Materia de Microbiologia Aplicada

PONTIFÍCIA UNIVERSIDADE CATÓLICA DE GOIÁS – PUC GOIÁS
DEPARTAMENTO DE BIOLOGIA
CURSO DE ENGENHARIA DE ALIMENTOS
Disciplina: MICROBIOLOGIA APLICADA
Profa: Ana Maria da Silva Curado Lins, MSc.
Microbiologia
2010
Introdução à Microbiologia
Introdução
Microbiologia: Mikros (= pequeno) + Bio (= vida) + logos (= ciência)

A Microbiologia era definida, até recentemente, como a área da ciência que
dedica-se ao estudo dos microrganismos, um vasto e diverso grupo de organismos
unicelulares de dimensões reduzidas, que podem ser encontrados como células
isoladas ou agrupados em diferentes arranjos (cadeias ou massas), sendo que as
células, mesmo estando associadas, exibiriam um caráter fisiológico
independente.
Assim, com base neste conceito, a microbiologia envolve o estudo de
organismos procariotos (bactérias, archaeas), eucariotos inferiores (algas,
protozoários, fungos) e também os vírus.
Esta área do conhecimento teve seu início com os relatos de Robert Hooke e
Antony van Leeuwenhoek, que desenvolveram microscópios que possibilitaram as
primeiras observações de bactérias e outros microrganismos, além de diversos
espécimes biológicos. Embora Van Leeuwenhoek seja considerado o "pai" da
microbiologia, os relatos de Hooke, descrevendo a estrutura de um bolor, foram
publicados anteriormente aos de Leeuwenhoek. Assim, embora Leeuwnhoek tenha
fornecido importantes informações sobre a morfologia bacteriana, estes dois
pesquisadores devem ser considerados como pioneiros nesta ciência.
Recentemente foi publicado um artigo discutindo a importância de Robert
Hooke para o desenvolvimento da Microbiologia.
Classificação dos seres vivos
De acordo com a definição tradicional da microbiologia, esta é uma ciência

que até recentemente, era responsável pelo estudo de organismos classificados
em três reinos distintos: Monera, Protista e Fungi. No entanto, a partir dos
estudos de Carl Woese, a microbiologia passou a estar relacionada a três domínios
de seres vivos.
Sistemas de classificação dos seres vivos:
Linnaeus (séc. XVIII): reinos Animal e Vegetal
Haeckel (1866): introdução do reino Protista
Whittaker (1969): 5 reinos, dividos principalmente pelas características
morfólogicas e fisiológicas:
Monera: Procariotos
Protista: Eucariotos unicelulares - Protozoários (sem parede celular) e
Algas (com parede celular)
Fungi: Eucariotos aclorofilados
Plantae: Vegetais
Animalia: Animais
No entanto, a partir dos estudos de C. Woese (1977), passamos a dispor de

um sistema de classificação baseado principalmente em aspectos evolutivos
(filogenética), a partir da comparação das sequências de rRNA de diferentes
organismos. Com esta nova proposta de classificação, os organismos são agora
subdividos em 3 domínios (contendo os 5 reinos), empregando-se dados
associados ao caráter evolutivo.
Archaea: Procariotos
Bacteria: Procariotos
Eukarya: Eucariotos
A princípio, acredita-se que estes 3 domínios divergiram a partir de um
ancestral comum. Provavelmente os microrganismos eucarióticos atuaram como
ancestrais dos organismos multicelulares, enquanto as bactérias e archaeas
correspondem a ramos que não evoluíram além do estágio microbiano.
Archaea: são organismos procariotos que, freqüentemente são encontrados em
ambientes cujas condições são bastante extremas (semelhantes às condições
ambientais primordiais na Terra), sendo por isso, muitas vezes considerados como
sendo “ancestrais” das bactérias. No entanto, hoje em dia considera-se as
archaeas como um grupo “intermediário” entre procariotos e eucariotos. Muitos
destes organismos são anaeróbios, vivendo em locais "inabitáveis" para os
padrões humanos - fontes termais (com temperaturas acima de 100°C), águas
com elevadíssimos teores de sal (até 5M de NaCl - limite de dissolução do NaCl),
em solos e águas extremamente ácidos ou alcalinos (espécies que vivem em pH 0,
outras em pH 10) e muitas são metanogênicas.
Genericamente, podemos dizer que as Archaeas definem os limites da
tolerância biológica às condições ambientais.
Bacteria: Corresponde a um enorme grupo de procariotos, anteriormente

classificados como eubactérias, representadas pelos organismos patogênicos ao
homem, e bactérias encontradas nas águas, solos, ambientes em geral.
Dentre estas, temos as bactérias fotossintetizantes (cianobactérias) e outras
quimiossintetizantes (E. coli), enquanto outras utilizam apenas substratos
inorgânicos para seu desenvolvimento.
Eukarya: No âmbito microbiológico, compreende as algas, protozoários e

fungos (além das plantas e animais).
As algas caracterizam-se por apresentarem clorofila (além de outros pigmentos),
sendo encontradas basicamente nos solos e águas.
Os protozoários correspondem a células eucarióticas, apigmentados, geralmente
móveis e sem parede celular, nutrindo-se por ingestão e podendo ser saprófitas
ou parasitas.
Os fungos são também células sem clorofila, apresentando parede celular,
realizando metabolismo heterotrófico, nutrindo-se por absorção.
Como mencionado anteriormente, os vírus são também assunto abordado
em microbiologia, embora, formalmente, não exibam as características celulares,
no sentido de não apresentarem metabolismo próprio, de conterem apenas um
tipo de ácido nucleico, etc.
A Microbiologia na atualidade
A definição clássica de "microbiologia" mostra-se bastante imprecisa, e até

mesmo inadequada, frente aos dados da literatura publicados nesta última
década. Como exemplo pode-se citar duas premissas que já não podem mais ser
consideradas como verdade absoluta na conceituação desta área de
conhecimento: as dimensões dos microrganismos e a natureza independente
destes seres.
Em 1985 foi descoberto um organismo, denominado Epulopiscium fischelsoni que,
a partir de 1991, foi definido como sendo o maior procarioto já descrito, exibindo
cerca de 500 Pm de comprimento. Esta bactéria foi isolada do intestino de um
peixe marinho (Surgeonfish, peixe barbeiro ou cirurgião), encontrado nas águas
da Austrália e do Mar Vermelho. Além de apresentar dimensões nunca vistas, tal
bactéria mostra-se totalmente diferente das demais quanto ao processo de divisão
celular, que ao invés de ser por fissão binária, envolve um provável tipo de
reprodução vivíparo, levando à formação de pequenos “glóbulos”, que
correspondem às células filhas.
Mais recentemente, em 1999, outro relato descreve o isolamento de uma

bactéria ainda maior, isolada na costa da Namíbia. Esta, denominada
Thiomargarita namibiensis, pode ser visualizada a olho nú, atingindo até cerca de
0,8 mm de comprimento e 0,1 a 0,3 mm de largura.
Como analisar a questão do tamanho dos
microrganismos?
Durante muito tempo se acreditava que o tamanho das bactérias era
imposto pelo seu próprio metabolismo, ou seja, se a bactéria aumentasse muito
em tamanho, ela seria incapaz de se manter viável e morreria. Tal fato decorre da
seguinte dedução: A área superficial da membrana citoplasmática seria o fator
limitante para a eficiência das trocas com o meio externo.
Sabendo-se que a área de uma esfera é calculada pela fórmula e que o
volume de uma esfera é obtido pela fórmula , a medida que a área aumenta, seu
volume aumenta muito mais rapidamente. Assim, se uma bactéria começasse a
crescer, aumentando sua área, a proporção área/volume diminuiria. Isto faria com
que a célula passasse a apresentar um volume muito grande, sendo que sua área
superficial seria insuficiente, em termos de trocas através da membrana, para
manter sua viabilidade.
A partir dos isolados de bactérias “gigantes”, o conceito da limitação de
tamanho bacteriano vem sendo abandonado, pois não há mais como questionar a
existência e viabilidade destas bactérias e, possivelmente, novos relatos serão
incorporados, deixando de ser meras curiosidades.
Uma das explicações mais prováveis para tal fato reside na existência de
grandes mesossomos nestes tipos bacterianos, refutando assim a hipótese de que
tais estruturas seriam meros artefatos de microscopia.
Novos estudos vêm sendo realizados, os quais estão trazendo informações
sobre outras estratégias desenvolvidas pelos microrganismos para que
sobrevivam, quando apresentam dimensões extremamente maiores que os
microrganismos "convencionais".
Microrganismos atuando como seres multicelulares

Outro aspecto que vem sendo demonstrado refere-se ao caráter
“multicelular” das bactérias. Embora estas exibam a capacidade de sobreviver
como uma célula única, realizando os processos metabólicos necessários à sua
perpetuação, quando as bactérias encontram-se associadas, formando colônias,
ou biofilmes (estruturas rígidas, adesivas, de natureza geralmente polissacarídica,
que encontram-se fortemente ancoradas às superfícies, criando um ambiente
protegido que possibilita o crescimento microbiano), estas passam a se comportar
de forma social, exibindo divisão de tarefas e alterando seu perfil fisiológico de
forma a apresentar uma cooperação que reflete-se em diferentes níveis
metabólicos.
Sabe-se que muitos genes de virulência são expressos somente quando a
densidade populacional atinge um determinado ponto. Da mesma forma, a
capacidade de captar DNA do meio externo, a bioluminescência, etc, envolvem a
percepção da densidade populacional por parte das bactérias.
Este tipo de mecanismo de comunicação é denominado “sensor de quorum”
(quorum sensing) e vem sendo amplamente estudado nas mais diferentes áreas
da Microbiologia, uma vez que foi descrito tanto para bactérias como para fungos.
Estudos com bactérias primitivas
Ainda em relação às novas pesquisas desenvolvidas na área de Microbiologia,

temos o cultivo de bactérias pré-históricas, visando a busca de compostos com
atividade antimicrobiana ou de interesse comercial. Neste sentido, empresas
foram criadas (“Ambergene”), especializadas na reativação de formas bacterianas
latentes, isoladas de insetos preservados em âmbar. Os resultados obtidos
revelam a reativação de mais de 1200 espécies bacterianas, apresentando de 2 a
até 135 milhões de anos.
Em 2000, foi publicado um relato descrevendo o isolamento e cultivo de uma
espécie bacteriana a partir do líquido contido em um cristal de sal de 250 milhões
de anos. Os estudos de sequenciamento do DNA que codifica o RNA ribossomal
16S indicam que o organismo pertence ao gênero Bacillus, uma bactéria em forma
de bastonete, Gram positiva, com a capacidade de formar endósporos. Até o
momento, esta corresponde à espécie bacteriana mais antiga.
A questão da vida em marte
Em 1997, foram publicados relatos de expedições da NASA a Marte,

sugerindo a presença de possíveis microrganismos (“nanobactérias”) em
espécimes minerais, sendo que achados semelhantes foram também detectados
em partículas de meteoritos de Marte, que atingiram a Terra. A favor desta
hipótese há o achado de microrganismos que decompõem minerais,
frequentemente isolados das profundezas marinhas (A cerca de 1,5 km abaixo do
solo).
Os meteoritos apresentam carbono, fósforo, nitrogênio, além da presença
de água. Já em relação às condições ambientais de Marte (muito frio), temos
como contra-argumento o isolamento de Archaea a partir de ambientes
absolutamente inóspitos, inicialmente comsiderados como inadequados à vida.
De acordo com alguns pesquisadores, não é absurdo considerar que a vida
surgiu em Marte, pois estudos com o meteorito Nakhla, que caiu em 1911 no
Egito, com aparentemente de 1,3 bilhões de anos, revelam a presença de
elementos cocóides, potenciais fósseis bacterianos, variando de 0,25 a 2,0 Pm de
tamanho, o que seria correspondente ao tamanho médio atual das bactérias.
Curiosamente, estas formas ovais apresentam um teor maior de carbono no
seu interior que nas áreas ao seu redor. Além disso, exibem também um elevado
teor de óxido de ferro, um composto comum em células fossilizadas.
Recentemente, a NASA enviou outra sonda para Marte e os dados recebidos
reforçam cada vez mais a idéia da existência anterior de vida em Marte, devido
aos achados da possível ocorrência de água naquele planeta.
Assim, com base nestes novos achados e principalmente com estudos
envolvendo as Archaea, a microbiologia vem levantando uma série de questões
quanto à fisiologia e o metabolismo celular, além de questionar permanentemente
os limites das condições de vida.
Ubiqüidade dos microrganismos
Os microrganismos são os menores seres vivos existentes, encontrando-se

em uma vasta diversidade de ambientes e desempenhando importantes papéis na
natureza. Este grupo caracteriza-se por ser completamente heterogêneo, tendo
com única característica comum o pequeno tamanho dos organismos.
Acredita-se que cerca de metade da biomassa do planeta seja constituída
pelos microrganismos, sendo os 50% restantes distribuídos entre plantas (35%) e
animais (15%).
Em termos de habitat, os microrganismos são encontrados em quase todos
os ambientes, tanto na superfície, como no mar e subsolo. Desta forma, podemos
isolar microrganismos de fontes termais, com temperaturas atingindo até 130°C ;
de regiões polares, com temperaturas inferiores a -10°C; de ambientes
extremamente ácidos (pH=1) ou básicos (pH=13). Alguns sobrevivem em
ambientes extremamente pobres em nutrientes, assemelhando-se à água
destilada. Há ainda aqueles encontrados no interior de rochas na Antártida.
Em termos metabólicos, temos também os mais variados tipos, desde
aqueles com vias metabólicas semelhantes a de eucariotos superiores, até outros
que são capazes de produzir ácido sulfúrico, ou aqueles capazes de degradar
compostos pouco usuais como cânfora, herbicidas, petróleo, etc.
Uma vez que os microrganismos precederam o homem em bilhões de anos,
pode-se dizer que nós evoluímos em seu mundo e eles em nosso.
Desta forma, não é de se estranhar que a associação homem-
microrganismo mostra-se com grande complexidade, com os microrganismos
habitando nosso organismo, em locais tais como a pele, intestinos, cavidade oral,
nariz, ouvidos e trato genitourinário. Embora a grande maioria destes
microrganismos não causem qualquer dano, compondo a denominada “microbiota
normal”, algumas vezes estes podem originar uma série de doenças, com maior
ou menor gravidade. Nesta classe de organismos estão aqueles denominados
patogênicos e potencialmente patogênicos.
Sabe-se que em cerca de 1013 células de um ser humano podem ser
encontradas, em média, cerca de 1014 células bacterianas. No homem, estas se
encontram em várias superfícies, especialmente na cavidade oral e trato
intestinal.
Principais funções dos microrganismos na natureza
Além de seu importante papel como componentes da microbiota residente

de animais e plantas, em nosso dia a dia convivemos com os mais diversos
produtos microbiológicos “naturais” tais como: vinho, cerveja, queijo, picles,
vinagre, antibióticos, pães, etc. Paralelamente, não pode ser deixada de lado a
importância dos processos biotecnológicos, envolvendo engenharia genética, que
permitem a “criação” de novos microrganismos, com as mais diversas capacidades
metabólicas.
Os microrganismos desempenham também um importante papel nos
processos geoquímicos, tais como o ciclo do carbono e do nitrogênio, sendo
genericamente importantes nos processos de decomposição de substratos e sua
reciclagem. Dentre os compostos utilizados como substrato temos, alguns de
grande importância atualmente: DDT, outros pesticidas, cânfora, etc.
O carbono encontra-se na atmosfera primariamente como CO2, sendo
utilizado pelos organismos fotossintetizantes, para sua nutrição.
Virtualmente, a energia para o desenvolvimento da vida na Terra é derivada, em
última análise, a partir da luz solar. Esta é captada pelas plantas e
microrganismos fotossintetizantes (algas e bactérias), que convertem o CO2 em
compostos orgânicos, através da reação:
CO2 + H2O => (CH2O)n + O2
Os herbívoros alimentam-se de plantas e os carnívoros alimentam-se dos
herbívoros.
O CO2 atmosférico torna-se disponível para a utilização na fotossíntese
origina-se de duas fontes biológicas principais: 1) 5 a 10% a partir de processos
de respiração e 2) 90 a 95% oriundos da degradação (decomposição ou
mineralização) microbiana de compostos orgânicos.
Em termos de ciclo global, há um balanço entre o consumo de CO2 na
fotossíntese e sua produção através da mineralização e respiração. Este balanço,
no entanto, vem sendo fortemente alterado por atividades humanas, tais como a
queima de combustíveis fósseis, promovendo um aumento da qualntidade de CO2
atmosférico, resultando no conhecido “efeito estufa”.
A celulose existente nas plantas, embora seja um substrato extremamente
abundante na Terra, não é utilizável pela vasta maioria dos animais. Por outro
lado, vários microrganismos, incluindo fungos, bactérias e protozoários a utilizam,
como fonte de carbono e energia. Destes microrganismos, muitos encontram-se
no trato intestinal de vários herbívoros e nos cupins.
Muitos compostos tóxicos podem ser degradados por microrganismos,
dentre eles, policlorados, DDT, pesticidas.
Outra abordagem que tem se mostrado de grande valia para o homem
refere-se à introdução de genes bacterianos em outros organismos (ditos
transgênicos), tais como plantas. Assim, está em franco desenvolvimento a
obtenção de plantas transgênicas resistentes a pesticidas ou ao ataque de insetos.
Microrganismos como agentes de doenças
Os microrganismos, eventualmente provocam doenças no homem, outros

animais e plantas. Apesar dos enormes avanços em relação ao tratamento de
doenças infecciosas, estas vêm se tornando novamente um tema preocupante, em
virtude do crescente surgimento de linhagens bacterianas cada vez mais
resistentes às drogas. Atualmente, a Organização Mundial da Saúde vem
demonstrando crescente interesse nas doenças emergentes e reemergentes, de
origem infecciosa.
Abaixo apresentamos um quadro cronológico que deixa clara tais
preocupações, em relação ao número de mortes provocadas por doenças
infecciosas.
Importância da Microbiologia
É uma área da Biologia que tem grande importância seja como ciência
básica ou aplicada.
Básica: estudos fisiológicos, bioquímicos e moleculares (modelo comparativo
para seres superiores). => Microbiologia Molecular Aplicada: processos industriais,
controle de doenças, de pragas, produção de alimentos, etc.
Áreas de estudo:
Odontologia: Estudo de microrganismos associados à placa dental, cárie dental e
doenças periodontais. Estudos com abordagem preventiva.
Medicina e Enfermagem: - Doenças infecciosas e infecções hospitalares.
Nutrição: - Doenças transmitidas por alimentos, Controle de qualidade de
alimentos, Produção de alimentos (queijos, bebidas).
Biologia: - Aspectos básicos e biotecnológicos. Produção de
antibióticos, hormônios (insulina, GH), enzimas (lipases, celulases), insumos
(ácidos, álcool), Despoluição (Herbicidas - Pseudomonas, Petróleo), Bio-filme
(Acinetobacter), etc.
BIOTECNOLOGIA - Uso de microrganismos com finalidades industriais, como
agentes de biodegradação, de limpeza ambiental, etc.
Um breve histórico da importância da microbiologia

Efeitos das doenças nas civilizações
Talvez um dos aspectos mais negligenciados quando se estuda a microbiologia
refere-se às profundas mudanças que ocorreram no curso das civilizações,
decorrentes das doenças infecciosas.
De forma geral, as doenças provocavam um abatimento físico e moral da
população e das tropas, muitas vezes influenciando no desenrolar e no resultado
de um conflito.
A própria mobilização de tropas, resultando em uma aglomeração, muitas
vezes longa, de soldados, em ambientes onde as condições de higiene e de
alimentação eram geralmente inadequadas, também colaborava na disseminação
de doenças infecciosas, para as quais não existiam recursos terapêuticos.
Paralelamente, em áreas urbanas em franca expansão, os problemas
mencionados acima eram também de grande importância, pois rapidamente as
cidades cresciam, sendo que as instalações sanitárias geralmente eram
completamente precárias.
Com a prática do comércio entre as diferentes nações emergentes, passou a
haver a disseminação dos organismos para outras populações, muitas vezes
susceptíveis a aqueles agentes infecciosos.
Abaixo listaremos, brevemente, um pequeno histórico com alguns exemplos dos
efeitos das doenças microbianas no desenvolvimento de diferentes civilizações.
O declínio do Império Romano, com Justiniano (565 AC), foi acelerado por
epidemias de peste bubônica e varíola. Muitos habitantes de Roma foram mortos,
deixando a cidade com menos poder para suportar os ataques dos bárbaros, que
terminaram por destruir o Império.
Durante a Idade Média varias novas epidemias se sucederam, sendo
algumas amplamente disseminadas pelos diferentes continentes e outras mais
localizadas. Dentre as principais moléstias pode-se citar: Tifo, varíola, sífilis,
cólera e peste.
Em 1346, a população da Europa, Norte da África e Oriente Médio era de
cerca de 100 milhões de habitantes. Nesta época houve uma grande epidemia da
peste, que disseminou-se através da “rota da seda” (a principal rota mercante
para a China), provocando um grande número de mortes na Ásia e posteriormente
espalhando-se pela Europa, onde resultou em um total de cerca de 25 milhões de
pessoas, em poucos anos.
Novas epidemias da peste ocorreram nos séculos XVI e XVII, sendo que no
século XVIII (entre 1720 e 1722), uma última grande epidemia ocorreu na França,
matando cerca de 60% da população de Marselha, de Toulon,. 44% em Arles,
30% em Aix e Avignon.
A epidemia mais recente de peste originou-se na China, em 1892,
disseminando-se pela Índia, atingindo Bombaim em 1896, sendo responsável pela
morte de cerca de 6 milhões de indivíduos, somente na Índia.
Antes da II Guerra Mundial, o resultado das guerras era definido pelas
armas, estratégias e “pestilência”, sendo esta última decisiva. Em 1566,
Maximiliano II da Alemanha reuniu um exército de 80.000 homens para enfrentar
o Sultão Soliman da Hungria. Devido a uma epidemia de tifo, o exército alemão foi
profundamente dizimado, sendo necessária a dispersão dos sobrevivente,
impedindo assim a expulsão das hordes de tribos orientais da Europa nesta época.
Na guerra dos 30 anos (1618-1648), onde protestantes se revoltaram
contra a opressão dos católicos, além do desgaste decorrente da longa duração do
confronto, as doenças foram determinantes no resultado final.
Na época de Napoleão, em 1812, seu exército foi quase que completamente
dizimado por tifo, disenteria e pneumonia, durante campanha de retirada de
Moscou. No ano seguinte, Napolãeo havia recrutado um exército de 500.000
jovens soldados, que foram reduzidos a 170.000, sendo cerca de 105.000 mortes
decorrentes das batalhas e 220.000 decorrentes de doenças infecciosas.
Em 1892, outra epidemia de peste bubônica, na China e Índia, foi
responsável pela morte de 6 milhões de pessoas.
Até a década de 30, este era quadro, quando Alexander Fleming,
incidentalmente, descobriu um composto produzido por um fungo do gênero
Penicillium, que eliminava bactérias do gênero Staphylococcus, um organismo que
pode produzir uma vasta gama de doenças no homem. Este composto -
denominado penicilina - teve um papel fundamental na desfecho da II Guerra
Mundial, uma vez que passou a ser administrado às tropas aliadas, enquanto o
exército alemão continuava a sofrer pesadas baixas no campo de batalha.
Além destas epidemias, vale ressaltar a importância das diferentes
epidemias de gripe que assolaram o mundo e que continuam a manifestar-se de
forma bastante intensa até hoje. Temos ainda o problema mundial envolvendo a
AIDS, o retorno da tuberculose (17 milhões de casos no Brasil) e do aumento
progressivo dos níveis de resistência aos agentes antimicrobianos que vários
grupos de bactérias vêm apresentando atualmente.
Morfologia e ultraestrutura bacterianas (Parte 1)

Morfologia: Tamanho, forma e arranjos bacterianos
As bactérias são extremamente variáveis quanto ao tamanho e formas que
apresentam. Até recentemente acreditava-se que as menores bactérias
apresentavam cerca de 0,3 Pm (ex: Mycoplasma), entretanto, já existem relatos
de células menores, denominadas nanobactérias ou ultramicrobactérias, com
tamanhos variando de 0,2 a 0,05 Pm de diâmetro, sendo algumas inclusive já
cultivadas em laboratório. Há ainda controvérsias quanto a este grupo, pois vários
autores acreditam ser meros artefatos.
Muitas bactérias medem de 2 a 6 Pm de comprimento, por 1 a 2 Pm de largura,
mas certamente estes valores não podem ser definidos como absolutos, pois
eventualmente encontramos bactérias de até 500 ou 800 Pm, como no caso de
Epulopiscium ou Thiomargarita.
Em relação às formas, a maioria das bactérias estudadas seguem um padrão
menos variável, embora existam vários tipos morfológicos distintos. De maneira
geral, as bactérias podem ser agrupadas em três tipos morfológicos gerais: cocos,
bacilos e espiralados.
Os cocos correspondem a células arredondadas, podem se dividir sem um plano
de orientação definido, o que leva a um grande número de arranjos diferentes.
Assim temos os cocos isolados, diplococos (Neisseria, pneumococos), tetracocos,
sarcinas (cubos contendo 8 células), estreptococos (cocos em cadeia) e
estafilococos (cocos formando massas irregulares).
Os bacilos têm forma de bastonetes, podendo apresentar extremidades
retas (Bacillus anthracis), arredondadas (Salmonella, E. Coli), ou ainda afiladas
(Fusobacterium). Como seu plano de divisão é fixo, ocorrendo sempre no menor
eixo, os bacilos exibem uma menor variedade de arranjos, sendo via de regra
encontrados isolados, como diplobacilos ou ainda como estreptobacilos. Há ainda
um arranjo, denominado “em paliçada”, também denominado letras chinesas, que
é típico do gênero Corynebacterium. Tal tipo de arranjo ocorre porque a parede
celular desses organismos é dupla e no momento da divisão celular ocorre a
ruptura de apenas uma das camadas, deixando as células unidas pela camada de
parede que não se rompeu. Os bacilos podem ainda apresentar-se como pequenas
vírgulas (Vibrio cholerae) ou em forma de meia lua (Selenomonas).
Espiralados: Sua nomenclatura é bastante controvertida ainda. Um tipo de

classificação divide os espiralados em dois grupos, osespiroquetas, que
apresentam uma forma de espiral flexível, possuindo flagelos periplasmáticos. O
outro grupo são os espirilos, que exibem geralmente morfologia de espiral
incompleta e rígidos. Geralmente os espiralados são microrganismos bastante
afilados, de difícil observação por microscopia de campo claro, sendo muitas vezes
analisados por meio da microscopia de campo escuro, ou de técnicas de coloração
empregando a impregnação por sais de prata.
Há ainda formas intermediárias como os cocobacilos; formas pleomórficas

