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Diversidade Molecular
https://doi.org/10.1007/s11030-022-10395-8

ARTIGO ORIGINAL

Dinâmica molecular e triagem virtual baseada

em estrutura e identificação de compostos naturais como
moduladores de sinalização Wnt: possíveis terapêuticas para a doença de Alzheim

Suman Manandhar1 · Runali Sankhe1 · Keerthi Priya1 · Gangadhar Hari1 · Harish Kumar B.1 · Chetan H.
Mehta2 · Usha Y. Nayak2 · K. Sreedhara Ranganath Pai1

Recebido: 17 de agosto de 2021 / Aceito: 22 de janeiro de 2022

© O(s) Autor(es) 2022

Abstrato

A via de sinalização Wnt é uma via evolutivamente conservada responsável pela neurogênese, crescimento axônico, polaridade neuronal,
formação e manutenção de sinapses. Downregulation da sinalização Wnt foi encontrado em pacientes com doença de Alzheimer (DA). Várias
abordagens experimentais para ativar a via de sinalização Wnt provaram ser benéficas no alívio da DA, que é uma das novas abordagens
terapêuticas para a DA. O presente estudo se concentra na triagem virtual baseada em estrutura computacional seguida pela identificação de
potenciais fitomoléculas visando diferentes marcadores de sinalização Wnt como WIF1, DKK1, LRP6, GSK-3ÿ e acetilcolina esterase.
Inicialmente, a triagem de 1924 compostos da biblioteca baseada em plantas do banco de dados de zinco foi feita para as cinco proteínas
selecionadas usando a abordagem de encaixe seguida por cálculos de MM-GBSA
As cinco principais moléculas de acerto foram identificadas para cada proteína. Com base na pontuação de encaixe e nas interações de
ligação, as duas principais moléculas de acerto para cada proteína foram selecionadas como moléculas promissoras para o estudo de
simulação de dinâmica molecular (MD) com as cinco proteínas. Portanto, a partir deste estudo in silico, relatamos que a Mangiferina poderia
ser uma molécula potencial visando a via de sinalização Wnt modulando a atividade de LRP6, Baicalina para atividade de AChE, ácido
Chebulic para DKK1, ZINC103539689 para WIF1 e Morin para proteína Gsk-3ÿ. No entanto, a validação adicional da atividade é garantida
com base em experimentos in vivo e in vitro para melhor compreensão e forte afirmação. Este estudo fornece uma abordagem in silico para a
identificação de moduladores da via de sinalização Wnt como uma nova abordagem terapêutica para DA.

*
K. Sreedhara Ranganath Pai
ksr.pai@manipal.edu

1
Departamento de Farmacologia, Manipal College of
Ciências Farmacêuticas, Manipal Academy of Higher
Educação, Manipal 576104, Índia
dois

Departamento de Farmácia, Manipal College of

Ciências Farmacêuticas, Manipal Academy of Higher
Educação, Manipal 576104, Índia

Vol.:(0123456789) 1 3
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Resumo gráfico

Fitomoléculas: banco de dados de zinco

Ancoragem molecular

DKK1
GSK-3ÿ WIF1 LRP6 Dor

Análise de ligação de energia gratuita: MMGBSA

Análise de farmacocina c: QikProp

Top 2 hits para

cada proteína

Dinâmica Molecular

Palavras -chave Doença de Alzheimer · Sinalização Wnt · DKK1 · LRP6 · WIF1 · Triagem virtual · Dinâmica molecular

Introdução A via de sinalização Wnt pode ser amplamente classificada

Wingless and Integrated (Wnt) [1] compreende uma família de
glicoproteínas secretadas que são conservadas evolutivamente
em várias espécies [2]. As moléculas secretadas da família Wnt
estão envolvidas na regulação de vários processos essenciais durante
o desenvolvimento, como gastrulação, desenvolvimento de órgãos,
formação de eixos, organização do desenvolvimento do plano corporal
e homeostase dos tecidos. A via de sinalização Wnt desempenha um
papel importante como mediador para a manutenção da comunicação
intercelular que é essencial para o desenvolvimento do sistema nervoso.
Está envolvido na regulação de circuitos neuronais, plasticidade e
conectividade controlando a remodelação axônica, orientação,
morfogênese de dendritos e formação de sinapses [4].
A geração contínua de novas células ocorre ao longo
idade adulta; no entanto, há uma capacidade limitada para a
regeneração de células neuronais no cérebro adulto. Recentemente,
a descoberta de células-tronco nas áreas restritas do cérebro [5]
trouxe a possibilidade de substituir os antigos neurônios moribundos
por células-tronco. O canônico ativado Wnt/
A via de sinalização da ÿ catenina está envolvida na manutenção da
pluripotência das células-tronco embrionárias e na autorrenovação [6].
Os membros das vias de sinalização Wnt desempenham um papel
importante no desenvolvimento e diferenciação de células-tronco em
interneurônios [7, 8].
em canônica e não canônica, dependendo do envolvimento da ÿ-
catenina. A sinalização Wnt canônica começa com a ligação da
proteína Wnt ao receptor transmembrana acoplado à proteína G de
sete hélices e à proteína relacionada ao receptor de lipoproteína 6
(LRP6). Isso leva à hiperfosforilação do desgrenhado (Dvl), causando
a desmontagem do complexo de destruição composto por Axina,
Adenomatosis polysis coli (APC) e GSK-3ÿ [9-11]. A dissociação do
complexo proteico de destruição inativa a GSK-3ÿ impedindo assim a
fosforilação da ÿ-catenina e sua degradação proteassômica. Assim, o
aumento do acúmulo de ÿ-catenina no citoplasma e sua translocação
nuclear levam à ativação de genes alvo TCF/LEF [12].
A proteína extracelular Dickkopk-1 (DKK1) previne
a interação de LRP6 com Wnt modulando assim
negativamente a via de sinalização Wnt canônica. Da mesma forma,
o fator inibitório Wnt (WIF1) é conhecido por inibir a sinalização Wnt,
uma vez que se liga diretamente a diferentes ligantes Wnt canônicos
e não canônicos Wnt3a, Wnt4, Wnt5a, Wnt7a, Wnt9a e Wnt11. WIF1
também desempenha um papel crítico no estágio de desenvolvimento
embrionário durante a formação do eixo. Durante os estágios iniciais
da geração do cérebro do peixe-zebra, foi observada uma regulação
negativa significativa de WIF1 e ativação da sinalização Wnt canônica
[13].
A alteração na via Wnt leva a doenças relacionadas à idade,
como osteoporose, parkinsonismo, doença de Alzheimer (DA),

