonagem
Simbiose

Lineares:
Fertilidade
Resistncia
Degradativo
Virulncia
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Cromdeos

Para alm do cromossoma principal, 1 em cada 10 genomas bacterianos, possu um

segundo cromossoma ou megaplasmdeo. Este cromossoma possui caractersticas
diferentes do cromossoma principal.
Alguns autores, consideram-nos uma classe simples de elementos com um consistente
conjunto de propriedades.
Um segundo replico, que possua genes essenciais, foi descoberto h 20 anos, em
Rhodobacter sphaeroides.
Este replico foi designado por segundo cromossoma.
Possua genes essenciais para o crescimento e sobrevivncia das bactrias.
O mecanismo de replicao e as origens de replicao so semelhantes aos
plasmdeos.

Desta forma, podemos definir uma cromdeo como um elemento gentico que possui genes
essenciais como o cromossoma principal, e origens de replicao semelhantes aos
plasmdeos.

Harrison et al. (2010)

Os cromdeos esto amplamente distribudos pelo domnio Bacteria e podem ser definidos
por um conjunto de caractersticas em comum:

I.

Os cromdeos tm um sistema de replicao e manuteno semelhantes aos plasmdeos.

II.

Os cromdeos so replices que tm uma composio nucleotdica semelhante dos

cromossomas.

III.

Os cromdeos possuem genes essenciais que so encontrados no cromossoma de outras

bactrias.

25

Gentica Microbiana

Tabela de comparao entre cromossomas, cromdeos e plasmdeos

Tamanho

Cromossomas

Cromdeos

Plasmdeos

Sempre os maiores

Os maiores replices

Os replices mais

replices

secundrios

pequenos

Normalmente dentro de

Contedo G+C

Varia

1% de diferena do
cromossoma

Menos (>1%) que os

cromossomas

Sistemas de
Manuteno e

Tipo-cromossoma

Tipo plasmdeo

Tipo plasmdeo

Replicao
280 universais, 75

Genes principais

unicamente dos
cromossomas

Distribuio

Ampla conservao dos

Filogentica dos

genes e sintenia entre

genes

gneros

Alguns genes
principais, nenhum
unicamente universal e
nenhum nico

Poucos genes
partilhados a qualquer
nvel filogentico

Conservao dos genes

e sintenias partilhadas

Genes especficos de

apenas dentro dos

espcies e estirpes

gneros

Importante: % G-C semelhante entre cromossomas e cromdeos, mas diferente nos plasmdeos.

Formao
- Pensa-se que tenham sido originados a partir de plasmdeos aps a aquisio de genes essenciais,
com a perda simultnea ou subsequente de cpias originais;
- A consequncia da aquisio dos genes principais por parte...

Vantagem Evolutiva
I.

Um cromdeo iria permitir que uma bactria tivesse um genoma maior, mantendo um
cromossoma pequeno permitiria que esta se replicasse mais rapidamente e de forma
mais eficaz (aumenta a eficincia de replicao).
26

Gentica Microbiana

II.

Os genes dos cromdeos so coordenadamente regulados, quando a clula se adapta a

um papel especial (ex: mudana de ambiente).

Genomas de Agrobacterium

Slater et al. (2009)

Os 3 genomas mostram arquitecturas genmicas distintas:

C58 e S4
- Possuem 2 verdadeiros cromossomas *
- C58 possui 1 cromossoma circular e 1 cromossoma linear (A. tumefaciens)
- S4 possui 2 cromossomas circulares

K84
- Possui 1 cromossoma verdadeiro *
- Possui 1 segundo replico com 2.65 Mbp
- Possui 3 palsmdeos (pAgK84, pAgK84b, pAtK84c)

(*) Um replico contm operes de rRNA e genes essenciais para o crescimento prototrfico.

Foi ento descoberto, que em C58 e S4, um dos dois cromossomas tem uma origem de
replicao semelhante dos plasmdeos, tratando-se por isso de um cromdeo.
C58 possui 1 cromossoma, um cromdeo (com tamanho e % de G/C semelhante) e 2
plasmdeos (com diferena de mais de 1% de G/C com os anteriores);
S4 possui 5 plasmdeos, para alm de 1 cromosoma e 1 plasmdeo.

27

Gentica Microbiana

Sequncias de insero

Segmentos discretos de DNA

Geralmente variando entre 1 e 1,5 Kb

Podem transpor directamente para novos locais do genoma

So muito simples: codificam apenas as protenas necessrias sua mobilidade

Possuem:
- Um gene, codifica a transposase, que cataliza a transposio.
- Uma pequena repetio invertida (IR) em cada extremidade.
- As sequncias IRL(left) e IRR(right) de cada IS so similares, mas no idnticas
- As IR podem variar de 9 a 41 bp, so caractersticas de cada IS e necessrias para a
transposio.

Mecanismo de Transposio
A transposase reconhece as repeties invertidas do alvo, corta o DNA onde est e
no DNA alvo;

D-se o movimento da IS para o novo local;

A DNA polimerase preenche os espaos e ligase une as extremidades;
A transposio da IS conduz duplicao da pequena sequncia do DNA alvo;
O tamanho da duplicao depende da IS e normalmente tem um tamanho que varia
entre 9 e 13 bp.

O genoma da E.coli rico em IS.

Muitas das IS codificam uma transposase que possu um tripleto conservado de a.a: Asp,
Asp e Glu.

28

Gentica Microbiana

Algumas IS, codificam enzimas ligadas recombinase serina e trionina stio-especfica, ou

replicase do crculo rolante.

Conhecem-se pelo menos 19 famlias diferentes de IS nos genomas procariticos.

As sequncias de insero esto presentes nos cromossomas de numerosas bactrias,
contudo nenhuma IS foi encontrada em genomas sequenciados (ex. Bacillus subtillis).

Em algumas bactrias, muitas IS so encontradas com elevado nmero de cpias.

Bordetella pertussis 261 cpias de diferentes IS
Bordetella parapertussis 112 cpias de diferentes IS
Yersinia pestis 140 IS completas e parciais (3,7 % do genoma)

29

Gentica Microbiana

Transposes

Basicamente so IS que possuem genes adicionais. Os transposes so, por isso, maiores
que as IS.

Contm genes que codificam protenas necessrias para a transposio e outras funes.

Contm nas extremidades repeties invertidas (IR)

Flanqueados por repeties directas flanqueadoras (ou duplicaes de stio alvo).

Podem conter genes de resistncia a antibiticos.

Capacidade de mobilizao entre cromossomas/plasmdeos da mesma clula e entre clulas

distintas (por conjugao bacteriana ou transformao natural).

Podem ser transposes simples ou compostos.

Transposes simples: Tm uma estrutura similar as IS, mas com genes adicionais. Ex: Tn3

Transposes compostos: Os genes detectados fenotipicamente so flanqueados por 2 cpias de

IS. Ex: Tn10

Alguns Transposes Conjugativos (CTn)

- Importante grupo de transposes
- Tm capacidade de se mobilizarem
- Alguns so classificados como elementos conjugativos e integrativos (ICEs)

30

Gentica Microbiana

- ICEs
Grupo hetergeneo de elementos genticos mveis auto-transmissveis com capacidade para:

- Se mobilizarem como plasmdeos conjugativos

- Se integrarem no cromossoma hospedeiro como um fago lisognico
- Muitos possuem genes de resistncia a antibiticos ou metais pesados
- Outros possuem genes de reparao do DNA
- Promovem plasticidade
- Principal contribuio para (...)

Genes de resistncia nos plasmdeos

- Localizam-se frequentemente em transposes
- Podem ser transferidos entre bactrias pelos plasmdeos
- Podem saltar para plasmdeos de diferentes gamas de hospedeiros

Plasmdeos Multirresistentes a antibiticos

Transposio
- O movimento dos elementos mveis mediado pele transposase
- A integrao gera sempre uma duplicao no DNA alvo denominada de duplicao de stio alvo.
- A transposio pode ser replicativa ou conservativa
Transposio Replicativa gerada uma nova cpia do elemento mvel; h um aumento
do n de cpias; tambm denominada de copy-and-paste.
Transposio Conservativa No h replicao, apenas corte e colagem noutro local; no
h aumento do n de cpias (mas h sempre duplicao de stio alvo); tambm denominada
de cut-and-paste.

31

Gentica Microbiana

A Transposio o processo pelo qual um gene muda de local no genoma, gerando

variabilidade gentica entre os diferentes organismos. Alm disso:
restrita a genes ligados aos elementos transponveis em bactrias: IS, Transposes e
alguns vrus especiais (fago Mu - mutator);
Se o local de insero for no interior de um gene, resulta na perda da funo (mutagnese
por transposio)
essencialmente um mecanismo de recombinao, mas que no (...)
uma recombinao stio especfica e no recombinaoo homloga (dependente de
protenas RecA).

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Gentica Microbiana

Integres e Cassetes Gnicas

Sistema de captura de genes, que utilizam a recombinao stio-especfica, no envolvendo a

transposase e independente de recombinase.

Consiste num sistema espcializado de recombinao basicamente constitudo por um gene int
e um local attI.

Gene int codifica uma enzima de recombinao stio-especfica, a integrasse

Local attI o local de recombinao no integro
Ambos localizados no integro, e que so essenciais para que haja a integrao da cassete
gnica.

5`CS e 3`CS Regies terminais invariveis, chamadas sequncias constantes

5`CS Acomoda o gene int, o local de insero attl, e o promotor a partir do qual os genes da
cassete so expressos.
3`CS Acomoda o gene ou genes das cassetes a inserir.

Cassete Gnica
- Sequncia pequena dsDNA circular autnomo no replicativo, originada durante o processo
de movimento de um integro para outro, ou no seu interior.
- Possuem um gene sem promotor, e o local de reconhecimento Attc.
- Apenas quando inserido no integro que o gene da cassete se torna funcional.

33

Gentica Microbiana

- Constituem estados intermdios, existentes durante a movimentao. As cassetes entram e

saem do integro.
- Normalmente no esto soltas, mas sim integradas no integro. Quando a cassete est solta,
o gene de resistncia no se expressa, pois no tem promotor.
Attc Sequncias de insero da cassete gnica, localizada a jusante do gene. tambm chamado
de elemento base 59, embora o seu tamanho possa variar substancialmente.

Insero das cassetes gnicas:

- As cassetes podem ser inseridas, uma aps outra, no local attl. Cada insero regenera o local attl
(a insero sempre no attI);
- A cassete sempre integrada junto ao local de insero attI. No mesmo integro podem integrar-se
vrias cassetes gnicas.

- sempre removido a 1 cassete que foi inserida (Cassete que est na extremidade). Na imagem, a
1 cassete a ser integrada a que contm o gene 2. Esta cassete ser tambm a 1 a ser
removida.

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Gentica Microbiana

Classificao dos integres

No h concordncia entre os autores.
Classificados segundo:
- Similaridades nas sequncias dos genes intI classes 1,2,3, SXT ICE e pRSV1;
- Grupo taxonmico ao qual os seus hospedeiros pertencem (ex: Xanthomonas,
Vibrio ou Pseudomonas).
*Ambas as abordagens apresentam srias limitaes.

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Gentica Microbiana

Elementos ISCR

Sistema de recombinao que contribui para a montagem de bancos de genes de resistncia

nas bactrias.

Segundo Toleman et al. (2006) so pequenas sequncias crpticas (no possuem fentipo
conhecido; fentipo que os distinga), de tamanho similar ao de muitas IS.

Previu-se que transpusessem, como as IS, da a designao.

O movimento ocorre por Crculo rolante, que une a replicao por crculo rolante
recombinao

Transposio

Inicialmente detectados com IS associadas, mas distntas dos integres de classe I.

Como a mesma sequncia era encontrada frequentemente, ficou conhecida como regio
comum (CR)

Mais tarde, verificou-se que a CR original, agora com outro nome (ISCR), comum ()

As ISCR no possuem repeties terminais invertidas, como os transposes e as IS.

No tm integrase (verificada em integes), mas tm transposase.

Possuem 2 sequncias terminais distintas com funes diferentes:

OriIS Origem de replicao RC

TerIS Terminador da replicao e sinal para a quebra do DNA. Mas, este terminador no
totalmente eficiente (a terminao no sempre eficaz).

As ISCR so notveis pela sua estreita associao com uma larga variedade de genes de
resistncia a antibiticos.

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Gentica Microbiana

Intres (Grupos I e II) Procariotas

Nas bactrias tambm existem intres (segmentos de DNA que so transcritos como parte de
RNA prematuro mas finalmente removidos, atravs da ligao das sequncias de exes que os
flanqueiam).
Nos procariotas tambm existem intres que possuem funo reguladora.
Nos procariotas ocorre tambm o processamento dos transcritos.
O que no se verifica, em procariotas, so as modificaes ps-traduo.