(quando o microrganismo não tem uma morfologia padrão), tal como
Mycoplasma; ou ainda formas de involução, originadas quando o meio encontra-se
desfavorável ao desenvolvimento. Nesses casos, como o organismo deixa de
realizar os processos metabólicos (nutrição e divisão celular) adequadamente,
este sofre alterações morfológicas.
Há também bactérias apresentando apêndices, tais como extensões
celulares na forma de longos tubos ou hastes (prostecas) (Rhodomicrobium
vannielii). Além destas bactérias, estudos vêm revelando a ocorrência de bactérias
com formas bastante peculiares, tais como células estreladas ou retangulares.
Ultraestrutra Bacteriana
A ultraestrutura bacteriana começou a ser estudada em maiores detalhes

nas décadas de 50 e 60, a partir do melhoramento das técnicas de microscopia
eletrônica. Os procedimentos adotados incluíam a lise celular, seguida de
centrifugação para promover a separação dos vários componentes subcelulares,
que podiam agora ser purificados e analisados bioquimicamente.
Parede Celular - Estrutura presente na maioria das bactérias conhecidas, exceto
em micoplasmas e algumas Archaea, que não a possuem.
Corresponde a uma das estruturas mais importantes nas células bacterianas,
estando localizada na porção mais externa, acima da membrana citoplasmática.
Devido à sua grande rigidez, a parede celular é responsável pela manutenção da
forma do microrganismo. Como o ambiente intracelular é bastante concentrado
em relação ao meio externo, (variando de 2 a até 10 atm), a parede atua como
uma barreira física rígida, que mantém a forma celular, impedindo que a célula
estoure em decorrência do grande turgor.
Além disso, a parede celular atua como uma barreira de proteção contra
determinados agentes físicos e químicos externos, tais como o choque osmótico. A
parede pode ainda desempenhar importante papel em microrganismos
patogênicos, em decorrência de presença de componentes que favorecem sua
patogenicidade, tais como antígenos ou moléculas envolvidas no reconhecimento
celular.
Em 1884, Christian Gram desenvolveu um método de coloração de bactérias
que permitia sua separação em dois grupos distintos, as Gram positivas (que
coravam-se em roxo) e as Gram negativas (que coravam-se em vermelho). A
partir do advento da microscopia eletrônica e do aperfeiçoamento das técnicas de
análise bioquímica dos diferentes componentes celulares, foi verificado que esta
diferença entre as bactérias Gram positivas e Gram negativas era, provavelmente,
devida às diferenças de composição e estrutura das paredes celulares.
Assim, quando observadas sob microscopia eletrônica de transmissão, as
bactérias Gram positivas apresentam uma parede celular espessa (de 20 a 80
nm), de aspecto homogêneo, enquanto as células Gram negativas exibem uma
parede mais delgada (de 9 a 20 nm) e de aspecto bastante complexo,
aparentemente apresentando mais de uma camada. A microscopia eletrônica de
varredura revelou outras diferenças entre estes dois grupos de organismos. As
Gram positivas exibiam a superfície mais lisa e homogênea, enquanto as Gram
negativas apresentavam-se com maior complexidade superficial.
Composição da parede celular
Peptideoglicano (mureína ou mucopeptídeo): Compostoexclusivamente

encontrado no domínio Bacteria, sendo o responsável pela rigidez da parede
celular. O peptideoglicano corresponde a um enorme polímero complexo que, em
bactérias Gram positivas pode formar até 20 camadas, enquanto em células Gram
negativas está presente, formando apenas uma ou duas camadas.
O peptideoglicano corresponde a um esqueleto, formado por dois derivados
de açúcares, a N-acetilglicosamina (NAG) e o ácido Nacetilmurâmico (NAM),
unidos alternadamente, através de ligações do tipo ß-1,4. O grupo carboxil de
cada molécula de NAM liga-se a um tetrapeptídeo, composto por aminoácidos que
alternam-se nas configurações L e D. Destes aminoácidos, o D-glutamato, D-
alanina e o ácido mesodiaminopimélico não são encontrados em qualquer outra
proteína conhecida.
Acredita-se que sua presença confira maior resistência da parede contra a
maioria das peptidases.
Assim, em cada resíduo de NAM há um tetrapeptídeo associado. A enorme
rigidez da da parede celular é resultante das ligações entre os tetrapeptídeos de
cadeias adjacentes. Neste aspecto, há uma grande diferença entre as bactérias
Gram positivas e negativas. Nas bactérias Gram negativas (Ala-Glu-DAP-Ala), a
ligação entre os tetrapepídeos é direta, ocorrendo entre o grupamento amino do
DAP subterminal (posição 3) e o grupamento carboxi da D-Ala terminal (posição
4). Já nas Gram positivas (Ala-Glu-Lys-Ala), a ligação é indireta, sendo mediada
por uma ponte interpeptídica de natureza variável (cinco glicinas em S. aureus). A
análise das figuras abaixo deixa clara a grande estruturação do peptídeoglicano,
em virtude das inúmeras ligações cruzadas existentes ao longo da molécula.
Assim, devido a esta complexa estruturação física, o peptideoglicano confere
rigidez à parede, embora exiba certo grau de elasticidade e também porosidade.
Nas bactérias Gram positivas, cerca de 90% da parede celular é composta

pelo peptídeoglicano, que geralmente forma cerca de 20 camadas.
O restante da parede é composto essencialmente por ácido teicóico. Nas
bactérias Gram negativas, apenas cerca de 10% da parede corresponde ao
peptideoglicano, existindo geralmente como uma camada única ou dupla. Os
demais componentes da parede celular de bactérias Gram negativas serão
analisados posteriormente.
Esquema ilustrando o espesso peptideoglicano de bactérias Gram positivas
(Adaptado de Madigan et al., Brock Biology of Microorganisms, 2003)
Ácidos Teicóicos: Juntamente com peptideoglicano, os ácidos teicóicos

compõem a parede celular das bactérias Gram positivas. Estes compostos,
presentes em grandes quantidades, correspondem a polímeros de glicerol ou
ribitol ligados a açúcares ou aminoácidos e conectados entre si por meio de
grupamentos fosfato.
Os ácidos teicóicos associam-se ao peptideoglicano pela ligação do
grupamento 6 hidroxil do ácido N-acetilmurâmico, podendo alternativamente
associar-se aos lipídeos da membrana citoplasmática, quando passam a ser
denominados de ácidos lipoteicóicos. Devido à sua carga negativa, os ácidos
teicóicos contribuem com o caráter negativo da superfície celular de Gram
positivas. Seu papel fisiológico é ainda desconhecido, mas especula-se que estes
possam participar nos processos de passagem de íons pela parede, ou ligar-se a
prótons, mantendo um pH celular relativamente baixo.
Em casos de escassez de fosfato, os ácidos teicóicos podem ser substituídos
por ácidos teicurônicos, deixando assim os fosfatos livres para comporem ATP ou
DNA, por exemplo.
Fórmula de um ácido teicóico, contendo ribitol

O componente adicional da Parede Celular de Gram negativos
Membrana Externa: Esta, embora denominada "membrana"externa é um

componente da parede celular, presente apenas nas bactérias Gram negativas. A
membrana externa corresponde a uma segunda bicamada lipídica (semelhante à
membrana plasmática), localizada acima do peptideoglicano, contendo
fosfolipídeos, lipoproteínas, proteínas e também lipopolissacarídeos. Quando
comparada à membrana citoplasmática, a membrana externa exibe maior
permeabilidade a pequenas moléculas, tais como glicose ou outros
monossacarídeos.
Sua face interna geralmente é rica em pequenas lipoproteínas (7,2 kDa),
denominadas lipoproteínas de Braun, que ligam-se covalentemente ao
peptideoglicano, ancorando firmemente a membrana externa à camada de
peptideoglicano.
Estudos indicam que a membrana externa e a membrana citoplasmática
mantém contato em algumas discretas regiões celulares, denominadas sítios de
adesão. Acredita-se que estas regiões de junção podem conferir maior rigidez à
parede celular das bactéria Gram negativas, além de fixar melhor a membrana
externa, não deixando-a frouxa, associada somente ao peptideoglicano. Os sítio
de adesão foram também denominados junções de Bayer e acredita-se que
possam ser importantes locais de passagem de compostos citoplasmáticos, seja
componentes envolvidos na síntese da membrana externa ou diferentes
nutrientes.
Esquema da parede celular de organismos Gram negativos
A face externa da membrana externa é rica em lipopolissacarídeos (LPS),
inexistentes na membrana citoplasmática. Estes componentes são também
denominados de endotoxina, uma vez que provocam febre, choque e
eventualmente morte, quando injetados em animais. O LPS é uma molécula
complexa, composta por 3 regiões distintas: lipídeo A, polissacarídeo central e
cadeia polissacarídica lateral O, ou Antígeno O.
Esquema do lipopolissacarídeo, encontrado na face externa da membrana
externa
O lipídeo A corresponde à porção mais interna da molécula, ancorando o
LPS à porção hidrofóbica da membrana externa. Este componente corresponde à
porção tóxica do LPS e geralmente é composto por ácido esteárico, palmítico,
mirístico, láurico ou capróico. Estes ácidos graxos estão ligados a um dissacarídeo
de NAcGlicosamina-P. A porção polissacarídica localiza-se acima do lipídeo A, em
direção ao exterior, sendo composta por duas regiões, o polissacarídeo central e
polissacarídeo O, que é mais externo, de natureza repetitiva. Em Salmonella, o
cerne é composto por 10 açúcares pouco usuais. Conectado ao cerne, há o Ag O,
que geralmente é composto por 3 a 5 açúcares bastante peculiares e variáveis. A
natureza destes açúcares pode ser modificada pelos microrganismos, resultando
em um mecanismo de evasão do sistema imune. O LPS também confere carga
nagativa à superfície celular.
O LPS se associa a proteínas, formando a face externa da unidade de
membrana.
A membrana externa apresenta um grupo especializado de proteínas,
denominadas genericamente de porinas, que atuam como canais para a
passagem de pequenas moléculas hidrofílicas, participando assim do processo de
nutrição. As porinas podem ser específicas, contendo sítios de ligação para 1 ou
mais substratos, ou inespecíficas, compondo canais aquosos.
A maioria das porinas correspondem a proteínas transmembrânicas, com 3
subunidades idênticas, que formam orifícios de cerca de 1 nm, sendo que,
aparentemente, possuem mecanismos para a abertura e fechamento. Para
algumas substâncias, a membrana externa é mais restritiva.
Compostos que afetam a Integridade da Parede Celular
Ação da Lisozima na PC: Esta enzima, sintetizada por alguns organismos

e por glândulas endócrinas do homem, age clivando as ligações do tipo β-1,4,
presentes no peptideoglicano. Nas células Gram positivas, o tratamento com
lisozima origina protoplastos (células sem parede celular), enquanto nas Gram
negativas, a lisozima origina esferoplastos (células com resquícios de parede
celular).
Ação da penicilina na PC: Este antibiótico impede a ligação dos
tetrapeptídeos. A droga se liga irreversivelmente às PBPs, que são proteínas
envolvidas no processo de biossíntese do peptideoglicano. Paralelamente, as
autolisinas, que atuam em conjunto com a maquinaria de biossíntese, passam a
degradar porções do peptideoglicano. Como a síntese está bloqueada, o resultado
líquido é a formação de uma parede defeituosa.
A Camada S
Algumas bactérias e várias Archaea apresentam uma camada de natureza
protéica ou glicoprotéica estruturada (como um piso de tacos), denominada
camada S. Esta camada, as bactérias, encontra-se acima da parede celular e até o
momento, suas funções não se encontram totalmente esclarecidas.
Acredita-se que esta camada proteja a célula contra flutuações osmóticas,
de pH e íons, além de auxiliar na manutenção da rigidez da parede. Alguns
autores especulam que a camada S pode mediar a ligação dos organismos a
superfícies.
Microscopia eletrônica de uma célula contendo a camada S.
(Adaptado de Prescott et al., 2002)
Cápsula, Glicocálix e camada limosa - A cápsula pode ser definida

como uma camada externa à parede celular, geralmente apresentando-se como
um material viscoso, fortemente associado à superfície celular, geralmente de
natureza polissacarídica e raramente protéica. Por outro lado, o termo camada
limosa é algumas vezes definido como uma uma zona difusa, contendo material
pouco organizado, sendo facilmente removida.
A presença da cápsula normalmente confere vantagens às bactérias, pois
suas principais funções incluem: ligação às células do hospedeiro, fator de
virulência por dificultar a fagocitose e também a proteção, seja aumentando a
resistência ao dessecamento, uma vez que armazena grandes quantidades de
água, fonte de nutrientes e proteção contra a infecção por bacteriófagos, ou
interação com anticorpos.
Em odontologia, a presença da cápsula pode ser considerada como um
importante fator de virulência para o principal agente cariogênico - S.mutans, que
sintetiza um cápsula composta por um homopolissacarídeo denominado glucano
(produto da degradação da sacarose em glicose e frutose). Tal polímero adere-se
firmemente à parede celular do microrganismo e permite sua aderência ao
esmalte, favorecendo sua colonização.
Outros microrganismos apresentam cápsula de natureza heteropolimérica -
S. pneumoniae. Eventualmente, a cápsula pode ser de natureza polipeptídica,
como em B. anthracis (ácido glutâmico, na forma D).
Micrografia óptica, empregando a

tácnica de coloração negativa,
revelando células capsuladas.
(Adaptado de Tortora et al., Microbiologia, 1998)
Micrografia eletrônica de
transmissão, revelando a delgada
cápsula circudando a célula
(Adaptado de "An eletctronic companion to microbiology")
Fímbrias e Pili - Muitas bactérias Gram negativas apresentam apêndices

finos (3 a 10 nm), retos e curtos, denominados fímbrias. Geralmente estas são
bastante numerosas, podendo atingir números de 1000 ou mais por célula. Como
são muito pequenas e delgadas, somente podem ser visualizadas pela microscopia
eletrônica. As fímbrias são de natureza protéica, compostas por subunidades
repetitivas de uma proteína denominada genericamente de pilina. As fímbrias
possuem, geralmente em sua extremidade, e algumas vezes ao longo da
estrutura, proteínas distintas, denominadas adesinas, as quais mediam a adesão
específica da célula bacteriana a diferentes substratos.
Micrografia eletrônica de
varredura de bacilos apresentando
fímbrias
Esquema ilustrando a organização
estrutural de uma fímbria, assinalando a
presença de moléculas do tipo adesina,
situadas na extremidade da estrutura
(Adaptado de An Electronic Companion to Microbiology)
Muitas bactérias podem ainda apresentar outro tipo de apêndice,
denominado pilus F ou fímbria sexual, o qual exibe semlhanças estruturais com as
fímbrias. No entanto, este tipo de fímbra é normalmente encontrado em um
menor número nas células, variando de 1 a 10. O pilus F corresponde a uma
estrutura bastante longa e menos rígida que as fímbrias convencionais, estando
envolvido no reconhecimento de outras bactérias, em um processo de
transferência de genes denominado conjugação.
Micrografia eletrônica colorizada, revelando a longa fímbria sexual (pilus F).
Observar também a presença de fímbrias.
Atualmente, diferentes tipos diferentes de fímbrias vêm sendo descritos,
sendo vários destes associados à adesão, ou à virulência.
Bactérias Gram positivas podem, muitas vezes, apresentar estruturas
fibrilares (diferentes de fímbrias) em sua superfície, provavelmente também
envolvidas nos processos de adesão a substratos.
Flagelos - Estruturas longas, delgadas e relativamente rígidas,
apresentando cerca de 20 nm de espessura e 15 a 20 Pm de comprimento,
responsáveis pela locomoção das bactérias. Devido à sua pequena espessura, os
flagelos somente podem ser visualizados por meio de colorações específicas,
microscopia de campo escuro, ou por microscopia eletrônica.
De acordo com o número e distribuição dos flagelos, as bactérias podem ser
classificadas como: atríquias (sem flagelos), monotríquias (um único flagelo),
anfitríquias (um flagelo em cada extremidade) , lofotríquias (um tufo de flagelos
em uma, ou ambas as extremidades) e peritríquias (apresentando flagelos ao
longo de todo o corpo bacteriano).
Bactéria monotríquia
(Adaptado de Atlas, 1997 - Principles of
Microbiology)
Bactéria anfitríquia
(Adaptado de Tortora et al., 1998 - Microbiology)
Bactéria lofotríquia
(Adaptado de Tortora et al., 1998 -
Microbiology)
Bactéria lofotríquia
(Adaptado de Atlas, 1997 - Principles of
Microbiology)
Bactéria peritríquia
Microbiology)
Bactéria peritríquia
Estrutura - Estruturalmente, o flagelo pode ser subdivido em 3 regiões:
filamento, corpo basal e gancho, sendo estas duas últimas importantes para a
inserção e movimentão do filamento. O filamento dos flagelos apresenta estrutura
helicoidal, com comprimento de onda constante para cada espécie.
Este corresponde a um cilindro longo e oco, composto por unidades
repetitivas de uma proteína denominada genericamente de flagelina, que pode
variar de 30 a 60 kDa, dependendo do microrganismo. Sua extremidade distal é
revestida por uma proteína seladora. Algumas bactérias apresentam bainhas de
diferentes naturezas revestindo o filamento, tal como em Vibrio cholerae, ou
Bdellovibrio. O gancho apresenta maior espessura que o filamento, sendo
composto por diferentes subunidades protéicas. O corpo basal corresponde à
porção mais complexa do flagelo, apresentando 4 anéis ligados a um bastão
central em bactérias Gram negativas, enquanto em Gram positivas são
observados apenas 2 anéis. Os anéis externos L e P associam-se ao LPS e
peptidioglicano, respectivamente, enquanto os anéis S e M estão associados à
membrana citoplasmática.
Esquema da estrutura dos flagelos bacterianos, em células
Gram negativas (à esquerda) e Gram positivas (à direita)
(Adaptado de Prescott et al., Microbiology, 2000)
Detalhe ampliado da estrutura de um flagelo de células Gram negativas
Síntese flagelar - Muitos genes estão envolvidos na síntese do flagelo e na
mobilidade celular. Em E. coli e Salmonella foram identificados mais de 40 genes
(fla), que codificam proteínas estruturais, de exportação de componentes para o
exterior e de regulação de muitos eventos bioquímicos envolvidos na síntese de
novos flagelos. A síntese de flagelos é fortemente regulada, tanto por fatores
metabólicos como por sinais emitidos durante a divisão celular. Acredita-se que as
subunidades de flagelina sejam transportadas ao longo do filamento e se
autoarranjam espontaneamente, quando atingem a ponta.
Movimentação - A movimentação dos flagelos ocorre através de um
mecanismo de rotação do filamento, em velocidades que podem atingir até 270 ou
1100 rps, o que permite uma locomoção de até 100 Pm/segundo, correspondendo
a 100 vezes o seu comprimento/minuto. Os flagelos atuariam de maneira análoga
a propulsores de um barco, sendo o sentido da rotação importante para o tipo de
movimentação resultante. Em muitas células monotríquias, a rotação no sentido
anti-horário promove a movimentação para frente, enquanto a rotação no sentido
horário faz com que a célula se locomova no sentido oposto.
Em outras monotríquias, quando o flagelo gira no sentido horário promove a
locomoção.
Tipos de movimentação de células monotríquias
No caso de bactérias peritríquias, quando os flagelos giram no sentido
antihorário as células se movem para frente. Estes dobram seus ganchos e seus
filamentos se agrupam, formando um feixe, que gira e propele a célula.
Quando a rotação ocorre no sentido horário, os flagelos se separam e a bactéria
passa a vibrar somente, até que os flagelos voltem a girar no sentido anti-horário,
impulsionando novamente a célula para frente.
Para que haja a movimentação, o bastão localizado entre o gancho e o anel M tem
a capacidade de rodar livremente na membrana citoplasmática.
Acredita-se que o anel S esteja fixo na parede celular, sem a possibilidade de
rodar. Os anéis P e L sustentariam o bastão. Há evidências que o corpo basal
atuaria como uma estrutura passiva que giraria no interior de um complexo
proteíco inserido na membrana, semelhante a um rotor de um motor elétrico, que
gira no centro de um anel de eletromagnetos (estator). A energia necessária para
a rotação é provida pela força próton motiva. A dissipação do gradiente de prótons
cria uma força que gira o flagelo no sentido anti-horário, impelindo o
microrganismo. O rotor seria composto pelo bastão central, pelo anel M e por um
anel C, ligado ao M através da membrana citoplasmática. Estes anéis são
formados por várias proteínas, sendo a FliG bastante importante. No estator,
temos as proteínas MotA e MotB, que formam um canal de prótons, sendo que
MotB também ancora o complexo ao peptideoglicano.
Esquema ilustrando a movimentação de bactérias peritríquias
Flagelos periplasmáticos - Estes flagelos são encontrados apenas nos
espiroquetas (sendo muitas vezes denominados de filamentos axiais). Como o
prórpio nome indica, estes flagelos situam-se no periplasma, localizandose abaixo
da membrana externa destas bactérias. Os flagelos periplasmáticos originam-se a
partir dos polos celulares, voltando-se em direção ao centro da célula, envolvendo
a membrana citoplasmática do corpo bacteriano.
Micrografia
eletrônica colorizada, revelando os
flagelos periplasmáticos (amarelo)
Microbiology)
Micrografia eletrônica revelando o flagelo
periplasmático, situado abaixo da membrana
externa
(Adaptado de An Electronic Companion to
Microbiology)
Movimentação por meio de deslizamento
Muitos procariotos são móveis, apesar de não possuírem flagelos. Estas

bactérias são capazes de se movimentar sobre superfícies sólidas, por um
processo denominado deslizamento. A motilidade por deslizamento é apresentada
por vários membros de Bacteria, sendo, no entanto, estudada somente em alguns
poucos grupos. O movimento deslizante é consideravelmente mais lento – 10
Pm/seg para algumas bactérias, quando comparado às velocidades atingidas pelo
movimento flagelar mas, da mesma forma, permite a locomoção das bactérias em
seus habitats.
Mecanismos da Motilidade Por Deslizamento
Embora até o momento nenhum mecanismo de deslizamento tenha sido

comprovado, existem alguns modelos definindo o processo, além de evidências
sugerindo a existência de mais de um tipo de mecanismo. Em cianobactérias, à
medida que as células deslizam, secretam um polissacarídeo limoso em sua
superfície externa. Aparentemente, este polissacarídeo estabelece o contato entre
a superfície celular e a superfície sólida, contra a qual a célula desliza. À medida
que o polissacarídeo limoso excretado se adere à superfície, a célula é
gradativamente puxada. Esta hipótese é sustentada pela observação de poros
excretores de compostos limosos na superfície de várias cianobactérias
filamentosas.
Em Flavobacterium johnsoniae, provavelmente o mecanismo de
deslizamento envolve a movimentação de proteínas na superfície celular. De
acordo com este modelo, proteínas específicas de motilidade, ancoradas nas
membranas citoplasmática e externa, parecem propelir a célula para frente por
um mecanismo de cremalheira contínua. Ao que parece, o movimento das
proteínas da membrana citoplasmática é promovido pela liberação de energia
oriunda da força próton motiva que, de alguma maneira, transmite esta energia às
proteínas da membrana externa, localizadas ao longo de uma “pista de corrida” na
superfície celular. Acredita-se que o movimento das proteínas da pista de corrida
contra uma superfície sólida, literalmente empurre a célula para frente.
Assim como as outras formas de motilidade, o deslizamento apresenta
grande relevância ecológica. Este movimento permite que a célula explore novos
recursos, ou interaja com outras células, de maneira benéfica.
Esquema proposto para a movimentação deslizante de Flavobacterium