13
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e câncer de cólon [14]. A expressão aumentada de Dkk-1 é
observada ao redor das placas amilóides no cérebro de pacientes
com DA e os neurônios expressando p53 representando a perda de
sinalização Wnt na DA [15]. A sinalização Wnt desregulada tem sido
associada a doenças neurodegenerativas. Várias tentativas focadas
usando moléculas pequenas e moléculas sintéticas foram realizadas
para ativar a via de sinalização regulada negativamente para a
atenuação de doenças neurodegenerativas.
A ativação endógena mediada pelo ligante Wnt-3a da via de
sinalização canônica Wnt provou fornecer sinais de sobrevivência
celular, prevenindo os efeitos neurotóxicos das placas amilóides (Aÿ)
[16, 17]. O tratamento com oligonucleotídeos antisense DKK1 para
os animais isquêmicos demonstrou proteger os neurônios do
hipocampo contra danos isquêmicos e neurônios corticais cultivados
contra a toxicidade de NMDA.
A importância do design baseado em computação do
O medicamento foi comprovado para várias doenças, incluindo
a doença neurodegenerativa [18-20]. Compostos naturais têm
imenso potencial para serem convertidos como novas drogas com
direcionamento de sinalização Wnt específico [21-24]. No presente
estudo, uma tentativa in silico foi feita para rastrear a biblioteca
fitoquímica do banco de dados Zinc para a avaliação da afinidade de
ligação com diferentes proteínas (DKK1, LRP6, WIF1, GSK3ÿ) da
via de sinalização Wnt e acetilcolinesterase (Dor).
Materiais e métodos
Todos os estudos baseados em computação foram realizados
na plataforma Maestro, envolvendo LigPrep, o assistente de
preparação de proteínas, GLIDE (Grid-based Ligand Docking with
Energet ics) e ferramentas Desmond da Schrodinger Inc.
preparação de proteína
Na modelagem molecular baseada em estrutura, o uso de estrutura
proteica precisa é importante. A sinalização Wnt desregulada tem
sido associada à DA. No presente estudo, proteínas ligadas à via
de sinalização Wnt foram selecionadas para explorar a afinidade de
ligação, interações das fitomoléculas selecionadas e avaliar
virtualmente seu potencial de regulação positiva da sinalização Wnt.
RCSB PDB id: 2YGO [25], 3S2K [26], 1Q5K [27] e 4M0F [28] foram
recuperados do banco de dados de proteínas e preparados usando o
'assistente de preparação de proteínas' do Maestro, suíte Schrodinger.
O WIF1 é conhecido por inibir a sinalização Wnt, pois se liga
diretamente a diferentes ligantes Wnt canônicos e não canônicos.
O PDB id 2YGO que representa o domínio WIF humano EGF-
like domínio 1 de WIF1 em complexo com 1,2-dipalmi
toilfosfatidilcolina foi selecionado para identificar moléculas com
boa interação e possível potencial inibidor de WIF1. O aumento
da expressão de Dkk-1 é visto ao redor do
placas amilóides no cérebro de pacientes com DA e os neurônios
que expressam p53 resultando na perda de sinalização Wnt na DA [15].
A inibição da proteína DKK1 ou sua ligação com LRP6 pode ser
uma possível alternativa terapêutica para a DA. Atualmente,
escolhemos o PDB id: 3S2K que representa a base estrutural da
inibição da sinalização Wnt pela ligação de Dickkopf ao LRP5/6. Foi
comprovado que a exposição Aÿ induz a superexpressão de GSK-3ÿ
que medeia a hiperfosforilação da proteína Tau e, eventualmente, o
desenvolvimento de AD [29, 30].
A inibição da GSK-3ÿ tem imenso potencial como terapia alternativa
para a DA. PDB id: 1Q5K foi selecionado que representa a estrutura
cristalina de GSK-3ÿ em complexo com inibidor n-(4-
metoxibenzil)-n'-(5-nitro-1,3-tiazol-2-il)
ureia. PDB id 4M0F representa a estrutura cristalina da
acetilcolinesterase humana (AChE) em complexo com o território B.
As estruturas cristalográficas de raios X das proteínas acima
mencionadas (PDB id: 2YGO, 3S2K, 1Q5K, 4M0F) foram
importadas, pré-processadas e minimizadas usando o assistente
de preparação de proteínas. Nessas etapas, as cadeias laterais e
aminoácidos ausentes foram preenchidos, os átomos pesados e as
moléculas de água foram removidos e a minimização restrita foi
feita para gerar a estrutura proteica de menor energia em pH neutro.
Todos os aminoácidos importantes são retidos na estrutura
da proteína durante a preparação da proteína. Para a proteína
GSK-3ÿ, a grade do receptor de AChE foi gerada com base no
ligante cocristalizado usando o 'Receptor grid generation' do módulo
GLIDE [31] , enquanto a grade para outras proteínas foi gerada com
base em sítios farmacológicos ativos obtidos do mapa de sítios [32].
Preparação do ligante
Fitomoléculas (1924) do subconjunto Biogênico do banco de dados
ZINC [33] foram preparadas usando o módulo 'LigPrep' do Maestro,
suíte Schrodinger. Este módulo é usado para gerar (i) as estruturas
3D de energia mais baixa com quiralidade correta, (ii) tautômeros, (iii)
conformação de anel, (iv) química estéreo e (v) estados de ionização
usando Epik. O processo de preparação do ligante foi realizado em
pH neutro sob o campo de força OPLS3e.
Docking molecular baseado em estrutura
Após a preparação do ligante, o docking molecular foi realizado
usando high throughput virtual screening (HTVS), seguido pelo
modo Standard precision (SP) e extra precision (XP), utilizando o
módulo GLIDE do Maestro, suíte Schrodinger [34].
O encaixe da biblioteca de fitomoléculas foi feito para cinco
proteínas selecionadas com base na grade do receptor que foram
geradas usando ligantes de entrada para proteínas GSK3ÿ e AChE
ou usando os sítios gerados usando a ferramenta sitemap.
Docking no modo HTVS facilitado em uma triagem rápida das
moléculas de acerto para diferentes proteínas (1467 moléculas
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para GSK-3ÿ; 1523 moléculas para AChE; 1605 moléculas para DKK1; 978
moléculas para LRP6; e 1391 moléculas para a proteína WIF1). Além disso,
com base na pontuação do dock e nas interações de ligação, 500 moléculas
dessas moléculas de hit da lista restrita foram selecionadas e encaixadas no
modo SP de encaixe e, eventualmente, as 200 principais moléculas para cada
proteína foram encaixadas usando o modo XP de encaixe.
Cálculo de energia de ligação
A energia de ligação relativa de 20 complexos de proteína-ligando ancorados
XP foi calculada com cada proteína selecionada, usando
Área de superfície nascida generalizada da mecânica primária-molecular
(MM-GBSA) [35–37]. Prime MM-GBSA usa o modelo de solvatação
VSGB [38] que é dependente do modelo de Born generalizado elétrico de
matriz variável e solvente como água sob o campo de força OPLS3e. A energia
de ligação também ajuda a prever com que força o ligante se liga à proteína
selecionada.
A energia livre de ligação de todas as proteínas-ligantes selecionadas
complexo é calculado pela fórmula:
Ligação ÿG=complexo G–(proteína G+ligante G).
onde G = MME (energia de mecânica molecular)+ GSGB (modelo de
salvação SGB para solvatação polar)+GNP (solvatação não polar).
Análise ADME
A análise ADME foi calculada para os 20 principais acertos de cada
proteína, usando o módulo 'QikProp' do Maestro, suíte Schrodinger [39].
A ferramenta 'QikProp' ajuda a prever as propriedades semelhantes a drogas
de ligantes selecionados. Neste contexto, as propriedades do ADME como
peso molecular, QPlogPo/w (coeficiente de partição octanol/água), QPlogS
(solubilidade), QPlog HERG (capacidade de bloquear canal K+), QPPCaco
(permeabilidade celular Caco2), QPlogBB (Sangue/ coeficiente de partição
cerebral), absorção oral humana (% absorção oral) e regra de cinco foram
calculados.
Simulação de dinâmica molecular (MD)
O módulo 'Desmond' do Maestro, suíte Schrodinger, foi usado para realizar
a simulação MD dos dois principais hits com todas as cinco proteínas
selecionadas. No módulo Desmond, foi utilizada a caixa de simulação
ortorrômbica com dimensões específcas utilizando um sistema solvente
explícito simulado sob diferentes condições. No estudo atual, dois acertos para
cada proteína foram selecionados para simulação de MD, com base nos
resultados obtidos de XP docking, interações de ligação e análise de ADME.
A simulação MD foi feita em três etapas, ou seja, construtor do sistema,
minimização e simulação MD. Durante a primeira etapa, o complexo
ligante-proteína ancorado foi
13
Diversidade Molecular
submetido a um integrador de sistema usando um sistema solvente SPC pré-
definido. O sistema solvente SPC é usado principalmente para criar condições
de contorno ortorrômbicas. Além disso, pela adição de íons sódio, a carga
negativa foi neutralizada no modelo. Na etapa seguinte, o modelo gerado foi
ainda submetido à minimização, que é balanceada a 1 bar de pressão usando
o conjunto NPT (pressão-temperatura normal) e pressão de 300 K. A simulação
MD foi realizada por 50 ns, em que o quadro de 50 ps foi capturado e salvo na
trajetória.
No geral, 1.000 quadros foram capturados durante a simulação MD.
Análise após simulação MD
Após a simulação de MD, foi feito o cálculo do RMSD da proteína e do
ligante, bem como a análise das interações mostradas pelo ligante durante
toda a duração da simulação. O RMSD mede a mudança média no
deslocamento de átomos selecionados para um determinado quadro em
relação a um quadro de referência.
O RMSD para o quadro x é:
Não
não é ( rÿ( tx ) ÿ rj ( tref ))2
RMSDX = ÿÿÿÿ 1 i=1 j
onde N é o número de átomos na seleção de átomos. tref
é o tempo de referência e rÿ é a posição dos átomos selecionados no
quadro x
Resultados e discussão
Previsão do SiteMap para o bolso de vinculação de drogas
Para três das proteínas, LRP6 (PDB id: 3S2K cadeia A), DKK1 (PDB
id: 3S2K cadeia X) e WIF1 (PDB id: 2YGO), as estruturas de ligante
cocristalizadas não estavam presentes. Assim, a ferramenta de previsão
SiteMap foi usada para prever o sítio de ligação de droga. A previsão do
SiteMap levou à identifcação de um sítio drogável de volume 573.496 ÿ3 com
pontuação de drogabilidade (Dscore) de 1.291 e pontuação do local de 1.204
para a proteína WIF1. A bolsa identificada para a proteína WIF1 da qual
incluiu a área de superfície total 3821,811 ÿ2 incluiu a região hidrofóbica de
526,63 ÿ2
,
, área hidrofílica de 1969,72 ÿ2
e região aceitadora de ligação de hidrogênio de 600,446 ÿ2 . Da mesma
forma, para a proteína DKK1, três sítios drogáveis foram identificados com o
melhor sítio como sítio1 com 307.671 ÿ3 de volume, pontuação de sítio de
0,878 e Dscore de 0,998. O local identificado 1 bolso para a proteína DKK1
compreendeu a área de superfície total de 5811,98 ÿ2 que incluiu a região
hidrofóbica de 46,31 ÿ2 , área
hidrofílica de 3172,79 ÿ2 , região aceptora de ligação de hidrogênio de
1624,40 ÿ2 , e região doadora de ligação de hidrogênio de 1531,69
ÿ2 . Sitemap gerou cinco bolsos drogados para proteína
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LRP6 com o melhor site como site3 de volume 308,7 ÿ3 com Dscore de região de 252,79 ÿ2, 468,27 e região doadora de ligação de hidrogênio de
ÿ2 .
1.042 e sites score de 1.147 contendo os resíduos envolvidos na ligação a A lista dos bolsos gerados para diferentes proteínas com o
DKK1. O local identificado 3 bolsos para a proteína LRP6 compreendeu a área Dscore, as pontuações do site e os resíduos envolvidos