Intres grupos I e II

Normalmente no so mveis

Elementos genticos mveis raros (no possuem assim um papel normal)

Formam estruturas secundrias distintas

Grupo I ( 1 intro bacteriano identificado)

Intro do grupo I de autoprocessamento encontrado no gene timidilato sintase (td) do fago

T4

Encontrados em muitas espcies bacterianas, principalmente nos genes do tRNA.

Recentemente foi identificado um intro no gene reca de Bacillus anthracis

O tamanho dos intres (grupo I) varia de 200 a 3000 nt.

Os maiores frequentemente possuem ORFs (livres ou no)

Tm a capacidade de se espalhar atravs de uma populao de alelos hmologos sem

intres.
So marcas que ficam, que saltam!

Grupo II

Inicialmente identificados em organelos de plantas, fungos e outros eucariotas inferiores.

Mas tm sido encontrados em genomas bacterianos de diferentes linhagens:

- Intres do grupo II tambm podem apresentar ORFs;
- O tamanho dos intres (II) varia de 600 a 3000 nt.

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Gentica Microbiana

Profagos

Fases latentes dos bacterifagos (ciclo lisognico);

Constituem elementos genticos cromossmicos comuns;

Alguns (P1 e N15) so elementos extracromossmicos como os plasmdeos;

Podem constituir cerca de 20% do genoma bacteriano;

Maiores contribuintes para a diversidade das espcies:

- Genoma da estirpe E.coli 0157 sakai tem 18 profagos;
- Genoma da estirpe E.coli K-12 tem apenas 11 profagos;
- Genoma de S. euterica serovar TyphiCTK (salmonela) tem 7 profagos distintos (3.8% do
genoma).

Alguns dos genes fgicos provocam grandes alteraes fenotpicas no hospedeiro,

incluindo:
- variao antignica;
- ()
O primeiro factor fgico codificador de virulncia foi a toxina difteria. Desde ento, foram
descobertos mais fagos de virulncia;
Muitos dos factores de virulncia, codificados por fagos lisognicos, no so essenciais para a
replicao e crescimento do fago, mas aumentam o fitness da bactria;
O local de integrao de muitos profagos j foi caracterizado. Muitos profagos so integrados
nos genes rRNA;
- O fago lambda s tem um local de integrao, sendo por isso responsvel por transduo
especializada.
Frequentemente, o local attl do fago reconstitui o gene, para produzir um tRNA normal.

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Gentica Microbiana

Ilhas de Patogenicidade (Pathogenicity Islands - PAIs)

As PAIs caracterizam-se por codificarem factores de virulncia. Alm disso, os PAIs so
exclusivamente encontrados em estirpes patognicas.

Factores de virulncia de bactrias patognicas codificados por PAIs:

- Adesinas (Factores de aderncia)
- Toxinas
- Invasivas
- Sistemas de secreo (tipo III e Tipo IV)
- Sistemas de tomada (update) de ferro
- etc

Agrobacterium tumefacis

e Helicobacter pylori transferncia de material gentico (secrees tipo IV)

unidireccionalmente.

Existem bactrias no patognicas que tambm possuem elementos DNA estranho que lhes
confere vantagem, semelhantes s PAIs so denominadas de Ilhas Genmicas (GEIS)
PAIs e GEIs Adquiridas durante a evoluo.

As ilhas de patogenicidade (PAIs) so um subtipo de ilhas genmicas (GEIs);

Dependendo dos genes que se encontram na ilha, podemos ter vrios tipos de ilhas genmicas:
- Patogenicidade
- Simbiose
- Metablicas
- Resistncia
- Fitness
As PAIS e GEIS so elementos muito mveis. Sendo por isso uma preocupao a nvel da
patogenicidade criao de estirpes patognicas.

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Gentica Microbiana

Ilhas de patogenicidade constituem segmentos de DNA inseridos no cromossomo

bacteriano,

que

atribuem

uma

variedade

de

caracteristicas

de

virulncia

aos

microorganismos que a possuem. Dentre as propriedades conferidas pelas PAIs destacam-se

a capacidade de aderir e invadir o epitlio da clula hospedeira, produzir toxinas, captar
ferro do meio ambiente e sintetizar o sitema de secreo tipo III, dispositivo molecular que
permitem a translocao de molculas efetoras para o interior da clula hospedeira. A
capacidade de adquirir propriedades patognicas em um unico evento gentico permite a
evoluo, bem como o surgimento de microorganismos patognicos.

As caractersticas das PAIs e GEIs, nomeadamente o nvel da % GC (diferente do genoma),

a presena de integrase e a instabilidade genmica, sugerem a sua aquisio por
transferncia horizontal de genes. Assim, os genes transferidos podem ser identificados
atravs de caractersticas distintas do genoma, como a % em GC.

Alguns GEIS so capazes de:

- Se integrar no cromossoma do hospedeiro, rearranjar, excisar e transferir para outro local do
genoma ou para um novo hospedeiro atravs de transformao, conjugao e transduo.

Recombinao stio-especfica
(integrao)

Rearranjar

Exciso
(sada do genoma)

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Gentica Microbiana

Evoluo das PAIs

A aquisio da PAI envolve cinco passos, os quais esto representados na figura seguinte:
1) aquisio dos genes de virulncia por transferncia horizontal;
2) integrao do DNA externo no genoma (ou plasmdeo) hospedeiro por recombinao
stio especfica mediada por uma integrase ou recombinase ou outros mecanismos. Este evento pode
ocorrer mltiplas vezes, envolvendo genes de diferentes organismos e resultando em uma ilha com
estrutura de mosaico;
3) o elemento gentico mvel pode promover rearranjos genticos tais como perda ou
aquisio de genes;
4) expresso dos genes adquiridos e contribuio para o desempenho bacteriano (por
exemplo, patogenicidade), o que favorece a seleo positiva destas variantes;
5) recombinaes consecutivas e eventos de exciso e insero resultando em perda ou
ganho de informaes genticas.

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Gentica Microbiana

Ilhas de patogenicidade - PAIs

Possuem:
- Sequencias directas flanqueadoras
- Gene de virulncia
- Integrase
- Genes de mobilidade
- locais de ligao DR usadas na integrao e exciso

Inserem-se em genes de tRNA, inserindo-se assim em regies especficas no genoma.

Uma caracterstica interessante encontrada nas PAIs a presena de fagos temperados

(possuem ciclo lisognico, no so fagos virulentos que causam lise), sequncias de
insero e integrases (elementos envolvidos na mobilidade gentica) nas extremidades da
ilha, indicando a presena de hot spots (pontos quentes), e significando um local no
genoma onde a insero ou deleo facilitada. Essa caracterstica tambm fornece pistas
de que a transferncia horizontal de grandes fragmentos de DNA seja, provavelmente, a
explicao para a aquisio de novos fatores de virulncia pelas bactria

Foram identificadas em estirpes patognicas de E.coli em humanos.

Recentemente foram encontrados nos genomas de agentes patognicos de humanos, animais
e plantas.
PAIs variam de cerca de 10 a 200 kb.

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Gentica Microbiana

Ilhas Genmicas - GEIs

Genes localizados em GEIs fazem parte do fundo gentico flexvel do genoma bacteriano.
Alguns so mveis, outros no. Alguns deixaram de ser mveis, pelo processo evolutivo.
Estas ilhas podem aumentar grandemente o fitness da bactria e desta forma so foras
condutoras da evoluo bacteriana.

Existem variadas GEIs, e podem conter genes para:

- Adaptao ambiental (ilhas ecolgicas);
- Sobrevivncia simbitica (ilhas simbiticas);
- Vida parastica PAIs (ilhas patogenicidade);
- Ilhas metablicas;
- Ilhas de resistncia;
- Ilhas Fitness;
- etc.

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Gentica Microbiana

Small RNA (sRNA)

At sequenciao da E.coli, s se conheciam 10 sRNA;
Actualmente conhecem-se mais 50 novos sRNA, atravs da sequenciao do genoma de
E.coli e de outras bactrias;
Os genes sRNA no esto, geralmente, bem conservados entre espcies distantes
relacionadas;
50% dos genes de sRNA tm entre 50 a 250 nt de comprimento
Apenas um pequeno nmero de novos sRNA ()

Em E.coli, os sRNAs esto envolvidos na regulao de numerosos processos celulares:

- Armazenamento e utilizao de carbono
- Resposta limitao do ferro
- Resposta ao stress oxidativo
- Transio para o estado estacionrio
- Resposta a condies acdicas
- Expresso de protenas de membrana (omp)

A prevalncia de genes de siRNA em bactrias que no E. coli no conhecida.

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Gentica Microbiana

3. Genomas Eucariotas
Saccharomyces cerevisiae: um sistema modelo para estudos
genticos complexos

S. cerevisae modelo para estudos genticos complexos; levedura com todos os genes anotados.

Elementos Genticos de S.cerevisae:

- 16 cromossomas lineares, contendo retrotransposes
- Plasmdeo circular (2 m)
- DNA mitocondrial
- dsRNA viral
- ssRNA circular
- pries
Os cromossomas variam entre 220-3060 kb (no so grandes). Assim, em condies
adequadas possvel separar os cromossomas atravs de electroforese de campo pulsado;
Desta forma, providenciam a definio de caritipos electroforticos das estirpes, atravs do
tamanho dos cromossomas.
Os ges podem ser utilizados para anlises subsequentes, como por exemplo Southern Blot.

Evoluo do Genoma
- Atravs de duplicaes de grandes fragmentos cromossmicos;
- 53 grupos de genes duplicados entre os 16 cromossomas (apenas se consideram os maiores
grupos, no se considerando, por exemplo, os elementos transponveis e pequenos blocos que se
encontram duplicados entre os cromossomas).

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Gentica Microbiana

Genoma Nuclear de S. cerevisae

- 75% do genoma transcrito em RNA

- H cerca de 6000 genes: 5885 potenciais genes codificantes de protenas; 40 genes de snRNA;
274 genes de tRNA genes, 80 com intres
- Sequncia repetitivas: 100-200 cpias de rDNA (repeties directas de 9.1kb) no cromossoma XII

Plasmdeo 2m

- Plasmdeo circular com 6 kb, presente em muitas estirpes

- Codifica um sistema especializado de recombinao: recombinase FLP. A funo deste sistema
manter o n de cpias de plasmdeo a um n elevado.
- Contm 2 regies, com cerca 599 ()

DNA mitocondrial

- Representa cerca de 70-76 kb do genoma

Vrus em S. cerevisae

- Quase todas as estirpes contm vrus de dsRNA (constitui cerca de 0,1% do total de cidos
Nucleicos)

Outro RNA em S. cerevisae

- Tem tambm ssRNA circular 20s. Parece codificar uma RNA polimerase RNA dependente;
- Possui replicao independente (herana no mendeliana)

Genoma de S. cerevisae Ps sequenciao

- 16 cromossomas separados
- DNA cromossmico com 12052 kb
- 6183 ORFs
- 3,8% das ORFs contm intres
- os genes foram agrupados em categorias funcionais
46

Gentica Microbiana

Genes agrupados por categorias funcionais:

- Organizao celular e biognese - 28%
- Metabolismo - 17%
- Produo de energia - 3%
- Transcrio - 10%
- Sntese proteica 5%
- Transcrio 10%
- etc.

Importncia das leveduras para estudos:

Permitem o estudo fundamental, nomeadamente a nvel de ciclo celular (cancro).
Organismo importante para o estudo de pries. Leveduras produzem elementos prinicos.
Os pries so muito difceis de estudar, assim as leveduras apresentam-se como o organismo
modelo para o seu estudo;
Possui um sistema de transformao muito verstil.
Pries nico elemento, at data, que no se replica via material gentico. So protenas
infecciosas.
Em termos de cultura possui as mesmas vantagens moleculares que os vrus e
procariotas: crescimento rpido; crescimento em meios de cultura definidos; fcil
plaqueamento de rplicas e isolamento de mutantes; vivel em numerosos marcadores
moleculares;
no patognico, facilitando o manuseamento;
sistema e mtodo gentica/bioqumica bem conhecido;

As leveduras so um sistema modelo para estudos genticos complexos: alm de possuir um

sistema de transformao de DNA muito verstil, a S.C. possui cerca de 6000 genes
anotados (sequenciao completa em 1996) em que 182 dos genes tem similaridades com
genes de doenas humanas, nomeadamente genes crticos de patologias neoplsicas
(tumores).

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Gentica Microbiana

Genoma de leveduras
Genoma diploide

DNA

Cromossomas

Plasmdeo 2um

85

10

...

N de cpias

2x16

60-100

~50 (8-130)

...