Periplasma (gel periplasmático) - Corresponde a um espaco situado entre a membrana externa e
membrana citoplasmatica, encontrado em celulas Gram negativas.
Embora questionaveis, relatos esporadicos descrevem a existencia de um espaco observado entre o
peptideoglicano e a membrana citoplasmatica de organismos Gram positivos. O periplasma apresenta
consistencia de gel, provavelmente devido ao grande numero de proteinas presentes nesta regiao. Em
virtude disto, este "espaco" passou a ser denominado gel periplasmatico. O periplasma pode atingir de
1 a cerca de 70 nm de espessura, correspondendo a ate 40% do volume total da celula.
Em Gram negativas, tem grande importancia, pois varias enzimas e outras proteínas estao
localizadas, incluindo hidrolases, proteinas de ligacao envolvidas no transporte e quimiorreceptores.
Bacterias quimiolitotroficas e denitrifcantes apresentam muitas vezes proteínas transportadoras de
eletrons no periplasma, outras apresentam enzimas envolvidas na síntese de peptideoglicano. A
presenca do periplasma bacterias Gram positivas e ainda motivo de controvérsias, devido ao enorme
potencial secretor que este grupo apresenta.
Membrana Citoplasmática - Estrutura delgada, com cerca de 8 nm, composta por uma
bicamada fosfolipidica (podendo apresentar 7 tipos de fosfolipideos diferentes), entremeada de
proteinas (cerca de 200 tipos distintos), atuando como importante barreira osmotica, altamente
seletiva. Normalmente, as membranas de organismos procariotos apresentam maiores concentracoes
de proteinas que as membranas eucarioticas, tendo em vista a ausencia de organelas citoplasmaticas
nas bacterias.
A bicamada fosfolipidica e composta por glicerol ligado a duas cadeias de acidos graxos, atraves de
ligacoes do tipo ester, com proteinas entremeadas. Tanto as proteinas como os fosfolipideos podem
mover-se lateralmente ao longo da membrana. Esta e estabilizada principalmente por interacoes
hidrofobicas e por pontes de H.
Paralelamente, os ions Ca+2 e Mg+2 tambem participam, interagindo ionicamente com as cargas
negativas dos fosfolipideos.
Via de regra, os fosfolipideos bacterianos contem acidos graxos com cadeias nao ramificadas de 16 a
18 atomos de carbono. Esta composicao pode ser variavel, de acordo com as condicoes ambientais.
Assim, quando cultivadas em temperaturas baixas, ha um aumento da proporcao de acidos graxos
insaturados, aumentando consequentemente a fluidez da membrana. Por outro lado, aumetando o
grau de saturacao, as cadeias tornam-se mais rigidas, pois as moleculas tem maior capacidade de
associacao.
Esquema da membrana citoplasmatica bacteriana
Via de regra, exceto no caso dos micoplasma (bacterias desprovidas de parede celular), micoplasmas,
as membranas procarioticas nao apresentam esterois, como observado em eucariotos. Entretanto,
muitas bacterias apresentam moleculas pentaciclicas, semelhantes a esterois, denominadas
hopanoides, talvez conferindo maior rigidez a membrana. A presenca de esterois na membrana
citplasmatica de micoplasmas pode ser justificada pela ausencia da parece celular, neste grupo de
organismos.
Similaridade estrutural entre os esterois (a), colesterol (b) e hopanoides (c)
Mesossomos - correpondem a extensas invaginacoes da membrana citoplasmatica, em forma de
vesiculas, lamelas ou tubulos. Geralmente sao encontrados com maior abundancia em Gram positivos,
mas tambem presentes em Gram negativos. Ate hoje, sua existencia e funcoes sao ainda debatidas
pelos pesquisadores. Diversas funcoes tem sido atribuidas aos mesossomos, tais como a participacao
na segregacao dos cromossomos durante a divisao, papel respiratorio, papel na esporulacao, ou ate
mesmo como sendo um mero artefato decorrente dos procedimentos utilizados para a preparacao
microscopica dos especimes. A partir do acahado de extensos mesossomos em bacterias de grandes
dimensoes, acredita-se que sua principal funcao seja de aumentar a superficie da membrana,
aumentando assim o conteudo enzimatico das celulas.
Matriz Citoplasmática - E composta por cerca de 70% de agua, alem dos demais compostos
celulares, tais como o DNA, inclusoes e plasmideos. Caracteristicamente, o citoplasma celular
apresenta um grande concentracao de ribossomos e proteinas, tais como proteinas atuando como um
sistema de citoesqueleto.
Nucleóide e plasmídeos- Os procariotos sao organismoshaploides, geralmente apresentando apenas
1 unico cromossomo nao envolto por carioteca. Eventualmente, algumas bacterias podem apresentar 2
ou 3 cromossomos. O cromossomo bacteriano e normalmente cirucular e encontra-se bastante
enovelado, em uma regiao celular denominada nucleoide. Em bacterias, o cromossomo nao
apresenta-se associado a histonas, sendo estabilizado por outras proteinas de natureza basica.
Geralmente o DNA cromossomal corresponde a uma molecula bastante grande, podendo ser 1000
vezes maior que a propria celula. Em E. coli, o DNA possui cerca de 4,7 Mb, exibindo
aproximadamente 1 mm de comprimento, quando linearizado.(Adaptado de An Electronic Companion to
Microbiology)
Varias bacterias apresentam tambem moleculas de DNA extracromossomal, denominadas plasmideos,
as quais sao geralmente circulares, contendo muitas vezes genes que conferem caracteristicas
adaptativas vantajosas ao microrganismo. Seu numero e dimensoes sao bastante variaveis.
Corpúsculos de inclusão - Sao granulos de armazenagem, de diferentes naturezas, sendo
geralmente utilizados como fonte de material de reserva ou energia, muitas vezes insoluveis. Estes
podem apresentar-se sem qualquer envoltorio ou envoltos por uma unica camada lipidica delgada
(diferente de uma membrana), ou por proteinas.Dentre os compostos organicos armazenados temos o
glicogenio, o amido e poliidroxibutirato. Ja dentre os inorganicos temos polifosfatos (volutina ou
metacromaticos) e enxofre.
Granulos de poliidroxibutirato
Os magnetossomos sao particulas intracelulares de magnetita (Fe3O4), que originam um dipolo
magnetico na celula, que pode responder aos campos geomagneticos. Estes foram descritos em
algumas bacterias aquaticas e algas. Outras bacterias aquaticas apresentam vesiculas de gas, que
conferem mobilidade nas diferentes camadas de agua. Sao estrutura sem forma de fuso, ocas,
compostas por proteinas, tendo tamanhos variaveis (30 - 300 nm de diametro e ate 1000 nm de
comprimento). Consistem de um orificio oco envolto por uma membrana (armacao) proteica
extremamente delgada (2 nm). Nesta membrana encontram-se por 2 tipos de proteinas que originam
uma estrutura rigida, impermeavel a agua e permeavel a gases. A proteina predominante tem cerca de
7.5 kDa, contendo A 50% de residuos de aminoacidos hidrofobicos (Ala, Val, Leu, Ile), provavelmente
voltados para o interior da particula, evitando a entrada de agua. Células apresentando
magnetossomos em seu interior (corpúsculos negros enfileirados)
Preparação de magnetossomos
(Adaptado de Prescott et al., Microbiology,
2000)
Bactérias se movendo em direção a
um campo magnético
Esquema de uma vesícula de ar,
indicando como as proteínas que a
formam se associam
(Adaptado de Madigan et al., Brock Biology of
Microorganisms, 2003)
Domínio Archaea
Considerações Gerais
Por volta da decada de 70, varios organismos procarioticos foram isolados a partir de uma
serie de ambientes considerados extremamente inospitos, quase que incompativeis com a presenca
de seres vivos. Estes ambientes naturais caracterizavam-se por apresentar temperaturas bastante
elevadas (proximas a 100oC), extrema acidez (pH proximo a 2), altas salinidades (cerca de 10 a 15%)
e, muitas vezes, ausencia completa de oxigenio. Como varias destas caracteristicas correspondiam as
possiveis condicoes encontradas na Terra primitiva, os pesquisadores acreditavam que os organismos
procarioticos presentes nestes ambientes deveriam corresponder a celulas primitivas, talvez "fosseis
vivos", representando as formas de vida ancestrais das bacterias modernas. Por esta razao, estes
organismos foram denominados "arqueobacterias".
No entanto, a partir dos trabalhos de Carl Woese e colaboradores (ha cerca de 25 anos),
realizando estudos comparativos de sequencias de DNA que codificavam rRNA (16S e 23S) de
diferentes organismos, foram definidos 3 grandes dominios compreendendo todos os seres vivos.
Assim, de acordo com a proposta de Woese, os seres vivos poderiam ser agrupados em tres grandes
dominios: Bacteria (anteriormente denominadas eubacterias), Archaea (as "arqueobacterias") e
Eucarya (Eucariotos). Estes tres dominios teriam derivado de um hipotetico ancestral comum de todas
as celulas.
A analise da arvore filogenetica apresentada abaixo, revela como a denominacao
"arqueobacterias" e inadequada e quao obsoleta e a ideia de que as "arqueobacterias" seriam os
ancestrais das bacterias atuais, pois estes organismos nao correspondem aos ancestrais da bacterias
atualmente conhecidas.
Árvore filogenética universal, apresentando os três domínios da vida
(Adaptado de Madigan et al., 2003 - Brock Biology of Microorganisms)
Esta arvore revela claramente que as "arqueobacterias" nao correspondem aos ancestrais das
bacterias atuais, visto que sua possivel origem ocorre quase que concomitantemente a origem das
bacterias mais primitivas.
Outro aspecto que a arvore permite deduzir e o fato das "arqueobacterias" ocuparem uma
posicao intermediaria entre os dominios Bacteria e Eucarya, sugerindo que estas correspondem a um
grupo de organismos diferentes de bacterias e de celulas eucarioticas. De fato, estudos geneticos e
fisiologicos posteriormente revelaram que tais organismos apresentam caracteristicas de bacterias, de
eucariotos, alem de caracteristicas exclusivas, não encontradas em qualquer outro dominio. Por esta
razao, deixaram de ser denominadas "arqueobacterias", recebendo a denominacao archaea.
Uma questao ainda nao elucidada refere-se ao porque de encontrar-se um grande variedade
de archaea extremofilas, habitanto ambientes de altas temperaturas, salinidade, ou extremos de pH.
Por outro lado, o acumulo de conhecimentos sobre este grupo vem mostrando que as archaea podem
ser encontradas nos mais diversos ecossistemas, desde ambientes aquaticos frios, sistema digestorio
do homem e outros animais, em tecidos vegetais.
Certamente nao e absurdo cogitar que no futuro sejam descobertas archaea patogenicas ao homem
ou outros seres vivos.
As caracteristicas apresentadas por alguns dos membros deste dominio parecem refletir as condicoes
primitivas da Terra, quando tal dominio comecou a evoluir como um ramo filogeneticio distinto. Ao que
parece, varias archaea conservaram mais do que as eubacterias estas caracteristicas fisiologicas
primitivas, o que seria responsavel pela distribuicao atual no planeta.
Assim, as archaea compreendem um grupo heterogeneo de microrganismos que podem ser
caracterizados, em sua maioria, como habitantes de ambientes inospitos, geralmente crescendo em
condicoes consideradas ate entao como extremas e limitrofes para a vida.
Classificação das Archaea

Atualmente, considera-se que este dominio apresente tres filos: Crenarchaeota, Euryarchaeota e
Korarchaeota.
Árvore filogenética do domínio Archaea
O filo Crenarchaeota, separa-se muito proximo da raiz da arvore universal, sendo composto
por organismos hipertermofilos (Thermoproteus, Pyrolobus e Pyrodictium), compreendendo os
organismos capazes de crescer nas maiores temperaturas conhecidas.
Estes hipertermofilos sao, em sua maioria, quimiolitotroficos autotroficos, sendo entao
classificados como produtores primarios. Neste grupo ha tambem organismos isolados (mas ainda nao
cultivados em laboratorio) de ambientes frios, tais como aguas oceanicas.
Lagoa quente, rica em enxofre, que e convertido a acido sulfurico, por especies de archaea.
Sulfolobus, exemplo de uma archaea do filo Crenarchaeota, habitante da lagoa ilustrada acima.
O filo Euryarchaeota e um grupo fisiologicamente diverso, sendo composto por dois grupos: 1)
as archaea metanogenicas, que sao anaerobias, (Methanococcus, Methanobacterium e
Methanosarcina), encontradas em ambientes de condicoes extremas, e 2) as halofilicas extremas, que
sao aerobias (Halobacterium, Halococcus). As metanogenicas compreendem os organismos mais
anaerobios conhecidos, ou seja, o oxigenio mesmo em concentracoes baixissimas, exerce um efeito
extremamente letal sobre estes organismos. Neste filo ha ainda o genero Thermoplasma, composto
por bacterias acidofilas, termofilicas, que nao apresentam parede celular. As halofilicas geralmente
coram-se como Gram negativas, nao apresentam esporos e, em sua maioria, sao imoveis, geralmente
apresentando grandes plasmideos, contendo cerca de 25 a 30% do DNA da celula. Dentre as
metanogenicas, encontra-se o genero Methanopyrus, que cresce em temperaturas de ate 110°C.
Lago hipersalino no Egito,
rico em carbonato de sodio. O pH
destas aguas encontra-se na faixa de
10, sendo habitado por archaea
halofilas extremas, tais como
Halobacterium salinarum. A coloracao
vermelha e decorrente da presenca
de pigmentos carotenoides, presentes
nestes organismos.
Thermoplasma, uma archaea desprovida de parede celular.
Pilha de refugo da mineracao de
carvao, que muitas vezes sofre autocombustao.
Habitat da archaea
Thermoplasma.
O filo Korarchaeota e composto quase que somente por isolados identificados apenas a partir do
sequenciamento de 16S rRNA, sendo considerado um grupo de hipertermofilos. Ate o momento,
poucos especimes de Korarchaeota foram cultivados em laboratorio. Pesquisas realizadas em uma
fenda termal localizada no fundo do mar da Islandia, em 2002, levaram a identificacao de uma nova
especie de archaea apresentando caracteristicas bastante distintas, quando comparada aos demais
membros desse dominio. A especie Nanoarchaeum equitans diferencia-se das demais archaea por ser
aparentemente muito primitiva (ou modificada), sendo encontrada em associacao com outra archaea
(Igniococcus sp.). Este organismo de morfologia arredondada e bastante diminuto, apresentando cerca
de 400 nm de diametro e um pequeno genoma, de 0,5 Megabases. De acordo com seus
descobridores, as grandes diferencas apresentadas por Nanorachaeum em relacao a sequencia de
RNA ribossomal, sugerem que tal organismo seja classificado em um novo filo, proposto como
Nanoarchaeota.
Micrografia de fluorescencia,
empregando um corante especifico
para DNA, revelando as celulas de
Igniococcus (maiores) e de
Nanoarchaeum equitans (menores).
No quadro a direita, micrografia
eletronica evidenciando a estreita
associacao das duas archaea.
Boucher & Doolittle (2002) Nature, 417:27-28
(clique no autor, caso deseje ver o artigo original)
Micrografia de fluorescencia
empregando corantes especificos para os rRNAs
de Igniococcus (verde) e Nanoarchaeum
(vermelho)
Huber et al. (2002) Nature, 417:63-67.
(clique no autor, caso deseje ver o artigo original)
Estrutura celular das Archaea
Quanto a morfologia, podem ser esfericas, bacilares, espiraladas, achatadas, quadradas,

discoides e muitas vezes de morfologia irregular ou pleomorficas. Suas dimensoes são extremamente
variaveis, de 0,1 a 15 Um, com alguns filamentosos atingindo 200 Um.
As archaea apresentam varias caracteristicas especiais, que permitem seu desenvolvimento em uma
vasta gama de ambientes. Estas incluem alteracoes de composicao de membrana, composicao
variada de paredes celulares, presenca de proteinas tipo histonas, introns, mecanismos de splicing,
entre outros.
Parede celular: Apresenta composicao e estruturacao extremamente variaveis neste grupo de
microrganismos. Esta variabilidade sugere que o ancestral comum seria desprovido de parede, sendo
as diversas paredes resultantes de evolucao independente, de acordo com os diferentes ambientes e
grupos de archaea.
Diferentes composições de parede celular presentes em archaea.