de superfície total de 871,75 ÿ2 que incluiu a região hidrofóbica de 83,06 ÿ2 na bolsa estão representados na Tabela 1. A grade para docking foi gerada
usando as coordenadas dos sítios mais bem identificados para essas três
, área hidrofílica de 713,35 ÿ2 , aceptor de ligação de hidrogênio proteínas.

Tabela 1 Lista de bolsos drogáveis identificados nas proteínas WIF1, DKK1 e LRP6 com o Dscore, pontuação do local, o volume do bolso e resíduos disponíveis no bolso

Nº de sites Pontuação do Local D Volume de Pontuação (Å3 ) Resíduos

WIF1

1 1.204 1.291 573.496 Cadeia A: GLU36, TYR37, LEU38, ILE40,

LEU48, ILE49, ILE55, LE57, VAL58, MET63,
PHE66, THR67, ASP69, PHE70, ARG71,
ALA73, GLN74, GLN75, ARG76, MET77,
PRO78, ALA79, ILE80, MET87, PHE89,
TRP91, GLN92, TYR101, PHE103, VAL127,
AL134, VAL136, PHE138, PHE150, VAL152,
VAL154, VAL156, LEU165, THR167,
PRO168, ILE172, PHE173, PHE174

local 1

DKK1

1 0,878 0,998 307.671 Cadeia C: LYS182, GLN184, GLU185, GLY186,

LEU190, ARG191, SER192, SER193, CYS195,
ALA196, SER197, GLY198, LEU199, CYS201,
ALA202, ARG203, HIS204, LYS208, ILE209,
CYS210, LYS211, PRO212, VAL213, LEU214,
LYS215, GLU216, GLN218, VAL219, CYS220,
THR221, LYS222, HIS223, ARG224, ARG225,
LYS226, SER228, HIS229, LYS231, GLU232,
PHE234GLN235, ARG236, CYS237, TYR238,
CYS239, GLU240, GLU241, GLY242,
LEU243, SER244, CYS245, ARG246, ILE247,
ARG259, LEU260, HIS261, ARG265, HIS266

local 1

dois 0,603 0,668 21.266 Corrente C: VAL188, CYS189, LEU190, ARG203,

PHE205, TRP206, SER207, LYS208, GLY230,
ILE233

local 2

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Tabela 1 (continuação)