Mutantes

Todos os tipos

Nenhum

Cyt a, a3, b

...

mitocrondrial

dsRNA

Quantidade
relativa (%)

48

Gentica Microbiana

Transferncias Naturais de Genes em Procariotas

Fontes de variabilidade gentica em Archea e Bacteria
A obteno de novos gentipos pode ocorrer por vrias vias:
- Mutao
- Transposio
- Conjugao
- Transformao

Mecanismos de Transferncia de

- Transduo

material gentico

Dentro dos mecanismos anteriores importantes na transferncia de material gentico, a

transduo um mecanismo de baixa expresso (no to importante), ao passo que a
transformao considerado o mecanismo de maior importncia a nvel da transferncia
horizontal de genes, ou seja, como fonte de variabilidade gentica.
A conjugao mais frequente numas bactrias que noutras;
a transformao ocorre em poucas bactrias, mas tcnicas de laboratrio aumentam
a taxa de DNA captado;
Os bacterifagos tem uma gama restrita de hospedeiros.

Mecanismos de Transferncia Natural vias pelas quais o DNA bacteriano pode ser
transferido de clula para clula

Transformao Transferncia de parte do genoma, por tomada de DNA do meio exterior. O

DNA exterior tem origem no colapso de bactrias, assim, no um mecanismo espontneo. A
presena do DNA leva formao de poros (pillus) nas bactrias para poder entrar para o
interior da bactria.
Conjugao Pode ser transferncia de plasmdeos, ou transferncia parcial do genoma.
Envolve sempre o contacto entre 2 bactrias (contacto fsico). Quando se trata de plasmdeos, no
final da conjugao ambas as bactrias so dadoras.
Transduo Transferncia como parte integrante do genoma viral. Utilizao de um fago
como veculo de transferncia.
49

Gentica Microbiana

Caractersticas comum aos 3 mecanismos de transferncia natural de genes:

- Transferncia unidirecional de material gentico;
- O Material gentico incorporado na clula na forma de ssDNA.

Tanto as bactrias como as archaeas apresentam estes 3 mecanismos de transferncia de

genes:

A conjugao mais frequente numas bactrias que noutras;

A transformao ocorre em poucas bactrias, mas tcnicas de laboratrio

aumentam a taxa de DNA captado;

Os bacterifagos tem uma gama restrita de hospedeiros.

Estes processos de toca gentica diferem da reproduo sexual em diploides eucariotas em

duas questes:
1) Troca de DNA e reproduo no so coupled;
2) O material gentico doado que no recombinado degradado e a clula
receptora mantm-se haploide.
Estes 3 mecanismos de transferncia podem ser usados para mapear genes.

50

Gentica Microbiana

Transformao
Uma bactria sofre lise, e o material gentico fica disperso no exterior.
Esse DNA do meio exterior transferido unidireccionalmente, para uma clula bacteriana
(clula receptora).

Origina alteraes fenotpicas no receptor, que se designa por transformante.

Apenas algumas bactrias podem captar fragmentos de DNA do meio externo. A fonte de DNA
podem ser outras clulas da mesma espcie ou clulas de outras espcies.
A fonte de DNA pode ser resultado da morte de bactrias (lise) ou por secreo de clulas vivas.

Transformao Natural
- As bactrias variam na capacidade de tomar DNA eficientemente.
- H bactrias que so naturalmente transformveis, apresentando competncia natural (ex.
Bacillus subtillis, Steptococcus pneumoniae)
- As bactrias podem ser electroporadas ou tratadas quimicamente, para se tornarem mais
permeveis (facilmente transformveis).
Experincias de Griffith (1928) Descobriu a transformao natural atravs de experincias em
camundongo (rato). Enunciou a existncia de um princpio transformador.
Experincias de Avery, Macleod e McCarty (1994) Demonstrou que o princpio transformador
era o DNA.
Nota: O DNA transformante incorporado no cromossoma bacteriano por um processo anlogo da produo de
exconjugantes recombinantes nos cruzamentos Hfr X F-.

51

Gentica Microbiana

Natural vs Artificial
Natural

Artificial

- Apenas tomado um segmento de cadeia simples;

- Bactrias foradas a tomar segmentos de cadeia dupla,

- Apenas algumas estirpes bacterianas possuem aparelho

plasmdeos, atravs de choques trmicos, elctricos

para a tomada (ex. formao do poro);

(electroporao) e salinos (tratamento com Ca2+);

- Aparelho: protenas de membrana que se ligam e trazem

- Introduo de DNA de grandes dimenses e de cadeia

DNA para o citoplasma;

dupla (dsDNA);

- Nalguns casos, ocorre apenas durante uma pequena fase

- necessrio tornar a bactria competente.

da curva de crescimento;

* Mudanas em laboratrio para utilizao de M.O.: Estirpes de E.coli so modificadas para que no sejam capazes de
conjugao; compram-se kits em que as bactrias so competentes para a transformao; pode tornar-se as bactrias
competentes em laboratrio (aps tratamento com frio ou tratamento qumico so rapidamente congeladas em azoto
lquido para no voltarem ao estsdo inicial os tratamento so realizados para criar instabilidade membranar de modo a
que se criem buracos para a entrada de DNA).

Passos Gerais da Transformao Natural

1. Ligao de dsDNA superfcie externa da bactria;
2. Movimento do DNA ao longo da parede celular e membrana bacteriana;
3. Degradao de uma das cadeias de DNA;
4. Translocao do ssDNA restante para o citoplasma, atravs da membrana interna;
5. Integrao estvel do ssDNA translocado no cromossoma receptor por recombinao
homloga.

*Uma das cadeias de dsDNA degradada.

Apenas entra ssDNA.
* A recombinaoo homloga em bactrias
envolve sempre um crossing-over duplo.

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Gentica Microbiana

Competncia nas bactrias Gram +

Sistemas melhores estudados: B. subtillis e S. pneumoniae. So naturalmente competentes
para a transformao. Contudo, B. subtillis tem perdido reputao porque mais fcil retirar os
genes da conjugao da E.coli e torna-la competente para a transformao. Alm disso, como
competente para a transformao facilmente toma DNA do exterior, o que no bom em
laboratrio.

As protenas envolvidas na transformao foram identificadas pelo isolamento de mutantes

deficientes para a tomada de DNA: genes com (competncia)
B. subtillis possui vrios genes com que se encontram organizados em operes.
Os genes com esto organizados em operes .
So sistemas muito bem regulados assim como existe uma grande quantidade de genes
envolvidos (protenas com).

A transformao natural geneticamente determinada!

Transformao de B. subtillis

- Uma cadeia de DNA penetra na clula enquanto a outra degradada

- Formao de uma cadeia tripla;
- Recombinao (deslocao da cadeia por duplo crossing-over);
- Formao de um cromossoma com segmento a/a+;
- Aps replicao, a descendncia ser metade no transformante (aa) e outra metade transformante
(a+a+)

Competncia nas bactrias Gram

A tomada de DNA do exterior difere (mas pouco) entre Gram+ e Gram-.
Existem Gram- que diferem das Gram+ e das restantes Gram-:
Helicobacter pilory

Necessitam de sequncias especficas para a ligao de DNA;

Apenas tomam DNA da respectiva espcie

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Gentica Microbiana

As bactrias Gram- utilizam 2 sistemas de tomada de DNA:

- protenas com similaridade estrutural s protenas usadas pelas Gram +;
- o outro utiliza protenas tipo IV (Helicobacter pilory)
So dois mecanismos distintos com 2 grupos proteicos distintos.

As protenas estruturalmente similares esto envolvidas em:

Tomada de DNA pelas bactrias Gram +

Tomada de DNA pelas bactrias Gram

Conjugao

Secreo de protenas

Mobilidade de saco: twitching (formao do pillus e retraco)

Termo PSTC:
Aplica-se a algumas das protenas devido ao seu envolvimento na formao do pillus,
secreo, twitching e competncia. As protenas PSTC permitem uma economia de genes, uma vez
que so flexveis ao nvel da funo.

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Gentica Microbiana

Conjugao
Transferncia de plasmdeo ou transferncia parcial do genoma durante a conjugao.
Transferncia de plasmdeos: a receptora pode funcionar como dadora.
Transferncia de cromossoma (Hfr): o receptor fica sempre receptor (s muito raramente
que no, como descrito adiante).

processo tipo sexual;

transferncia unidirecional;

contacto directo, dador e receptor;

os receptores so designados de transconjugantes;

o segmento de DNA dador recombina com o cromossoma bacteriano receptor.

Tero as bactrias qualquer processo similar reproduo sexual e recombinao??

- (...)
- (...)
- (...)
- Os receptores contendo DNA (...)

Experincia de Lederberg e Tatum (1946)

Demonstrao da recombinao em E.coli: Dois auxotrficos complementares do origem a

uma estirpe que sintetiza todos os nutrientes (prototrfica).

met- bio- thr- leu+ thi+

Mistura A e B

met+ bio+ thr+ leu- thi-

Sem colnia

Colnias prototrficas

Sem colnia

(met+ bio+ thr+ leu+ thi+)

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Gentica Microbiana

Argumentao: as clulas no trocariam

os genes, mas sim libertavam os
nutrientes para o meio e eram utilizados
pela outra estirpe.

Transconjugantes: descoberta da conjugao - possibilidade de alimentao cruzada em alternativa

a um cruzamento.

Experincia de Bernard Davis

Demonstrou que o contacto fsico era necessrio para a recombinao gnica.

Veio contrariar a teoria da alimentao cruzada (troca de lquidos/metabolitos entre
bactrias)

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Gentica Microbiana

Experincia: construiu-se um tubo em forma de U, que foi dividido por um filtro com poros,
formando dois compartimentos. Desta forma, apenas passava meio entre as duas estirpes e no
bactrias.

Aps incubao, procedeu-se ao plaqueamento e nenhuma colnia prototrfica se formou

em meio mnimo, logo necessrio o contacto entre as bactrias para se formarem clula
selvagens Conjugao.

A unio fsica das bactrias foi mais tarde confirmada ao microscpio electrnico.
O contacto entre bactria receptora e dadora conseguida atravs da pili sexual ou
feromonas ou aglutininas.

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Gentica Microbiana

Factor de fertilidade (F)

(William Hayes 1953)

A transferncia de genes em E.coli ocorria apenas numa direco:

- uma clula dadora;
- uma clula receptora.

Acidentalmente descobriu-se um dador variante que tinha perdido a capacidade de transferir

material gentico, passando a receptor.

Associando o dador variante, que tinha perdido a capacidade de transferir material gentico, com
outras estirpes dadoras conseguiu restaurar a sua capacidade dadora

Parecia existir um tipo de transmisso infecciosa de algum factor

A transferncia de genes seria mediada pelo factor sexual F ou factor de fertilidade F:

- estirpes com F: dadoras e designadas de F+
- estirpes sem F: so apenas receptoras e designadas de F-.

Em E.coli o factor de fertilidade designado de Plasmdeo F, contudo, noutras bactrias

existem outros factores, mas nominados diferentemente.

F um plasmdeo circular (100kb relativamente grande) com replicao autnoma;

Possui genes par a produo de pilina (F-pilli ou sex-pilli), constituinte do pilus sexual que
permite o contacto entre clulas;

Possui um oriT que a origem de transferncia usada na conjugao;

Possui RepF1A que contm oriS (replicao unidireccional) e ori V (replicao

bidireccional);

Possui RepF1B que ukm backup.

Possui duas cpias de IS3 e uma cpia de Tn1000 (so regies de homologia portteis para a
mobilizao cromossmica);

Possui traS (inibe a transferncia de DNA) e traT (inibe a formao do par conjugante) que
reduzem a transferncia de mltiplos F. Desta forma no h passagem de mltiplos F.

Em condies normais apenas existe um plasmdeo F na E.coli.

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Gentica Microbiana

Genes no plasmdeo F: genes do metabolismo do DNA durante a conjugao; genes de biognese

do pilus; genes para estabilizao das clulas conjugantes.

Viso geral conjugao

Envolve a formao de um canal citoplasmtico (tubo de conjugao);

Quando o plasmdeo F sofre uma quebra na origem, uma cadeia de ssDNA transferida e
replicada atravs do mecanismo crculo rolante;

Quando a transferncia est completa ambas as clulas so F+ com dsDNA.

As bactrias dadoras possuem plasmdeos autotransmissveis so plasmdeos de

fertilidade autnomos; possuem todos os genes envolvidos na transferncia (codificantes e
reguladores).
Os plasmdeos mobilizveis s se transmitem (mobilizam) se na clula existirem
plasmdeos autotransmissveis. So elementos em trans, funcionam em trans.

Em E.coli, o plasmdeo F o plasmdeo autotransmissvel e os mobilizveis so outros

plasmdeos que se servem da maquinaria do plasmdeo F.
O plasmdeo Ti tambm autotransmissvel.

As bactrias necessitam de sinalizao para a conjugao.

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Gentica Microbiana

Genes necessrios ocorrncia de conjugao

- genes tra: necessrios transferncia de genes.
- sistema Dtr (DNA transfere and replication): envolvido na preparao do DNA
plasmdico para a transferncia. Faz parte deste sistema a Relaxase, que quebra o DNA na
sequncia nic do oriT, e liga-se covalentemente ao DNA at a sua transferncia ara a clula
receptora estar concluda. A sequncia no oriT especfica de cada plasmdeo.
- sistema Mpf (Mating-pair formation): responsvel por manter as clulas em contacto,
pela formao do tubo de conjugao.