(Adaptado de Atlas, R.M. (1997) - Principles of microbiology)
Quando coradas pelo metodo de Gram, algumas archaea comportam-se como Gram positivas
e outras como Gram negativas, embora suas paredes sejam completamente distintas daquelas de
eubacterias. Como observado na figura acima, suas paredes celulares apresentam uma grande
diversidade quanto a composicao quimica e, diferentemente das eubacterias, nao apresentam
peptideoglicano. Alem disso, existem tambem outras archaea que nao exibem parede celular
(Thermoplasma).
O genero Thermoplasma cresce bem em temperaturas de 55°C e pH 2, em meios complexos.
Estes organismos apresentam a membrana citoplasmatica bastante diferente, contendo compostos
semelhantes a lipopolissacarideos, contendo ligacoes tetraeter. Um outro genero, filogeneticamente
relacionado a Thermoplasma, e Picrophilus, que cresce em pHs de 0,06 a 0,7.
Varias archaea exibem uma parede espessa, rigida, semelhante a parede Gram positiva
(Methanobacterium, Methanopyrus, Halococcus), entretanto, os polimeros que compoem a estrutura
podem ser: pseudopeptideoglicano ou metanocondroitina. O pseudopeptideoglicano diferencia-se do
peptideoglicano pela ocorrencia de acido talosaminuronico em substituicao ao muramico, pela ligacao
do tipo b-1,3 ao inves de b-1,4 entre os acucares e pela ausencia de D-aminoacidos nas porcoes
peptidicas da molecula.
Nestas bacterias, a lisozima nao exibe qualquer atividade de degradacao da parede, uma vez
que seu sitio de acao sao as ligacoes b-1,4. Da mesma forma, a penicilina e ineficaz contra estes
organismos porque o mecanismo de sintese de parede e distinto nas archaea.
A metanocondroitina e um polimero de 4 acucares (galactosamina, acido glucoronico, N-acetil-
galactosamina e glicose), muito semelhante ao tecido conectivo animal, composto por sulfato de
condroitina.
Aquelas archaea que coram-se como Gram negativas podem ter paredes compostas por
proteinas, polissacarideos ou glicoproteinas. As paredes proteicas podem variar entre si, podendo ser
do tipo monocamada de natureza cristalina, ou policamadas, de proteinas tubulares. As glicoproteinas
sao tambem comuns, muitas vezes contendo grandes quantidades de aminoacidos carregados
negativamente. As halobacterias sao um exemplo do modelo descrito acima, onde as cargas negativas
da parede interagem com os ions Na+ do ambiente, estabilizando a parede.
O genero Halococcus apresenta a parede celular composta por um heteropolissacarideo
altamente sulfatado, nunca observado em qualquer outro ser vivo.
Eventualmente, algumas archaea exibem uma camada proteica adicional ao redor da parede
celular, ou compondo a propria parede, denominada “camada S”, em um estado cristalizado.
Membrana Citoplasmática: corresponde a uma estrutura unica, apresentando composicao quimica e
arranjo totalmente diferentes das membranas citoplasmaticas de quase todas as bacterias e de todos
eucariotos.
Membrana Bacteria Archaea Eucarya
Conteúdo protéico alto alto baixo
Composição lipídica fosfolipideos
Sulfolipideos,
glicolipideos,
hidrocarbonetos
ramificados, isoprenoides,
fosfolipideos
Fosfolipideos
Estrutura dos
lipídeos
cadeia linear cadeia ramificada cadeia linear
Ligação dos lipídeos ester eter (di e tetraeter) ester
As membranas de archaea geralmente apresentam um alto conteudo proteico e varios lipideos:
glicolipideos, sulfolipideos, fosfolipideos (raros) e lipideos apolares do tipo isopreno. A presenca de
hidrocarbonetos ramificados aumenta a fluidez da membrana, uma vez que dificultam a formacao de
estruturas cristalinas. Dentre os principais lipideos estao aqueles do tipo glicerol-eter-isopreno
(hidrocarbonetos de 20, 25 ou 40 Carbonos).
Uma caracteristica da porcao lipidica da membrana e o fato desta nao ser composta por acidos
graxos convencionais. Em seu lugar encontram-se longas cadeias de hidrocarboneto ramificadas. Os
hidrocarbonetos ligam-se ao glicerol por ligacoes do tipo eter (ao inves de ester) e podem apresentar-
se como bicamadas (como em todas as membranas) ou como monocamadas. Quando formam
bicamadas, denominam-se glicerol dieter e quando originam monocamadas, diglicerol tetraeter.
Quando ha a monocamada, esta modula sua fluidez atraves da ciclizacao de alguns elementos
da cadeia de hidrocarboneto, formando aneis pentaciclicos.
As proteinas de membrana podem ser tambem bastante diferentes daquelas observadas em
outros tipos celulares.
Estrutura e composição da membrana presente em várias archaea.
Cromossomo: E bastante semelhante ao cromossomo das eubacterias, uma vez que e unico
e, na maioria dos casos, circular. Por outro lado, sua organizacao e semelhante aos eucariotos, uma
vez que observam-se proteinas (do tipo histona) associando-se ao DNA, atuando na manutencao da
estrutura do DNA, afetando tambem a expressao genica. Foi observado que em muitos hipertermofilos
a associacao das proteinas ao DNA promove um enovelamente do tipo positivo no DNA, enquanto em
eucariotos, este e negativo.
Foi tambem relatada a presenca de introns no cromossomo de Archaea, em genes de RNA de
hipertermofilos e halofilos, sendo processado atraves de endonucleases.
Transcrição: Em relacao aos promotores, aparentemente sua estrutura tem maior semelhanca
com promotores de eucariotos que de procariotos. A RNA polimerase e mais complexa que a de
bacterias, podendo ser composta por 8 polipeptideos em metanogenicas e halofilicas (enquanto em
Bacteria sao 4). Nas hipertermofilas, podem existir 10 polipeptideos distintos (assemelhando-se a RNA
polimerase de eucariotos).
Ribossomos: Sao do tipo 70S, semelhantes aos de bacterias, entretanto, sua composicao
proteica e bastante distinta, tornando-os resistentes aos antibioticos que afetam a sintese proteica
bacteriana. A traducao tambem e diferentes das Bacteria, assemelhando-se mais aos Eucarya, sem a
participacao da formil-metionina no inicio do processo. A toxina difterica, que inibe a traducao de
celulas eucarioticas tambem inibe o processo em Archaea.
Flagelos: Muitas archaea, inclusive aquelas sem parede celular, podem apresentar flagelos.
Estes diferem totalmente dos flagelos bacterianos, uma vez que nao apresentam a estruturacao em
corpo basal, gancho e filamento. Nas Archaea, o flagelo nao apresenta os aneis observados nas
bacterias e, geralmente, e composto por varios tipos de “flagelina”, que exibe composicao similar a
varias fimbrias. Ao que parece, o flagelo e composto por flagelina, que se organiza a partir da
membrana citoplasmatica, projetando-se para o exterior da celula.
Metabolismo
As archaea apresentam uma enorme diversidade metabolica. Muitas são quimiorganotroficas,
com metabolismo semelhante as demais celulas, outras são quimiolitotroficas, utilizando o H2 como
doador de eletrons nas reacoes de oxi-reducao. Varias archaea sao anaerobias e geralmente
termofilas e suas vias para obtencao de energia geralmente envolvem
1) Reducao do CO2 a metano ou conversao do acetato a CO2 e entao metano; sendo incorporado pela
via do Acetil-Coa CO2 + 4H2 k CH4 + 2H2O nas metanogenicas
2) Reducao de SO4 a H2S; SO4 2- + H+ + 4H2 k HS- + 4H2O
3) Reducao de Enxofre elementar a H2S. S + H2 k HS- + H+
Assim, pode-se notar que muitas archaea exibem metabolismo quimioautotrofico.
Ecologia de archaea
Embora inicialmente fossem consideradas organismos restritos a ambientes extremos, muitas
archaea vem sendo isoladas de ambientes favoraveis aos demais organismos procarioticos e
eucarioticos. No entanto, dentre as varias archaea descritas ate o momento, a maioria e encontrada
em poucos ambientes especializados terrestres e aquaticos, tais como lagos extremamente salinos,
ambientes estritamente anaerobios e/ou ambientes extremamente quentes. Ate pouco tempo, a menor
temperatura onde foi possivel se fazer o cultivo “in vitro” de archaea era de 30°C.
Dados recentes indicam, por outro lado, que este grupo de microrganismos pode tambem ser
isolado de ambientes frios. Atualmente sabemos que estes organismos são importantes membros da
microbiota aquatica de regioes frias do planeta. Ao que parece, as archaea podem corresponder a ate
34% da biomassa procariotica das aguas costeiras superficiais da Antartida.
De maneira geral, e pelo fato da maioria das archaea conhecidas serem isoladas de ambientes
quentes, salinos e/ou anaerobios, este dominio e didaticamente dividido em tres grandes grupos:
termofílicos, halófilos e metanogênicos.
No entanto, vale ressaltar mais uma vez que dados mais recentes comprvam a ampla distribuicao
geografica e ecologica desse grupo de organismos.
Termofilia: Sabe-se que varias archaea tem temperatura otima superior a 80°C e temperatura
maxima de crescimento acima de 100°C (Pyrodictium brockii tem otimo de 105°C e Pyrolobus fumarii
de 106°C, embora cresca em ate 113°C). Ainda nao se sabe ate onde pode ir esta faixa de
temperatura.
Pyrolobus fumarii foi isolado de uma fenda no Oceano Atlantico, a uma profundidade de 3.650
metros, crescendo em uma faixa de temperatura de 90 a 113°C, pH de 4 a 6.5 e concentracoes de
NaCl variando de 1 a 4%. Experimentos realizados em laboratorio mostram que culturas na fase
exponencial de crescimento sobrevivem ao tratamento em autoclave (121°C) por 1 hora.
A termofilia requer adaptacoes fisiologicas especializadas, pois as proteinas e acidos nucleicos nao
podem ser desnaturados e a membrana deve manter-se funcional nestas temperaturas.
Curiosamente, a estrutura primaria (sequencia de aminoacidos) de varias proteinas de
Archaea nao exibem diferencas significativas quando comparada a outros organismos.
Provavelmente, o principal fator para esta caracteristica seja o dobramento destas proteinas.
Uma caracteristica das proteinas de termofilicos refere-se a substituicao de aminoacidos mais flexiveis
por aqueles que conferem maior rigidez a molecula. Alem disso, foi sugerido que as proteinas
poderiam ser estabilizadas pela presenca de altos teores de aminoacidos hidrofobicos. As archaea
termofilas tambem exibem um enorme numero de chaperonas, que garantem o dobramento correto
das proteinas nas temperaturas mais elevadas.
Em termos de genoma, observa-se muitas vezes valores maiores de G+C nas hipertermofilas,
estabilizando assim os acidos nucleicos. Entretanto, tal caracteristica nao pode ser considerada como
regra. Muitas termofilicas apresentam altas concentracao de 2,3- difosfoglicerato ciclico, um composto
que protege contra a depurinizacao. Varias outras produzem uma DNA girase reversa, que enovela o
DNA no sentido positivo, que e mais estavel que o negativo, o qual e encontrado na maioria das outras
celulas. Alem disso, muitas vezes sao encontradas proteinas do tipo histona ou outras, que se ligam
fortemente ao DNA, protegendo-o.
Quanto a membrana, sua funcionalidade e decorrente da presenca de isopreno e da ciclizacao
de seus componentes, alem da alta frequencia de membranas do tipo tetraeter. As termofilas podem
ser encontradas em fontes geotermicas, fontes vulcanicas (que expelem vapores e compostos
sulfurados), fontes termais marinhas, onde erupcoes vulcanicas elevam a temperatura para mais de
100°C. Nestes casos, estas bacterias requerem, adicionalmente, pressoes elevadas para o seu
desenvolvimento. Estes organismos sao muito utilizados em biodigestores de esgoto e tambem como
fonte de insumos laboratoriais (Taq pol).
Halofilia: Este grupo de archaea habita locais denominados hipersalinos, requerendo grandes
quantidades de sal para seu desenvolvimento. Um halofilo extremo requer pelo menos 1,5M de NaCl
(9%), podendo variar de 2 a 4M (12 a 23%) para outras especies. Foramdescritos organismos capazes
de crescer na presenca de 5,5M de NaCl, o que equivale a 32%, correspondendo ao limite de
saturacao para este sal. Embora ambientes salinos sejam comuns, os hipersalinos sao raros,
encontrando-se em areas quentes e secas do mundo (lagos salgados, salinas, mar morto). Nestes
ambientes, as celulas tenderiam a perdem agua, devido a elevada concentracao externa de sal.
Entretanto, exibem uma adaptacao fisiologica que corresponde ao acumulo de sais ou ions em
seu citoplasma, ou pela sintese de compostos organicos intracelulares, denominados solutos
compativeis. Assim, o genero de halofilos Halobacterium bombeia grandes quantidade de K+ para o
interior da celula, superando a concentracao externa de Na +. Nestes organismos, as enzimas devem
exibir maior tolerancia ao sal, tendo em vista que seu funcionamento devera ocorrer em um ambiente
muito concentrado. Muitas apresentam bombas de cloro, que constantemente bombeiam este ion para
o interior da celula. As paredes podem conter uma grande quantidade de aminoacidos carregados
negativamente, ou polissacarideos sulfatados, para interagir com ions Na+ presentes no meio, sendo
esta interacao essencial a integridade da parede.
Metanogênicos: Este foi o primeiro grupo de archaea descrito, sendo unico por sua
capacidade de sintetizar metano. Sua distribuicao geografica e muito ampla, sendo encontrados no
intestino de ruminantes, em cupins, em lagoas, lodos de esgoto, etc. Podem ser quimiolitotroficos ou
quimiorganotroficos e, via de regra, sao anaerobio estritos, exibindo enorme sensibilidade ao oxigenio.
Interações microbianas
Ao que parece, as archaea interagem intensamente com outros organismos, embora sejam
eventos menos frequentes que aqueles observados para as eubacterias.
As archaea metanogenicas realizam associacoes com outros microrganismos, uma vez que
necessitam de substrato (principalmente H) para a producao de metano. Assim, em processos de
degradacao anaerobia de residuos de industrias de papel, que ocorrem em rios e lagos e tambem no
intestino de ruminantes, pode-se observar a ocorrencia de comunidades microbianas contendo
metanogenicas, havendo a producao de metano e gas carbonico.
Um dos principais produtos da fermentacao de muitos anaerobios e o H2, que e prontamente utilizado
pelas metanogenicas, que associado ao CO2, origina o metano. O acido formico pode tambem ser
utilizado como doador de eletrons para a reducao do CO2. A producao de metano, por sua vez, garante
um ambiente anaerobico. Ja foi descrita a ocorrencia de metanogenicas endossimbiontes em
protozoarios que habitam o rumen de vertebrados.
Foi descrita a associacao de archaea com animais e em alguns tecidos vegetais, embora ate o
momento nao tenha sido comprovada a capacidade de invadir tecidos ou manifestar potencial
patogenico nesses organismos. Em muitos casos a presenca de metanogenicas no rumen pode levar
a prejuizos ao gado, uma vez que competem pelo acetato produzido na fermentacao da celulose.
Ha ainda um problema ambiental associado a producao de metano pelas archaea, pois este
metano expelido pelas archaea contribui ao agravamento do efeito estufa. Estudos recentes indicam
que a quantidade de metano expelida pelas Archaea pode ser de 400 ton3/ano (cerca de 50 litros por
dia). Dados recentes revelam a deteccao de archaea em amostras de placa dental subgengival,
embora nada tenha sido provado em relacao ao potencial patogenico dos organismos isolados.
Nutrição de microrganismos
Introdução
Os microrganismos exibem os mais diversos mecanismos nutricionais. Em relacao aos
procariotos (Bacteria e Archaea), a nutricao ocorre predominantemente pela absorcao, uma vez
que a grande maioria destes organismos possui uma espessa parede celular, impossibilitando
a realizacao de fagocitose.
Os seres vivos podem ser classificados de acordo com as fontes de energia e de
carbono que utilizam para seu crescimento. Assim, em relacao as fontes de energia, tempos os
organismos fototróficos (que utilizam a energia luminosa) e os quimiotróficos (que utilizam a
energia proveniente de reacoes quimicas). Em relacao as fontes de carbono, temos os
organismos autotróficos (fontes inorganicas) e os heterotróficos (fontes organicas). Dentre os
procariotos, iremos encontrar exemplos em todas as possiveis classes de organismos.
Classificação dos seres vivos, de acordo com as fontes de energia e carbono
(Adaptado de Tortora et al., Microbiology - An Introduction, 1997)
Composição química da célula procariótica
As celulas procarioticas sao compostas, essencialmente por macromoleculas
(proteinas, acidos nucleicos, polissacarideos e lipideos), apresentando tambem uma menor
quantidade de outros compostos organicos e inorganicos. Alem destes, encontramos ions e
agua. Relativamente, podemos consideram a celula como sendo .90% de agua, .10% de
macromoleculas e o restante compreendido pelos demais componentes.
A maioria das pequenas moleculas e obtida a partir do meio, sendo as macromoleculas
sintetizadas em seu interior.
Nutrientes
Os nutrientes sao definidos como as substancias encontradas no ambiente, que participam do
anabolismo e catabolismo celular, podendo ser divididos em dois grandes grupos: macronutrientes,
que sao necessarios em grandes quantidades e micronutrientes, necessarios em pequenas
quantidades. Alguns nutrientes sao utilizados como fonte de material para a biossintese das moleculas,
enquanto outros correspondem a fontes de energia, necessaria aos processos biossinteticos e de
manutencao dos organismos. Muitas vezes, diferentes nutrientes podem apresentar os dois papeis
descritos acima.
Principais Macronutrientes
Carbono: corresponde a base de todas as moleculas organicas. Entre os procariotos
melhor estudados ate o momento, a maioria requer algum tipo de composto organico como
fonte de carbono, o qual pode ser de diferentes variedades (aminoacidos, acidos organicos,
acucares, bases nitrogenadas, etc).
Nitrogênio: corresponde ao segundo elemento mais abundante nas celulas, compondo
proteinas, acidos nucleicos e peptideoglicano. Podemos encontrar o nitrogenio sob a forma de
compostos organicos ou inorganicos, sendo ambas as formas prontamente utilizadas por um
grande numero de procariotos. Assim, a partir da degradacao de proteinas e acidos nucleicos,
bem como a partir de amonia e nitrato, os organismos utilizam o nitrogenio presente na
natureza. Embora o nitrogenio esteja em grandes concentracoes na atmosfera, este nao e
amplamente utilizado, exceto por aqueles organismos denominados fixadores de N2.
Hidrogênio: elemento presente em proteinas, acucares e demais moleculas organicas.
Fósforo: encontrado em compostos organicos (acidos nucleicos) ou inorganicos
(fosfatos), sendo importante na composicao de acidos nucleicos e fosfolipideos. Em sua
maioria, os microrganismos utilizam o fosforo sob a forma de compostos inorganicos.
Enxofre: compondo a cisteina e metionina, estando presente tambem em varias
vitaminas (tiamina, biotina). Na natureza, o enxofre sofre uma serie de transformacoes, as
quais sao exclusivamente realizadas por microrganismos. A principal fonte de enxofre para os
microrganismos corresponde aos sulfatos inorganicos ou H2S.
Potássio: necessario para todos os microrganismos, devido ao seu papel ativador de
varias enzimas, tais como aquelas envolvidas na traducao.
Magnésio: necessario geralmente em grandes quantidades, uma vez que tem papel na
estabilizacao de ribossomos, membranas e acidos nucleicos, sendo tambem importante para o
funcionamento de diferentes enzimas, especialmente aquelas envolvidas na transferencia de
fosfato.
Cálcio: embora nao seja essencial ao crescimento da maioria dos microrganismos, tem
papel de estabilizacao da parede celular e de termorresistencia nos esporos.
Sódio: importante, especialmente para microrganismos marinhos e certas archaea
halofilas.
Ferro: presente em um grande numero de proteinas, especialmente aquelas envolvidas
na respiracao.
Principais Micronutrientes: Embora necessarios em pequenas quantidades, tem papel
tao importante quanto os macronutrientes.
Cobalto: necessario apenas para a formacao da vitamina B12.
Zinco: tem papel estrutural em varias enzimas (DNA e RNA polimerases) e outras
proteinas de ligacao ao DNA.
Molibdênio: presente em certas enzimas como a nitrato redutase assimilativa.
Cobre: importante para enzimas respiratorias.
Manganês: ativador de muitas enzimas.
Níquel: presente em hidrogenases.
Fatores de crescimento: correspondem a compostos organicos especificos, que sao
necessarios em quantidades muito pequenas devido a incapacidade das celulas os
sintetizarem (vitaminas, aminoacidos, purinas e pirimidinas), os quais sao geralmente
fornecidos como componentes dos meios de cultura (peptonas, extrato de levedura) utilizados
para o crescimento in vitro dos microrganismos. Na natureza, tais fatores sao normalmente
encontrados nos habitats naturais dos microrganismos. Por exemplo, bacterias do genero
Porphyromonas requerem vitamina K como fator de crescimento, sendo esta fornecida pelo
proprio hospedeiro eucarioto.
As vitaminas correspondem ao fator de crescimento mais comum para os
microrganismos. Estas sao definidas como compostos organicos necessarios em pequenas
quantidades, para o crescimento e funcoes nao relacionadas a nutricao, atuando na maioria
das vezes como parte de coenzimas. Estao descritas abaixo algumas das funcoes
desempenhadas pelas principais vitaminas requeridas pelos microrganismos:
biotina - Biossintese de acidos graxos, b-decarboxilacoes, fixacao de CO2;
tiamina (B1) - a-decarboxilacoes e transcetolase
piridoxina (B6) - transformacoes de aminoacidos e ceto acidos
cobalamina (B12) - reducao e transferencia de fragmentos unicos de carbono, sintese de
desoxirribose.
As bacterias dos generos Streptococcus e Lactobacillus tem uma necessidade por
vitaminas maior do que aquela exibida pelo homem.
O processo de nutrição em procariotos
Nos procariotos contendo parede celular os processos de nutricao ocorrem atraves da
absorcao dos nutientes, a partir do ambiente externo. Entretanto, devido as caracteristicas
diferenciais na composicao e estrutura da parede celular dos organismos Gram positivos e
Gram negativos, este processo apresenta algumas diferencas nestes dois grupos de
organismos.
Nutrição em Gram positivos: Estas bacterias caracterizam-se por sintetizar uma serie
de exoenzimas, as quais sao liberadas no meio, clivando os nutrientes, que sao capatados por
proteinas transportadoras. Os fungos (celulas eucarioticas), posuem um sistema de nutricao
semelhante ao das bacterias Gram positivas, nutrindo-se pela absorcao, apos a clivagem
extracelular de compostos complexos.
Nutrição em Gram negativos
Papel da parede celular em Gram negativas
A parede celular das bacterias Gram positivas e composta por varias camadas de
peptideoglicano, enquanto nas Gram negativas observa-se uma maior complexidade quimica e
estrutural da parede, decorrente da presenca de camadas lipoproteica e lipopolissacaridica,
localizadas externamente a camada de peptideoglicano, originando a membrana externa. Estas
diferencas, por si so, contribuem em grande parte as diferencas observadas na forma de
captacao dos nutrientes.
Devido a presenca de uma membrana externa de carater hidrofobico (LPS), as
bacterias Gram negativas apresentam um grande numero de porinas associadas a camada
lipopolissacaridica. As porinas correspondem a proteinas, formadas por tres subunidades
identicas, que originam um canal de cerca de 1 nm de diametro, cujo mecanismo de abertura e
fechamento permanece ainda desconhecido. Desta forma, as porinas permitem a passagem de
moleculas hidrofilicas, de baixa massa molecular.
Estas proteinas podem atuar de forma inespecifica, formando canais aquosos, ou
especifica, exibindo sitios de ligacao para substratos de ate 5 kDa, ou ainda, acopladas a
proteinas transportadoras.
Papel das proteínas periplasmáticas em bactérias Gram negativas
O periplasma corresponde a porcao celular localizada entre a membrana plasmatica e a
membrana externa, geralmente exibindo constituicao gelatinosa, provavelmente devido ao
grande numero de enzimas e proteinas presentes, assim como pela propria presenca do
peptideoglicano e lipoproteinas. De forma geral, sao encontrados tres tipos de proteinas no
periplasma de celulas Gram negativas: hidrolases, que atuam na degradacao inicial dos
nutrientes; proteínas de ligação, que iniciam os processos de transporte e os quimioreceptores,
envolvidos em processos de quimiotaxia. O transporte inicial das moleculas para o citoplasma,
a partir do periplasma, e um processo que requer gasto energia, por meio da utilizacao de ATP.
Papel da membrana citoplasmática na nutrição de Gram positivos e negativos
A membrana citoplasmatica, estrutura vital para qualquer tipo de celula, e uma barreira
que separa o conteudo celular do meio externo. A membrana corresponde a uma barreira
altamente seletiva, permitindo que as celulas concentrem metabolitos especificos em seu
interior. No dominio Bacteria, a membrana apresenta-se como uma bicamada fosfolipidica,
contendo proteinas dispersas por toda sua superficie. A estutura global da membrana e
estabilizada atraves de interacoes do tipo pontes de hidrogenio, interacoes hidrofobicas e pela
presenca de ions Ca++ e Mg++, os quais se combinam com as cargas negativas dos
fosfolipides. Embora em archaea, a membrana apresente estrutura totalmente distinta,
podendo ser do tipo bicamada ou monocamada, muitas vezes desprovida de fosfolipideos, tal
estrutura desempenha os mesmo papeis fisologicos descritos para as membranas de qualquer
ser vivo.
Assim, a membrana tem papel essencial nos processos de nutricao procariotica, uma
vez que todos os nutrientes e produtos de degradacao devem atravessa-la. Devido a sua
permeabilidade seletiva, a maioria das moleculas sao incapazes de simplesmente atravessar a
membrana de forma passiva. Ao contrario, estas devem ser ativamente transportadas atraves
da membrana.
O interior de uma celula procariotica consiste em uma solucao aquosa hipertonica em
relacao a maioria dos habitats onde os procariotos sao geralmente encontrados. Assim, a agua
tem a capacidade de passar livremente para o citoplasma, pelo processo de osmose. Outros
compostos, tais como pequenas substancias apolares e lipossoluveis (acidos graxos, alcoois,
benzeno) sao capazes de solubilizar-se na membrana e entrar na celula. Moleculas carregadas
como ions, aminoacidos, compostos polares, devem ser transportados especificamente uma
vez que, devido a sua natureza, nao sao capazes de atravessar a membrana.
Processos de transporte através da membrana
A presenca de proteinas transportadoras na membrana permite que a celula capte
compostos que naturalmente nao penetrariam na celula, devido a natureza semi-permeavel da
membrana. Estas proteinas podem ser agrupadas em tres classes: uniportadoras,
simportadoras e antiportadoras.
As proteinas uniportadoras sao aquelas que que transportam uma unica substancia de
um lado para outro da membrana. As duas outras classes sao descritas como
cotransportadoras, uma vez que para transportar uma substancia qualquer, necessitam
transportar outra, concomitantemente. As simportadoras sao aquelas que carreiam ambos os
compostos em uma mesma direcao enquanto nas antiportadoras o transporte se da em
direcoes opostas.
Este tipo de transporte, mediado por proteinas, permite a celula apresentar
concentracoes internas de determinados compostos superiores aquelas encontradas no meio
externo.
Uma das principais caracteristicas do processo de transporte mediado por proteinas
reside na sua elevada especificidade, assim, determinados transportadores carreiam apenas
um unico tipo de molecula, embora a maioria apresente afinidade por uma classe de moleculas
Tipos de transporte mediado por proteínas
Difusão facilitada
Neste tipo de processo, a ligacao do nutriente a proteina transportadora induz uma
mudanca de conformacao na proteina, formando um canal pelo qual o nutriente tem acesso ao
citoplasma. Embora haja a participacao de transportadores neste processo, a acao das leis das
massas impede que ocorra a formacao de um gradiente de concentracao, mantendo assim as
concentracoes intra e extracelular semelhantes.
Este processo de difusao mediada por transportadores e denominado difusao facilitada, o qual
nao envolve gasto de energia.
Os mecanismos descritos a seguir caracterizam-se por requerem um gasto de energia,
uma vez que estes permitem um acumulo dos compostos transportados no interior da celula.
Desta forma, estes mecanismos envolvem o transporte contra um gradiente de concentracao,
sendo a energia necessaria para o bombeamente dos compostos para o interior da celula.
Nestes casos, a energia pode advir da clivagem de ATP ou pela dissipacao de gradientes de
protons ou ions Na+ atraves da membrana. Este gradiente ionico e estabelecido durante
reacoes que liberam energia e podem ser utilizados como fonte potencial de energia para a
captacao de nutrientes contra um gradiente de concentracao.
Translocação de grupo
Neste tipo de transporte, o nutriente sofre uma alteracao quimica durante sua passagem
atraves da membrana. Uma vez que o produto translocado para o interior da celula e agora
diferente daquele presente no meio externo, nao ha a formacao de um gradiente de
concentracao.
Moleculas de acucares tais como glicose, frutose, N-acetilglicosamina, purinas e pirimidinas
sao exemplos de translocacao de grupo, sendo fosforiladas durante o processo pelo sistema
fosfotransferase.
Em E. coli, o sistema fosfotransferase e composto por 24 proteinas, sendo 4
necessarias para o transporte de um dado acucar.
O sistema fosfotransferase tem tambem papel na regulacao do transporte dos acucares, uma
vez que na presenca de glicose e outro acucar, o sistema fosforila preferencialmente as
moleculas de glicose.
Tranporte ativo
Alguns acucares, a maioria dos aminoacidos, varios ions inorganicos e acidos organicos
sao transportados atraves deste tipo de mecanismo. A energia necessaria para efetuar os
processos advem ou do ATP ou, mais comumente, da formacao de um gradiente de protons
(ions hidrogenio) por toda a membrana, denominado forca proton motiva. Como resultado, a
membrana fica energizada e este potencial eletroquimico e responsavel pela captacao dos
nutrientes.
Cada transportador tem sitios especificos tanto para o substrato como para os protons.