Nº de sites Pontuação do Local D Volume de Pontuação (Å3 ) Resíduos

3 0,48 0,496 6,86 Cadeia C: GLU216, GLY217, ARG246, ILE247,

GLN248, LYS249, GLN264, ARG265

local 3

LRP6

1 1.063 1.008 932.274 Cadeia A: THR934, LYS941, ASN966, VAL967,

ARG968, ALA969, ILE970, ASP971, TYR972,
PRO974, TYR1017, ASP1018, LEU1019,
SER1020, ILE1021, ASP1022, ILE1023,
TYR1024, ALA1061, ILE1062, VAL1063,
VAL1064, ASN1065, PRO1066, GLU1067,
ILE1105, ALA1106, LEU1107, ALA1108,
LEU1109, ASP1110, SER1111, ARG1112,
LEU1113, GLN1146, VAL1148, GLY1149,
LEU1150, THR1151, VAL1152, PHE1153,
GLU1154, LYS1162, GLN1187, LEU1188,
SER1189, ASP1190, ILE1191, HIS1192,
ALA1193, VAL1194, LYS1195, GLU1196,
LEU1197, ASN1198, GLU1201, TYR1202

local 1

dois 0,994 0,984 695.947 Corrente A: HIS698, VAL699, VAL700, GLU701,

PHE702, GLY703, TRP721, THR726,
ARG728, GLU730, GLY736, GLN737, HIS738,
ARG739, VAL741, TRP744, HIS902, PRO917,
ALA918, TYR920, ALA931, PRO932,
THR933, PHE935, GLU938, GLN940,
ASN945, ARG946, MET947, VAL948, ILE949,
ASP950, GLN953, SER954, PRO955, ASP956,
ILE957, ILE958, LEU959, PRO960, TYR972,
PRO974, LYS977, GLU993, GLU994, ASP995,
GLN1182, ILE1185, ALA1186, VAL1194,
LYS1195, GLU1196, LEU1197, LEU1199

local 2

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Tabela 1 (continuação)

Nº de sites Pontuação do Local D Volume de Pontuação (Å3 ) Resíduos

3 1.147 1.042 308,7 Cadeia A: SER665, ALA666, LEU667, ASP668,

PHE669, GLU708, GLY709, MET710,
ALA711, VAL712, TRP714, ARG751,
ALA752, LEU753, ALA754, LEU755,
TRP767, ASN794, GLY795, LEU796, THR797,
ILE798, TYR800, LEU810, PHE836, GLY837,
LEU838, THR839, MET877, ASP878, ILE879,
LEU880, VAL881, ARG886, GLN887

local 3

4 0,974 0,976 373.184 Cadeia A: GLN740, VAL741, LEU742, VAL743,

TRP744, LYS745, ASP779, GLY780, SER781,
GLU782, ARG783, LEU905, VAL913,
CYS914, GLY915, CYS916, PRO917, ALS918,
HIS919, TYR920, SER921, LEU922, PRO932,
THR933, THR934, PHE935, VAL948,
ILE949, ASP950, GLN952, SER954, PRO955,
PHE1153

local 4

5 0,885 0.868 206.486 Cadeia A: TRP714, ASP756, ALA758, GLU759,

PHE761, TYR763, ARG775, ASP799,
TYR800, ALA801, ARG803, MET820,
GLN840, TYR841, GLN842, SER885,
ARG886, GLN887, SER888, GLY889, VAL909

local 5

A cor vermelha indica a região aceptora da ligação de hidrogênio, a cor azul indica a região doadora da ligação de hidrogênio e a cor amarela indica uma região hidrofóbica dos sítios
identificados

Validação do protocolo de encaixe O redocking foi realizado pelo alinhamento com as

poses alinhadas conforme mostrado na Fig. 1.
Docking
mostrou o docking A validação da grade gerada foi feita pelo escore de com o inibidor
redock de entrada
de ÿ13.022 docom
kcal/mol PDBHid:-interação
4MOF
gerada seguida de sobreposição e comparação do RMSD. resíduo de ligação comPHE295
TYR 124, o liganteecocristalizado usando a grade
interação de empilhamento
ÿ–ÿ

13
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Fig. 1 Sobreposição do
ligante reencaixado e cocristalizado
na proteína 4M0F e 1Q5K para
validação do protocolo de encaixe
ID do PDB: 4M0F (AChE)
com TRP286. Docking do ligante cocristalizado de PDB id: 1Q5K mostrou o
escore de dock de ÿ7.556 kcal/mol com a formação de interação H-bond
com LYS85 e
resíduos VAL135. A sobreposição do ligante encaixado com o ligante
cocristalizado mostrou RMSD de 0,55 em 4M0F e 0,706 em 1Q5K indicando
que a geração de grade ocorreu no bolso desejado como aquele do sítio de
ligação do inibidor.
Triagem virtual dos fitoquímicos selecionados
No estudo atual, listamos, analisamos e explicamos a pontuação
de encaixe e as interações de ligação dos cinco principais ligantes para
cada proteína após o encaixe no modo XP de encaixe.
Interação molecular dos cinco
principais ligantes com acetilcolinesterase
A enzima AChE está envolvida na regulação do nível do neurotransmissor
acetilcolina mediada pela hidrólise da acetilcolina em colina e acetato. Na
DA, o nível de neurotransmissores de acetilcolina é reduzido.
Os inibidores de AChE aprovados pela FDA agem aumentando o nível de
ace tilcolina no cérebro. O sítio ativo da AChE humana mostrou um profundo
desfiladeiro de 20ÿ de profundidade com a tríade catalítica formada pelos
resíduos HIS447, GLU334 e SER203 [28].
O complexo donepezil–AChE mostra a formação da interação
entre o anel benzílico do donepezil com o TRP86; anel indanona interagindo
com o resíduo TRP286 [40]. No presente estudo, para avaliação da afinidade
de ligação dos fitoquímicos à proteína AChE, a grade PDB id: 4M0F foi
gerada considerando as coordenadas do ligante co-cristalizado territrem B.
O sítio de ligação do territrem B compreende tanto o catalítico quanto o
periférico sítios envolvendo interação de empilhamento ÿ–ÿ entre as cadeias
laterais de TRP 286 e TYR341; interação de ligação de hidrogênio com
resíduos SER293, TYR72 e TYR124 [28].
Atualmente, neste estudo, encontramos a pontuação de encaixe superior
de ÿ14.205 kcal/mol mostrado pela Mangiferina. Mangiferina, um membro
xantona que consiste em 1,3,6,7-tetrahidroxix anten-9-ona e um resíduo
beta-D-glicosil no 6-
posição, está presente em nível signifcativo no fruto da manga, casca, folhas
, e núcleo.
mostraram as interações de Resíduo
ligação de hidrogênio
glucosil com resíduos de
de Mangiferina
aminoácidos
13
Diversidade Molecular
ID do PDB: 1Q5K (GSK-ÿ)
SER203 e HIS447 envolvidos na tríade do sítio ativo e anel de xantona
formaram interação ÿ–ÿ com o resíduo TRP286, como mostrado pelos
inibidores de AChE padrão conhecidos.
Da mesma forma, Baicalin apresentou o segundo maior escore de doca de
ÿ13.224 kcal/mol. A baicalina (5,6,7-trihidroxifavona) pertence à classe
favona de glicosídeos principalmente encontrada na erva Scutellaria
baicalensis. O grupo hidroxila do 7-O-glucuronido da baicalina forma
interações de ligação de hidrogênio com ASP74. Da mesma forma, o grupo
hidroxila e oxi do anel benzopirano da baicalina forma interação de ligação H
com resíduos TYR 341 e PHE295, respectivamente; O anel benzênico do
anel benzopirano está envolvido na formação da interação ÿ–ÿ com TRP286.
As pontuações de encaixe das principais moléculas foram encontradas na faixa
de ÿ14.205 a ÿ10.987 kcal/mol. A lista dos dois principais ligantes, juntamente
com sua pontuação de encaixe, energia de ligação e interações, é mostrada na
Tabela 2.
Interação molecular dos cinco principais ligantes com LRP6
LRP6 atua como um co-receptor para ligantes Wnt que, juntamente com o
receptor Frizzled, ativa a via de sinalização canônica Wnt/ÿ-catenina. A análise
de sequência revelou que as proteínas LRP6 são compostas por quatro
repetições do domínio extracelular YWTD (P1-P4) pareadas por repetições do
fator de crescimento epidérmico (EGF) (E1-E4) variando do aminoácido 21 a
1246 seguido por três domínios do tipo LDLR [41 ]. As quatro repetições
formadas por YWTD e EGF (1-4) representam o ectodomínio de reconhecimento
funcional envolvido na ligação com Wnt e antagonistas. Com base nos estudos,
as repetições em tandem podem ser amplamente divididas em LRP6(1–2)
E unidades LRP6(3–4). LRP6(1–2) provou ser um sítio de ligação para Wnt9b,
Wnt1 enquanto o sítio LRP6(3–4) favorece WNt3a [17].
A inibição de LRP6 mediada por DKK1 é baseada na ligação de DKK1 ao
terceiro e quarto domínio ÿ-hélice de LRP6 (P3E3P4E4) que se estende de
630 a 1244. A estrutura do complexo DKK1-LRP6 confirma a superfície
superior de LRP6 como o sítio de ligação de DKK1. Experimentos
mutagênicos e estequiométricos relataram que DKK1C forma um complexo 1:1
com LRP6 e validou LRP6 P3 como o sítio de ligação para a inibição da
sinalização Wnt mediada por DKK1c [42]. Um estudo feito por Chen et al., para
entender o efeito da mutação pontual em LRP6 e sua afinidade de ligação com
DKK1, sugere o papel de resíduos específicos na ligação com DKK1 [43].
mutantes de ponto único
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Diversidade Molecular