Como o processo genrico do processo de conjugao?

Apesar de semelhantes, possuem algumas variaes entre Gram+ e Gram-

Fases:
- Formao do par e cruzamento (duas bactrias);
- Sinais da protena-piloto para a Relaxase;
- Quebra numa cadeia na oriT e deslocaoo da cadeia;
- Separao do par de cruzamento;
- Final: obteno de um transconjugante

Plasmdeos mobilizveis
No so autotransmissveis mas podem ser transferidos se houver um autotransmissvel.
Este processo designa-se de mobilizao.

Os sistemas Mpf e Drt dos plasmdeos autotransmissveis podem actuar em trans no local oriT cisactuante do plasmdeo e mobiliz-lo.

Por razes histricas, os genes tra do sistema dtr dos plamdeos mobilizveis chamam-se genes mob
e a regio requerida para a mobilizao, regio mob.

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Gentica Microbiana

O processo de mobilizao de um plasmdeo mobilizvel idntico transferncia de um

plasmdeo autotransmissvel, excepto que o sistema Mpf funciona no seu sistema Dtr e no do
plasmdeo mobilizvel.

Cruzamentos tri-parentais:
1 contm o plasmdeo autotransmissvel (plasmdeo helper)
2 contm o plasmdeo a ser mobilizado
3 o eventual receptor
- Misturam-se as 3 estirpes e espera-se que o helper passe o autotransmissvel para a 2.
Posteriormente, o mobilizvel (que tambm est na 2) pode ser transmitido para a 3, uma vez que
faz uso da maquinaria do plasmdeo autotransmvel. A 3 selecionada atravs de meio selectivo.
Assim, s seleccionmos 3 que possuam o plasmdeo mobilizvel (o nosso plasmdeo de interesse).

Nenhum DNA cromossmico transferido pelo factor F padro. Contudo, por vezes ocorre
transferncia do DNA cromossmico, mas quando o factor F sofre integrao.

Formam-se estirpes Hfr: estirpes com elevada frequncia de recombinao. Replicam o factor F
como parte do seu cromossoma.

Integrao do factor F
O factor F mostrou integrar-se em 20 locais do cromossoma bacteriano de E.coli.

Integrao: IS e transposes podem ser usados como fontes de homologia para a

recombinao e consequente integrao do factor de fertilidade.
Dependendo da orientao das IS e transposes no cromossoma, a estirpe Hfr vai transferir
o DNA cromossmico no sentido horrio ou anti-horrio.

Integrao do factor F atravs de recombinao homloga entre elementos IS2 no plasmdeo e

cromossoma formando uma clula Hfr.

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Gentica Microbiana

O plasmdeo F codifica funes tra incluindo pili

Quebra nos oriT

Incio da transferncia

Replicao no dador acompanha a transferncia do ssDNA

Fragmento transferido sofre recombinao

A transferncia do DNA comea quando o factor F quebrado no oriT.

Na conjugao entre Hfr e clulas F-, o factor F integrado cortado, e a ponta 5 do
filamento cortado move-se para a clula F-, do mesmo modo que a conjugao entre clulas
F+ e F-. Como nas clulas Hfr o factor F est ligado ao cromossoma bacteriano, assim o
cromossoma acompanha-o para a clula receptora. O quanto do cromossoma bacteriano
transferido depende do tempo que as duas clulas permaneam em conjugao.
Uma vez dentro da clula receptora, o filamento de DNA dador replica-se (crculo rolante) e
o crossing-over com o cromossoma da clula F- pode ocorrer. Aps recombinao
homloga, o DNA degradado. Formao de exconjugantes recombinantes.
Num cruzamento de Hfr e F-, a clula F- quase nunca se torna F+ ou Hfr, porque o factor F
cortado a meio durante o incio da transferncia do filamento, colocando parte de F no
incio e parte no final do filamento a ser transferido. Para se tornar F+ ou Hfr, a clula
receptora teria de receber o factor F inteiro, necessitando que todo o cromossoma bacteriano
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Gentica Microbiana

fosse transferido. Este evento ocorre raramente, pois a maioria das clulas separa-se antes
que todo o cromossoma seja transferido.
Caso no ocorra recombinao homloga, a clula receptora permanece igual sem qualquer
recombinao e o DNA transferido degradado.

Exciso do factor F

ocorre espontaneamente a baixa frequncia;

quando numa clula Hfr se destaca o factor F;

alm do factor F tambm podem ser excisados genes bacterianos F ou F-prime;

quando transporta genes bacterianos, designado de Flac (p.e.)

as clulas F podem conjugar-se com clulas F-, desde que possuam o plasmdeo F com toda
a informao gentica necessria para a conjugao e a transferncia gentica.

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Gentica Microbiana

H outros plasmdeos que se transferem rapidamente por conjugao semelhana do factor

F de E.coli,
Ex: pK214 Lactococcus lactis entrou em contacto com bactrias que infectam o Homem, alm de
possurem resistncia a antibiticos (muito perigoso, uma vez que quem ficar infectado por este
plasmdeo os antibiticos no fazem qualquer efeito).

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Gentica Microbiana

Localizaes possveis do Factor F

Pode ser F+, F-, Hfr ou F
F+ presente como DNA circular separado (Dador)
F- ausente (Receptor)
Hfr presente, integrado no cromossoma bacteriano (Dador de alta frequncia)
F presente como DNA circular separado (Dador, podendo levar genes bacterianos)

Resumo da conjugao

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Gentica Microbiana

Similaridade entre a infeco com Agrobacterium tumefaciens e a conjugao

bacteriana
Quando uma planta ferida (p.e. roedores), as clulas vegetais libertam fenis e estes
atraem o A. tumefaciens. Verifica-se que tal como na conjugao bacteriana h contacto entre o A.
tumefaciens e as clulas vegetais, sendo este contacto tambm estabelecido por pillus (canal
citoplasmtico).
O A. tumefaciens possui um plasmdeo plasmdeo Ti, plasmdeo de virulncia. Aquando
da infeco so activados genes de virulncia presentes no plasmdeo, que levam quebra do oriT
no T-DNA. Desta forma h ligao covalente entre o T-DNA e uma enzima que responsvel por
levar o T-DNA para a clula vegetal. O T-DNA mobilizado em cadeia simples.
Em suma, a infeco com A. tumefaciens possui vrias similaridades com a conjugao
bacteriana.

Possibilidade de plantas transgnicas com A. tumefaciens

- colocar no T-DNA genes de interesse, e remover os que provocam tumores.

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Gentica Microbiana

Transduo
Transferncia de fragmentos de DNA (~1-100Kb) de uma bactria para outra, atravs de
fagos (partculas fgicas transdutoras).

um mecanismo menos frequente, no ocorre frequentemente, e no um mecanismo

eficaz.
Fagos: T2, T4, T5, T6, T7 e (lambda).
Transdutores fagos capazes de transduzir
Trandutantes estirpe receptora

A transduo um fenmeno raro porque:

- o empacotamento do DNA do hospedeiro por engano raro;
- o DNA transduzido deve sobreviver na clula receptora para formar um
transdutante estvel;
- nem todos os fagos conseguem transduzir.

Fagos virulentos: lisam a clula (ciclo ltico)

Fagos temperados: podem envergar por ciclo lisognico e por induo passar a ltico.

Apenas os fagos temperados so capazes de transduzir.

A nomenclatura da transduo:
2 tipos:
- especializada ocorre transferncia de genes especficos (transduo com fago )
- generalizada ocorre transferncia de qualquer gene (transduo com P1).

Tipicamente os fagos transportam pequenas quantidades de DNA (cerca de 1% do

cromossoma do hospedeiro).

O DNA viral sofre recombinao com o DNA cromossmico do hospedeiro.

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Gentica Microbiana

Transduo generalizada

Ocorre transferncia de qualquer gene (bactrias)

Fagos bons transdutores - P1 e P22, e Mu: locais pac com pouca especificidade; empacotamento de
DNA por mecanismo de cabea cheia. O fago Mu como se fosse o extremo da transduo
generalizada, como se fosse o para a transduo especializada.

Os fagos transduzidos conseguem iniciar um processo infeccioso mas so incapazes de replicar e

lisar a clula, uma vez que para levarem genes do hospedeiro no podem levar determinados genes
seus. O DNA partido, e os genes podem ir ntegros (o que se quer).

Processo
Uma bactria dadora (E.coli) pode ser lisada por P1. O cromossoma bacteriano rompido
em pequenos pedaos. Ocasionalmente, as novas partculas fgicas incorporam erradamente um
pedao de DNA bacteriano na cabea do fago em lugar do DNA fgico, dando origem a um fago
transdutor.
Um fago que leva DNA bacteriano pode infectar outra clula. Esse DNA bacteriano pode
ento ser incorporado no cromossoma da clula receptora por recombinao (duplo crossing-over).
Como os genes em qualquer uma das partes cortadas do genoma hospedeiro podem ser
transduzidas, este tipo de transduo por necessidade do tipo generalizada.

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Gentica Microbiana

1- Infeco do dador com fago P1;

2- Multiplicao do fago;
3- Montagem dos fagos normais e transdutores (1-2%). Alguns possuem genes bacterianos na
cabea;
4- Libertao dos fagos por lise celular;
5- Infeco da bactria receptora (a) com um fago transdutor (a+);
6- Troca gentica do gene dador a+ com o gene receptor por duplo crossing-over;
7- Bactria transduzida estvel (transdutante a+).

Na transduo generalizada podemos ter mltiplos transdutantes. Teoricamente tantos

quantos pedaos de DNA cromossmico houver (com genes ntegros).

Quando o receptor recebe um marcador* origina um transdutante simples

Quando o receptor recebe mais do que 1 marcador origina co-transdutantes

Quando no leva nenhum marcador no transdutante

*refere-se marcador, um vez que o segmento transportado pode no ser um gene (pode no estar intacto).

Os fagos transdutores de maneira geral conseguem iniciar um processo infeccioso mas so

incapazes de lisar a clula ou de se replicar. Isto porque perderam genes para levar parte do
cromossoma bacteriano (h um comprometimento do tamanho, transportam sempre o
mesmo, o que levam a menos do seu DNA o que transportam do DNA hospedeiro).

Transduo especializada (fago E.coli)

1. Apenas ocorre transferncia de genes localizados junto do local att do profago.
2. Os fagos transdutores especializados transportam genes virais e bacterianos.

Existem fagos que se inserem num local especfico do DNA bacteriano. Quando saem formam uma
ala defeituosa (similar ao tipo que produz plasmdeos F). Assim, s podem captar e transduzir
genes que esto prximos.
Exemplo: fago de E. coli
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Gentica Microbiana

O fago apenas se insere num local (regio att) que se situa entre a regio gal e a regio bio
do cromossoma hospedeiro (forma um profago).

O profago pode envergar para o ciclo ltico e desta maneira o fago tem de ser excisado.
Durante a lise, o profago normalmente sai exactamente do ponto correcto para produzir um
cromossoma circular normal. Muito raramente, a exciso anormal devido a uma ala defeituosa
e pode resultar em partculas fgicas que levem um gene vizinho e deixem alguns genes do fago.
Assim, apesar de ser defectivo para genes que deixou, ganhou genes (gal ou bio), uma vez que a sua
ligao especfica entre gal e bio, e aquando da incorrecta exciso ou trs gal ou bio. Desta forma,
origina a fagos dgal ( defectivos de gal) ou pbio.
Estes fagos transdutores podem infectar outras bactrias se estiver presente uma segunda
partcula normal do fago (dupla infeco). S assim o dgal se pode integrar no cromossoma no
local de ligao de .

Fagos selvagem ajudantes

Um transdutante como no est inteiro, a bactria no o reconhece e o mais provvel a
bactria ser infectada por outro fago (a bactria s pode ser infectada, no mesmo espao de tempo,
por apenas um fago). Se ocorrer induo do fago dgal a partir de um di-lisognico contendo dgal
e selvagem em tandem:
O fago selvagem ajudante permite que o fago dgal venha a multiplicar-se.
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Gentica Microbiana

A transduo especializada com o fago no til para a experincia, a no ser que queira
transferir (p.e.) o gene da galactose para uma bactria deficiente.

Integrao
A protena Int (integrasse) promove a recombinao entre a sequncia attP do DNA de e a
sequncia attB do cromossoma bacteriano (local nico).

Exciso
A exciso pode ocorrer por induo com luz UV.
As propriedades da partcula transdutora vo ser determinadas pelos genes perdidos pelo fago.
Exciso rara com erro produz um lisado com baixa frequncia de produo. A exciso e
empacotamento (correctos) produz um fago lisado transdutor com elevada frequncia.