Com a entrada do nutriente, o proton tambem atravessa e membrana e com isso vai diminuindo
o gradiente e a forca motiva.
Cations tipo K+ podem ser transportados ativamente por uniportadores, em resposta a
diferenca de cargas, uma vez que o interior da celula fica carregado negativamente.
Os anions provavelmente sao transportados juntamente com protons, por
simportadores. Moleculas nao carregadas, como aminoacidos ou acucares, sao transportadas
tambem por simportadores, juntamente com um ou mais protons.
Alem da forca motora resultante do gradiente de protons, o transporte ativo tambem pode ser
executado utilizando a energia liberada pela hidrolise de ATP, como no caso do transporte de
maltose em E. coli.
A Cultura de microrganismos in vitro: A partir do conhecimento dos requerimentos
nutricionais, podem ser confeccionados meios que permitam o crescimento microbiano in vitro.
Cultura pura: corresponde a uma cultura contendo um unico tipo de organismo. Esta e
importante, uma vez que permite o estudo dos microrganismos isoladamente. Para isso,
precisamos conhecer as necessidades nutricionais e ambientais dos microrganismos.
Os meios de cultura consistem em meios aquosos, adicionados de nutrientes e,
eventualmente, agar (polissacarideo = ester sulfato de galactana, retirado de algas - Gelidium),
caso se deseje a consistencia solida. Ha duas classes de meios: os quimicamente definidos
(sinteticos) e os indefinidos (complexos). Tipos de meios em relacao a consistencia: Liquidos,
Semi-solidos e Solidosn Tipos de meios, quanto a composicao: Simples, Enriquecidos,
Seletivos, Diferenciais.
Crescimento microbiano
Introdução ao Crescimento Microbiano
Em microbiologia, o termo crescimento refere-se a um aumento do numero de celulas e
nao ao aumento das dimensoes celulares.
Crescimento Populacional: e definido como o aumento do numero, ou da massa
microbiana.
A taxa de crescimento e a variacao no numero ou massa por unidade de tempo. O
tempo de geração e o intervalo de tempo necessario para que uma celula se duplique. O tempo
de geracao e variavel para os diferentes organismos, podendo ser de 10 a 20 minutos ate dias,
sendo que em muitos dos organismos conhecidos, este varia de 1 a 3 horas. O tempo de
geracao nao corresponde a um parametro absoluto, uma vez que e dependente de fatores
geneticos e nutricionais, indicando o estado fisiologico da cultura. O tempo de geracao pode
ser calculado quando uma cultura encontra-se em fase exponencial, pela formula abaixo:
N=No.2n, onde N= numero final de celulas, No= numero inicial de celulas, n= numero de
geracoes.
n= log(N) - log(No)/0.301
g = t/n , onde g= tmpo de geracao, t= tempo de crescimento e n= determinado acima.
Medidas do crescimento microbiano
O crescimento dos microrganismos pode ser mensurado por diferentes tecnicas, tais
como pelo acompanhamento da variacao no numero ou peso de celulas, por exemplo. Dentre
as diferentes tecnicas utilizadas, descreveremos alguns exemplos.
Contagem total de células: esta metodologia envolve a contagem direta das celulas
em um microscopio, seja de amostras fixadas (e coradas) ou analisadas a fresco, (sendo
aplicados cerca de 10 Ul da suspensao, na maioria dos casos), utilizando-se câmaras de
contagem. A contagem direta e uma tecnica rapida, mas tem como principais limitacoes a
impossibilidade de distincao entre celulas vivas e mortas (o que pode ser contornado pelo uso
de corantes vitais, para leveduras) e contagens erroneas, devido as pequenas dimensoes de
algumas celulas, ou pela formacao de agregados celulares.
Em preparacoes nao coradas, deve-se utilizar microscopio de contraste de fase, o qual
deve ser empregado apenas quando as celulas nao estao muito diluidas (<106 celulas/ml).
Exemplo ilustrando o procedimento de contagem direta
Ha tambem os contadores eletronicos (do tipo Coulter) usados em hematologia, que
podem ser empregados na contagem de celulas microbianas. Em determinadas situacoes, por
exemplo quando se requer apenas uma estimativa da quantidade de microrganismos, pode-se
empregar a contagem proporcional, que corresponde a uma analise comparativa das culturas
com suspensoes padrao. Como exemplo de uma suspensao padrao podemos citar a escala de
MacFarland, que corresponde a uma serie de tubos contendo uma solucao de BaSO4 em
diferentes concentracoes, apresentando assim, graus de turvacao distintos. Desta forma,
comparando-se a turvacao da cultura em estudo com os tubos de MacFarland, pode-se obter
uma estimativa do numero de celulas presentes na amostra.
Contagem de viáveis: Procedimento tambem conhecido como contagem em placa,
que estima o numero de celulas viaveis (isto e, capazes de se reproduzir) em uma amostra.
Esta metodologia envolve a coleta de aliquotas de uma cultura microbiana em diferentes
tempos de crescimento, as quais sao entao inoculadas em meio solido. Apos a incubacao dos
meios, geralmente por uma noite, o numero de colonias e contado. Como uma colonia
normalmente e originada a partir de um organismo, o total de colonias que se desenvolvem no
meio corresponde ao numero de celulas viaveis presentes na aliquota analisada. Esta tecnica
deve sempre realizada empregando-se varias dilucoes (100 a 104 celulas) das amostras. A
contagem de viaveis pode ser feita pela semeadura em superficie ou em profundidade ("pour
plate"). Geralmente o volume a ser inoculado nao deve ultrapassar 0,1 ml, para evitar a
confluencia das colonias. Se a tecnica de semeadura em profundidade for utilizada, pode-se
inocular de 0,1 a 1,0 ml de celulas. Esta tecnica e precisa quando o numero de colonias (ou
placas de lise, no caso de particulas virais ) contadas situa-se entre 30 e 300 e quando as
condicoes culturais e ambientais estao adequadas para os microrganismos analisados. Este
tipo de contagem esta sujeito a grandes erros (agregados, duas celulas proximas, originando
uma colonia), que podem ser minimizados pela realizacao de triplicatas para cada diluicao.
Esta metodologia e amplamente utilizada, exibindo elevada sensibilidade, detectando baixos
numeros de celulas e permitindo tambem a contagem de diferentes tipos de microrganismos,
pelo emprego de meios seletivos (meios que favorecem o crescimento de um determinado tipo
ou grupo de organismo) e/ou seletivos e diferenciais (meios que alem de favorecerem o
desenvolvimento de um tipo ou grupo de organismo, tambem permite sua distincao, a partir de
alguma caracteristica fenotipica).
Tambem podem ser usadas membranas filtrantes, onde os liquidos sao filtrados e as
membranas colocadas diretamente sobre os meios de cultura.
Técnica de contagem de viáveis
Massa de células: pode ser determinada a partir da estimativa do peso seco ou do
peso umido de uma cultura. Este tipo de procedimento e realizado quando nao e necessario
determinar o numero preciso de microrganismos presentes.
Peso seco: Muito utilizado na quantificacao de fungos, onde o micelio e retirado da cultura,
lavado e transferido para um frasco e submetido a secagem. Realizam-se entao sucessivas
pesagens, ate o momento onde nao observa-se mais variacoes. Este procedimento pode
tambem ser realizado centrifugando-se a cultura e pesando o sedimento, ou entao secando-o
(100 - 150°C/16 horas) e depois pesando-o.
Turbidimetria: quantificacao em espectrofotometro ou colorimetro a 660 nm, uma vez
que neste comprimento de onda, a cor geralmente parda dos meios de cultura nao interfere
com os resultados. Nestes comprimentos, a absorcao de luz por componentes celulares
corados e desprezivel mas, se necessario, outros comprimentos de onda podem ser usados.
Tal metodologia requer a confeccao de uma curva padrao. Embora a analise turbidimetrica seja
menos sensivel, e de rapida e facil execucao, nao destruindo a amostra. Entretanto, nao
permite a determinacao de celulas viaveis.
Análises químicas: A partir da quantificacao de proteinas ou de nitrogenio, ou por meio
da analise de diferentes atividades metabolicas.
Número Mais Provável (NMP): Amplamente utilizado em laboratorios de microbiologia
de alimentos ou ambiental, na quantificacao de microrganismos em agua, leite e outros
produtos. Esta metodologia e basicamente utilizada para a pesquisa de coliformes totais e
coliformes fecais, que sao microrganismos indicadores de poluicao fecal, o que pode ter como
consequencia a presenca de outros organismos, tais como protozoarios e virus. Esta tecnica foi
desenvolvida apos analises estatisticas complexas. A determinacao do NMP e realizada
inoculando-se 3 series de 5 tubos, com 10, 1 e 0,1 ml da agua ou do produto homogeneizado
em solucao salina, em meios seletivos para coliformes totais contendo tubos de Durham
invertidos em seu interior. Estes sao incubados por 48 hs/37°C sendo entao analisados quanto
ao crescimento e a presenca de gas no interior dos tubos de Durham.
Tal resultado e considerado como positivo para a presenca de coliformes totais.
Amostras dos tubos positivos sao entao repicados para caldos seletivos para coliforme fecais,
tambem contendo tubos de Durham, os quais sao incubados por mais 24 ou 48 hs a 42°C. De
todos os tubos positivos faz-se uma semeadura em placa com meio seletivo e posterior
identificacao bioquimica. De acordo com o numero de tubos que apresentam gas determina-se
o NMP, pela consulta de uma tabela desenvolvida por Hoskins (1934). Este e um teste apenas
presuntivo para a presenca de coliformes.
Curva de crescimento (cultura descontínua)
Quando uma cultura microbiana desenvolve-se em um sistema fechado, pode-se confeccionar
uma curva de crescimento. Esta pode ser dividida em diferentes etapas: lag, log, estacionaria e
de declinio.
Curva de Crescimento Padrão, em um sistema fechado
Lag: periodo variavel, onde ainda nao ha um aumento significativo da populacao. Ao
contrario, e um periodo onde o numero de organismos permanece praticamente inalterado.
Esta fase e apenas observada quando o inoculo inicial e proveniente de culturas mais antigas.
A fase lag ocorre porque as celulas de fase estacionaria encontram-se depletadas de varias
coenzimas essenciais e/ou outros constituintes celulares necessarios a absorcao dos nutrientes
presentes no meio.
A fase lag tambem e observada quando as celulas sofrem traumas fisicos (choque
termico, radiacoes) ou quimicos (produtos toxicos), ou quando sao transferidas de um meio rico
para outro de composicao mais pobre, devido a necessidade de sintese de varias enzimas.
Assim, durante este periodo observa-se um aumento na quantidade de proteinas, no peso seco
e no tamanho celular.
Log ou exponencial: nesta etapa, as celulas estao plenamente adaptadas, absorvendo
os nutrientes, sintetizando seus constituintes, crescendo e se duplicando. Deve ser levado em
conta tambem que neste momento, a quantidade de produtos finais de metabolismo ainda e
pequena. A taxa de crescimento exponencial e variavel, de acordo com o tempo de geracao do
organismo em questao. Geralmente, procariotos crescem mais rapidamente que eucariotos.
Nesta fase sao realizadas as medidas de tempo de geracao. Geralmente, ao final da fase log,
as bacterias passam a apresentar fenotipos novos, decorrentes do processo de comunicacao
denominado "quorum sensing".
Estacionária: Nesta fase, os nutrientes estao escasseando e os produtos toxicos estao
tornando-se mais abundantes. Nesta etapa nao ha um crescimento liquido da populacao, ou
seja, o numero de celulas que se divide e equivalente ao numero de celulas que morrem. Na
fase estacionaria que sao sintetizados varios metabolitos secundarios, que incluem antibioticos
e algumas enzimas. Nesta etapa ocorre tambem a esporulacao das bacterias.
Foram detectados alguns genes (sur) que sao necessarios a sobrevivencia das celulas
na fase estacionaria. Alem destes, existem outros genes (fatores s alternativos da RNA
polimerase, proteinas protetoras contra dano oxidativo).
Declínio: A maioria das celulas esta em processo de morte, embora outras ainda
estejam se dividindo. A contagem total permanece relativamente constante, enquanto a de
viaveis cai lentamente. Em alguns casos ha a lise celular.
Culturas descontinuas tendem a sofrer mutacoes que podem repercutir na populacao como um
todo. As proprias condicoes ambientais tendem a promover variacoes de carater fenotipico
(reversivel) nas culturas.
Crescimento em culturas contínuas: tecnica muito usada nos processos industriais
de obtencao de produtos microbiologicos. Nestes casos, tem-se o interesse em manter as
celulas em fase log ou estacionaria. Utilizam-se fermentadores ou quimiostatos, que permitem
um crescimento em equilibrio dinaminco, havendo assim um controle da densidade
populacional e da taxa de crescimento. Estes sao respectivamente controlados pela
concetracao do nutriente limitante (fonte de C ou N) e pela taxa de fluxo (taxa de diluicao). Em
baixas concentracoes do nutriente limitante, a taxa de crescimento e proporcional a
concentracao do nutriente (que e virtualmente zero).
Crescimento sincronizado: inicialmente obtido por processos que retardavam a
sintese de DNA. Atualmente, utiliza-se metodos de separacao mecanica das celulas menores,
recem-divididas. Pode ser feita pela filtracao em varios papeis de filtro, que retem celulas
maiores, em fase de divisao.
Efeito dos fatores ambientais no crescimento
O crescimento dos microrganismos e grandemente afetado pelas condicoes fisicas e
quimicas do ambiente onde se encontram, sendo que estas podem influir positivamente ou
negativamente de acordo com o microrganismo em questao.
Temperatura: Corresponde a um dos principais fatores ambientais que influenciam o
desenvolvimento bacteriano. A medida que ha um aumento da temperatura, as reacoes
quimicas e enzimaticas na celula tendem a tornar-se mais rapidas, acelerando a taxa de
crescimento. Entretanto, em determinadas temperaturas inicia-se o processo de desnaturacao
de proteinas e acidos nucleicos, inviabilizando a sobrevivencia celular.
Assim, todos os microrganismos apresentam uma faixa de temperatura onde
desenvolvem-se plenamente. Nesta faixa de temperatura podemos determinar as temperaturas
minima, otima e maxima (temperaturas cardeais), para cada microrganismo. A temperatura
maxima provavelmente reflete os processos de desnaturacao mencionados acima, enquanto os
fatores que determinam a temperatura minima ainda nao sao bem conhecidos, embora
certamente a fluidez da membrana seja um dos fatores determinantes destes niveis termicos
baixos.
Temperaturas cardeais dos microrganismos
Dentre os diferentes microrganismos observa-se uma ampla variedade de faixas de
temperatura, onde para alguns o otimo encontra-se entre 5 e 10°C, enquanto para outros e de
90 a 100°C. Assim, os microrganismos podem ser classificados em quatro grupos, de acordo
com os otimos de temperatura: psicrofilos (0 a 20°C, otimo de ≈ 15°C - Flavobacterium),
mesofilos (12 a 45°C, 37°C - E. coli), termofilos (42 a 68°C, 62°C - Thermococcus), e
hipertermofilos (80 a 113°C, 105°C - Pyrodictium brockii).
Tipos de bactérias em relação à temperatura
Psicrófilos: os ambientes frios sao predominantes na Terra (oceanos, polos, solos)
entretanto este grupo (bacterias, fungos e algas) e muito pouco estudado. Destes, os mais
conhecidos sao as algas que crescem sob o gelo ou em geleiras (Chlamydomonas nivalis),
dando coloracao vermelha.
Ha os microrganismos psicrotolerantes que sao aqueles cujo otimo encontra-se entre
20 e 40°C e que sobrevivem a 0°C. Sao um grupo amplo (bacterias, fungos, algas e
protozoarios) que podem contaminar alimentos e outros substratos refrigerados.
Mesófilos: crescem numa faixa de 20 a 40°C, com um otimo em torno de 37°C, sendo
os principais microrganismos encontrados em animais de sangue quente.
Termófilos e Hipertermófilos: otimos de 45 e ≥ 80°C, respectivamente. Sao
encontrados nos solos, silagem, fontes termais e no fundo oceanico, em fontes. Geralmente
sao procariotos, sendo as Archaea as mais resistentes, apresentando enzimas e proteinas
termoestaveis, provavelmente devido a substituicao de aminoacidos, conferindo um novo
folding. Tem tambem uma maior concentracao de acidos graxos saturados na MC. As Archaea
nao tem acidos graxos na MC, mas sim hidrocarbonetos de cadeias com diferentes
comprimentos, compostas por unidades repetitivas de 5 C (fitano), ligadas a glicerol fosfato, por
ligacao eter.
Os termofilos e hipertermofilos tem grande interesse biotecnologico porque tendem a
fazer os processo mais rapidamente, com menor contaminacao por outros microrganismos e
possuem enzimas mais termoestaveis.
pH: Os ambientes naturais tem uma faixa de pH de 5 a 9, o que comporta o crescimento
de diferentes tipos de microrganismos.
Bacterias - faixa entre 7, com algumas acidofilas (Thiobacillus de 0,5 a 6,0 com otimo entre 2 e
3,5) e outras alcalifilicas (Bacillus e Archaea).
Fungos - tendem a ser mais acidofilos que as bacterias (pH <5).
Distribuição de alguns microrgansmos, de acordo com o pH
Tensão de O2: Extremamente importante no desenvolvimento, uma vez que os
microrganismos comportam-se de forma bastante distinta, sendo classificados como aerobios,
anaerobios facultativos, anaerobios estritos, anaerobios aerotolerantes e microaerofilos
(requerem concentracoes baixas de O2).
As condicoes de anaerobiose podem ser conseguidas pelo uso de agentes redutores nos
meios de cultura, tais como o tioglicolato de sodio, que reage com o oxigenio, formando agua;
pela remocao mecanica do oxigenio, sendo substituido por nitrogenio e CO2; pelo uso de
sistemas comerciais do tipo "GasPak", que gera hidrogenio e CO2 com um catalisador de
paladio. Adiciona-se agua ao sistema, a qual gera hidrogenio, que reage com o oxigenio na
superficie do catalisador, formando agua; ou ainda pelo uso de "glove box" anaerobias ou a
mesa inoculadora desenvolvida pelo VPI.
Classes de organismos, em relação à tensão de oxigênio
Água: Essencial a qualquer microrganismo, embora as necessidades sejam variadas. E
o solvente universal, mas sua disponibilidade e variavel (solucoes com acucares ou sais tem
menos agua disponivel).
Aw: pressao do vapor em equilibrio com a solucao/ pv da agua, variando de 0 a 1.
Os organismos que vivem em ambientes onde a disponibilidade de agua e baixa
desenvolvem mecanismos para extrair agua do ambiente, pelo aumento da concentracao de
solutos internos, seja bombeando ions para o interior ou sintetizando ou concentrando solutos
organicos (solutos compativeis), que podem ser acucares, alcoois ou aminoacidos (prolina,
betaine, glicerol).
Pressão osmótica: Fator extremamente importante, principalmente a partir do maior
conhecimento sobre as Archaea, visto que varios membros deste dominio requerem altas
concentracoes de sais para seu desenvolvimento.
Classes de organismos, em relação à salinidade
Fatores adicionais:
Fonte luminosa para fototroficos autotroficos. Pressão atmosférica, para aqueles que
vivem em profundidades.
Reprodução em procariotos
Introdução
A divisao celular e um processo complexo, que ocorre de variadas maneiras,
dependendo do tipo de organismo. Em eucariotos, os microtubulos do fuso mitotico atuam
como a forca motriz durante a segregacao cromossomal. Nas celulas animais e em fungos, um
anel de actina-miosina se forma na porcao mediana de uma celula em divisao, sendo que a
forca gerada pela interacao entre estas duas proteinas promove o crescimento interior do septo
de divisao. Nas plantas, a formacao do septo e complexa, devido a parede celular espessa.
Assim, surge na regiao central da celula um “disco”, que cresce de forma centrifuga. Em todos
estes casos o sitio de divisao celular e definido indiretamente pelos microtubulos, pois o
posicionamento do fuso mitotico parece ser crucial no direcionamento do plano de divisao. Nas
plantas um feixe transiente de microtubulos envolve a celula no plano de divisao, com um
possivel papel na selecao do sitio de divisao.
Embora intensamente estudado, o processo de divisao celular em procariotos ainda e
pouco conhecido, existindo alguns modelos propostos. Uma das principais conclusoes obtidas
destes estudos refere-se ao fato da divisao celular em procariotos corresponder a um processo
extremamente complexo e regulado, tanto em termos espaciais como temporais. Assim, ha
uma serie de mecanismos que regulam os eventos de duplicacao e segregacao do
cromossomo e a formacao do septo de divisao, garantido a eficiencia do processo. Outro
importante achado refere-se a intensa participacao de proteinas citoplasmaticas, atuando como
analogos do citoesqueleto de celulas eucarioticas, no processo de divisao celular.
Ate o momento, os estudos indicam que a maioria dos procariotos se divide por fissao
binaria, originando duas celulas filhas identicas logo apos a duplicacao e segregacao
cromossomal. O ciclo celular bacteriano pode ser divido em duas fases: 1) Um ciclo de DNA,
que inclui a replicacao e segregacao dos cromossomos e 2) um ciclo de divisao, com a
citocinese e separacao das celulas filhas.
No entanto, estudos com outras bacterias, tais como a bacteria pedunculada Caulobacter
crescentus, revelam um processo mais complexo de divisao, originando celulas distintas
morfologica e fisiologicamente. Relatos mais recentes da literatura descrevem a ocorrencia de
diferentes procesos de reproducao no dominio Bacteria.
Assim, em Epulopiscium, uma bacteria "gigante" simbionte intestinal do peixe cirurgiao,
foi observada a ocorrencia de viviparidade, com a formacao de 1 a 7 celulas filhas ativas
metabolicamente, as quais sao liberadas apos a lise da celula mae. Neste mesmo genero e em
Metabacterium polyspora, foi descrita a formacao de multiplos esporos intracelulares. Tais
relatos deixam claro o quanto ainda desconhecemos sobre a reproducao em procariotos e que
estes organismos sao capazes de exibir mais de um mecanismo de reproducao.
Visando abordar de maneira geral os eventos associados a reproducao procariotica por
meio da fissao binaria, passaremos a descrever os principais resultados obtidos a partir de
pesquisas realizadas especialmente com Escherichia coli e Bacillus subtilis.
O processo de fissão binária - Uma visão geral
Fissão binária em B. subtilis – Esta bacteria corresponde a um excelente modelo de
estudo devido a sua capacidade de originar endosporos, quando em condicoes desfavoraveis.
Neste sentido, um dos aspectos que mais chamou a atencao dos pesquisadores foi que
durante a reproducao o septo de divisao era formado na regiao mediana da celula, enquanto na
esporulacao o septo localizava-se na regiao proxima a um dos polos celulares (Fig. 1). A fissao
binaria ocorre quando a celula cresce, atinge cerca do dobro de seu comprimento e se divide.
Paralelamente, ha a duplicacao e segregacao do DNA (Fig. 1a). Por outro lado, na
esporulacao, ha a duplicacao do cromossomo, mas o septo formado tem localizacao polar,
sendo esta a regiao de formacao do endosporo (Fig. 1b).
Adaptado de Angert (2005) Nature Rev. Microbiol., 3:214-224.
Fig. 1 – Ciclos de vida em B. subtilis. Em (a) ciclo vegetativo. Em condicoes
favoraveis, a celula aumenta de tamanho, replica o cromossomo (azul) e se divide por fissao
binaria. O aparato de divisao e montado, com a proteina FtsZ (verde) formando um anel no
meio da celula, onde ocorre a divisao. Em condicoes de exaustao ambiental (Fig. 1b), a celula
forma esporos. As duas copias do cromossomo assumem uma nova configuracao, que se
estende de um polo a outro. A maquinaria de divisao e montada nos dois polos, mas a divisao
ocorre somente em um deles. Parte de um dos cromossomos fica presa por um septo de
divisao, sendo empacotado pelas proteinas do septo, em um compartimento fechado (preesporo).
O pre-esporo e entao englobado pela celula mae. O pre-esporo e preparado para a
dormencia, pois proteinas se ligam, protegendo o DNA, o citoplasma e mineralizado e e
formada uma barreira proteica ao redor da estrutura.
Varios sao os aspectos ainda pouco elucidados sobre a divisao celular. Por exemplo,
como ocorre a segregacao do DNA? Como o septo de divisao e localizado corretamente? Os
estudos vem mostrando que as bacterias possuem uma serie de proteinas citoplasmaticas que
atuam como um verdadeiro citoesqueleto, sendo responsaveis pela correta migracao do DNA e
posicionamento do septo. Existem autores que vem utilizando o termo "replissomo" para
descrever a complexa maquinaria celular envolvida no processo de divisao. Alem disso, dados
recentes tambem revelam que os lipideos de membrana sao importantes componentes do
replissomo. Dentre os diversos componentes da maquinaria, uma proteina denominada MreB,
semelhante a actina, esta implicada na segregacao do DNA.
Um dos componentes mais estudados corresponde a proteina FtsZ, um homologo estrutural da
tubulina que, durante a fissao binaria, se organiza como um anel no centro da celula e atua
como ponto de ancoragem de outros elementos do aparato. Estes outros componentes
redirecionam o crescimento da parede celular e protegem o DNA de danos enquanto o
envelope invagina. FtsZ e uma proteina muito conservada e e uma das primeiras proteinas a
se organizar no fututro sitio de divisao. Nos proximos topicos discutiremos a proteina FtsZ em
maior detalhe.
Em condicoes normais, o septo de divisao somente e formado apos a segregacao do
DNA duplicado. Varios sao os processos que resultam em tal situacao. Um deles corresponde
a propria oclusao do futuro sitio de divisao pelo nucleoide ainda nao segregado. Ao que parece,
o DNA se liga a uma serie de lipideos da membrana, nao permitindo que o anel FtsZ seja
montado. Outras proteinas, denominadas sistema MinCD, impedem a montagem do complexo
FtsZ nos polos.
Alem destas, varias outras vem sendo estudadas, tais como EzrA, que afeta a estabilidade dos
polimeros FtsZ, otimizando sua montagem apenas nos locais corretos. No caso de danos ao
DNA, as proteinas YneA e SulA desestabilizam o anel, impedindo a divisao.
O processo de segregação dos cromossomos bacterianos
Esta etapa da divisao celular procariotica foi analisada a partir dos estudos com B. subtilis,
como mencionado anteriormente, uma bacteria capaz de esporular. A partir dos estudos com
mutantes incapazes de realizar o processo completo de segregacao cromossomal, foi
verificado que sempre um mesmo segmento de DNA era o primeiro a atingir os polos celulares.
O mapeamento deste segmento de DNA revelou que tal sequencia correspondia a regiao
situada adjacente a oriC, que e a origem de replicacao do DNA cromossomal.
Em E. coli, a replicacao do cromossomo ocorre quando o complexo proteina DnaA-ATP
se liga a sitios em oriC. A ligacao promove o desenovelamento da oriC, o recrutamento de uma
helicase (DnaB) e a montagem de um replissoma. A iniciacao da replicacao e regulada,
ocorrendo uma vez a cada ciclo celular. A Figura 2 esquematiza o ciclo de iniciacao da
duplicacao do DNA mediado pela proteina DnaA.
Adaptado de Boeneman, K. & Crooke, E. (2005) Curr. Op. Microbiol., 8:143–148.
Fig. 2 – Regulação da atividade de DnaA. Quando na presenca de excesso de ATP, a
proteina DnaA se liga ao ATP e se complexa em oriC, iniciando a replicacao do DNA. A DnaA
hidrolisa o ATP, originando ADP e passando para a forma inativa. Nesta forma, ha a interacao
de DnaA-ADP ligada a oriC com fosfolipideos acidos da membrana citoplasmatica,
promovendo a reciclagem de DnaA para sua forma ativa, ligada ao ATP.
O conjunto DnaA/oriC/lipideos de membrana encontra-se situado na porcao mediana da
celula e, a medida que a sintese das moleculas de DNA ocorre, estas migram para os polos,
liberando assim a regiao central para a formacao do septo de divisao.
Em eucariotos, o movimento e segregacao dos cromossomos e controlado pelos
centromeros. Estes, ligam-se aos microtubulos do fuso mitotico atraves de conjuntos proteicos
denominados cinetocoros. O movimento do cromossomo ao longo do fuso ocorre como
resposta a uma forca exercida nos cinetocoros, seja pela acao de proteinas motoras ou pela
“montagem-desmontagem” dos microtubulos que formam o fuso.
O fato da regiao oriC estar sempre localizada nas vizinhancas do polo celular sugere
que esta regiao poderia conter uma sequencia do tipo centromero. Alem disso, pela sua
localizacao sempre igual, foi especulado que deveria haver a participacao de uma ou mais
proteinas, desempenhando o papel dos cinetocoros ou das proteinas motoras dos eucariotos.
A partir de outros estudos, foi identificada um proteina, denominada Spo0J que, em
linhagens mutantes, promovia alteracoes na segregacao dos cromossomos de celulas
vegetativas. Em celulas onde o gene spo0J foi deletado, a oriC deixava de se localizar nos
polos celulares, indicando que a proteina Spo0J poderia estar envolvida no posicionamento
polar da oriC.
Por meio de estudos microscopicos,verificaram que a proteina Spo0J forma “focos” se
se ligam ao DNA em um ou mais sitios, nas proximidades de oriC. Assim, cada copia da regiao
onde esta a origem de replicacao parece ter seu proprio conjunto de Spo0J.
O achado mais marcante em relacao a estes eventos de segregacao corresponde a
rapida migracao deste conjunto (DNA-Spo0J) ao longo do eixo celular. Tal fenomeno sugere a
existencia de proteinas geradoras de forca e a presenca de alguma estrutura analoga a um
citoesqueleto.
Dados mais recentes sugerem a participacao de uma proteina, denominada RacA, no
processo de migracao dos cromossomos para os polos. Ao que parece, esta proteina exerce
um papel analogo ao desempenhado pelo fuso mitotico.
A replicação bacteriana seria como uma mitose?
O conjunto de Spo0J poderia ser comparado funcionalmente aos cinetocoros, que sao
as organelas envolvidas na ligacao dos centromeros aos microtubulos do fuso.
Alternativamente, Spo0J poderia atuar em uma fase inicial, transformando as regioes
oriC recem-replicadas em estruturas com um dobramento tal que seriam entao separadas por
outras proteinas (talvez RacA). Isto poderia ter um papel importante, pois sabe-se que em
bacterias, os eventos de replicacao se sobrepoem. Nestes casos, a separacao correta evitaria
o emaranhado de cromossomos.