Tabela 2 Pontuação de doca, energia de ligação e resíduos de interação com representação 2D para enzima Acetilcolinesterase (ID PDB: 4M0F), LRP6,
Proteína DKK1 (ID PDB: 3S2K), enzima GSK-3 ÿ (ID PDB: 1Q5K), proteína WIF1 (ID PDB: 2YGO) das duas principais moléculas

XP Dock dG MMGBSA interações

composto Diagrama de Interação 2D
pontuação Ligação (Kcal/
(Kcal/mol) mol)

Docking molecular de precisão extra para AChE (ID PDB: 4M0F)

ZINC33832403 (Gifrin Man) 14.205 ÿ52,65 H-Bond: TYR72, SER203,

HIS447

interação ÿ–ÿ : TRP286

Hidrofóbico: TYR72, LEU76,

TRP86, TYR124, ALA204,
TYR286, PHE297, TYR337,
PHE338, TYR341
Polar: THR75, HIS447, SER203

Negativo carregado: ASP74,

GLH202

ZINC3943903 (Bai ÿ13.224 ÿ43,28 H-Bond: ASP74, PHE295,

TYR341
calin)
interação ÿ–ÿ : TRP286

Hidrofóbico: TYR72, LEU76,

TRP86, TYR124, TRP286,
VAL294, PHE295, PHE297,
TYR337, PHE338, TYR341
Polar: THR75, SER293, HIS447

Negativo carregado: ASP74

Docking molecular de precisão extra para LRP6 (ID do PDB: Chain A _3S2K)

ZINC33832403 (Gifrin Man) ÿ10.960 44.19 H-Bond: ASP668, GLU708,

MET710, LEU753, LEU755,
TYR800, THR797

Hidrofóbico: PHE669, ALA666,

MET710, ALA711, VAL712,
TRP714, ALA752, LEU753,
ALA754, LEU755, LEU796,
ILE798, TYR800, LEU838,
MET877, ILE879, LEU880
Polar: ASN794, THR797,
THR839, GLN840, GLN887

Negativo carregado: ASP668,

GLU708, ASP878

Positivo carregado: ARG886

ZINC12504453 (Calys ÿ10.487 ÿ32.32 H-Bond: LEU667, MET710,

tegine) LEU753, LEU838, ASP878

Ponte de Sal: ASP878

Hidrofóbico: LEU667, ALA666,
MET710, ALA711, ALA752,
LEU753, ALA754, LEU796,
LEU838, ILE879, LEU880
Polar: ASN794, THR797,
THR839

Negativo carregado: ASP668,

ASP878

13
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Diversidade Molecular

Tabela 2 (continuação)

XP Dock dG MMGBSA interações

composto Diagrama de Interação 2D
pontuação (Kcal/ Ligar (Kcal/
toupeira) toupeira)

Docking molecular de precisão extra para DKK1 (ID do PDB: Chain X_3S2K)

ZINC33832403 (Gifrin Man) 11.155 48,53 H-Bond: SER192, CYS201,

LYS208, HIE229, THR221

Hidrofóbico: LEU190, CYS200,

CYS201, ALA202, CYS220,
CYS237, TYR238, CYS245
Polar: SER192, THR221, HIS223,
HIE229, GLN235

Positivo carregado: ARG191,

ARG203, LYS208, LYS222,
ARG236

ZINC000013385490 ÿ9.972 34,28 H-Bond: THR221, HIS223,

(ácido quebólico) HIE229, GLN235, ARG236,
CYS239

Ponte de sal: LYS222

Hidrofóbico: LEU214, CYS220,
CYS237, TYR238, CYS239,
CYS245

Polar: THR221, HIS223, HIE229,

GLN235

Negativo carregado: LYS222,

ARG236

Docking molecular de precisão extra para GSK-3ÿ (ID do PDB: 1Q5K)

ZINC33832403 (Gifrin Man) ÿ10.344 34,91 H-Bond: ASP133, LYS183,

ASN186, ASP200

Hidrofóbico: ILE62, PHE67,

VAL70, ALA83, VAL110,
LEU132, TYR134, VAL135,
LEU188, CYS199
Polar: SER66, GLN185, ASN186

Negativo carregado: ASP133,

ASP181, ASP200

Positivo carregado: LYS85,

LYS183

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Diversidade Molecular

Tabela 2 (continuação)

XP Dock dG MMGBSA interações

composto Diagrama de Interação 2D
pontuação (Kcal/ Ligar (Kcal/
toupeira) toupeira)

ZINC3881558 (Morin) ÿ9.427 41,27 H-Bond: VAL135

Hidrofóbico: ILE62, VAL70,

ALA83, VAL110, LEU132,
TYR134, VAL135, PRO136,
LEU188, CYS199,
Polar: THR138

Negativo carregado: ASP133,

GLU137, ASP200

Positivo carregado: LYS85,

ARG141

Docking molecular de precisão extra para WIF1 (ID do PDB: 2YGO)