Ciclo do fago
Os fagos temperados regulam a sua entrada no ciclo ltico/lisognico:
- quando o hospedeiro cresce num meio rico, o entra na via ltica (Cro elevada e CI baixa)
- em condies desfavorveis, funciona como profago lisognico (Cro baixa e CI elevada)
um mecanismo bem regulado!
As protenas repressoras envolvidas na escolha entre a lise e a lisogenia so Cro e CI.
CI:
reprime o operador/promotor ltico;
promove o operador/promotor lisognico.
Cro:
promove o operador/promotor ltico;
reprime o operador/promotor lisognico.

O balano destas protenas decide se o ciclo ltico ou lisognico.

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Gentica Microbiana

Hospedeiro saudvel:
- produo elevada de Cro
- lisogenia bloqueada
- ltica progride

Hospedeiro em condies desfavorveis:

- sntese de Cro baixa
- fago entra no ciclo lisognico

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Gentica Microbiana

FAGOS NA BIOLOGIA, BIOTECNOLOGIA E

MEDICINA
Os bacterifagos so as mais abundantes entidades no planeta, com um valor esimado de
1030-1032 viries no bioma.
Contudo, os bacterifagos no so um novo campo de interesse cientfico.
H vrias centenas de anos que so referidas as surpreendentes propriedades antibacterianas
das guas dos rios Ganges e Junna (ndia).

Terapia fgica
dHerelle
- foi pioneiro no reconhecimento das potencialidades dos fagos no tratamento de infeces
bacterianas;
- Em 1919, realiza o primeiro ensaio de terapia fgica com sucesso, num rapaz de 12 anos
com desinteria bacteriana; e repete esse sucesso com mais 3 pacientes com disenteria;
- Em 1922, publica o The Bacteriophage, com descries clssicas dos diferentes aspectos
dos fagos e seus ciclos de vida.

Final de 1920
Produo comercial de preparaes fgicas nos EUA e Frana para um vasto mercado.

Entre 1917 e 1956

+/- 800 publicaes abordam vastas aplicaes mdicas dos fagos.

Terapia fgica: utilizada para curar disenteria, tifo, paratifo, clera e infeces do trato urinrio,
mas tambm pedras ou eczemas as quais no so causadas por bactrias.
O resultados eram inconsistentes e muitos ensaios eram realizados sem conhecimentos
cientficos de fagos ou de microbiologia: Fagos no caracterizados, em concentraes no
conhecidas eram dados aos pacientes com infeces bacterianas no identificadas, sem
grupos de controlo, sem placebos, e sem acompanhamento.

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Gentica Microbiana

Reavaliao dos primeiros ensaios de terapia fgica

- os falhanos podem atribudos a um ou mais factores;
- a heterogeneidade e a ecologia dos fagos e bactrias no era compreendida (a terapia
fgica s faz sentido se se souber qual a bactrias em questo);
- falha na seleco de fagos altamente virulentos contra as bactrias alvo (o fago tem de ter
ciclo ltico!);
- uso de preparaes de fagos isolados para tratar infeces envolvendo misturas de
bactrias diferentes;
- emergncia de mutantes insensveis a fagos;
- falha na caracterizao adequado ou no ttulo das preparaes fgicas;
- falha na neutralizao do pH gstrico prvia administrao oral;
- inactivao dos fagos por resposta imunolgica do hospedeiro (os humanos no respondem
aos fagos, mas nunca se sabe. tambm se coloca a questo da resistncia bacteriana);
- presena de endotoxinas na preparao fgicas conduzindo a choque txico no paciente;
- escassez de laboratrios bacteriolgicos de confiana para identificar correctamente os
agentes patognicos causadores da infeco.

Anos 40: factores j enunciados anteriormente; o advento do antibitico, como a penicilina; e o

incio da 2 guerra mundial, permitiram que a terapia fgica fosse abandonada.

Desde os anos 20 a pesquisa na terapia fgica floresce com a fundao do instituto do bacterifago,
microbiologia e virologia em Tblisi (Gergia).

O porqu de se tornar a falar em terapia fgica?

Existem doenas que os antibiticos no resolvem, principalmente devido questo da
resistncia a antibiticos; ou ento porque no conhecido um antibitico para determinada doena
bacteriana. Assim, a soluo talvez seja a terapia fgica.
Contudo, as farmacuticas no esto interessadas, na medida em que muitas pessoas so
capazes de formarem um cocktail viral para o combate a bactrias.

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Gentica Microbiana

De facto, a 2Guerra fez com que a terapia fgica fosse abandonada do ocidente.
Entretanto, na Ex Unio Sovitica

Desde os anos 20,

- A pesquisa na terapia fgica floresce com a fundao do Instituto do Bacteriofago, Microbiologia

e Virologia em Tblisi (Georgia);
- Imediaes do IBMV, em Tblisi, na Gergia:
- Construo de diversos locais para a produo em larga escala de preparaes fgicas;
- Baseada na pesquisa do instituto, essa preparao foi continuamente melhorada.

A partir de 1950,

- A resistncia a antibiticos um problema conhecido na ex-URSS

Por decreto: Espcimes de todas as bactrias resistentes a antibiticos foram enviadas para Tblisi,
para constituir o que se tornou a maior coleco de bactrias resistentes a antibiticos e fagos
correspondentes.

- Na Gergia,
A Terapia Fgica faz parte dos cuidados mdicos de sade:
* Cuidados peditrico, cirrgicos ou de queimados
* Utilizados sozinhos ou combinados com antibiticos contra: infeces primrias
ou nosocomiais; profilcticos; tratamentos de incises antes da cirurgia; desinfeco de blocos
operatrios.

Com a Guerra Fria,

- A cortina de ferro abrange a comunidade cientfica do Leste, que fica de fora da troca cientfica
mundial de conhecimentos assente na utilizao de jornais internacionais de lngua inglesa.

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Gentica Microbiana

A Pesquisa nos fagos no se limitou ex-URSS, a Terapia clnica fgica bem documentada tem
sido utilizada no Instituto de Imunologia e Medicina Experimental da Academia de Cincias
Polaca, em Wrodaw (Polnia).

Entre 1981 e 1986, (Polnia)

- 550 pacientes foram tratados com fagos. Entre queimadoras, infeces cutneas, infeces
urinrias, meningite , otites, septicemias.
- O tratamento com antibiticos falhou, mas o tratamento com fagos foi eficiente

No Ocidente, esta terapia com fagos no teve tanta aplicao. Questes ticas e pouco interesse das
industrias farmacuticas, foram os responsveis.
De facto, as coisas no avanaram tanto uma vez que eram necessrios ensaios clnicos,
financiamento, etc., assim como a nvel de legislao e tica impedia e questionava esta pesquisa.

Terapia Fgica nos EUA

- O aumento de infeces causadas por bactrias resistentes a antibiticos tornou possvel a

disponibilidade de alguns tratamentos com fagos em humanos
- A FDA, pouco a pouco, comeou a aceitar determinados tipos de tratamentos, p.e., lceras
venosas nas pernas.

Fagos Uma alternativa para o tratamento de infeces bacterianas?

Os fagos vivem em bactrias. Cada bactria alberga um tipo especfico de fago.

Comparados com os antibiticos, os fagos tm vrias vantagens:

Impacto ilmitado
Contrariamente s bactrias, os fagos so auto-replicativos e auto-limitativos
Desenvolvimento de resistncia limitado
As bactrias desenvolvem resistncia a fagos, mas os fagos tm uma taxa de mutao mais elevada.
Alm disso, normalmente no se utiliza apenas um fago, mas sim um cocktail.

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Alvos especficos
O tratamento com antibiticos causa frequentemente desequilbrios e podem (...)
Os fagos tm como alvos tipos particulares de bactrias, causando menos danos.

Renovado Interesse no Uso de Bacterifagos em diversos campos

- Veculos para terapia gnica
- Desenvolvimento de vacinas
- Novos estudos de terapia gnica
- Vectores na engenharia gentica
- Ferramentas biotecnolgicas
- Deteco e tipificao de bactrias
- Fonte de enzimas para combate a infeces

Potencialidades como vectores na transferncia de genes e distribuio de

vacinas:
- Baixo Custo
- Segurana ( relativa)
- Estabilidade Fsica

Potencialidades como vectores na transferncia de genes:

Bacteriofago
Partculas do fago no modificadas so capazes de transduzir clulas de mamfero (rato) in vivo, e
ser tomadas por mecanismos no destrutivos.
Uma regio do corresponde a uma regio no essencial para o ciclo ltico. Esta pode ser
substituda por um novo gene.

Fagemdeo M13
Westwater et al. utilizaram o fagemdeo M13 para levar os genes letais gef e chpBK, que so lerais
para E.coli (verificado em ratos).

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Potencialidades como vectores na Distribuio de vacinas:

- Vacinao directa com fagos que transportam antignios na sua superfcie;

- Utilizando partculas fgicas para transportar uma vacina de DNA (cassete de expresso).

Fagos na Deteco e Tipificao de Bactrias

Especificidade dos fagos para os hospedeiros:
-Permitiu a utilizao para a tipificao de bactrias
- Deteco de baixos nmeros de bactrias patognicas

Mais recentemente,
- Utilizao de fagos para entregar genes reprter (expressados aps a infeco bacteriana);
- Fagos com tintas fluorescentes ligadas covalentemente cpside (deteco da adsoro
especfica);
- Fagos com fragmentos de pptidos ou anticorpos (que se ligam especificamente a bactrias
patognicas ou toxinas)

Impacto na Genmica Fgica

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Sequenciao dos Genomas Procariotas

Permitiu o isolamento de enzimas codificadas pelos fagos;
Incorporao em formas mais direccionadas de tratamento;

Como tirar partido do conhecimento dos genomas fgicos?

Enzimas codificadas por fagos e sequncias de DNA com aplicaes biotecnolgicas.

Lisinas
- Enzima chave dos produtos fgicos
- So uma alternativa utilizao de fagos completos para destruir a bactria.

Exemplos de aplicaes:

Fischetti et al.

Demonstraram a eficcia com que outras lisinas derivadas de fagos podem ser utilizadas para
eliminar bactrias problemticas como: Streptococcus pyogenes e Streptococcus pneumonia.

Zimmer et al.

- Demonstraram que a murena hidrolase, isolada do fago 3626 de Clostridium perfringers, mata
especificamente todas as estirpes testadas de doenas associadas a C. perfringers.
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- Outras clostrdias e bactrias de outros gneros permaneceram insensveis.

Potencial desta tecnologia para novas medidas de controlo na alimentao, raes e

comunidades microbianas complexas.

Schuch et al., 2002

- Tratamento do Bacillus anthracis, agente causal do antrax: Demonstraram que a lisina, isolada do
fago de B. anthracis capaz de matar rapidamente tanta as clulas germinativas como esporos
bacterianos.
Preocupaes actuais com esta terapia lisinas

Holinas
- Protena de membrana codificada pelo genoma fgico, que regula o tempo de lise.

pRNA
- Ribozima responsvel pelo empacotamento viral.

Hoeprich et al.

- Descobriram um novo sistema para o tratamento de Hepatite B, em clulas de mamferos;

- Utilizaram o sistema de empacotamento de DNA pRNA do fago 29 de B. subtilis para entregar
ribozimas clula (ribozimas destroem o vrus da hepatite);

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Gentica Microbiana

- Estas enzimas clivam especificamente o sinal poli A do mRNA do vrus da Hepatite B, inibindo a
replicao viral.

***Esta aplicao relata a utilizao de uma ribozima do fago para destruir um vrus humano
infeccioso, e no bactrias!

Genes relacionados com lisogenia

- repressor (resistncia fgica)
- integrase (eng. celular de mamferos e bactrias)
- genes sie (resistncia fgica)

Stoll et al.

- Relataram a construo de um vector que expressa a integrase do fago lactococal TP901-1 nas
clulas humanas.
- Foi demonstrada a capacidade da integrase facilita a integrao intramolecular de transfeco de
plasmdeos em clulas humanas.

Bacteriofagos Aplicaes
Interesse pelas capacidades dos fagos em controlarem populaes procariotas: estendeu-se
das aplicaes na medicina aos campos da agricultura, aquacultura, indstria alimentar e do
ambiente.
Existem inmeras aplicaes na agricultura: no combate a doenas vegetais (vrus vegetais)
e microrganismos patgenos. Actualmente existem empresas (p.e. OMNILYTICS) que
vende cocktails fgicos: existe uma listagem com a espcie vegetal e o especfico cocktail
contra a doena e/ou patgeno.
Aplicaes no tratamento de guas residuais

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Transferncia de DNA inter-reinos:

O Agrobacterium como ferramenta biotecnolgica

H duas doenas nas plantas, que se originam a partir da interaco entre agrobactrias e
plantas feridas:
Crown-gal, ou cancro do colo, ou doena da galha Agrobacterium tumefaciens
Hairy root, ou razes de cabeleira Agrobacterium rhizogenes

o nico microrganismo que naturalmente permite a transferncia de material gentico entre

procariota e eucariota.

DNA
Procariota
(Agrobacterium)

Eucariota
(Clula vegetal)

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No incio do sculo XX, Smith e Townsend (1907)

A bactria do solo Gram-, Agrobacterium tumefaciens, o organismo responsvel pela doena da
galha.