Tais achados nao sao surpresa, uma vez que os eucariotos e os procariotos devem ter
evoluido a partir de um ancestral comum, que era eficiente na segregacao cromossomal.
Assim, nao teria porque este evento ser tao distinto nas bacterias, onde a grande maioria dos
processos ocorrem de forma similar aos eucariotos.
Modelo proposto para a segregação cromossomal, em bactérias
(Adaptado de Errington, J. ASM News 64:210-217, 1998)
Seleção do sítio de divisão durante a divisão celular simétrica
Como a celula seleciona o sitio mediano ainda nao esta precisamente estabelecido, entretanto
muitos dados ja existem para explicar esta etapa do processo de divisao celular.
Estudos com mutantes de E. coli indicam que as celulas contem tres sitios potenciais de
divisao: na regiao central e nos polos. Normalmente, para que ocorra uma divisao na regiao
central, os sitios polares devem ser inibidos, sem a inibicao do sitio potencial mediano. Nestas
celulas, parece que tal processo se da pela acao cooperativa de um inibidor de divisao com um
fator topologico de especificidade, os quais sao codificados pelos genes minC, minD e minE.
Papel das proteínas Min, na localizaçào do septo de divisão
(Adaptado de Rothfield & Zhao. Cell, 84:183-186, 1996)
Parece que, inicialmente, as proteinas MinC e MinD atuariam em conjunto, como um
inibidor inespecifico de divisao, capaz de bloquear todos os sitios possiveis de septacao. Esta
observacao se baseia no fato que a divisao fica completamente bloqueada quando minC e
minD sao expressos, na ausencia de minE. A proteina MinE, de alguma forma, conferiria a
especificidade topologica ao sistema, de forma que MinCD bloquearia somente os sitios
polares, sem interferir com o sitio mediano.
MinE teria duas funcoes: 1) Como antagonista de MinCD e 2) Como fator de especificidade
topologica pois quando se liga ao sitio central, restringe o conjunto MinCD aos sitios polares,
nao desejados para a divisao. Estudos indicam que estas funcoes de MinE estao localizadas
em dominios distintos na sequencia de 88 aminoacidos da proteina. A funcao antagonica sobre
MinCD esta localizada em um pequeno dominio N-terminal (MinE1-22). A funcao topologica
esta associada a um dominio C-terminal (MinE23-81).
Assim, o dominio N-terminal atuaria como um antagonista de MinCD, enquanto o Cterminal
atuaria, direta ou indiretamente, como um sensor topologico, capaz de distinguir o sitio
potencial mediano daqueles nos polos.
Os autores especulam que existiriam uma molecula alvo (topologico) que marcaria o sitio
mediano como sendo diferente dos sitios polares. A elevada afinidade da regiao Carboxiterminal
de MinE por este alvo levaria a localizacao preferencial da proteina na regiao mediana,
enquanto a porcao amino-terminal impediria a acao bloqueadora de MinCD. Como a MinE
estaria sequestrada na regiao mediana, a proteina nao estaria disponivel para interferir com a
atividade de MinCD nos polos.
Dados mais recentes indicam que alem das proteinas Min, os fosfolipideos de
membrana tambem teriam papel na selecao do sitio de septacao. Uma das primeiras proteinas
que participam do processo de septacao, FtsA ou ZipA, poderiam reconhecer e interagir com
um dominio fosfolipidico situado da porcao central da membrana da celula, permitindo assim a
ligacao de FtsZ.
Adaptado de Mileykovskaya, E. & Dowhan, W. (2005) Curr. Op. Microbiol., 8:135–142.
Esquema do ciclo celular. (a) A nova celula filha apresenta a origem e a terminacao
de replicacao do DNA ("o" verde, oriC e "T" vermelho, de lado, respectivamente); o sistema Min
(bolas verdes e rosas) ligado aos polos, ou oscilando entre os polos; dominios lipidicos nos
polos (vermelho). (b) O cromossomo sofre uma rotacao, trazendo a oriC para a porcao central,
onde e formado um dominio lipidico rico em cardiolipina (vermelho). O DNA comeca a ser
replicado pela DnaA, e pela montagem do replissomo (pentagono). (c,d) As origens recemreplicadas
se movem em direcao aos polos, liberando o dominio lipidico central para agora
interagir com FtsZ (purpura). (e) Organizacao da maquinaria de divisao (multicolorida) e
conversao do dominio central em futuros polos. (f) Em E: coli, MinD (rosa) e seu dominio Cterminal
(cinza) trocam ADP por ATP (direita), expondo a porcao C-terminal, que interage com
lipideos de membrana nos polos. O polimero de MinD-ATP pode crescer em direcao ao centro.
Proximo ao centro, a ligacao de MinE (verde) induz a hidrolise de ATP, levando MinD para a
conformacao MinD-ADP, despolimerizando-o e voltando para os polos. (g) Varias moleculas de
DnaA (amarelo) associadas a ATP ou ADP.
Somente quando ligada a ATP a DnaA (diagrama da direita) e capaz de se ligar proximo
a oriC (azul e verde), abrir o DNA e permitir a montagem do replissomo. A forma inativa, DnaAADP
ligada a oriC e reciclada na membrana (vermelho).
Formação do septo de divisão e a separação das células filhas
Estudos indicam que uma proteina presente em E. coli, denominada FtsZ, desempenha
importante papel na formacao do septo e separacao das celulas filhas, durante o processo de
divisao celular.
A proteina FtsZ forma um anel no sitio da divisao celular, sugerindo um papel estrutural para
esta proteina neste processo. Atualmente sabe-se que a FtsZ tem homologia com as porcoes
que se ligam ao GTP da tubulina, sendo os cristais das duas muito semelhantes e que tambem
atua como GTPase.
A FtsZ hidrolisa o GTP apos formar estruturas semelhantes a polimeros de tubulina e
vem sendo encontrada (ou homologos) em um grande numero de especies de Bacteria e
Archaea estudadas ate o momento, formando um anel no sitio de divisao.
Homologos de FtsZ ja foram detectados em celulas vegetais, onde mutacoes nestes genes
impedem a divisao dos cloroplastos, reforcando a hipotese de sua participacao na divisao
celular e tambem a teoria da endossimbiose.
Componentes da maquinaria de divisão celular
Durante a divisao, varias proteinas sao recrutadas para o anel formado por FtsZ: FtsA,
FtsQ, FtsW, FtsL, FtsN, FtsK, FtsI (PbP3) e ZipA, que se organizam em um complexo para
realizar a divisao. Exceto por FtsZ, FtsA e ZipA, todas as demais apresentam domininios
transmembranosos e periplasmaticos, indicando que atravessam a membrana citoplasmatica.
O anel FtsZ localiza-se exatamente no centro de uma celula vegetativa bacilar, como E. coli,
sugerindo uma pre-determinacao do local, provavelmente mediada por MinE.
Durante a divisao o anel FtsZ comeca a se contrair, pela remocao sucessiva de suas
subunidades, as quais migram para as futuras regioes centrais das novas celulas filhas. Assim,
acredita-se que os sitios de divisao da proxima geracao ja estao presentes nas celulas mae,
sendo o processo de montagem e desmontagem bastante rapido.
Formação do septo e separação das células filhas
(Adaptado de Margolin, W. ASM News 65, 1999)
Seleção do sítio de divisão durante a divisão celular assimétrica
Em B. subtilis, os sitios polares sao utilizados para a formacao do septo apenas durante
a esporulacao. Quando crescendo vegetativamente, B. subtilis utiliza a regiao mediana para a
formacao do septo de divisao entretanto, em condicoes desfavoraveis, o sitio de septacao
passa para um dos polos, permitindo a esporulacao.
Durante o crescimento vegetativo, B. subtilis seria semelhante a E. coli, com MinCD
atua conjuntamente, provavelmente com a proteina de funcao igual a MinE, ainda nao
descoberta, que suprimiria o uso dos sitios polares para a divisao. Havendo um estimulo para a
esporulacao, a especificidade topologica do sistema seria revertida, ocorrendo liberacao dos
sitios polares. Um modelo explicativo implicaria na existencia de duas MinE, com diferentes
propriedades topologicas, que determinariam a localizacao central ou subterminal do septo.
Reprodução pela formação de esporos múltiplos, inativos - Metabacterium
polyspora
Esta bacteria Gram positiva habita o trato GI de cobaias e produz multiplos (ate 9)
endosporos. O ciclo de vida desta bacteria requer que o organismo circule pelo trato GI, ou
seja, depende da natura coprofaga de seu hospedeiro. Esporos de M. polyspora sao isolados
das fezes do hospedeiro e somente estes esporos maduros sobrevivem a passagem pelo
estomago, indo germinar no intestino delgado (figura abaixo). Algumas celulas fazem fissao
binaria neste estagio, mas a maioria esporula. A partir do intestino delgado, as bacterias se
depositam no ceco, ondem terminam de esporular. Ao que parece, os pre-esporos ou
endosporos maduros nao sao capazes de realizar fissao binaria. Os esporos passam pelo ceco
e finalmente sao eliminados nas fezes, podendo ser novamente ingeridos pelo hospedeiro,
recomecando o ciclo.
A esporulacao em M. polyspora e diferente, com uma divisao iniciada nos dois polos e o
DNA vai para os dois compartimentos. Apos o englobamento, o pre-esporo pode se dividir,
produzindo outros pre-esporos que amadurecem. Assim, existem 3 ou mais copias do genoma.
Adaptado de Angert, E.R. (2005). Nature Rev. Microbiol., 3:214-224.
Formação de múltiplos esporos em M. polyspora. a-g: fluorescencia especifica para
membrana e capas de esporos. a: as celulas se dividem nos dois polos. b: pre-esporos
englobados pela celula mae. c. pre-esporos capazes de fazer fissao binaria (a seta indica um
novo septo de divisao formado). d: divisao e crescimento do pre-esporo. e: amadurecimento do
pre-esporo, f: M polyspora com 7 pre-esporos. g: celula que emerge do esporo, se divide nos
polos e comeca a esporular. h: micrografia de contraste, mostrando fissao binaria em M.
polyspora, um evento raro.
O processo de reprodução em Epulopiscium fischelsoni - uma bactéria vivípara
Desde a sua descoberta, o genero Epulopiscium tem fascinado os microbiologistas, por
suas caracteristicas extremamente diferentes daquelas observadas nas bacterias comumente
estudadas. Alem de ser unica por suas dimensoes (podendo atingir cerca de 600 a 800 nm),
estes organismos apresentam um tipo viviparo de reproducao.
Dados recentes da literatura revelam que as celulas de Epulopiscium sao capazes de
gerar de 1 a 7 celulas filhas ativas, em seu interior. Ao que parece, o processo se assemelha a
esporulacao, envolvendo a condensacao da molecula de DNA duplicada, que normalmente
dirige-se aos polos da celula mae.
Estudos envolvendo analises microscopicas revelam que apos o periodo de
condensacao e migracao do DNA para as extremidades celulares, este se apresenta
descondensado, com as celulas filhas ativas metabolicamente.
Geralmente, sao produzidas 2 celulas filhas, estando uma em cada polo. No entanto,
quando sao geradas mais que 2 celulas filhas, observa-se a condensacao do DNA em regioes
medianas da celula mae, situadas imediatamente abaixo da parede celular.
Esquema geral de uma célula de Epulopiscium originando uma célula filha
(Adaptado de Angert & Clements (2004) Mol. Microbiol., 51:827–835)
Estes resultados sao bastante recentes, embora em 1998 tenha sido publicado um
artigo descrevendo a ocorrencia de "vesiculas contendo nucleoides" neste organismo. Muito
pouco se sabe ainda sobre o processo de reproducao neste organismo, embora os dados
obtidos no estudo referente a figura acima descrevam tambem a ocorrencia do anel formado
pelas proteinas FtsZ.
Assim, possivelmente em um futuro nao muito distante, novas informacoes estarao
disponiveis acerca do processo viviparo de reproducao neste procarioto.
Metabolismo Microbiano
Classes de organismos, quanto às fontes de energia e carbono
Energia: e definida como a capacidade de produzir trabalho
Os organismos podem ser classificados em dois grandes grupos, de acordo com a forma que
obtem sua energia:os fototroficos, que obtem sua energia a partir da energia luminosa, pela
fotossintese e os quimiotroficos, que obtem sua energia a partir da utilizacao de compostos
quimicos, envolvendo especialmente reacoes de oxidacao e reducao.
Em relacao as fontes de carbono, os organismos podem ainda ser classificados como
autotroficos, quando utilizam fontes inorganicas de carbono (CO2) e heterotrofico, quando as
fontes de carbono sao de natureza organica.
Inicialmente, serao discutidos os processos de producao de energia em organismos
quimiotroficos heterotroficos, uma vez que estes sao bastante conhecidos e estudados
metabolicamente.
Nos organismos quimiotroficos, a energia e obtida basicamente atraves de reacoes de
oxirreducao, tendo como substratos os nutrientes adquiridos pelas celulas.
Todo e qualquer nutriente, exibem uma energia associada aos eletrons presentes nas ligacoes
interatomicas e, dependendo da estabilidade na distribuicao desta energia, podemos ter
compostos com ligacoes “ricas em energia”, ou seja, ligacoes instaveis, que facilmente liberam
a energia contida. Assim, nos organismos quimiotroficos, pode-se falar em energia quimica:
aquela liberada quando compostos organicos ou inorganicos sao oxidados.
Reações de oxi-redução
Oxidacao => remocao de eletrons (ou atomos de hidrogenio) de um atomo ou molecula.
Reducao => Ganho de eletrons (ou atomos de hidrogenio) de um atomo ou molecula.
Tal definicao decorre do fato de que frequentemente, estas reacoes envolvem a
transferencia nao somente de eletrons, mas sim de atomos de hidrogenio (na forma de H+).
Como os eletrons nao podem ficar isolados, “soltos”, estes devem fazer parte de atomos ou
moleculas. Assim, toda reacao de oxidacao requer acoplada uma reducao. Assim, o composto
que foi oxidado denomina-se de doador de eletrons, enquanto aquele reduzido e o aceptor de
eletrons.
Mecanismos de geracao de ATP
Os organismos apresentam tres mecanismos de fosforilacao para a geracao de ATP:
1) Fosforilacao em nivel de substrato: onde o ATP e gerado pela transferencia de um
grupamento fosfato de alta energia a partir de um composto fosforilado ao ADP. Esta ligacao
rica em energia geralmente foi adquirida na reacao onde o substrato foi oxidado.
2) Fosforilacao oxidativa: Neste caso, os eletrons sao tranferidos do composto organico,
atraves de uma serie de carreadores a um aceptor final, sendo que a transferencia dos eletrons
entre os diferentes carreadores libera energia, onde parte e utilizada na geracao de ATP, pela
quimiosmose.
3) Fotosforilacao: que ocorre em celulas que contem pigmentos que absorvem luz.
Neste caso, a energia luminosa, e convertida em ATP e NADPH, que serao utilizados para a
biossintese, empregando tambem uma cadeia de transporte de eletrons.
Processos onde há a produção de energia, em quimiotróficos
A producao de energia nos organismos quimiotroficos: pode, a grosso modo, ser
dividida em tres categorias: fermentacao, respiracao aerobia e respiracao anarobia.
- Fermentacao: processo que ocorre na ausencia de aceptores finais (anaerobio).
- Respiracao: oxigenio ou outro agente oxidante atua como aceptor final (aerobia ou
anaerobia).
Uma vez que estes tres processos envolvem reacoes de oxirreducao, podemos
diferencia-los genericamente, de acordo com os doadores inciais e aceptores finais de eletrons.
Assim, temos:
Fermentação: processo onde o doador inicial e o aceptor final de eletrons
correspondem a moleculas organicas. Desta forma, a fermentacao e um processo onde ocorre
oxidacao parcial dos compostos organicos, que podem ser acucares, proteinas, acidos, entre
outros. Como o processo e parcial, ha apenas uma pequena fracao de energia liberada. Nas
fermentacoes, o ATP e gerado a partir da fosforilacao em nivel de substrato.
Por exemplo, apos a quebra da glicose, originando acido piruvico, este pode ser
convertido a outro composto organico, por um processo de fermentacao. Assim, a fermentacao
e um processo que nao depende do ciclo de Krebs, ou da cadeia de transporte de eletrons.
Neste tipo de reacao, os eletrons sao transferidos das coenzimas reduzidas (NADH,
NADPH) ao acido piruvico ou derivados, regenerando-os para novos ciclos de glicolise.
Varios tipos de fermentacao sao observados em diferentes microrganismos, sendo os
exemplos mais conhecidos a fermentacao alcoolica e a fermentacao latica.
Tipos basicos de fermentacao:
Latica (homo ou heterolatica) => acidos latico, acetico, formico, etanol (Lactobacillus,
Streptococcus, Leuconostoc).
Propionica: Propionico, acetico e CO2 (Propionibacterium, Veillonella).
Acetona-Butirica: acido butirico, acetona, butanol, isopropanol, acido acetico, acido formico,
etanol, H2 e CO2 (Clostridium, Eubacterium, Bacillus).
Acetica: acetico, gluconico (Acetobacter).
Aerogenes-coli-tifico: Formico, acetico, latico, succinico, etanol, 2,3-butilenoglicol, H2 e CO2
(Escherichia, Enterobacter, Salmonella).
Exemplos de fermentações
(Adaptado de Tortora et al., Microbiology, an introduction, 1996)
Respiração: Processo onde o doador inicial de eletrons e oxidado, tendo como aceptor
final de eletrons e um composto inorganico. Quando o aceptor final e o oxigenio, a respiracao e
denominada aeróbia e quando o aceptor e outro composto (Sulfato, nitrato), e denominada
anaeróbia. Em todos os processos de respiracao temos a participacao de uma cadeia de
transporte de eletrons.
Respiração Aeróbia
Apos a glicolise, o acido piruvico e convertido a actil-CoA, que entra no ciclo de Krebs,
onde ocorrem uma serie de reacoes de oxirreducao, que transferem a energia para coenzimas,
principalmente NAD+, reduzindo-as. Esta energia armazenada sera transferida, levando a
formacao de ATP, pela cadeia de transporte de eletrons, localizada na membrana
citoplasmatica.
Esta cadeia de transporte corresponde a uma serie de moleculas transportadoras
(flavoproteinas, citocromos e ubiquinonas), que sofrem reacoes de oxirreducao, as quais
promovem uma gradual liberacao de energia, que dirigira a geracao quimiostatica de ATP.
As cadeias de transporte snao bastante variaveis nas diferentes bacterias e uma
mesma bacteria pode apresentar diferentes cadeias de transporte de eletrons.
Durante o transporte ha a producao de ATP, atraves da fosforilacao oxidativa, que esta ligada
ao estabelecimento de um gradiente de protons atraves da membrana.
Quimiosmose: Estas proteinas transportadoras de protons estao orientadas na membrana de
tal forma que possibilita a separacao entre protons e eletrons, sendo os eletrons mandados
para a face citoplasmatica da membrana, por transportadores especificos e os protons para o
lado de fora da celula. Ao final do processo, os eletrons sao carreados ao aceptor final (O2 na
respiracao aerobia), que e reduzido, formando agua. Para formar agua, precisa de ions H+ do
citoplasma, vindos da dissociacao da agua. Em decorrencia destes processos, e gerada uma
formacao liquida de OH- no interior da celula, resultando em um gradiente de pH e um potencial
eletrico ao longo da membrana (dentro fica negativo e alcalino e fora, positivo e acido). A
membrana fica entao energizada (forca motora de protons). Esta energia eletrica pode entao
ser utilizada transporte de ions, movimentacao flagelar ou na formacao de ATP.
Formacao de ATP: A enzima ATPase (um canal para o transporte de protons), ligada a
membrana, possui 2 partes: uma cabeca em multi-subunidades, presente na face interna, e
uma cauda, condutora de protons, que atravessa a membrana. Ela cataliza a reacao entre ATP
e ADP + Pi. Atuando em uma direcao, ela cataliza a formacao de ATP (fosforilacao oxidativa)
pela entrada controlada de protons (a formacao do gradiente e dada com gasto de energia,
enquanto sua dissipacao controlada libera energia).
Exemplos da respiração aeróbia
Respiração anaeróbia: Neste processo, o aceptor final de eletrons nao e o oxigenio,
sendo substituido por nitrato, sulfato ou carbonato. Uma vez que parte do ciclo de Krebs nao e
funcional em condicoes de anaerobiose, e tambem pelo menor numero de moleculas
transportadoras de eletrons presentes, este processo rende menor quantidade de energia, mas
ainda fornece mais que na fermentacao. Eventualmente, ocorre em organismos que realizam
respiracao aerobia.
Fotossíntese: Um dos processos mais importantes na terra, realizado por organismos
autotroficos, que possibilita a conversao da energia luminosa em energia quimica, a qual e
entao utilizada para a conversao do CO2 da atmosfera em compostos de carbono reduzidos,
especialmente acucares.
Neste processo, os eletrons sao obtidos a partir dos atomos de hidrogenio da agua. A
fotossintese pode ser dividida em duas etapas: fase clara a energia luminosa e utilizada na
conversao de ADP a ATP e na reducao de NADP a NADPH. Ha ainda a fase escura, os
eletrons sao utilizados, juntamente com o ATP, para reduzir o CO2 a compostos organicos.
Reacoes luminosas: correspondem a fotofosforilacao, onde a energia luminosa e
absorvida pelos pigmentos (clorofila, bacterioclorofila), excitando os eletrons, que passam para
a primeira de uma serie de moleculas transportadoras, semelhante a cadeia de transporte de
eletrons. Com isso, ha a passagem de protons pela membrana, com a conversao de ADP em
ATP.
A fotofosforilacao pode ser de dois tipos: ciclica e aciclica. No processo ciclico, o eletron
retorna a clorofila, enquanto na aciclica, processo mais comum, os eletrons liberados nao
retornam a clorofila, sendo incorporados ao NADPH. Os eletrons perdidos sao subsituidos por
outros, provenientes da agua ou outro composto oxidavel, tal como H2S. (Na ciclica, quanto ha
a absorcao dos quanta pela bacterioclorofila, a molecula se excita, perdendo um eletron,
tornando-se um agente oxidante potente. O eletron e transferido num processo semelhante a
CTE (Ferredoxina-ubiquinona-cit b-cit f) e retorna a bacterioclorofila.
Entre b e f ha a producao de ATP. Na aciclica (algas) ha dois sistemas de pigmentos
que tambem perdem eletrons, passam por um processo semelhante a CTE, mas o eletron e
usado para reduzir o NADP a NADPH). Reacoes escuras: nao requerem a luz, para que
ocorram e incluem o ciclo de Calvin-Benson, onde o CO2 e fixado.
Exemplos da fotossíntese
Outros tipos metabólicos
Fotoautotróficos: Utilizacao de compostos inorganicos como doadores: Ocorre nos
quimiolitotroficos, sendo as fontes o H2S, H2 e NH3. Os processos sao similares a respiracao
aerobia. A fonte de carbono e geralmente o CO2.
Quimiolitotróficos: O CO2 e reduzido a gliceraldeido 3P (fixacao), que sera
metabolizado via o ciclo de Calvin. A energia para a realizacao destes processos advem da
oxidacao de compostos inorganicos (H2, NH4, NO3).
As bacterias purpuras e verdes usam a luz para produzir ATP; produzem NADPH a partir da
oxidacao de H2S ou compostos organicos (fotossintese anoxigenica). As algas e cianobacterias
geralmente obtem o NADPH pela hidrolise da agua, sendo um evento mediado pela luz
(oxigenica).
Biofilmes Microbianos
Introdução
Nossa percepcao de bacterias como organismos unicelulares baseia-se essencialmente
no conceito de culturas puras, nas quais as celulas podem ser diluidas e estudadas a partir de
culturas liquidas. Como praticamente todos os conceitos e conhecimentos microbiologicos
foram adquiridos a partir do estudo de organismos em culturas puras, somente ha alguns anos
comecamos a entender que, na realidade, a maioria das bacterias se encontra na natureza
vivendo em comunidades, de maior ou menor estruturacao.
O tipo de "ecologia" que imaginavamos em relacao aos procariotos, ou seja, celulas
individuais crescendo de maneira planctonica (livres, em suspensao), raramente e encontrado
na natureza. Sabe-se atualmente que, quando em seus habitats naturais, via de regra as
bacterias sao encontradas em comunidades de diferentes graus de complexidade, associadas
a superficies diversas, geralmente compondo um biofilme, isto e, um ecossistema estruturado
altamente dinamico, que atua de maneira coordenada.
Assim, embora possam ter uma existencia planctonica independente, este tipo de vida
parece ser eventual.
Os biofilmes, complexos ecossistemas microbianos, podem ser formados por
populacoes desenvolvidas a partir de uma unica, ou de multiplas especies, podendo ser
encontrados em uma variedade de superficies bioticas e/ou abioticas. Desta maneira, muitos
autores definem biofilmes como associacoes de microrganismos e de seus produtos
extracelulares, que se encontram aderidos a superficies bioticas ou abioticas.
Geralmente, a dinamica de formacao de um biofilme ocorre em etapas distintas.
Inicialmente temos or organismos denominados colonizadores primarios, que se aderem a uma
superficie, geralmente contendo proteinas ou outros compostos organicos. As celulas aderidas
passam a se desenvolver, originando microcolonias que sintetizam uma matriz
exopolissacaridica (EPS), que passam a atuar como substrato para a aderencia de
microrganismos denominados colonizadores secundarios. Estes colonizadores secundarios
podem se aderir diretamente aos primarios, ou promoverem a formacao de coagregados com
outros microrganisos e entao se aderirem aos primarios.
(Adaptado de Rickard et al., Trends Microbiol., 11:94-100, 2003)
Desenvolvimento de um biofilme. (a) Colonizacao primaria de um substrato; (b)
crescimento, divisao celular e producao do exopolissacarideo (EPS), com o desenvolvimento
de microcolonias; (c) coadesao de celulas individuais, de celulas coagregadas e grupos de
celulas identicas, originando um biofilme jovem, de multiplas especies; (d) maturacao e
formacao de mosaicos clonais no biofilme maduro.
Assim, o biofilme corresponde a uma "entidade" dinamica pois, de acordo com os
microrganismos que o compoem, teremos consicoes fisicas, quimicas e biologicas distintas.
Estas alteracoes fazem com que cada biofilme seja unico, de acordo com os microrganismos
presentes. Neste sentido, ao longo do tempo a composicao microbiana dos biofilmes
geralmente sofre alteracoes significativas. A figura abaixo ilustra nao somente a estruturacao
fisico-quimica de um biofilme, mas tambem sua evolucao e amadurecimento, dependendo das
relacoes estabelecidas pelos microrganismos presentes.
Estágios de formação e vida de um biofilme, determinados por fatores físicos, biológicos e ambientais
(Adaptado de Jenkinson & Lappin-Scott, Trends Microbiol., 9:9-10, 2001)
Comportamento coletivo
Ha varias decadas, foi proposto que as bacterias poderiam corresponder a organismos
interativos, capazes de atuar coletivamente, facilitando sua adaptacao as alteracoes
ambientais. Para que um biofilme de uma ou varias especies seja formado, e necessario o
estabelecimento de um comportamento multicelular, que se reflete em atividades coordenadas
de interacao e comunicacao dos varios organismos. Assim, os biofilmes nao sao simples
camadas viscosas contendo organismos. Estes representam sistemas biologicos altamente
organizados, onde as bacterias estabelecem comunidades funcionais estruturadas e
coordenadas.
Um dos mecanismos de comunicacao interbacteriana que vem se mostrando
extremamente importante na formacao e desenvolvimento de biofilmes corresponde ao quorum
sensing.
Comunidades associadas às superfícies
Os procariotos podem habitar qualquer ambiente adequado as formas de vida
superiores, assim como varios ambientes inospitos a maioria das formas de vida. Tal fato e
decorrente de sua inigualavel diversidade metabolica e plasticidade fenotipica. Um dos
importantes aspectos associados a esta ubiquidade esta relacionado a capacidade destes
organismos migrarem para diferentes nichos, onde podem se propagar. O mecanismo mais
comum que permite a migracao dos procariotos corresponde a motilidade, seja de origem
flagelar, deslizante, ou de outro tipo. No entanto, sao conhecidos mecanismos que tambem
permitem a migracao bacteriana.
Por exemplo, algumas especies podem sintetizar celulose, originando uma pelicula que
mantem as celulas proximas a interface ar-agua, ou na superficie de plantas. Bacterias
fotossintetizantes podem se posicionar nas colunas de agua, em resposta a intensidade
luminosa, pela producao de vesiculas de gas. Outras, apresentam magnetossomos,permitindo
movimentacoes ao longo dos campos magneticos da Terra. Um importante mecanismo na
formacao de comunidades corresponde a agregacao ou aderencia, que otimiza tanto as
interacoes celulares como tambem as taxas de sedimentacao dos organismos.
As comunidades bacterianas tem importantes papeis na natureza, seja na producao e
degradacao de materia organica, na degradacao de poluentes, ou na reciclagem de nitrogenio,
enxofre e varios metais. A maioria destes processos requer o esforco coletivo de organismos
com diferentes capacidades metabolicas. Assim, os biofilmes participam metabolizando
esgotos e aguas contaminadas com petroleo, na nitrificacao, na reciclagem de enxofre oriundo
de drenados acidos de minas (onde o pH e 0) e em varios outros processos. Outro tipo de
biofilme esta associado as particulas em suspensao, muitas vezes denominadas neve marinha,
extremamente importante nas transformacoes biogeoquimicas do carbono em ambientes
pelagicos, na metanogenese, fixacao de nitrogenio e producao de enxofre. Estes achados
revelam que nos biofilmes podem ser criadas condicoes de anaerobiose, em ambientes
normalmente aerobios.
(Adaptado de Davey & O’Toole, Microbiol. Mol. Biol. Rev., 64:847-867, 2000)
Exemplo da ecologia de comunidades microbianas. As quatro microcolonias centrais
correspondem a organismos que geram e consomem hidrogenio. Os fermentadores utilizam
acucares e produzem acidos organicos, utilizados pelos produtores de hidrogenio. Alem das
interacoes metabolicas, a comunicacao intra e intercelular pode ser mediada por moleculas
sinalizadoras.
As interacoes que permitem a agregacao de diferentes especies, ou mesmo generos
microbianos em um biofilme geralmente envolvem a participacao de adesinas (moleculas de
adesao presentes em fimbrias ou dispersar ao longo da superficie celular), que reconhcem
receptores especificos na superficie de outras celulas, ou em diversos tipos de substratos.
Assim, a figura abaixo esquematiza a formacao de um biofilme aquatico, revelando a
complexidade tanto estrutural como temporal deste ecossistema. As horas correspondem ao
tempo medio necessario a adesao dos diferentes microrganismos, revelando a dinamica de
formacao e estruturacao deste biofilme.
Esquema de coagregações envolvendo bactérias aquáticas.