ZINC33832403 (Gifrin Man) ÿ13.546 ÿ53,75 H-Bond: PRO78, THR167

interação ÿ–ÿ : PHE89, PHE173
Hidrofóbico: LEU38, ILE40,
LEU48, ILE49, ILE57, MET63,
PHE70, MET77, PRO78, ILE80,
MET87, PHE89, PHE138,
VAL136, PHE150, VAL152,
VAL154, PRO168, PHE173,
Polar: THR167

ZINC103539689 ÿ12.667 60,85 interação ÿ–ÿ : PHE173

Hidrofóbico: LEU38, ILE40,

LEU48, ILE49, ILE55, ILE57,
MET63, PHE66, PHE70,
MET77, PRO78, ALA79, ILE80,
MET87, PHE89, PHE103,
VAL136, PHE138, PHE150,
VAL152, VAL154, PRO168,
PHE173, PHE174
Polar: THR167

Positivo carregado: ARG76

TYR706A, GLU708A e TRP767A de LRP6 resultaram na redução da
ligação a DKK1 sugerindo o papel direto desses resíduos na
participação com a interação DKK1.
Os resíduos GLU663, ILE681, TYR708, ASP748, SER749,
ARG751, TRP767, GLY769, ARG792, ASN 794, LEU810, ASP811,
ASP830, TRP850 e MET877 de LRP6 estão envolvidos na interação
com a proteína DKK1.
Grupos hidroxila na porção glicosil da mangiferina mostraram
as interações de ligação de hidrogênio com ASP668, LEU755,
TYR800 e grupos hidroxila e oxi ligados ao anel xantona da mangiferina
formaram interações de ligação H com GLU708, MET710, LEU753 e
THR797, indicando que a mangiferina se liga na mesma bolsa que a
de DKK1.
Da mesma forma, o composto calistegina apresentou uma
pontuação de encaixe de ÿ 10.487 kcal/mol com seus grupos
hidroxila formando ligações de hidrogênio com os resíduos LEU667,
MET710, LEU753, LEU838, ASP878, e o grupo amina do grupo
azabicicloctano da calistegina formou uma ponte salina com ASP878.
Os cinco principais compostos apresentaram pontuações dock na
faixa de ÿ10.694 a ÿ8.913 kcal/mol e energia de ligação livre de
ÿ44,19 a ÿ22,38 kcal/mol. Os dois principais compostos com
pontuação de doca, resíduos de interação e energia de ligação estão
listados na Tabela 2.
Interação molecular dos cinco
principais ligantes com a proteína Dickkopfÿ1 (DKK1)
DKK1 é uma proteína secretora extracelular com alta afinidade para
LRP6 e Kremen, promovendo endocitose de LRP6 seguida de sua
degradação tornando LRP6 indisponível para sinalização Wnt [44].
As proteínas da família Dkk incluem domínios ricos em cisteína
Dkk_N e Dkk_C que estão ligados a um ligante de cerca de 50
resíduos.DKK1, antagonista Wnt liga-se a ambos os sítios DKK1_N
a LRP6(1–2) e DKK1_C a LRP6(3–
4) [26]. Um estudo baseado em experimentos por Gregory et al.
relatou o segundo domínio rico em cisteína DKK_C

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compreendendo resíduos (CYS217-ARG237; CYS233-
CYS253) para estar envolvido na inibição da via de sinalização Wnt [45]. Com
base no experimento feito por Rismani et al., seleção de região no hotspot por
varredura de alanina dos resíduos do sítio de ligação GLN184, HIS204,
TRP206, ILE209, LYS211, VAL219, CYS220, THR221, LYS222, ARG224,
ARG236, ARG259 e LEU260 em DKK1 foi identificado para formar interação
com a proteína LRP6 [18]
Atualmente, em nosso estudo, o site top gerado pela ferramenta
sitemap com a melhor pontuação do site e Dscore incluindo os resíduos
importantes sugeridos pelo método experimental e computacional foi
selecionado para a triagem das fitomoléculas. A mangiferina apresentou um
escore de dock superior de ÿ11,15 kcal/mol entre todas as moléculas com
os grupos hidroxila em sua porção glicosil formando interações de ligação
das moléculas atingidas com a proteína, observamos que os resíduos VAL135 e ASP200 são ligações de hidrogênio comuns com os resíduos SER192, CYS201 e
LYS208.
Grupos hidroxila e grupos oxi do anel xantona formaram H e importante. As informações detalhadas das interações de ligação do ligante 2D com os
resíduos THR221 e HIE229.
O ácido quebólico, um composto fenólico isolado dos frutos maduros
de Terminalia chebula, apresentou o segundo maior índice de doca de
ÿ9.972 kcal/mol. Grupos hidroxila ligados ao anel isocromano de ácido
chebulic a partir de interações de ligação H com os resíduos HIE229,
GLN235, ARG236, THR221, grupo carboxil formaram interações de ligação
H com HIS223, CYS239 e formação de ponte salina com LYS222.
Foi encontrada interação com os resíduos THR221 e ARG236
comum na maioria das moléculas de maior sucesso. As informações
detalhadas da interação do ligante 2D, pontuação de encaixe e energia
de ligação de duas moléculas de maior sucesso estão listadas na Tabela 2.
Interação molecular de ligantes superiores com
proteína GSKÿ3ÿ
O envolvimento da GSK-3ÿ foi bem estabelecido em distúrbios
neuropatológicos, como deposição de amiloide, gliose e hiperfosforilação de
tau. Tideglusib, inibidor não competitivo da GSK3ÿ de ATP, completou a fase
II do ensaio clínico e foi reconhecido como um medicamento órfão para o
tratamento de tauopatia rara pela Food and Drug Administration (FDA). GSK-3ÿ
contém dois domínios principais: domínio N-terminal da fita ÿ que se estende
dos resíduos de aminoácidos 25-138 e um domínio ÿ-helicoidal do terminal C
com os resíduos 139-343. A interface desses dois
contém um sítio de ligação de ATP que é conectado por uma alça rica em
glicina e uma região de dobradiça. A bolsa de ligação de ATP envolve os
resíduos LYS85, GLU97, ASP113, TYR134, VAL135, THR138, ASN186,
LEU188, CYS199, ASP200 [46]. A estrutura cocristalizada de G-3ÿ com seu
inibidor AR-A014418 revela que as ligações do inibidor ocupam a região de
dobradiça junto com a bolsa de ATP através da formação de três hidrogênios
com o resíduo VAL135. A atividade catalítica da GSK-3ÿ é regulada pela
fosforilação nos resíduos SER9 e TYR216. Fosforilação do sítio SER9
13
Diversidade Molecular
inativa GSK-3ÿ, enquanto a fosforilação em TYR216 dentro da alça de
ativação aumenta sua atividade catalítica [47].
Atualmente, a triagem de fitoquímicos com estudo de docking
virtual para a enzima GSK-3ÿ resultou na identificação da mangiferina como a
molécula hit. Grupos hidroxila na porção glicosil da mangiferina mostraram
interação de ligação de hidrogênio com resíduos de aminoácidos LYS183,
ASP200 e interação de ponte salina com resíduo ASN186 com uma pontuação
XP de ÿ10.344 kcal/mol. O grupo hidroxila do anel xantona da mangiferina formou
uma ligação de H com o resíduo ASP133.
Morin, uma pentaidroxifavona tem sido comprovada como atividade
antioxidante, anti-hipertensiva e neuroprotetora.
O grupo hidroxila da morina apresentou duas interações de ligação de
hidrogênio com o resíduo de aminoácido VAL135. De
interação, pontuação de encaixe e energia de ligação das duas principais
moléculas de acerto estão listadas na Tabela 2, e as 5 principais moléculas
de acerto foram listadas no arquivo suplementar.
Interação molecular de moléculas hit com
proteína WIF1
WIF1 liga-se às proteínas Wnt, impedindo assim a ligação do receptor Wnt
Frizzled e inibindo a via de sinalização Wnt. WIF-1 consiste na região N-terminal,
domínio WIF (38-177 resíduos de aminoácidos), cinco domínios semelhantes a
EGF, cada um com 31-33 resíduos que se estendem de 178 a 338 resíduos e C
terminal hidrofílico. Com base na mutagênese sítio-dirigida, ensaios biofísicos e
in vitro baseados em células Malinasuskas et revelaram o envolvimento do
domínio WIF e
domínio EGF na ligação de Wnt. Seu estudo de mutagênese para revelar o
envolvimento de áreas no domínio WIF para reconhecimento de Wnt3a
descobriu que a mutação no resíduo MET77 foi
observado para mostrar uma diminuição de 10 vezes na afinidade de ligação
para Wnt3a [25].
No presente estudo, docking de fitomoléculas naturais
levou à identificação da mangiferina como a molécula hit apresentando
forte ligação com a proteína WIF1 com dock score de ÿ13.546 kcal/mol. O
resíduo glicosil da ligação de hidrogênio da mangiferina com o aminoácido
THR167 e o grupo hidroxila do anel xantona da mangiferina formaram a
ligação H com o resíduo PRO78, interação ÿ–ÿ com os resíduos PHE89 e
PHE167 do domínio WIF1. resíduo MET77
formaram a interação de fronteira e não-ligante para as moléculas mais
atingidas. Molécula ZINC103539689 mostrou doca
escore de ÿ12.667 kcal/mol e formou interação ÿ–ÿ com o resíduo PHE173.
Outras fitomoléculas acertaram mostrando energia de ligação estável de
ÿ34,70 a ÿ71,13 kcal/mol e escores de docking variando de ÿ12.680 a ÿ9.756
kcal/mol. As duas principais moléculas de acerto com os resíduos que interagem
estão listadas na Tabela 2.
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Diversidade Molecular