Anos 40,
Brann et al.
Demonstraram que a proliferao descontrolada das clulas tumorais no depende da presena
contnua da causadora. Mesmo sem a bactria, o tumor continua a desenvolver-se.

Anos 60,
Morel et al.
Demonstraram que variados tumores isentos de bactrias sintetizam a.a. conjugados invulgares
(opinas). Alm disso, o tipo de opina era especificado pela estirpe de Ag. que provocava o tumor.

Anos 70,
Vrios grupos
Descobriram nas estirpes patognicas de A. tumefaciens, um plasmdeo de grandes dimenses
nunca antes observado:
* cerca de 2000 Kb
* +/- 112 108 daltons
* 3 a 5% de cromossoma bacteriano
- Era esse plasmdeo que conferia o carcter patognico bactria!

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Gentica Microbiana

Processo de transferncia de DNA (T-DNA):

A ferida numa planta leva libertao de fenis, que atraem as bactrias (quimiotaxia). So
os compostos fenlicos que despoletam os mecanismos de infeco do Agrobacterium. H
infeco do material vegetal.
O processo de transferncia de material gentico da Agrobacterium para as clulas vegetais
um processo de conjugao.
O T-DNA, do plasmdeo Ti, incorporado no genoma vegetal.
T-DNA contem genes que codificam uma auxina e citocianina. Esses genes so expressos, o que
estimula a proliferao celular que leva ao aparecimento de tumores.
As clulas infectadas, com o T-DNA, libertam para o exterior opinas e fitohormonas. As
opinas servem de alimento para as bactrias. No plasmdeos Ti existem genes responsveis
pelo catabolismo das opinas.
H formao de galhas no local da ferida.
Para confirmar a infeco ou no por Agrobacterium tumefaciens:
Remoo e cultura de tecidos da galha e verificar se o crescimento hormono-dependente. Se se
desenvolver Agrobacterium, seno a galha foi causada por outro agente.
Com diferentes estirpes de A. tumefaciens podemos ter distintos tumores, o resultado no
linear. Alm disso, o grau de infecciosidade tambm varia.

Infeco natural com Agrobacterium rhizogenes

- Plasmdeo Ri
- uma infeco transiente, considerada por isso segura.
- utilizada para promover o enraizamento de lenhosas.
Em alguns exemplos podem alterar o ciclo de vida da planta de tal forma que esta passa a ter
2 perodos de fertilizao.

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Gentica Microbiana

Espcies/Estirpes de Agrobacterium
Inicialmente, a taxonomia distinguia as Agrobacterias com base nas suas propriedades
patognicas.
A.Tumefaciens provoca doena da galha
A.rubi provoca a doena da galha na framboeseira
A.rhizogenes induz razes em cabeleira
A.radiobacter estirpe no virulenta
Mais tarde, as estirpes foram identificadas com base nas suas propriedades bioqumicas e
fisiolgicas
Foram definidos 3 bitipos ou biovars, mas a taxonomia assenta nas estirpes/espcies.

Diviso do gnero Agrobacterium em biovars, baseado no:

- Crescimento
- Caractersticas metablicas

Assim,
A.tumefaciens e A.rubi Biovar I
A.rhizogenes - Biovar II
A.vitis Biovar III
A.larrymoorei Biovar I

O gnero Agroacterium foi agrupado em seis espcies, baseado na:

- Sintomatologia da doena
- Plasmdeo indutor da doena residente
- Origem dos isolados
A.radiobacter estirpe no virulenta
A.tumefaciens provoca a doena da galha
()

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Gentica Microbiana

A nomenclatura das espcies de Agrobacterium j sofreu inmeras alteraes nos ltimos

100 anos.
()

Recentemente, a classificao taxonmica comeou a sofrer alteraes, baseado na:

- Sequenciao do genoma do A.tumefaciens C58

A autenticidade de Agrobacterium foi questionada por causa da possvel sinonmia com o

Rhizobium

Rhizobium gnero, at recentemente, considerado apenas representado por bactrias formadoras

de ndulos fixadores de azoto e com relaes simbiticas com legumes
A acumulao de evidncia fenotpicas e moleculares mostraram que os dois gneros podem ser
circunscritos a um s taxum.

Rhizobium x Agrobcterium
Acresce que os caracteres de patogeneicidade do Agrobacterium e nodulao do Rhizobium
so transmitidas por plasmdeos e permutveis entre espcies individuais e entre membros
dos 2 gneros.
Esta evidncia milita contra a nomenclatura estvel assente nos caracteres patognicos para
o gnero Agrobacterium, ou para as suas espcies.
De acordo com as abordagens modernas (sobretudo moleculares) para a classificao dos 2
gneros, todas as espcies de Agrobacterium deveriam ser colocadas no gnero Rhizobium,
distinguindo-se (...).

Yong et al., 2001

Propuseram que o gnero Agrobacterium, membro de Rhizobiaciea, fosse renomeado como
membro do gnero Rhizobium, estreitamente relacionado, e tambm a renomeao das espcies.

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Gentica Microbiana

Ferrand et al, 2003

Argumentaram que existem diferenas suficientes ente Rhizobium e Agrobacterium e que a
designao genrica no deve ser alterada.

Velzquez et al., 2005

No existia nenhum organismo que tivesse as caractersticas de ambos. Mas em 2005 foram
encontradas 2 estirpes (163C e ATCC1132-5T) de Rhizobium rhizogenes capazes de induzir
tumores ou razes em plantas, e ndulos em Phasedus vulgaris, em condies naturais.

Foram encontrados nas duas estirpes:

- Plasmdeos simbiticos (pSym) contendo os genes nad e nif (nodulao);
- Plasmdeos do tipo pTi e pRi com genes vir (virulncia).

Os genes nadD e nifH destas estirpes esto filogeneticamente relacionados com os de

estirpes de Sinorhizobium, que nodulam P.vulgaris;

Os genes virA e virB4 da estirpe 163C esto filogeneticamente relacionaos com os de R.

tumefaciens C58, e os da estirpe ATCC1132-5T com os de estirpes indutoras de razes em
cabeleira.

Diversidade do T-DNA
Os T-DNAs so estruturas compostas derivados de unidades relacionadas.
- As unidades mais pequenas so genes individuais.
- Os chamados plast genes (Isso, b, c, d, e, 3, 4, 5, 6a, 6b, 7, rolB, rolC, ORF13,
ORF14, ORF18 e outros genes) so fracamente relacionados e possuem funes na iniciao dos
tumores e das razes, que ainda esto por determinar.

Durante a evoluo do T-DNA, os genes e grupos de genes foram combinados de diferentes

maneiras.

Diversidade dos plasmdeos Ti e Ri

Os plasmdeos Ti/Ri podem classificar-se:
- de acordo com as suas opinas;
- de acordo com as suas incompatibilidades.

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Gentica Microbiana

Classificao envolvendo o perfil de opinas

Os plasmdeos Ti/Ri usados na engenharia gentica so derivados de um pequeno nmero de
plasmdeos naturais.

No comum encontrar descries de pTi/Ri particulares;

Poucos pTi foram completamente sequenciados.

Tradicionalmente, as opinas tm sido usadas para classificar:

- Estirpes de Agrobacterium
- Os seus plasmdeos Ri/Ti

Foram identificadas estirpes e plasmdeos com:

- Octopina
- Nopalina
- Succinamopina
- Agropina
- Vitopina (exclusiva de videira)
- Tipo nulo
- Manopina
- Crisopina/succinamopina

A classificao de opinas no perfeita, e por isso levanta alguns problemas

1 Razo
Alguns plasmdeos Ti/Ri induzem tumores que no produzem qualquer tipo de opina
conhecida;
Outros foram inicialmente classificados com o tipo de nopalina-deficiente, pois os
padres de restrio eram similares ao da nopalina; mais tarde viu-se que produziam
succinamopina;
Outros ainda foram primeiro classificados como tipo nulo, depois viu-se que induziam a
sntese de agropina e, mais tarde, foram classificados como plasmdeos com
succinamopina;
Na estirpe Lippia canenses AB2/73, as opinas induzidas pelo AB2/73 so ainda
desconhecidas. Pertencem ao tipo nulo. (E ser que tem opinas? Afinal so
desconhecidas).
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Gentica Microbiana

2 Razo:
Os genes responsveis pela sntese e/ou utilizao de opinas ocupam apenas
relativamente pequenas partes dos grandes plasmdeos Ti/Ri
Assim mesmo se os plasmdeos Ti/Ri forem portadores de genes similares de opinas, as
suas sequncias remanescentes podem ser muito diferentes.
Uma classificao baseada exclusivamente nas opinas levar criao de grupos
artificiais.

3 Razo:
Um plasmdeo geralmente induz diferentes tipos de opinas e diferentes plamdeos
podem especificar diferentes combinaes de opinas.
Ex: Agropina e monopina (pRi A4)

- A escolha de uma opina em lugar de outra para definir um grupo plasmidico tem, desta forma,
sido largamente arbitrria.

Resumindo(.)

Classificao envolvendo incompatibilidade

A incompatibilidade plasmdica define-se como a incapacidade na herana estvel de dois
plasmdeos co-residentes na ausncia de seleco externa.
- No caso dos plasmdeos Ti/Ri foram definidos 4 grupos de incompatibilidade:
IncRh 1; (Plasmdeo Ti de A. Tumefaciens com octopina e nopalina)
IncRh 2;
IncRh 3;
IncRh 4.

Outros plasmdeos importantes (ecologicamente importantes)

- Alm dos plasmdeos Ti/Ri, as Agrobacterias contm outros plasmdeos ecologicamente
importantes.

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Gentica Microbiana

Plasmdeo com agrocina de A. radiobacter K84

Ex: pAgK84 e pAgK434

Codificam a sntese de antibiticos, que matam certas estirpes virulentas de

Agrobacterium;

K84 pode ser utilizado para controlo biolgico;

A sequncia do pAgK84 j foi determinada.

Em E.coli, estas sintetizam colicinas que funcionam como antibitico para certas estirpes.

Plasmdeos de A. vitis que utilizam tartarato (pTr)

Promovem o crescimento da videira, que apresenta elevados nveis de tartarato;

A estirpe AB3 transporta 2 regies tar relacionadas (Tar-I e TAR-II) em pTrAB3 e

pTiAB3, respectivamente;

As regies tar so encontradas em diferentes contextos e tambm noutras bactrias.

- Dois plasmdeos Ti (pTiAB3 e pTiAT6) tambm possuem o gene tar;

- Os pTr constituem um grupo heterogneo, e possvel que as suas regies tar tenham sido
adquiridas por transferncia horizontal de genes.

Independentemente da confuso na classificao taxonmica

O aspecto mais importante mais importante a gama de hospedeiros das diferentes estirpes de
Agrobacterium.

Como gnero, o Agrobacterium pode transferir DNA para:

Numerosas espcies vegetais, incluindo numerosas espcies angiosprmicas mono e
dicotiledneas, bem como gimnosprmicas;
Fungos, incluindo leveduras, ascomicetes e basidiomicetes;
Recentemente (2001), registou-se a transferncia de DNA para clulas humanas (in
vitro).

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Gentica Microbiana

Genomas de Agrobacterium
Slater et al., 2009
- Sequenciao de mais de dois genomas representativos das biovars de Agrobacterium (alm de
C58):
- A radiobacter K84 - estirpe avirulenta, agente de controlo biolgico na preveno da doena da
galha nos campos.
- A vitis S4 - estirpe virulenta, distinta de outras estirpes por:
- Produz a doena da galha na videira;
- Induz necroses nas razes.

Os 3 genomas mostram arquitecturas genmicas distintas:

C58 e S4
- Possuem 2 verdadeiros cromossomas *
- C58 possui 1 cromossoma circular e 1 cromossoma linear (A. tumefaciens)
- S4 possui 2 cromossomas circulares

K84
- Possui 1 cromossoma verdadeiro *
- Possui 1 segundo replico com 2.65 Mbp
- Possui 3 palsmdeos (pAgK84, pAgK84b, pAtK84c)

(*) Um replico contm operes de rRNA e genes essenciais para o crescimento prototrfico.
C58 possui 1 cromossoma, um cromdeo e 2 plasmdeos;
S4 possui 5 plasmdeos, para alm de 1 cromosoma e 1 plasmdeo.

Competncia para a modificao

- O aspecto crtico que permite saber qual das quaisquer espcies indicadas pode ser transformada
a identificao de clulas no interior das plantas que esto receptivas transformao.
- Apresentam competncia para a transferncia e integrao do DNA.
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Gentica Microbiana

Modelo para a aderncia e formao de biofilmes

A transio da aderncia reversvel para a ligao irreversvel tem sido definida pelo aparecimento
de fibrilhas de celulose.