Estrutura dos Biofilmes
A maioria dos biofilmes exibe uma certa heterogeneidade, existindo conjuntos de
agregados celulares distribuidos ao longo da matriz exopolissacaridica, que exibem densidades
variaveis, originando aberturas e canais por onde a agua pode trafegar.
Corte lateral, revelando a estrutura de um biofilme artificial de V. cholerae. A intensidade da cor está
associada à densidade celular.
As microcolonias que compoem um biofilme podem ser de uma ou varias especies,
dependendo das condicoes ambientais. Por exemplo, em locais de grande stress mecanico,
tais como a superficie dental, o biofilme e bastante compactado e estratificado. Os espacos
intersticiais (canais) tambem sao parte importante dos biofilme, pois permitem a circulacao de
nutrientes e a troca de metabolitos.
Por que formar um biofilme?
Acredita-se que a formacao de biofilmes esteja associada, por exemplo, a protecao
contra o ambiente, ou seja, bacterias em um biofilme encontram-se abrigadas e em relativa
homeostase, gracas a presenca da matriz exopolissacaridica. A matriz contem varios
componentes: exopolissacarideo, proteinas, acidos nucleicos, entre outros.
O exopolissacarideo e secretado para o meio externo, sendo de diferentes
composicoes. Ao que parece, o EPS tem diferentes estruturas e funcoes, dependendo das
comunidades e/ou condicoes ambientais. Este polimero pode impedir fisicamente a penetracao
de agentes antimicrobianos no biofilme, principalmente aqueles hidrofilicos e carregados
positivamente. Em alguns casos o EPS e capaz de sequestrar cations, metais e toxinas. Por
estas razoes, os biofilmes podem corresponder a excelentes mecanismos de transferencia de
metais nos ecossistemas, pois varios organismos marinhos pastadores se alimentam de
biofilmes. Foi tambem descrito que o EPS teria papel de protecao contra radiacoes UV,
alteracoes de pH, choques osmoticos e dessecacao.
Disponibilidade de nutrientes e cooperatividade metabólica
Os canais aquosos dos biofilmes podem ser comparados a um sistema circulatorio
primitivo, permitindo a troca de nutrientes e metabolitos, assim como a remocao de metabotilos
potencialmente toxicos. Em um biofilme, torna-se possivel a cooperacao metabolica. Por
exemplo, a degradacao de compostos organicos complexos, originando metano e CO2 durante
uma digestao anaerobia, requer pelo menos tres grupos de organismos. As bacterias
fermentativas iniciam o processo, gerando acidos e alcoois, que sao utilizados por bacterias
acetogenicas. Finalmente, as metanogenicas convertem o acetato, CO2 e hidrogenio,
produzindo metano.
Os biofilmes sao ambientes ideais para o desenvolvimento de relacoes sintroficas, que
e um tipo de simbiose onde dois tipos de organismos metabolicamente distintos dependem um
do outro para utilizarem certos substratos, na producao de energia.
Sintrofia em um grânulo de lodo de um reator metanogênico. Corantes
fluorescentes revelam organismos metanogenicos (em verde) e bacterias que oxidam
propionato (em vermelho). A cor amarela resulta da combinacao verde e vermelho, revelando
microcolonias sintroficas interligadas a cadeias de metanogenicos.
Aquisição de novas características genéticas
Varias bacterias possuem plasmideos, conferindo as mais diversas caracteristicas.
Estes podem ser transferidos horizontalmente por conjugacao, para diferentes especies
presentes em um bioflme. Estudo foram realizados com placas dentais artificiais, formadas
inicialmente por bacterias do genero Streptococcus. Uma linhagem de Bacillus, contendo um
transposon conjugativo albergando genes de resistencia a tetraciclina, foi inserida no sistema e
transferiu este transposon para celulas de Streptococcus.
A transducao pode, teoricamente, ser responsavel pela transferencia horizontal de
genes em biofilmes. Tal hipotese baseia-se no fato de sistemas marinhos e de agua doce
contem uma enorme abundancia de bacteriofagos (cerca de 108/ml), sendo responsaveis pela
lise de um grande numero de bacterias. Diariamente, de 10 a 20% da populacao bacteriana e
lisada por fagos, os quais tem relevante impacto na cadeia alimentar microbiana uma vez que
podem aumentar as taxas de mortalidade e/ou reduzir as taxas de crescimento em todos os
niveis troficos. Estudos recentes revelam que os fagos podem estruturar ou restruturar
comunidades microbianas. Em uma analise, onde uma populacao de cianobacterias foi
praticamente exterminada pelos fagos, observou-se a presenca de novas especies capazes de
degradas os compostos organicos que surgiram.
Papel dos biofilmes nas doenças
Ate o momento, a vasta maioria das doencas infecciosas vem sendo tratada
eficientemente com antibioticos entretanto, de acordo com as pesquisas mais recentes,
sabemos que tal tipo de estrategia pode ser ineficaz em duas situacoes: 1) com organismos
exibindo resistencia inata a droga e 2) em bacterias presentes em biofilmes.
Em um biofilme, as bacterias podem ser 1000 vezes mais resistente a um antibiotico,
quando comparadas as mesmas celulas planctonicas, embora os mecanismos envolvidos
nesta resistencia sejam ainda pouco conhecidos. Dentre os possiveis mecanismos, acredita-se
que possa haver a inativacao da droga por polimeros ou enzimas extracelulares, ou a
ineficiencia da droga em decorrencia de taxas de crescimento muito lentas no interior dos
biofilmes.
Infeccoes assciadas a biofilmes geralmente sao de natureza recorrente, visto que as
terapias antimicrobianas convencionais eliminam predominantemente as formas planctonicas,
deixando as celulas sesseis livres para se reproduzir e propagar no biofilme apos o tratamento.
Para tornar o quadro ainda mais grave, as bacterias presentes nos biofilmes encontram-se
mais protegidas contra o sistema imune do hospedeiro.
Exemplos tipicos de doencas associadas a biofilmes incluem as infeccoes de implantes
tais como valvulas cardiacas, cateteres, lentes de contato, etc.
Os biofilmes podem ainda promover doencas se formados em tecidos, tais como nas infeccoes
pulmonares provocadas por Pseudomonas aeruginosa, em pacientes com fibrose cistica, que
sao suscetiveis a infeccoes cronicas por esta bacteria. A periodontite e outro exemplo de
doenca provocada por biofilmes. O principal microrganismo associado a esta doenca,
Porphyromonas gingivalis, coloniza uma grande de superficies orais direta ou indiretamente,
sendo entao capaz de invadir as celulas das mucosas e liberar toxinas.
Biofilmes e resistência às drogas, devido a densidade e tipos celulares, exclusao
fisica da droga, expressao de genes de resistencia, quorum sensing e alteracoes da superficie
celular. (Adaptado de Mah & O’Toole, Trends Microbiol., 9:34-39, 2001)
Esquema do desenvolvimento temporal de uma placa dental.
Genética da formação dos biofilmes
Quatro organismos, P. aeruginosa, P. fluorescens, E. coli e V. cholerae, vem sendo
intensamente estudados, como modelos na formacao de biofilmes de especies unicas. Este
processo pode ser subdivido em etapas: a) Aderencia inicial a superficie, b) Formacao das
microcolonias, c) maturacao das microcolonias em um biofilme contendo a matriz de EPS.
Estudo microscópico da formação de um biofilme
por V. cholerae
(Adaptado de Watnick & Kolter, J. Bacteriol.,
182:2675–2679, 2000)
Etapas que uma nova espécie bacteriana realiza, durante
sua incorporação em um biofilme
(Adaptado de Watnick & Kolter, J. Bacteriol., 182:2675–
2679, 2000)
Ao que parece, o processo se inicia quando as bacterias percebem determinadas
condicoes ambientais, que disparam o fenomeno de transicao de celulas planctonicas em
sesseis. Assim, Pseudomonas aeruginosa e P. fluorescens parecem ser capazes de formar
bioflmes sob quase todas as condicoes, enquanto E. coli somente os forma se estiver em
meios minimos suplementados com aminoacidos, ou em meios pobres em nutrientes.
Diferentes vias geneticas podem ser utilizadas na formacao de biofilmes. Por exemplo,
V. cholerae parece ter diferentes vias para realizar a aderencia inicial, dependendo da
superficie. Assim, quando no intestino, este organismo utiliza a fimbria Tcp para realizar a
colonizacao, embora tal estrutura nao tenha papel na etapa inicial de formacao de biofilmes em
superficies abioticas, sendo o processo mediado por um outro tipo de fimbria, denominada
Msh.
Início de formação do biofilme
A partir de estudos com linhagens mutantes de P. aeruginosa, foi relatado que, quando
as celulas nao sintetizam flagelos, sao incapazes de realizar as interacoes iniciais com as
superficies. Mutantes que nao produzem a fimbria tipo IV (associada a movimentacao das
celulas em uma superficie) sao capazes de se aderir formando uma monocamada, ao inves de
microcolonias. Existem uma proteina, denominada Crc que, alem de atuar regulando o
metabolismo das celulas, tambem regula a expressao de dois genes que codificam proteinas
importantes na montagem da fimbria tipo IV.
O LPS da membrana externa tambem tem papel na adesao inicial. Em E. coli, os
flagelos tambem sao importantes nesta primeira etapa de formacao do biofilme. Ha ainda a
participacao de fimbrias do tipo I, uma proteina de membrana externa, Ag43 e do LPS. Em V.
chloreae acredita-se que o processo seja bastante similar ao de E. coli.
Maturação do biofilme
Apos a etapa de interacoes iniciais, comeca a haver a formacao das microcolonias,
normalmente associada a producao de EPS. Outra etapa importante corresponde a
organizacao da arquitetura do biofilme que, em P. aeruginosa parece ter a participacao do
"quorum sensing".
Estágios iniciais na formação de biofilmes de Gram negativos (P. aeruginosa, E.
coli, e V. cholerae).
(A) Em P. aeruginosa, os flagelos sao necessarios para aproximar a bacteria da
superficie, enquanto o LPS media as primeiras interacoes, havendo talvez a participacao de
proteinas da membrana externa. Quando formam monocamadas, fimbrias tipo IV mediam o
movimento pulsante, necessario a formacao de microcolonias. A producao destas fimbrias e
regulada, em parte, por sinais nutricionais (Crc), havendo ainda a ativacao de genes envolvidos
na sintese de alginato e repressao de genes flagelares. A formacao do biofilme maduro envolve
a participacao de homoserina lactonas sinalizadoras.
(B) Em E. coli, os flagelos aproximam as celulas do substrato, enquanto as primeiras
interacoes sao mediadas por fimbris tipo I e a proteina de membrana externa Ag43. O EPS,
acido colanico e resonsavel pela arquitetura do biofilme.
(C) V. cholerae, tambem usa os flagelos na aproximacao, sendo a ligacao mediada por
fimbrias MshA e talvez outras proteinas.
Dispersão
Em determinados momentos, os biofilmes sofrem dispersao, liberando microrganismos
que podem vir a colonizar novos ambientes. Os mecanismos geneticos associados a dispersao
nao sao ainda bem conhecidos.
Existem tres tipos de processos de dispersao: expansiva, quando parte das celulas de uma
microcolonia sofrem lise e outras retomam a motilidade, sendo entao liberadas da estrutura.
Outro tipo de dispersao envolve a fragmentação do biofilme, onde porcoes de matriz
extracelular associadas a microrganismos sao liberadas. Finalmente, o terceiro tipo de
dispersao, denominada superficial, ocorre pelo crescimento do proprio biofilme como um todo.
Quorum Sensing
Introdução
O quorum sensing (sensor de quorum) corresponde a um processo de comunicacao
intra e interespecies microbianas, que permite aos microrganismos apresentarem alteracoes
fenotipicas marcantes quando estes se encontram em altas densidades populacionais. A
descoberta deste tipo de interacao microbiana tornou evidente o conceito que, embora
geneticamente e estruturalmente mais simples, os microrganismos tem a capacidade de se
comportar como organismos complexos, capazes de se comunicar e agir coordenadamente,
respondendo a diferentes estimulos de modo unificado.
Este interessante processo foi descoberto em bacterias luminescentes marinhas,
habitantes de orgaos luminescentes de lulas e certos peixes.
Lula exibindo luminescência
Ha muitos anos conhecia-se a existencia de bacterias marinhas (por exemplo Vibrio
fischeri) capazes de emitir luminescencia. No entanto, este fenomeno era apenas observado
quando os microrganismos encontravam-se confinados nos orgaos de luz dos animais. Quando
tais bacterias encontravam-se livres na agua do mar, a luminescencia nao era observada.
Estudos posteriores revelaram que durante o dia as lulas expeliam as bacterias de seus orgaos
de luz mas, a medida que a noite se aproximava, estas passavam a acumumular os
microrganismos, que apos um determinado periodo de tempo tornavam-se luminescentes. Em
outras palavras, a emissao de luminescencia estava associada a densidade populacional
bacteriana.
Posteriormente o processo que resultava na luminescencia foi esclarecido, sendo
denominado quorum sensing, uma vez que correspondia a um mecanismo de comunicacao
onde os microrganismos monitoravam sua densidade populacional.
O mecanismo de Quorum Sensing
Atualmente esta bem definido que este sensoriamento populacional e realizado por
meio de pequenas moleculas, denominadas autoindutores (AI). Os autoindutores podem ser de
diferentes naturezas quimicas: em organismos Gram negativos, via de regra os autoindutores
sao do tipo N-acil homoserina lactonas (AHL), que correspondem a pequenas moleculas que
se difundem livremente para dentro e para fora das celulas. Em Gram positivos, normalmente
os autoindutores correspondem a pequenos petideos (hepta ou octapeptideos) que se ligam a
receptores localizados na superficie das celulas bacterianas.
Nos diferentes organismos que realizam o quorum sensing, o processo segue,
essencilamente, as mesmas etapas.
Durante o crescimento microbiano, todas as celulas produzem e liberam uma pequena
quantidade de autoindutores. Quando a populacao se encontra no meio da fase logaritmica ou
no inicio da fase estacionaria de crescimentno, a quantidade de autoindutor produzido alcanca
uma concentracao limite, suficiente para disparr o processo de alteracao da expressao genica.
Em termos bastante simples: os autoindutores se ligam a proteinas receptoras que sao
entao ativadas, promovendo a ativacao da expressao de certos genes, podendo ainda inibir a
expressao de outros genes que se encontravam ativos. Assim, o quorum sensing e ativado
quando a concentracao de autoindutor atinge um nivel tal que sua ligacao a uma proteina
receptora e eficiente, permitindo a ativacao transcricional de uma serie de genes.
Regulação da bioluminescência em Vibrio fischeri
Para melhor ilustrar o mecanismo de quorum sensing, descreveremos o fenomeno de
bioluminescencia apresentado por Vibrio fischeri.
Nealson et al., (1970) revelaram que o sobrenadante de culturas densas de V. fischeri continha
um composto capaz de induzir a luminescencia em culturas de baixa densidade, sendo por isso
denominado "autoindutor". Este autoindutor (VAI - Vibrio AutoIndutor) foi identificado em 1981,
como uma N-(3-oxohexanoil)homoserina lactona (OHHL), enquanto os genes regulatorios e
estruturais necessarios ao processo de luminescencia (regulon lux) foram descritos em 1984,
estando localizados em um segmento de DNA de 9 kb.
O regulon lux e composto por dois operons que sao transcritos em direcoes opostas,
sendo separados por uma regiao intergenica regulatoria. O operon da esquerda contem o gene
luxR, que codifica o ativador transcricional LuxR, que tambem atua como receptor do
autoindutor. O operon da direita contem o gene luxI, que codifica a OHHL sintase. Abaixo do
gene luxI, encontram-se os genes estruturais luxCDABE, que codificam as proteinas
necessarias ao desenvolvimento da bioluminescencia (subunidades a e b da luciferase - luxA e
luxB, a redutase - luxC, transferase - luxD e sintetase - luxE).
Assim, em qualquer etapa de seu ciclo de vida, as celulas de V. fischeri estao
produzindo pequenas quantidades do autoindutor (VAI), que se difunde livremente atraves das
membranas da bacteria. Nestes estagios onde a populacao microbiana ainda e pequena, esta
ocorrendo a ligacao do VAI ao seu receptor, LuxR, no entanto, tal ligacao e ainda transiente.
No entanto, a medida que a populacao aumenta, a quantidade de VAI tambem aumenta, ate
que atinge uma concentracao limiar, que dispara o processo, resultando na ativacao da
tanscricao dos operons lux.
A proteina LuxR e modular, sendo constituida por um dominio C-terminal de ligacao ao
DNA e um dominio N-terminal de ligacao a OHHL. A OHHL, produzida pelo gene luxI, liga-se a
proteina LuxR, ativando-a. Esta quando ativada liga-se ao DNA, em um sitio especifico,
denominado lux box, que corresponde a uma regiao de 20 nucleotideos invertidos repetidos,
situada entre os dois operons lux.
O complexo VAI-LuxR liga-se ao lux box e estimula a transcricao dos operons, promovendo
uma maior sintese de autoindutor, de proteina LuxR e de todo o aparato necessario a
luminescencia.
Regulação do operon lux pelo autoindutor de V. fischeri
Outras atividades microbianas associadas ao Quorum Sensing
Atualmente sao conhecidas centenas de especies microbianas que realizam o processo
de quorum sensing, revelando que tal tipo de comunicacao resulta em uma serie de alteracoes
fenotipicas apresentadas pelas culturas.
Dentre as principais atividades microbianas associadas ao quorum sensing temos:
- producao de antibioticos
- expressao de fatores de virulencia
- aquisicao do estado de competencia (a capacidade de captar DNA do meio)
- transferencia de DNA para outros organismos
- fixacao de nitrogenio
Alem destas atividades, cada vez mais esta se tornando claro o papel ecologico
desempenhado pelo quorum sensing. Sabe-se que os microrganismos sintetizam autoindutores
bastante especificos, reconhecidos apenas por membros da mesma especie. No entanto,
pesquisas revelam que organismos de especies proximas podem sintetizar autoindutores
semelhantes, capazes de interferir no quorum sensing de outros organismos. Por exemplo,
Staphylococcus epidermidis, um habitante da microbiota normal, sintetiza autoindutores que
interferem no quorum sensing de S. aureus, um microrgnaismo potencialmente patogenico.
Acredita-se que este tipo de interferencia tenha como principal funcao impedir ou dificultar a
colonizacao do hospedeiro por organismos invasores.
Ha alguns anos foi descoberto um segundo tipo de autoindutor, denominado AI-2, que
parece estar envolvido em um processo mais "geral" de cominucacao microbiana. Este AI-2
seria reconhecido por um grande numero de especies, talvez atuando como uma molecula que
sinaliza aos diferentes organismos a presenca de outros microrganismos. Este seria um tipo de
molecula que realizaria um "censo" geral da populacao.
A descoberta do quorum sensing trouxe novas e interessantes perspectivas para o
controle microbiano, especialmente no que se refere ao tratamento de doencas infecciosas.
Controle Microbiano
Definições
Esterilização: Destruicao ou remocao de todas as formas de vida de um objeto ou
habitat.
Desinfecção: Processo que promove a inibicao, morte ou remocao de varios
microrganismos patogenicos e saprofitas, sem eliminar todas as formas de vida.
Sanitização: Processo que leva a reducao dos microrganismos, a niveis seguros, de
acordo com os padroes de saude publica (elimina 99,9% das formas vegetativas).
Anti-séptico: Produto que evita a infeccao em tecidos, seja inibindo ou matando os
microrganismos. Como sao aplicados em tecidos vivos, os anti-septicos sao, geralmente,
menos toxicos que os desinfetantes (agentes aplicadas em materiais inanimados).
Germicida: mata microrganismos, mas nao endosporos. “Cida”: Qualquer agente que
promova a morte (ex: bactericida, fungicida, algicida) “Stático”: Qualquer agente que promova
a inibicao do crescimento (ex: bacteriostatico, fungistatico)
Padrão de morte microbiana
Da mesma forma que no crescimento, a morte microbiana e um evento que ocorre de
forma exponencial. Assim, apos uma rapida reducao do numero, a taxa de morte pode tornarse
mais lenta, devido a sobrevivencia de celulas mais resistentes.
Condicoes que afetam a atividade de um agente antimicrobiano, especialmente se tal
agente e de natureza quimica.
1. Tamanho da população: Quanto maior a populacao, maior o tempo necessario a sua
eliminacao.
2. Natureza da população: Se nesta populacao de microrganismos existirem
endosporos, os quais sao muito mais resistente que formas vegetativas, sua eliminacao nao
ocorrera tao facilmente. No caso de celulas em diferentes estagios de crescimento - celulas
mais jovens tendem a ser mais suscetiveis que celulas em fase estacionaria. Havendo a
presenca de membros do genero Mycobacterium, sua eliminacao e mais dificil que de outras
bacterias nao esporuladas, etc.
3. Concentração do agente: Geralmente, quanto mais concentrado, melhor (exceto
alcool). A relacao entre a concentracao e a eficiencia via de regra nao e linear.
4. Tempo de exposição: De acordo com normas da OMS, o tempo minimo de exposicao
deve ser de 30 minutos. Em casos de agentes esterilizantes, a exposicao deve ser tal que a
chance de haver sobreviventes e de 1 em 106.
5. Temperatura: Dentro de limites, o aumento da temperatura torna o processo mais
eficiente. Para agentes quimicos, geralmente o aumento de 1°C da temperatura aumenta em
10 vezes a eficiencia do processo, o que tambem permite a diluicao do agente.
6. Condições "ambientais": pH do meio - quando e acido, favorece a eliminacao termica;
presenca de materia organica - dificulta a acao do produto (necessidade de lavagens dos
materiais antes do controle por agentes quimicos), seja por proteger o microrganismo ou
competir pelo produto em uso. Altas concentracoes de acucar, proteinas ou lipideos diminuem
a penetrabilidade do calor, enquanto o sal pode aumentar ou diminuir a resistencia ao calor. A
consistencia do material ou solucao tambem interfere.
Controle microbiano por agente físicos
Os principais agentes fisicos que promovem o controle microbiano sao: Calor, Filtração
e Radiações. Eventualmente, outros agentes, tais como as baixas temperaturas, dessecacao,
podem ser utilizados.
CALOR - Uso disseminado desde epocas remotas, correspondendo ainda um dos
agentes fisicos mais praticos e eficientes para a esterilizacao e/ou desinfeccao. O calor pode
ser empregado sob duas formas: seco e umido, tendo a vantagem de apresentar, basicamente,
apenas 2 parametros a serem controlados: tempo e temperatura.
Para todos os organismos sao definidas as temperaturas cardeais, ou seja, as
temperaturas minima, maxima e otima de crescimento. Assim, quando estes sao submetidos a
temperaturas superiores a temperatura maxima de crescimento, os efeitos letais tornam-se
aparentes. A morte e um fenomeno que ocorre de forma exponencial, sendo proporcional
apenas a concentracao inicial da populacao. Ja o tempo para uma determinada fracao da
populacao a ser morta e independente da populacao inicial.
Processos empregando calor:
A morte se da pela oxidacao de constituintes celulares e desnaturacao de proteinas e
acidos nucleicos. Nao e a melhor maneira de utilizacao do calor, uma vez que o ar e menos
condutor da temperatura que a agua.
Calor seco
Incineração (E): processo drastico de eliminacao de microrganismos, que destroi o
produto.
Ao rubro (E): processo onde os materiis sao levados a incadescencia, promovendo a
destruicao de todos os microrganismos.
Flambagem (D): processo onde o material e submetido diretamente ao fogo, seja seco
ou embebido em alcool. Bastante utilizado na desinfeccao de alcas de vidro.
Estufa esterilizante (E: 160†C/2 hs ou 180°C/1 h). Amplamente utilizado para vidrarias e
outros materiais.
Calor úmido - Como mencionado anteriormente, e um processo mais eficiente devido
ao maior poder de penetracao do vapor d’agua. A morte e decorrente da desnaturacao de
acidos nucleicos e proteinas, podendo tambem romper membranas. Alem disso, o vapor tem
maior capacidade de romper as pontes de hidrogenio.
Autoclave (E - 121°C/20 min./1 atm) - Destroi esporos, em um pequeno volume, em 10
a 12 minutos. Com volumes maiores, o tempo e maior (5 litros => 70 minutos). Frequentemente
sao utilizados indicadores da eficiencia de esterilizacao, por exemplo, ampolas contendo
esporos de B. stearotermophilus ou de Clostridium PA3679, os quais sao inoculados em meios
de cultura apos o processo de esterilizacao. Caso haja o desenvolvimento de celulas
vegetativas, o processo nao foi realizado adequadamente, uma vez que nao houve a
esterilzacao.
Água em ebulição (D - 100°C/30 min.)
A titulo de comparacao, a eliminacao de esporos de C. botulinum pela fervura, requer cerca de
5,5 horas. Por outro lado, a 120°C, estes esporos sao eliminados apos 4 a 5 minutos.
Pasteurização (D - 62,8°C/30 min - pasteurizacao lenta, ou 71,7°C/15 seg -
pasteurizacao rapida)
UHT (E): 141°C/2 segundos - processo bastante utilizado para o leite e outros alimentos
liquidos.
FILTRAÇÃO - Processo muito util na esterilizacao de materiais termolabeis, sendo
empregado para liquidos e gases. Estes filtros sao geralmente compostos por celulose,
acetato, policarbonato, teflon, ou outro material sintetico. Embora o diametro dos poros possa
variar, os mais utilizados sao aqueles de 0,2 Um, que removem os microrganismos (exceto
virus) das solucoes e do ar.
Dentre os principais tipos de filtros podemos citar:
Filtros de profundidade: Correspondem aos filtros mais antigos, constituidos de malha
fibrosa ou granular, a base de papel, asbestos ou fibra de vidro, arranjados de forma a criar
uma serie de camadas aleatorias sobrepostas, formando pequenos canais sinuosos. Assim, os
microrganismos ficam retidos nas malhas e/ou adsorvidos a superficie do material. Estes filtros
sao feitos tambem de terra de diatomaceas (Berkefield) ou porcelana (Chamberlain). Na
pratica, sao usados como pre-filtros, para a remocao de particulas maiores. Muitas vezes sao
tambem usados na filtracao de ar.
Membranas Filtrantes: Correspondem ao tipo mais comum de filtro esterilizante, em
microbiologia. Sao membranas porosas de acetato de celulose, nitrocelulose ou policarbonato,
tendo espessura de ≈ 0,2 mm, contendo poros variando de ≈ 0,1 a 0,5 Um de diametro, que
ocupam cerca de 80 a 85% da membrana.
Filtros Isopore® (nucleopore): Correspondem a filmes extremamente delgados de
policarbonato (10 Um de espessura) que sao tratados com radiacao nuclear, seguida de
cauterizacao (marcacao) quimica. A radiacao provoca danos localizados na membrana e o
tratamento quimico aumenta essas falhas, formando orificios, cujo tamanho pode ser
controlado pela forca da solucao cauterizadora e pelo tempo de tratamento. Estes filtros
funcionam como verdadeiras peneiras, removendo todas as particulas maiores que os orificios.
Tem, entretanto, baixa porosidade, sendo muito usados na preparacao de amostras para a
microscopia de varredura, onde os organismos sao retidos no filtro, sendo mantidos em um
plano uniforme, no topo do filtro.
O ar tambem pode ser filtrado, em fluxos laminares contendo filtros HEPA (High
Efficiency Particulate Air filters), que removem 99,97% de particulas de 0,3 Um.
Bactérias retidas na superfície de um filtro do tipo Isopore®
RADIAÇÕES - Ionizante e nao ionizante
Radiação Não-Ionizante: A radiacao ultravioleta (de 4 a 400 nm - sendo 260 nm o
comprimento mais eficiente) e bastante letal, mas exibe baixa penetrabilidade, nao
atravessando vidros, filmes sujos e outro materiais. Assim, a radiacao UV e extremamente
eficiente na eliminacao de microrganismos presentes em superficies.
Como sua maior eficiencia se da a 260 nm, que corresponde ao comprimento de onda
onde se da a maior absorcao pelo DNA, a radiacao UV afeta primariamente este tipo de
molecula. Sua acao e principalmente decorrente da formacao de dimeros de pirimidinas
(timina), efeito este que pode ser revertido por sistemas de fotorreativacao (enzima de reparo
ativada pela luz) ou por sistema de reativacao independente da luz (polimerase).
Por outro lado, nao podem ser descartados outros efeitos deleterios do UV, uma vez
que quando a 340 nm, observa-se dano celular, sem estar primariamente relacionado as
mutacoes, uma vez que neste comprimento de onda os acidos nucleicos nao tem mais uma
grande capacidade de absorver este tipo de radiacao.
Radiação Ionizante: Radiacoes de pequeno comprimento de onda, portanto, de
altissima energia e penetrabilidade. Os dois principais tipos sao a radiacao gama e os Raios X.
Estas, sao bastante eficientes, uma vez que promovem a ionizacao de atomos, fazendo-os
perderem eletrons. Como consequencia sao gerados radicais livres extremamente reativos,
que podem destruir pontes de hidrogenio, duplas ligacoes, estruturas em anel. Quando na
presenca de oxigenio, geram radicais hidroxila livres, absolutamente toxicos para as celulas.
A radiacao gama e originada geralmente a partir de fontes de 60Co ou 137Ce.
Estas radiacoes vem sendo amplamente utilizadas em produtos termolabeis, tais como
plasticos e alguns tipos de alimentos (frutas, vegetais, alimentos marinhos). Nos alimentos seu
uso e interessante, uma vez que inativam enzimas autocataliticas que participam do processo
de degradacao natural.
Outros agentes Físicos de controle
Baixas temperaturas: A refrigeracao ou o congelamento sao amplamente utilizados no
controle microbiano de alimentos e produtos biologicos, pois levam a uma diminuicao ou
interrupcao do metabolismo. Como, na maioria dos casos, os microrganismos patogenicos ao
homem sao mesofilicos, estas baixas temperaturas sao eficientes no controle. Entretanto,
deve-se ter cuidado porque celulas de Clostridium botulinum, quando incubadas a 5°C, sao
ainda capazes de produzir e secretar a toxina do tipo E.
Dessecação: Liofilizacao ou dessecamento natural, que atua diferentemente nos
organismos, dependendo do tipo de meio, do material dessecado e da intensidade do
processo. Via de regra, os cocos Gram negativos sao mais sensiveis que os Gram positivos,
sendo M. tuberculosis um dos exemplos classicos de organismo resistente a dessecacao
(varias semanas em escarro seco).
Pressão osmótica: conservas com altos teores de sal ou acucar.