Fig. 2 Gráfico de desvio Complexo 1A: AChE + Mangiferina Complexo 1B: AChE + Baicalina
quadrático médio da raiz dos
ligantes top hit com proteínas
diferentes (AChE, LRP6, DKK1, GSK-3ÿ e WIF1)

Complexo 2A: LRP6 + Mangiferina Complexo 2B: LRP6 + Calistegina

Complexo 3A: DKK1 + Mangiferina Complexo 3B: DKK1 + ácido quebólico

Complexo 4A:GSK3ÿ + Mangiferina

Complexo 4B:GSK3ÿ + Morina

Complexo 5A:WIF1 + Mangiferina Complexo 5B: WIF1 + ZINC103539689

Análise MMGBSA para cálculo de
energia livre de ligação
A energia livre de ligação foi calculada e tabulada para todos os cinco
principais compostos das simulações de encaixe. As moléculas de topo
para AChE apresentaram energia de ligação na faixa de ÿ 34,53 a ÿ
57,34 kcal/mol. O amorfastilbol (ZINC5158604) apresentou a maior
energia de ligação de ÿ57,34 kcal/mol, seguido pela mangiferina de
ÿ52,65 kcal/mol.
mol que está tabelado na Tabela 2. Para a proteína LRP6, mangif erina
apresentou a maior energia livre de ligação de ÿ44,19 kcal/
mol, e a menor energia foi observada para o ácido rosamarínico de
ÿ0,33 kcal/mol. Para a proteína DKK1, o ginsenosídeo teve
a maior energia de ligação de ÿ 68,01 kcal/mol seguida pela
mangiferina com a energia de ligação de ÿ 48,53 kcal/
mol, e a menor energia de ligação foi para escutelareína de ÿ22,25
kcal/mol. Da mesma forma, para a proteína GSK-3ÿ a maior energia
de ligação foi mostrada pela curcumina, e pelo menos foi observada
para a mangiferina com a energia de ligação de ÿ34,91 kcal/
mol Por fim, o cálculo da energia de ligação para a proteína WIF1
apresentou a maior energia de ligação para a Curcumina (ÿ71,13 kcal/
mol) e a menor para a morina (ÿ34,70 kcal/mol).
Os detalhes da energia de ligação das 2 moléculas de maior sucesso
para cada proteína estão listados na Tabela 2. A análise da energia de
ligação para todas as moléculas de maior sucesso para diferentes
proteínas revelou que a mangiferina apresentou a maior energia de ligação

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Diversidade Molecular

Fig. 3 Contato proteína-ligante Complexo 1A: AChE + Mangiferina Complexo 1B: AChE + Baicalina
de ligantes top hit com diferentes
proteínas (AChE, LRP6, DKK1,
GSK-3ÿ e WIF1)

Complexo 2A: LRP6 + Mangiferina Complexo 2B: LRP6 + Calistegina

Complexo 3A: DKK1 + Mangiferina Complexo 3B: DKK1 + ácido quebólico

Complexo 4A:GSK3ÿ + Mangiferina Complexo 4B:GSK3ÿ + Morina

5B: WIF1 + ZINC103539689

Complexo 5A:WIF1 + Mangiferina complexo

para LRP6 e menor para GSK-3ÿ. No entanto, ele apresentou a maior
pontuação dock, portanto, para confirmação adicional da ligação e
estabilidade da mangiferina, realizamos um estudo de simulação de MD
para o complexo de mangiferina com todas as proteínas selecionadas
neste estudo atual.
Propriedades semelhantes a drogas das moléculas de maior sucesso
O sucesso e a descoberta de um novo fármaco não dependem
apenas da especificidade e seletividade do alvo, mas também das
propriedades farmacocinéticas. As moléculas de acerto selecionadas
para diferentes proteínas alvo foram analisadas usando o módulo
QikProp do conjunto Schrodinger. O peso molecular das moléculas de
acerto selecionadas estava entre 130,0 e 725,0. QPlogS é
a solubilidade aquosa prevista em mol dm-3 todos os com libras,
exceto nicotina, têm valores dentro da faixa aceitável de ÿ6,5–0,5.
QPlogPo/w predito coeficiente de partição octanol/água que é aceitável
entre ÿ2,0–+6,5 todos os compostos estão dentro do arranjo aceitável
mostrando equilíbrio hidrofóbico e lipofílico que é essencial para que a
droga seja absorvida pelo corpo e alcance o alcatrão obter site.
QPPCaco significa permeabilidade celular Caco-2 prevista, o que
significa permeabilidade da barreira sanguínea intestinal, apenas 5
compostos tridolgosir, buteína, scutellareína, curcumina e resveratrol
estavam na faixa aceitável. Todas as moléculas satisfizeram a regra dos
cinco de Lipinski. QPlogHERG é o valor de IC50 previsto para o bloqueio
do canal HERG K+, significando o potencial do composto para mostrar
toxicidade.