Fukua, 2008
Observao das folhas, no final da co-cultura por microscopia electrnica de varrimento.
- Zona da ferida: Acentuada
proliferao bacteriana; Fibrilhas
produzidas por A. Tumefaciens
-

Penetrao

massiva

das

bactrias, atravs de estomas;

- Menor densidade bacteriana
numa zona afastada da ferida;

Agrobacterium e a gama de hospedeiros

- A base gentica e molecular para a gama de hospedeiros de uma dada estirpe de Ag permanece
desconhecida;
- Vrios loci de virulncia do plasmdeos Ti, incluindo virC e vir F mostraram determinar a gama
de espcies vegetais;
- Estudos prvios parecem indicar que o plasmdeo Ti, mais do que os genes cromossmicos, o
principal determinante na gama de hospedeiros.

H vrios tipos de Ti:

- Alguns possuem apenas um T-DNA (produz tumores e
sntese de opinas);
- Outros possuem mais do que um T-DNA (com TL-DNA
produo de tumores e opinas - e TR-DNA sntese de
opinas).
*Numa regio fora do T-DNA, existe uma regio responsvel por
metabolizar as opinas.

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Gentica Microbiana

Plasmdeo Ri: mesmas caractersticas que o Ti; tambm pode ter mais do que um T-DNA.

Processo de transformao mediada por A.tumefaciens

A planta ferida produz compostos fenlicos e aucares que so captados pela protena VirA, que
fosforila a VirG que, por sua vez, activa os demais genes vir. A VirD2 cliva as bordas do T-DNA e
direcciona-o para a clula hospedeira atravs de canais formados pela VirB. J na clula vegetal, as
protenas VirE2 ligam-se fita-T formando o complexo T. Este complexo, ento, entra no ncleo
da clula vegetal com o auxlio das carioferinas e cicloferinas do prprio hospedeiro, e integra-se no
genoma da planta. Desta forma, a planta passa a produzir fitohormonas e opinas que servem de
nutriente para a agrobactria.

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Gentica Microbiana

Similaridades com a conjugao

- Estrutura tipo pilus;
- Quebra na Ori T;
- Desenrolamento e crculo rolante;
- ()
- (...)
- recircularizao e replicao.

T-DNA: um envelope com selo

- Muitas caractersticas do T-DNA
- Natureza da sua transformao

Valiosa ferramenta biotecnolgica

- Natureza da sua integrao

Uma das maiores contribuies da investigao do A.tumefaciens para a investigao nas

plantas uso do T-DNA como agente mutagnico
Todos os genes identificados podem ter impacto na transformao de espcies recalcitantes.

Isolamentos inesperados de Agrobacterium

Historicamente, o Ag tem sido sempre associado ao solo. Mas ultimamente, tm tambm aparecido
em clnicas.
- Surgiram vrios casos de doenas humanas provocadas por Agrobacterium radiobacter. Surgem
casos de infeco de cateteres e septicemia.

Como que isso acontece?

Talvez por transferncia horizontal de genes, que permite estes acontecimentos. Contudo, a causa
ainda no conhecida.
Interrogao:
A. radiobacter usado como controlo biolgico. E tambm causa infeces?

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Gentica Microbiana

Notas:
- Podem existir solos contaminados, e as videiras no estarem contaminados. E vice-versa.
- Mexer em terra infectada no justifica a infeco do homem por Agrobacterium.
- O aparecimento de Ag. Em ambientes que no o solo pode dever-se provavelmente transferncia
horizontal de genes. Os plasmdeos tero adquirido novos genes, que lhes confere a capacidade de
infectar clulas no vegetais.

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Gentica Microbiana

Tpicos em desenvolvimento de biodefesas contra

bioterrorismo e agroterrorismo
Comeou desde logo pela competio natural pelo habitat e pelos recursos.
- Tem gerado uma gama de estratgias defensivas e agressivas etre os seres vivos;
- Os humanos tm frequentemente tentado utilizar agentes biolgicos nos mais variados conflitos
blicos, mas sem grandes sucessos at agora;
- A guerra biolgica tem sido praticada ao longo da histria pelos organismos a todos os nveis da
escala evolutiva.
GUERRA BIOLGICA Bioterrorismo e Agroterrorismo
Objectivo principal a desenvolver:
- A guerra biolgica tem sido praticada ao longo da histria pelos organismos a todos os nveis da
escala evolutiva.

Guerra biolgica entre procariotas

- As bactrias produzem protenas letais para matar outros organismos;
- Porque muitos tipos de bactrias so encontrados em cada ambiente, a competio pelos nutrientes
e o habitat ocorre frequentemente
- Muitas bactrias competem atravs de uma forma de guerra biolgica segregando toxinas.

Bacteriocinas: Protenas txicas produzidas por bactrias, para eliminar outras bactrias.
Toxinas: quando as protenas produzidas por bactrias actuam contra outros microrganismos que
no bactrias.

Diferena na terminologia entre bacteriocinas e toxinas

uma questo de prespectiva.
- As bactrias produzem bacteriocinas contra as bactrias vizinhas, com o objectivo deliberado de
as matar;
- Mas as bactrias patognicas normalmente no pretendem matar as pessoas que infectam;
- As bactrias tambm infectam insectos e produzem toxinas que matam os insectos, mas so
incuas para os vertebrados. Ex: Bacillus thuringiensis.
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Gentica Microbiana

Exemplos:

E. coli
- Muitas estirpes de E. coli produzem uma ampla variedade de bacteriocinas colicinas para
eliminar outras estirpes da mesma espcie
- E. coli produz diferentes tipos de colicinas como a colicina E1 ou a colicina M.

As colicinas actuam por 2 mecanismos:

Algumas perfuram a membrana celular, levando perda de ies vitais

Outras codificam nucleases que degradam o DNA e o RNA.

- Estas toxinas no afectam as clulas que as produzem, pois simultaneamente h uma protena nos
plasmdeos que neutraliza a toxina (imunizadora);
- A capacidade para produzir colicinas est geralmente codificada em plasmdeos;
- O plasmdeo ColE1, com 6646bp, codifica a coliciba E1 (produto do gene cea) e a protena
imunizadora que permite bactria escapar aco da colicina (produto do gene imm);
- Embora frequentemente, os media apresentem situaes envolvendo a contaminao de alimentos
por E.coli, por vezes surgem estirpes patognicas E. coli que secretam toxinas;
- Estas causam diarreia ao afectar a parede intestinal, resultando na perda de fludos no clon, ao
invs de ocorrer absoro;
- particularmente perigosa para crianas pequenas, idosos e pessoas com o sistema imunitrio
comprometido;
- Se os alimentos (carne) forem expostos a pelo menos 70C, estas bactrias so eliminadas.

E.coli 0157:H7 estirpe patognica, que possui 2 genes codificadores de toxinas.

A. radiobacter K84
- Batria no oncognica de Ag.
-Produzem agrocinas
- (..)

Yersina pestis
- Produz pesticinas;
- Responsvel pela peste negra.
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Gentica Microbiana

Guerra biolgica entre eucariotas unicelulares

Paramecium- protozorio ciliado, muito conhecido
- Muitas estirpes de paramcias possuem bactrias simbiticas (caedibacter), conhecidas como
partculas kappa, que crescem e se dividem no interior da clulas da paramcia;
- Estas estirpes de paramcias com partculas kappa chamam-se killers.

Paramecium
- A morte ocorre quando as partculas kappa so libertadas pelas killer e engolidas por paramcias
sensveis (sem partculas kappa);
- A digesto da partcula kappa resulta na libertao de uma protena txica letal e na morte da
paramcia sensvel;
- Esta forma de guerra bacteriolgica praticada por eucariotas unicelulares;
- O gene da toxina no se encontra no cromossoma da bactria simbionte mas num plasmdeo
derivado por um fago;
- A toxina codificada pelo vrus que infecta a partcula passou a desempenhar a funo de muitas
outras estirpes.
- Este parece ser um princpio geral!

Muitas das toxinas usadas pelas bactrias patognicas que infectam humanos, so
efectivamente codificadas por DNA de origem no cromossmica: vrus, plasmdeos ou
transposes que se integram frequentemente nos cromossomas das estirpes bacterianas
patognicas.

Guerra biolgica promovida por outros eucariotas

Insectos
- Alguns insectos utilizam vrus como arma biolgica;
- Algumas vespas parasticas injectam os seus ovos em larvas comedoras de vegetais (larvas de
insectos fitfagos);
- Aps a ecloso dos ovos, as vespas recm-nascidas comem as laras a partir do interior;
- Estas eventualmente morrem e a nova gerao de vespas libertada prosseguindo o ciclo de vida.

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Gentica Microbiana

Vespas
- O segredo do sucesso das vespas assenta na injeco de um vrus juntamente com os ovos;
- O vrus da famlia dos AV tem como alvo uma estrutura da larva, equivalente ao fgado,
prejudicando o sistema de desenvolvimento da larva e o seu primitivo sistema imunitrio;
- A larva perde o seu apetite pelas plantas, que impede a formao da sua pupa e subsequente
metamorfose (no chega fase adulta nem deixa descendncia).

Existem muitos tipos de larvas fitofagas, incluindo as mais importantes pragas agrcolas, como a
broca do tabaco e do algodo
-H muitos tipos de vespas que as atacam e, consequentemente, muitos tipos de vrus, cada
um destinado a um tipo de larva.

Histria da guerra biolgica promovida por humanos

- Queimar colheitas (privao do alimento)
- Reservatrio de gua
- Arremessar animais mortos ou em decomposio
- Envenenar a gua para beber, mostrou tambm ser eficaz para afastar os inimigos
- Acontecimentos com ocorrncia muito precoce: conhecidos no sculo 6 A.C.

1340
Atacantes lanaram cavalos mortos com catapultas para dentro do castelo de thun leveque.
Os defensores registaram que o mau cheiro era insuportvel e renderam-se.

1346
Lanamento de corpos de indivduos em putrefaco com peste negra. Levou transmissoo da
peste.

1422
Lanamento de estrume de animais, na esperana de que ocorresse a disperso de doenas.

1763
Nos EUA, retiravam os cobertores e lenos de assoar de doentes com varola, e estes foram doados
aos ndios.
99

Gentica Microbiana

No Qubec, espalhou-se a varola nos rebeldes, sendo que os civis tinham sido imunizados.

1984
Os membros de um culto levaram contaminao de saladas com salmonela, com o objectivo de
que os indivduos no comparecessem a uma votao local.

1961-71
Na guerra do Vietnam, os militares dos EUA utilizaram o Agente Laranja (2,4-D mas em maior
concentrao). Funcionava como herbicida para eliminao de floresta. Contudo, teve efeitos muito
graves: mortes/afectados/crianas deficientes.

1991
Membros do Grupo de Patriotas do Minnesota extraram leo de rcino.
Objectivo: matarem elementos da lei e IRS americanos, atravs da colocao de rcino nos seus
sapatos, atacadores ou veculos. O rcino misturado com solvente seria facilmente absorvido pela
pele.
- Foram os primeiros a ser condenados segundo o acto de anti-terrorismo com armas biolgicas

1991
Guerra do Golfe, Iraque
- A ONU confirmou que o Iraque utilizou armas como o antrax, botulnica, aflotoxinas e rcino.
- Foi desenvolvido um programa de vacinao das tropas dos EUA, contra o antrax.

1995
Membros do Grupo Aum Shiurikyo tentaram levar a cabo ataques com antrax em p e a toxina
botulnica. Mais tarde, lanaram um ataque com gs Sarin no metro de Tokyo.

2001
Libertao de antrax em vrios estados do EUA
A libertao intencional de esporos ocorreu atravs de cartas para vrias pessoas.
Houve 22 casos de antrax, 11 por inoculao.

100

Gentica Microbiana

O que um agente biolgico?

- Inclui microrganismos, especialmente certas bactrias e vrus
- Inclui toxinas biolgicas, como a toxina botulnica ou as aflatoxinas as quais agem como agentes
qumicos.

O agente biolgico pode ser direccionado a humanos, plantas e animais (bioterrorismo) e

pode constituir uma ameaa:
s culturas,

gado, produtos alimentares

Agroterrorismo

durante o

processamento, distribuio, armazenamento e transporte, o qual pode causar

doena e ter severas consequncias econmicas como a BSE, a frebre aftosa ou a
doena da lngua azul, entre outras.

Os agentes biolgicos podem ser usados como armas em:

- Biocrimes
- Bioterrorismo
- Guerra biolgica

Organizao do Tratado do Atlntico Norte (NATO)

Uma arma biolgica definida como:
O fornecimento de qualquer agente infeccioso ou toxina, por qualquer processo de
distribuio, por forma a causar dano a humanos, animais, ou plantas

Tm sido apresentadas diferentes definies de bioterrorismo:

O uso intencional ou ameaa de uso de agentes biolgicos numa populao para atingir
objectivos polticos, sociais, religiosos, tnicos ou ideolgicos, provocando doena,
morte ou pnico em elevada escla.

- O objectivo pode no ser o mximo dano, mas uma declarao poltica.