Controle de Microrganismos por Agentes Químicos
Durante muito tempo foram mais empregados em processos de desinfeccao e antisepsia,
entretanto, atualmente estes vem sendo cada vez mais amplamente utilizados em
processos de esterilizacao.
Cuidados previos: lavagem adequada do material, garantia de pleno contato com o
agente.
Caracteristicas de um agente quimico ideal: boa atividade antimicrobiana, toxicidade
seletiva, solubilidade, estabilidade, inocuidade, nao interacao com a materia organica,
temperatura de acao adequada, alto poder de penetracao, sem poder corrosivo ou tintorial,
desprovido de acao danosa ao meio ambiente.
Principais Tipos de Agentes Químicos:
1) Compostos orgânicos:
Fenóis e derivados (cresois (metil-fenol), xilenois): Primeiros a serem usados (Lister,
1867 - salas de cirugia). O fenol nao e mais usado como desinfetante ou anti-septico devido a
sua toxicidade para os tecidos. Os derivados fenolicos (hexaclorofeno, hexilresorcinol) sao
empregados principalmente como anti-septicos ou desinfetantes hospitalares. Estes atuam
desnaturando proteinas e rompendo membranas. Sao tuberculocidas, efetivos na presenca de
materia organica, permanecem ativos por muito tempo. Entretanto tem odor desagradavel e
sao irritantes para pele.
Hexaclorofeno -associacao de fenol a halogenio (Cl) que e bastante eficaz, sendo
bastante usado em pastas dentifricias e saboes. No passado, pesquisas indicaram que tal
composto era cumulativo e carcinogenico.
Álcoois: Muito usados, efetivos, confiaveis e baratos, atuando como bactericidas,
fungicidas e contra virus envelopados. Os mais usados sao etanol e isopropanol, nas
concentracoes entre 70 e 80%. Atuam desnaturando proteinas e dissolvendo lipideos de
membrana.
Compostos Quaternários de Amônio: sao detergentes cationicos, moleculas organicas
derivadas de gorduras, atuando como umectantes e emulsificadores. Apenas os detergentes
cationicos sao detergentes efetivos, que desnaturam proteinas (Ex: cloreto de benzalconio, que
mata a maioria das bacterias).
2) Halogênios:
Iodo: anti-septico para a pele a 2%, ou em solucao agua-etanol de iodeto de potassio,
para procedimentos pre-operatorios. Eficaz contra bacterias, fungos, virus e protozoarios
parasitas. Atua oxidando componentes celulares e iodinando proteinas. Em concentracoes
elevadas elimina esporos. Tem como desvantagens: danos a pele, manchar e alergenico.
Iodoforos: Complexacao de iodo a carreador organico (agentes tensioativos, como a
PVP). Sao soluveis em agua, estaveis, sem propriedades tintoriais, liberando o iodo
lentamente, minimizando a irritacao cutanea. Usado na assepsia pre-operatoria e tambem
como desinfetante.
Cloro: Muito utilizado no tratamento de aguas e nas industrias de laticinios e alimentos.
Pode ser aplicado na forma de gas, hipoclorito de sodio ou de calcio, que geraacido
hipocloroso e entao O2, promovendo a oxidacao de materiais celulares e causando a morte em
cerca de 30 minutos. Eficaz contra fungos, bacterias e virus, com a desvantagem ser descorar
alguns materiais. E eficiente, barato, de facil uso, mas altamente reativo com a materia
organica. Como desvantagem, o uso do cloro em aguas pode produzir pequenas quantidades
de compostos organoclorados, particularmente o trihalometano (THM), um possivel agente
carcinogenico. Como alternativa pode ser usada a cloramina (monocloramina), que reduz
drasticamente os niveis de THM. A monocloramina pode ser gerada diretamente na agua pela
adicao simultanea de amonio e cloro ou hipoclorito.
O tratamento da agua presente nas torres de resfriamento de aparelhos ar condicionado
e extremamente importante para o controle de Legionella pneumophila.
3) Metais Pesados:
Foram muito usados no passado como germicidas (prata, mercurio, zinco e cobre),
sendo atualmente substituidos por compostos menos toxicos. Os mais usados sao compostos
organicos de mercurio, prata, cobre e zinco.
Nitrato de prata: usado em solucao 1%, para prevenir a oftalmia neonatorum, sendo
substituido em varios hospitais pela eritromicina (que protege contra Chlamydia tambem).
Temos ainda o Mercurocromo e mertiolate, usados como como preservantes de soros e
vacinas. O sulfato de cobre e usado na desinfeccao de aguas, especialmente contra algas.
Estes atuam combinando-se com proteinas, geralmente nos grupos SH, inativando-as.
4) Outros
Peróxidos: principalmente agua oxigenada, sobre organismos anaerobios, atuando pela
sua acao oxidante.
Ozônio: Vem sendo empregado na desinfeccao de agua, com sucesso, na Europa e
Estados Unidos. Embora seja um tratamento mais caro, tem a vantagem de nao produzir
compostos organoclorados. Por outro lado, devido a sua instabilidade, a agua submetida a este
tipo de tratamento esta mais sujeita a contaminacao que quando clorada.
Corantes: dividem-se em dois grupos, acridina (que interage com o DNA) e derivados
de rosanilina (Cristal violeta, verde malaquita), que atuam inibindo G+, Candida e Trichomonas.
Tem acao aparentemente ao nivel da parede celular das bacterias.
Comparação da eficiência de diferentes anti-sépticos
Agentes Químicos Esterilizantes:
Aldeídos: Formaldeido e Glutaraldeido, moleculas muito reativas, combinam-se com
proteinas, inativando-as.
Formaldeido 8% dissolvido em agua ou alcool (irritante e deixa residuos) e glutaraldeido
2% (menos irritante). Em 12 horas, destroem esporos.
Gases esterilizantes: Oxido de etileno, atua pela interacao com proteinas, com alta
capacidade de penetracao. Como e explosivo, e dissolvido em misturas de 10 a 20% com CO2
ou freon. Importante a presenca de umidade no ambiente e tambem temperatura.
Condicoes: 38°C/5-8 hs ou 54°C/3-4 hs, com 50% de umidade e EtO de 400 a 800
mg/litro.
Betapropiolactona: eventualmente usado. Nao penetra tao bem e pode ser
carcinogenico. Atua em concentracoes muito menores que o EtO.
Abaixo temos uma tabela, listando alguns dos principais agentes quimicos utilizados no
controle microbiano.
Antibióticos e Quimioterápicos
Introdução
Os antibioticos sao produtos de enorme importancia nao apenas na area de saude,
como tambem na economia, visto que apenas nos Estados Unidos, cerca de 100.000 toneladas
sao produzidas anualmente. Embora aproximadamente 8000 substancias com atividade
antimicrobiana sejam conhecidas e, a cada ano, centenas de novas substancias sejam
descobertas, pouquissimas sao efetivamente aproveitadas e utilizadas como agentes
antimicrobianos, visto que muitas destas nao atendem aos requisitos minimos para seu
emprego terapeutico. Paralelamente, nao podemos deixar de mencionar o crescente problema
em relacao ao surgimento de especies bacterianas resistentes aos diferentes antibioticos. Este
talvez corresponda ao principal desafio dos pesquisadores, visto que a multirresistencia vem se
tornando diariamente mais disseminada nas populacoes microbianas, sejam patogenicas ou
nao.
Mais recentemente, outro aspecto que vem sendo cada vez mais levado em
consideracao refere-se a ocorrencia dos biofilmes e sua importancia na terapeutica
antimicrobiana, pois o conhecimento sobre a ocorrencia de biofilmes microbianos em nosso
organismo levou a uma quebra do paradigma de tratamento das doencas infecciosas.
Certamente, para que os antibioticos possam ser empregados de forma mais eficaz, sera
necessario um maior conhecimento acerca dos biofilmes formados naturalmente em nosso
organismo. Pois, somente a partir da elucidacao da ecologia dos biofilmes naturais do homem,
teremos maiores chances de tratar de forma adequada as varias doencas infecciosas.
Conceitos
• Agente Antimicrobiano: Composto quimico que mata ou inibe o crescimento de
microrganismos, podendo ser natural ou sintetico.
• Agentes Quimioterápicos (Antimicrobicos): Agentes quimicos, naturais ou sinteticos,
usados no tratamento de doencas. Atuam matando ou inibindo o desenvolvimento dos
microrganismos, em concentracoes baixas o suficiente para evitar efeitos danosos ao paciente.
• Antibióticos: Grupo de agentes quimioterapicos (maioria), que constituem-se em
produtos microbianos ou derivados. Sao produtos do metabolismo secundario (quando a celula
entra em fase estacionaria), nao essenciais para o crescimento ou reproducao, sendo sua
sintese dependente da composicao do meio (podem ser super produzidos). Sao geralmente
compostos complexos, cuja sintese envolve varias etapas enzimaticas, sendo as enzimas
reguladas separadamente das do metabolismo primario. Via de regra, a producao de
antibioticos esta associada ao fenomeno de quorum sensing.
• Quimioterápico: Agente quimico sintetico, exibindo as mesmas atividades de um
antibiotico.
Histórico dos antibióticos e descobertas relacionadas
Paul Ehrlich (1854 - 1915): Desenvolveu o conceito de toxicidade seletiva, indicando
que determinado agente exibia uma acao danosa aos microrganismos, sem afetar as celulas
do hospedeiro. Tal conceito tem importante reflexo pratico, pois indica se um agente pode,
teoricamente, ser util no tratamento de doencas infecciosas. Este pesquisador trabalhava com
corantes e tecnicas de coloracao de microrganismos, quando verificou que alguns compostos
coravam os microrganismos, mas nao os tecidos animais. Esperava encontrar um corante
toxico aos microrganismos ("bala magica").
1904 - Uso pratico do vermelho de tripan, composto ativo contra o tripanossoma que
causava a doenca africana do sono.
Ehrlich & Hata: realizacao de testes com compostos arsenicais, em coelhos com sifilis.
Descobriram que o composto 606, arsfenamida, era ativo => Em 1910, foi lancado o
medicamento Salvarsan (nome comercial da arsfenamida), para o tratamento da sifilis.
1927 - Na I. G. Farbenindustrie (Bayer) - G. Domagk: testava corantes e outros
compostos quimicos, quanto a acao em microrganismos e toxicidade em animais.
1935 - Vermelho Prontosil: inocuo para animais, protegendo camundongos contra
estafilococos e estreptococos patogenicos. Neste mesmo ano, foi descoberto que o prontosil
era clivado no organismo, originando a sulfanilamida como um dos produtos. Na realidade, a
droga eficaz era a sulfanilamida.
1939 - Nobel para Domagk
1896 - E. Duchesne: descobriu a penicilina, mas raramente tal pesquisador e citado,
pois seus achados nunca foram devidamente publicados ou notificados, sendo esquecids
durante varios anos.
A. Fleming: Busca de um tratamento eficaz para os feridos na II Guerra Mundial. Foi o
"segundo" descobridor da penicilina e tentou, sem sucesso, purifica-la em quantidades
suficientes para ser utilizada como medicamento.
1939 - H. Florey & E. Chain - testavam atividade bactericida de varias substancias
(lisozima, sulfonamidas). Obtiveram a cultura de fungo isolada inicialmente por Fleming,
passando a trabalhar na purificacao da penicilina. Injetarama penicilina em camundongos
infectados com estafilococos ou estreptococos e observaram que quase todos sobreviveram.
(Trabalho publicado em 1940).
1945 - Nobel para Florey, Chain e Fleming
1944 - S. Waksman: descobrimento da estreptomicina (Streptomyces griseus), a partir
do teste de cerca de 10.000 linhagens de bacterias e fungos do solo.
1952 - Nobel para Waksman.
Até 1953 - Isolamento de microrganismos produtores de cloranfenicol, neomicina,
terramicina e tetraciclina.
A partir de 1953 - a industria investiu centenas de milhares de dolares na busca de
novas drogas antimicrobianas, sendo que tal linha de pesquisa perdura ate hoje em todo o
mundo, empregando diversos tipos de abordagens.
Características gerais das drogas antimicrobianas
• Toxicidade Seletiva: caracteristica que todo antimicrobiano deveria apresentar, pois
reflete-se na capacidade de atuar seleivamente sobre o microrganismo, sem provocar danos ao
hospedeiro.
Esta e expressa em termos do indice terapeutico: relacao B/A, onde
A) Dose terapeutica: concentracao p/ tratamento
B) Dose toxica: concentracao a partir da qual e toxica
Drogas que atuem sobre funcoes microbianas inexistentes em eucariotos geralmente tem
maior toxicidade seletiva e indice terapeutico (Penicilina).
• Espectro de ação: Refere-se a diversidade de organismos afetados pelo agente.
Geralmente os antimicrobianos sao de pequeno ou de amplo espectro. Atualmente, uma serie
de laboratorios vem trabalhando em busca de isolar e purificar antimicrobianos de espectro
restrito, que atuam especificamente sobre um ou um pequeno numero de microrganismos. No
entanto, atualmente os antibioticos comercializados enquadram-se nas categorias de pequeno
e amplo espectro de acao.
Exemplos de diferentes drogas antimicrobianas, classificadas de acordo com o espectro de ação.
• Quanto à síntese: Microbiana, quimica ou semi-sintetica
Microbiana - geralmente por uma ou poucas bacterias (actinomicetos) e varios tipos de fungos
filamentosos. Geralmente correspondem a produtos do metabolismo secundario.
Química - Sulfonamidas, Trimetoprim, Cloranfenicol, Isoniazida alem de outros antivirais
e antiprotozoarios.
Semi-sintéticos - sao antibioticos naturais, modificados pela adicao de grupamentos
quimicos, tornando-os menos suscetiveis a inativacao pelos microrganismos (ampicilina,
carbencilina, meticilina).
• Quanto à ação: "staticos" ou "cidas"
Os "cidas" podem ser "staticos" dependendo da concentracao, ou do tipo de organismo.
Os "staticos" tem sua acao vinculada a resistencia do hospedeiro.
• CMI e CML: 2 parametros que indicam a eficiencia da droga.
A droga "cida" geralmente elimina o agente em concentracoes de 2 a 4 vezes maior que
a "statica", sendo o inverso falso.
• Atingir concentracoes efetivas nos tecidos e entrar em contato com o microrganismo.
• Nao alterar os mecanismos naturais de defesa do hospedeiro.
Mecanismos de ação dos antimicrobianos
Varios sao os possiveis alvos para os agentes antimicrobianos. O conhecimento dos
mecanismos de acao destes agentes permite entender sua natureza e o grau de toxicidade
seletiva de cada droga.
Exemplos das principais estruturas ou etapas metabólicas afetadas por antibióticos
1) Inibição da síntese da Parede Celular: estes agentes antimicrobianos
correspondem aos mais seletivos, apresentando um elevado indice terapeutico.
penicilinas, ampicilina e cefalosporinas: contem em sua estrutura um anel b-lactamico, que
interage com proteinas denominadas PBPs (Penicillin Binding Protein), inibindo a enzima
envolvida na transpeptidacao, responsavel pela ligacao entre as cadeias de tetrapeptideos do
peptideoglicano. Com isso, ha o impedimento da formacao das ligacoes entre os tetrapeptideos
de cadeias adjacentes de peptideoglicano, ocasionando uma perda na rigidez da parede
celular. Acredita-se tambem que tais drogas podem atuar promovendo a ativacao de enzimas
autoliticas, resultando na degradacao da parede.
Mecanismo de ação dos antibióticos b-lactâmicos
(Adaptado de Atlas, R.M., Principles of Microbiology, 1997)
bacitracina: Interfere com a acao do carreador lipidico que transporta os precursores da
parede pela mebrana. Resulta na nao formacao das ligacoes entre o NAM e NAG.
vancomicina: liga-se diretamente a porcao tetrapeptidica do peptideoglicano. E ainda a
droga de escolha para linhagens resistentes de S. aureus.
2) Ligação à Membrana Citoplasmática: sao agentes antimicrobianos que muitas
vezes exibem menor grau de toxicidade seletiva.
polimixinas: Ligam-se a membrana, entre os fosfolipideos, alterando sua permeabilidade
(detergentes). Sao extremamente eficientes contra Gram negativos, pois afetam tanto a
membrana citoplasmatica como a membrana externa.
Ionoforos: Moleculas hidrofobicas que se imiscuem na Membrana citoplasmatica, permitindo a
difusao passiva de compostos ionizados para dentro ou fora da celula.
Exemplo de um antibiótico que atua como ionóforo
3) Inibição da síntese de ácidos nucléicos: seletividade variavel.
Novobiocina: se liga a DNA girase, afetando o desenovelamento do DNA, impedindo
sua replicacao.
quinolonas: Inibem a DNA girase, afetando a replicacao, transcricao e reparo.
Rifampicina: Ligacao a RNA polimerase DNA-dependente, bloqueando a transcricao.
4) Inibição da tradução: Sao geralmente bastante seletivos. Correspondem a um dos
principais grupos de agentes antimicrobianos, uma vez que a sintese proteica corresponde a
processo altamente complexo, envolvend varias etapas e diversas moleculas e estruturas.
Diferentes etapas da tradução que podem ser afetadas por agentes antimicrobianos
estreptomicina e gentamicina: Liga-se a subunidade ribossomal 30S, bloqueando-a e
promovendo erros na leitura do mRNA. Interferem com a formacao do complexo de iniciacao.
tetraciclina: Liga-se a subunidade ribossomal 30S (sitio A), impedindo a ligacao do
aminoacil-tRNA.
cloranfenicol: Liga-se a subunidade ribossomal 50S e inibe a ligacao do tRNA e da
peptidil transferase, inibindo a elongacao.
eritromicina: Liga-se a subunidade ribossomal 50S e inibe a elongacao.
Exemplos de drogas que interferem com a síntese protéica
5) Antagonismo metabólico: geralmente ocorre por um mecanismo deinibicao
competitiva.
Sulfas e derivados: inibicao da sintese do acido folico, pela competicao com o PABA.
Trimetoprim: bloqueio da sintese do tetrahidrofolato, inibindo a dihidrofolato redutase.
Similaridade estrutural entre a sulfanilamida e o PABA (importante precursor da síntese de purinas)
Isoniazida: afeta o metabolismo do NAD ou piridoxal, inibe a sintese do acido micolico -
"fator corda".
Resistência microbiana
Este tema tornou-se um motivo de preocupacao crescente entre os profissionais da
area de saude, pois a cada ano observamos o aumento de linhagens resistentes aos mais
diversos agentes antimicrobianos.
Proporcao de bacterias fecais, isoladas de
individuos normais, resistentes aos diferentes
antibioticos.
Aumento na proporcao de linhagens de N.
gonorrhoaea resistentes a penicilina.
A resistencia microbiana aos antimicrobianos pode ser de dois tipos:
• Natural: ausencia da estrutura, ou via metabolica alvo.
• Adquirida: Atraves de mutacoes espontaneas e selecao, ou por recombinacao apos
transferencia de genes.
Dentre os principais mecanismos de resistencia podemos citar:
Impermeabilidade a droga: Muitas bacterias Gram negativas sao resistentes a penicilina G por
serem impermeaveis a droga, ou por apresentarem alteracoes em proteinas de ligacao a
penicilina. No caso das sulfonamidas, o microrganismo pode tambem apresentar uma menor
permeabilidade a droga.
Inativacao: muitas drogas sao inativadas por enzimas codificadas pelos microrganismos. Por
exemplo, a penicilinase (b-lactamase) e uma enzima que cliva o anel b-lactamico inativando a
droga. Outras drogas podem ser inativadas em decorrencia de modificacoes introduzidas pelo
microrganismo, tais como a adicao de grupamentos quimicos. Assim, muitos microrganismos
sao capazes de promover a fosforilacao ou acetilacao de antibioticos.
Modificacao de enzima ou estrutura alvo: Por exemplo, alteracoes na molecula do rRNA 23S
(no caso de resistencia a eritromicina e cloranfenicol), alteracao da enzima, no caso de drogas
que atuam no metabolismo, ou uso de vias metabolicas alternativas.
Bombeamento para o meio: Efluxo da droga - No caso da resistencia as tetraciclinas, em
bacterias entericas.
Processos de transferência de genes entre bactérias
Introdução
Sabemos que, embora as mutacoes sejam responsaveis pela expressao de varias
novas caracteristicas por uma celula, muitos dos fenotipos expressos pelos microrganismos
procarioticos sao decorrentes da aquisicao de novos fragmentos de DNA, por meio de
processos de transferencia horizontal de genes. Tres processos de transferencia genetica entre
bacterias sao bastante conhecidos: transformação, conjugação e transdução. Ha ainda um
quarto processo, a conversão lisogênica, que envolve a transferencia de DNA de uma particula
viral para uma bacteria, sendo um evento importante na aquisicao de genes muitas vezes
associados a virulencia.
Transformação - E definida como um processo de incorporacao de DNA na forma livre,
geralmente decorrente da lise celular. A partir de seu descobrimento, foi demonstrado
formalmente que o DNA era a molecula envolvida na hereditariedade (experimentos iniciados
por F. Griffith, 1928).
Varias bacterias Gram positivas e negativas sao naturalmente transformaveis,
entretanto, dentro de um genero, nem todas as especies o sao. Na natureza, o processo ocorre
quando uma celula sofre lise, liberando seu DNA. Este, por ser de grande tamanho tende a
sofrer quebras, originando centenas fragmentos de aproximadamente 15 kb (o equivalente a
cerca de 15 genes, em Bacillus subtilis).
Como uma celula absorve poucos fragmentos, apenas uma pequena proporcao de
genes podem ser transferidos.
Inicialmente, para que o processo ocorra, e necessario que a cel. encontre-se
competente, isto e, deve apresentar sitios de superficie para a ligacao do DNA da celula
doadora e apresentar a membrana em uma condicao que permita a passagem deste DNA.
Esta propriedade e, provavelmente, uma caracteristica inerente de certas linhagens e, ao que
parece, envolve o mecanismo de quorum sensing. O estabelecimento da competencia e um
fenomeno controlado, envolvendo a participacao de diferentes proteinas (proteina de ligacao
ao DNA, presente na membrana, autolisinas, nucleases), sendo um processo variavel entre os
microrganismos.
Aparentemente, o numero de sitios disponiveis para a ligacao do DNA e limitado. Esta
captacao parece estar relacionada a uma pequena sequencia, de 10 a 12 pares de bases,
presente no DNA exogeno. Em Haemophilus, foi demostrada a presenca de uma proteina que
reconhece e liga-se a uma sequencia 5’ - AAGTGGGTCA - 3’, muito comum no genoma deste
microrganismo, garantindo que somente ocorrera a captacao de DNA de especies muito
similares.
A competencia e um processo que depende de varias condicoes distintas nos diferentes
microrganismos. Sabe-se que a fase de crescimento e as condicoes ambientais desempenham
um papel de extrema importancia no processo. Alem destes, a temperatura e a concentracao
de cations tambem influenciam a eficiencia do processo.
A captação do DNA tambem e diferente entre Gram positivos (G+) e Gram negativos
(G-): Nas G+ o DNA e captado como dupla helice e absorvido como fita simples, sendo uma
das fitas degradadas. Nas G-, o DNA e absorvido como fita dupla, embora apenas uma das
fitas participe do processo de recombinacao. Independente do tipo celular, a ligacao do DNA a
celula e mais eficiente quando esta como fita dupla.
Ligação do DNA: inicialmente e reversivel, tornando-se irreversivel depois. As celulas
competententes ligam o DNA com muito mais eficiencia que celulas nao competentes (1000
vezes mais). Streptococcus pneumoniae e capaz de ligar apenas cerca de 10 moleculas de
DNA de dupla fita, de 15 a 20 kb. Quando sao absorvidas, como DNA de fita simples, estas
passam para cerca de 8 kb.
Em Haemophilus influenzae, e necessario que o DNA tenha uma sequencia especifica
de 11 pb, para que haja a ligacao irreversivel e o DNA seja captado.
Integração do DNA: O DNA liga-se a proteinas na superficie celular, sendo em seguida
absorvido ou tendo uma de suas fitas degradadas por nucleases antes da absorcao. A medida
que o DNA e absorvido no interior da celula, este se associa a proteinas de ligacao ao DNA de
fita simples, protegendo-o de degradacao. A proteina RecA tambem participa deste processo,
associando-se a fita e promovendo a recombinacao. Ha entao a degradacao do que resta da
fita simples e formacao de um DNA hibrido, que na replicacao originara uma molecula parental
e outra recombinante.
Esquema dos eventos envolvidos na transformação em Streptococcus, um
organismo Gram positivo. O autoindutor (1) ao encontrar o receptor (2) interage com este,
promovendo a ativacao de varios genes (3, 4 e 5) dentre eles as autolisinas, nucleases e
proteina de ligacao ao DNA. Uma das fitas do DNA passa a ser captada pela celula, enquanto
a outra e degradada (6). Ao penetrar na celula a fita simples e protegida por proteinas. Caso
este DNa encontre uma regiao complementar, a proteina RecA auxiliara sua recombinacao
com o DNA endogeno (7).
Conjugação - Processo de transferencia de DNA de uma bacteria para outra,
envolvendo o contato entre as duas celulas (descoberta por Tatum & Lederberg, 1946). A
conjugacao esta associada a presenca de plasmideos de natureza F. Estes plasmideos contem
genes que permitem a transferencia do DNA plasmidial de uma celula para outra ou, em outras
palavras, a capacidade conjugativa. Quando a celula porta um plasmideo de natureza F e
denominada F+, doadora, ou macho, enquanto celulas desprovidas de tais plasmideos sao
denominadas F-, receptoras, ou femeas.
A capacidade conjugativa esta associada a presenca de determinados genes
localizados em um operon denominado tra. Estes genes conferem uma serie de caracteristicas
envolvidas na conjugacao tais como a sintese do pilus F, responsavel pelo reconhecimento e
contato entre as celulas, assim como a transferencia do DNA plasmidial.
Eventualmente, os plasmideos podem ser integrados no cromossomo, sendo este
processo mediado por pequenas sequencias de DNA denominadas IS (insertion sequences).
As celulas apresentados tais plasmideos integrados sao denominadas Hfr (do ingles High
Frequency of Recombination). Quando integrados, esses plasmideos podem mobilizar a
transferencia de genes cromossomais tambem.
Exemplo de um plasmídeo do tipo F
Em gram negativos, a conjugacao pode ser de dois tipos: entre celulas F+ e F-,
resultando em duas celulas F+ e entre celulas Hfr e F-, resultando em uma celula Hfr e outra F-
. Nos dois processos, acredita-se que o mecanismo provavel de transferencia do DNA seja pelo
circulo rolante, onde apenas uma das fitas e transferida, sendo a fita complementar sintetizada
pela celula receptora. Provavelmente, o estimulo para o disparo do processo seja o contato das
celulas. Assim, a conjugacao envolve a passagem de DNA de uma celula F+ para outra F-, que
torna-se entao F+ tambem.
Quando o plasmideo encontra-se incorporado ao cromosso, a conjugacao passa a
envolver a transferencia de genes cromossomais, sendo que nestes casos, a celula receptora
permanece F-, porque a regiao tra e a ultima a ser transferida, o que raramente ocorre na
natureza. Nestes casos, passam grandes blocos de DNA da celula Hfr para a receptora,
promovendo extensas recombinacoes.
(a)
(b)
(c)
(d)
Esquema dos eventos associados à conjugação entre células F+ e F-.
Eventos associados a conjugacao entre uma
celula Hfr e outra F-. Observe que a celula F- permanece
como receptora, uma vez que a regiao tra normalmente
nao e transferida.
Transdução: (Lederberg & Zinder, 1952) transferencia mediada por virus, podendo ser
generalizada (qualquer fragmento de DNA) ou especializada (determinados genes, passados
por fagos temperados).
Transdução generalizada: Descoberta em Salmonella typhimurium com o fago P22, embora
este processo tambem ocorra em outras bacterias, tais como E. coli. Este tipo de processo requer a
ocorrencia de um ciclo litico, onde eventualmente pode haver o empacotamento de fragmentos de
DNA da celula hospedeira, gerando particulas denominadas partículas transdutoras, que
correspondem ao capsideo viral contendo em seu interior DNA bacteriano. Embora nao possam ser
descritas como virus, as particulas transdutoras exibem a capacidade de adsorcao a superficie de
outras celulas bacterianas. A frequencia com que um determinado gene e transferido e baixa uma vez
que cada particula transdutora leva apenas um determinado fragmento de DNA (1 em 10 6 ou 108 cel.
recebem um determinado gene).
Transdução generalizada: durante um ciclo litico, pode haver a incorporacao de DNA
bacteriano no capsideo viral. Este DNA podera ser transferido para outra bacteria, pois os processos
de adsorcao e injecao de DNA dependem da estrutura do virus, independente do tipo de DNA contido
em seu interior.
Transdução especializada: Evento raro, embora bastante eficiente. O exemplo melhor
conhecido e primeiramente descoberto foi a transferencia de um genes que codificam produtos
envolvidos na degradacao de galactose pelo fago l de E. Coli. A etapa inicial no processo corresponde
a infeccao e lisogenizacao do fago, que ocorre em sitios especificos do genoma. Neste caso, a
integracao do fago ocorre adjacente ao conjunto de genes envolvidos na utilizacao de galactose. Pela
acao de algum indutor (ex: UV) ha a separacao do fago do genoma (integracao reversa), que
normalmente ocorre perfeitamente.
Entretanto, em alguns casos, essa separacao e defeituosa, promovendo a remocao de genes
bacterianos e deixando parte do genoma viral na celula. Essas particulas podem ser de dois tipos:
aquelas que carregam genes gal e outras que carregam genes bio. Aquelas particulas levando genes
gal sao denominadas ldgal (defectivas, contendo o gene gal), porque são incapazes de formar
particulas virais maduras (porque deixam no hospedeiro o gene que codifica a proteina integrase).
Quando estas particulas infectam novas celulas, juntamente com fagos normais (helper), pode haver a
transferencia de genes gal, a partir da infeccao e lisogenizacao dos dois fagos.
Transdução especializada: este processo e dependente da ocorrencia de um ciclo lisogenico. O fago
integra seu DNA ao DNA bacteriano e apos um determinado periodo de tempo e de acordo com certos
estimulos, este fago pode iniciar um ciclo litico. Caso a excisao do DNA viral ocorra de maneira
defeituosa, podera haver a transferencia de um pequeno fragmento de DNA bacteriano (porque parte
do DNA viral ficara incorporado ao genoma bacteriano). Este virus "defeituoso" podera transferir o DNA
bacteriano para outras celulas.
Conversão lisogênica: Transferencia de genes de fagos para bacterias. A propria lisogenizacao
torna a bacteria imune a outras infeccoes por este fago, mas alem disso, outros fenotipos podem ser
adquiridos. O exemplo mais classico consiste na conversao de celulas atoxigenicas de
Corynebacterium diphtheriae em toxigenicas, pelo fago s. Assim, a bacteria recebe um gene que
codifica uma toxina, sendo este gene de origem viral.

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