- Existe a tecnologia para modificar os agentes existentes ou para os armar, por ex, para tornar a sua
disseminao mais fcil e/ou causar grandes danos na sua disseminao

101

Gentica Microbiana

- Uso de agentes biolgicos para bioterrorismo costuma ser referido como bomba nuclear dos pases
pobres.
- Todos envolvem o uso de agentes biolgicos por forma a possuir uma sada: poltica, social,
economicamente, teolgica e pessoal.

A Guerra Biolgica envolve, no s escolher um agente biolgico, e eventualmente

proceder a modificao gentica, mas tambm a produo, armazenamento, processamento
e distribuio como um dispositivo agressivo.

Caractersticas desejveis para os agentes biolgicos serem usados como arma

biolgica:
Gerar altos nveis de pnico na maioria da populao;
Fceis de obter;
Baratos;
Fceis de produo em larga escala;
Serem fceis na obteno da arma ou facilmente alterados para tal (modificao gentica);
Elevada infecciosidade;
Transmisso pessoa-a-pessoa;
Elevada mortalidade;
Ausncia de tratamento eficiente;
Necessidade de cuidados intensivos, forando os recursos;
Elevado potencial de baixas ou mortalidade;
Grande grau de efeito de desamparo;
Sintomas no-especficos, retardando o incio do reconhecimento;
Longos perodos de incubao;
Difceis de diagnosticar;
Resultar em doenas longas, com cuidados prolongados necessrios;

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Gentica Microbiana

Variedade de bactrias, vrus e toxinas que foram propostos como agentes

biolgicos eficientes - O CDC (Centers for Disease Control) agrupou-os em 3 categorias
CATEGORIA A
- Agentes de alta prioridade, que so uma ameaa segurana nacional uma vez que podem ser
facilmente transmitidos e divulgados, resultam em alta mortalidade, tm potencial impacto na sade
pblica, podendo causar pnico pblico, ou exigirem medidas especiais de preveno.
- representam a maior ameaa segurana nacional.

Antrax (Bacillus anthracis)

Bactrias

Peste (Yersinia pestis)

Botulismo (Clostridium botulinum)
Tularmia (Francisella tularensis)

Antrax
- existe naturalmente no solo (Bacillus anthracis), e os seus esporos tem uma durao muito
extensa;
- existe vacinao contra o antrax (foi desenvolvida para o exrcito americano)
- existem bacterifagos eficientes contra a bactria;
- contaminao pessoa-a-pessoa rara;
- j foi utilizado algumas vezes como arma biolgica inalao dos esporos da bactria.
Peste
- a peste pneumnica tem 100% de mortalidade e a bubnica cerca de 60%;
- possvel transmisso pessoa-a-pessoa;
- a ameaa como arma biolgico advm da sua fcil disseminao atravs da inalao.
Botulismo
- O botulismo uma forma de intoxicao alimentar rara, mas potencialmente fatal, causada por
uma toxina;
- toxina retirada da bactria Clostridium botulinum (toxina A, CAS )
- uma das toxinas mortais mais conhecida;
- Actua ao nvel do SNC, sendo altamente mortfera;
- causa paralisia muscular progressiva, causando insuficincia respiratria;
- botox: a toxina botulnica usada em pequenas doses, como tratamento cosmtico temporrio.
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Gentica Microbiana

Tularmia
- causada pela bactria Francisella tularensis;
- a Tularemia no acontece naturalmente em humanos, mas sim em animais;
- mas pode passar para humanos atravs de - bactrias aerotransportadas: Bactrias podem ser
aerotransportadas durante qualquer processo que perturbe o solo (possibilidade de arma biolgica!);
- se F. tularensis for usada como uma arma, as bactrias provavelmente seriam disseminadas pelo
ar, para uma exposio por inalao. As pessoas que inalam o aerossol infeccioso, desenvolvem
dificuldades respiratrias, inclusive risco de vida atravs de pneumonia e infeco sistmica, se no
forem tratadas.

Orthopoxvirus
Vrus

Filovrus
Arenavrus

Varola
Vrus bola: febre hemorrgica
Vrus Marburg: febre hemorrgica
Vrus lassa: febre da lassa
Vrus Junin: febre hemorrgica Argentina

Varola
- taxa de mortalidade de 35%;
- o hospedeiro o Homem;
- transmisso pessoa-a-pessoa;
- vantagem como arma biolgica: natureza altamente contagiosa; actualmente a vacinao rara,
pelo que a populao no est imunizada, sendo possvel um surto da doena.
Vrus bola
- taxa de mortalidade de 70-90%;
- disseminao muito forte e rpida;
- causa febre hemorrgica e falha mltipla dos rgos;
- transmisso pessoa-a-pessoa.
Vrus de Marburg
- taxa de mortalidade de 25%;
- Transmisso pessoa-a-pessoa.
Vrus Junin
- envolve diarreias
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Gentica Microbiana

CATEGORIA B
- Menos problemtico que a categoria A. Agentes da categoria B so moderadamente fcil de
disseminar e tm baixas taxas de mortalidade.
- representam a segunda maior ameaa segurana nacional.

Brucelose (Brucella)
Mormo (Burkholderia mallei)
Bactrias

Melioidose (Burkholderia pseudomallei)

Febre Q (coxiella burnetti)
Diversas doenas entricas (subcategoria b) causadas por:
Salmonella, E.coli, Vibrio cholerae, entre outras.

Brucelose
- Surge devido ao consumo de queijos frescos caseiros;
- No h contaminao de pessoa a pessoa.
Mormo (Glanders)
- Hospedeiros: burro, cavalo e mula; mas pode infectar o homem;
- No transmissvel de pessoa a pessoa;
- Devido alta taxa de mortalidade em seres humanos e ao pequeno nmero de organismos
necessrios para estabelecer a infeco, Burkholderia mallei considerada como um potencial de
arma biolgica; assim como a causadora de meliodose.
Febre Q
- Afecta seres humanos e outros animais;
- a infeco resulta da inalao de esporos da bactria;
- como arma biolgica: contagiosa, estvel em aerossis numa ampla gama de temperaturas,
sobrevive em superfcies at 60 dias.
Clera
- Provocada pela bactria vibrio cholerae;
- A taxa de mortalidade elevada, em condies de vida subdesenvolvida;
- susceptvel de ser tratado.
Diarreia 4 enterohemorrgica Provocada por E.coli

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Gentica Microbiana
Toxina psilon (Clostridium perfringens)
Toxinas

Enterotoxina B (Staphylococcus aureus)

Toxina Ricina (Ricin communis)

As toxinas causam efeitos semelhantes o botulismo. Afectam o SNC.

CATEGORIA C
- Terceira, mais alta, ameaa segurana nacional. Incluem agentes patognicos emergentes,
que podem ser projectados/engenheirados para a disseminao em massa no futuro.
Tuberculose

multirresistente

(Myvobacterium

tuberculosis)

Bactrias

Entre outras

Sndrome pulmonar
Hantavrus

Febre hemorrgica com sndrome

renal

Vrus
Flavivrus
Nipah

Febre amarela
Dengue
Encefalite

Hantavrus fonte de preocupao. Surgem de forma espontnea em grande nmero, e so

facilmente modificados.

AGROTERRORISMO
Forma alternativa de bioterrorismo.
Alvo recursos alimentares
Os agentes biolgicos so direccionados para culturas agrcolas e animais com interesse zootcnico.
Alvos mais bvios: culturas bsicas.

Culturas agrcolas
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Gentica Microbiana

Grande diversidade de doenas que as podem afectar: podem ser utilizadas para fazer Guerra
Biolgica.
Vrus;
Bactrias;
Fungos primitivos (ferrugens e bolores).
Ferrugens do trigo e da soja: fungos patognicos, que podem destruir as principais culturas.
Cravagem do centeio (Claviceps purpurea): fungo que produz toxina; provoca doenas, morte do
gado e at mesmo humanos; causa ergotismo nos humanos.
Este composto utilizado, de forma doseada, em alguns medicamentos para a enxaqueca.
Uma cultura inteira ter de ser avaliada, mesmo se apenas uma parte est infectada;
Provoca grandes problemas e perdas;
Os esporos de fungos patognicos ou outros agentes biolgicos podem ser dispersados a
partir de um simples avio.

- O Agroterrorismo fcil de implementar!

Contaminao de sementes
- Muitas plantaes so realizadas com sementes com provenincia variada, o que torna fcil o
processo de contaminao durante a sua expedio.

Agricultura Moderna
- Facilmente vulnervel ao agroterrorismo, pois largas reas so plantadas com alta densidade de
cultivares geneticamente idnticas das principais culturas agrcolas;
- Reduz a variabilidade gentica das populaes naturais, diminuindo a resistncia a numerosas
infeces e alteraes ambientais.

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Gentica Microbiana

Notas finais
Muitas doeas podem ser disseminadas atravs da gua: um bem essencial quer para a
populao quer para a agricultura Bio e Agroterrorismo;
Existem muitas doenas que so transmitidas para novos alimentos, assim como comeam a
ser causadoras de sintomatologia em humanos;
Por vezes, surgem em humanos doenas, que inicialmente estavam associadas a animais. A
transmisso/contaminao muitas vezes fcil (at atravs das culturas vegetais);
A associao entre um determinado organismo e uma doena no assim to linear. Por
exemplo, a salmonela no sempre transmitida apenas pelos ovos, sendo que j foi
encontrada em ervas aromticas.
No podemos considerar que os produtos biolgicos so melhores. Por serem biolgicos no
esto sujeitos a um grande controlo laboratorial, pelo que podem estar contaminados e essa
contaminao no detectada. O processamento industrial garante alguma segurana.
O antrax nao difcil de cultivar (a bactria). Contudo, a nvel prtico existem alguns
entraves, que felizmente impedem a sua utilizao como uma arma biolgica eficaz.

Guerra Biolgica
Embora seja relativamente fcil faze-la, felizmente tm existido sempre entraves pelo caminho que
tm evitado esses ataques em larga escala.
A possibilidade de contaminao de sementes deve ser considerada com um perigo futuro real.
Pode ser uma via de contaminao dos humanos, atravs da alimentao.

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Gentica Microbiana

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Gentica Microbiana

Tpico do Dia: Investigadores holandeses provocaram alteraes no vrus H5N1

O vrus, tal como est, no facilmente transmissvel, contudo em humanos altamente

letal.

Bastam 5 mutaes para que este vrus se torne altamente transmissvel e mortfero (via
area entre humanos).

O artigo cientfico em questo, ainda no est disponvel, est a ser decidido se a Science
pode ou no publicar o artigo.

Este trabalho cientfico poder funcionar, potencialmente, como uma receita viral para matar
mais de metade da humanidade.

Um dos problemas que se pe se essas cinco mutaes podem ser adquiridas

espontaneamente, provocando uma calamidade a nvel mundial.
Esta descoberta constitui uma coktail capaz de matar mais de metade da Humanidade.

Discusso

1. Devem realizar-se trabalhos de investigao em reas cujos resultados apresentam

benefcios potenciais, mas que tambm podem ser extremamente perigosos?
2. Os resultados devero ser amplamente divulgados, ou deve haver reserva de alguns itens?

Prs e Contras ??

Contras

Construo de uma arma biolgica, baseada em vrus

Utilizao dos resultados por grupos de investigadores mal intencionados

As normas ticas no esto preparadas para dar soluo a estas situaes Falha na
implementao e fiscalizao dessas normas

Divulgao dos resultados deve ser limitada, doseada e questionada

O prprio grupo de investigao pode ser constitudo por pessoas com intenes perigosas

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Gentica Microbiana

Criao de coktails virais de distribuio gratuita

Uso indevido (bioterrorismo)

Ausncia de um rgo mundial regulador

Acelerar possveis processos naturais com efeitos possivelmente desastrosos

A divulgao traz riscos (uso indevido). A construo de uma arma biolgica pode ser mais
rpida do que a descoberta de uma cura.

Prs

Promover formas de preveno (desenho de frmacos, avaliao de comportamentos de

risco, estudos epidemiolgicos, informao da populao)

Promover o conhecimento cientfico / Investigao fundamental

Promover formas de diagnstico e tratamento

Promove a investigao cruzada e a evoluo do pensamento tico

A no divulgao vai contra o direito informao

Desenvolver novos estudos / refutar os resultados

Restringe a manipulao das economias farmacutica

Se restrito, s o grupo com a informao tem o poder de utiliz-la

Conseguir prever um tratamento antes do acontecimento

Acalmar a opinio pblica e combater o alarmismo

O objectivo pode ser aumentar o conhecimento para a descoberta de uma cura

A divulgao pode despertar o interesse da comunidade cientfica, despertando o alerta para

actividades/intenes perigosas. H o aumento do controlo/fiscalizao.

A soluo seria publicar o artigo cientfico, mas com alguma reserva em relao ao material
e mtodos. Revelar os resultados, mas deixar alguns segredos escondidos, de forma a
desenvolver uma patente.

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