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Diversidade Molecular
A maioria das moléculas atingidas mostrou um valor aceitável para a
toxicidade HERG, exceto as moléculas ZINC5158604, ZINC100067274 e
ZINC103539689. A mangiferina tem um valor experimental de Log P de
+2,73 [48] que suporta sua permeabilidade sangue-cérebro. Todas as
propriedades farmacocinéticas previstas das moléculas top hit são tabuladas
em (Tabela Suplementar 1).
Simulação MD
A simulação MD é considerada uma ferramenta computacional
fundamental para analisar eventos dinâmicos de ligante-proteína com
plexos. A simulação MD tem várias vantagens sobre o encaixe do XP.
Ele supera o problema da natureza rígida da proteína no XP-docking
normal. Na simulação MD, a proteína-
complexo de ligantes é de natureza dinâmica e também permite
mudanças conformacionais de ligantes dentro do sítio ativo de uma proteína.
Esse fenômeno também mimetiza o cenário de um sistema biológico, onde
a estabilidade do complexo proteína-ligante é avaliada na fronteira simulada
da água.
Considerando a pontuação de encaixe, interações não-ligantes com
resíduos de aminoácidos vitais e energia de ligação, os dois principais
acertos foram identificados e selecionados para simulação de MD com
2YGO, 3S2K Cadeia A (LRP6), 3S2K Cadeia X (DKK1), 1Q5K e 4M0F. No
presente estudo, foi feita uma tentativa de avaliar seu potencial de ligação
com outros moduladores da sinalização Wnt e seu possível papel na DA.
O quadro foi tirado a cada 50 ps para o período de simulação
de 50 que resultou na geração de 1000 quadros e foi salvo na
trajetória. Com base nos resultados obtidos na simulação de MD, um
diagrama de interação de simulação foi gerado com o desvio quadrático
médio (RMSD) e uma proteína-
O gráfico de interação do ligante foi calculado para as proteínas
2YGO, 3S2K, 1QSK e 4M0F com o ligante mangiferina e o 2º ligante
top hit Figs. 2, 3. O gráfico RMSD e Ligand ft ajudam a estimar a
estabilidade do complexo ligante-proteína. No estudo atual, a simulação MD
do ligante de mangiferina e da molécula de 2º hit do estudo de docking foi
realizada para cinco complexos ligante-proteína, a saber, Complexo 1A:
AChE + Mangiferina, Complexo 1B: AChE+Baicalin; Complexo 2A:
LRP6+Mangiferina, Complexo 2B: LRP6+Calistegina; Complexo 3A: DKK1
+ mangiferina, Complexo 3B: DKK1 + ácido quebúlico; Complexo 4A: GSK3ÿ
+ mangiferina, Complexo 4B: GSK3ÿ + Morina; e Complexo 5A:WIF1 +
Mangiferina, Complexo 5B:WIF1+ZINC103539689.
Análise de simulação de MD para moléculas top hit para
proteína AChE
O complexo 1A foi inicialmente estável por 0–24 ns, mas a deriva
posterior foi observada por 24–50 ns. Os valores médios de RMSD
para AChE e mangiferina foram de 2,4 Å e 0,9 Å, respectivamente. Valores
de RMSD de proteína e
ligando foram encontrados dentro do intervalo para o complexo 1A.
No complexo 1A, as interações polares com SER203 e HIS447 foram
retidas e perdidas com THR75. Nova interação de ligação hidrofóbica foi
observada com PHE295, retida com TYR337 e TYR341 e perdida com
outros aminoácidos como
comparado ao encaixe do XP. As interações negativas carregadas foram
retidas e foram perdidas com ASP74 e GLU202. novo
A interação de empilhamento ÿ–ÿ foi observada com TYR341 e perdida com
TRP286. Interações de ligação H com SER203 e
HIS447 foram retidos e foram perdidos com TYR72. Novo H
interações de ligação foram encontradas com ASP74, PHE295 e
GLY122. O Complexo 1B foi estável ao longo da simulação de 50 ns RMSD
da proteína e do ligante que foi inferior a 2 Å. As interações de ligações de
hidrogênio, como PHE295, ASP74, que foram vistas na pose de encaixe
do XP, foram mantidas e a nova ligação ASP72 foi formada durante a
simulação de MD.
O TYR341, que mostrou a interação do hidrogênio na pose de encaixe do
XP, foi alterado para um tipo de interação ÿ–ÿ no MD. O novo tipo de
interação ÿ–ÿ com TRP86, TYR337 e TYR124 foi observado durante a
simulação de MD.
Na acetilcolina esterase, os aminoácidos TRP86, TYP286 e TYR341,
SER293, TYR72 e TYR124 desempenham um papel crítico na inibição
da enzima [28]. Em nosso estudo, o Complexo 1A mostrou interação
apenas com TYR341 tanto na docking XP quanto na simulação MD. O
complexo 2B mostrou interação com TRP286, TYR341 tanto na docking XP
quanto na simulação MD, e uma nova interação com TYR72, TYR124 foi
formada na simulação MD que é essencial para a inibição da AChE. A partir
de
isso, ficamos sabendo que o complexo 2B interage com o resíduo
chave; portanto, a baicalina tem mais potencial para inibir a enzima
AChE do que a mangiferina.
Análise de simulação de MD para moléculas top hit para
proteína LRP6
No complexo 2A, a deriva inicial foi observada para 0-8 ns; eventualmente,
o complexo ligante-proteína foi estabilizado para o período de simulação
de 50 ns. Além disso, no complexo 2A, um desvio foi observado entre 13-17
ns. O valor RMSD
de proteína e ligante para o complexo 2A foi de 2 Å dentro de uma faixa
aceitável (1-3 Å). As interações de ligação H foram retidas com ASP668,
LEU755, TYR480, MET710 e THR797, que mostraram novas interações
com ALA 881, ARG886, VAL712, LEU796, ASP878, MET877, ASN794,
ILE798 e THR839, e perdidas com GLU708 e LEU573 em complexo 2.
Essas novas interações de ligação H podem contribuir para a estabilidade
adicional do complexo 2A. As novas interações da ponte de água foram
encontradas com os aminoácidos VAL881, ARG886, VAL712, TYR800,
MET710, ILE798, THR839 e ASP668, em comparação com as poses
ancoradas do XP. As interações hidrofóbicas foram encontradas com
VAL881, retidas com MET710, VAL712, LEU755, LEU796, TYR800, MET877,
LEU880 e ILE798, e perdidas com outros aminoácidos. o
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interações polares foram retidas com ASN794, THR797, THR839
e perdidas com GLU840 e GLU887. A interação positiva carregada
com ARG886 foi retida na simulação MD. A nova interação negativa
carregada foi encontrada com GLU708 retendo outras interações. Vários
estudos in vivo comprovaram o benefício da mangiferina na melhora da
memória com base na atividade anti-inflamatória e acetilcolinesterase
[49, 50]. O complexo 2B era estável de 0 a 35 ns mais tarde após 35 ns
de flutuação em proteína e ligante. A interação da ligação de hidrogênio
vista no encaixe do XP com MET710, ASP878, LEU667 foi mantida na
simulação MD.
A interação com ASP838, LEU753 que foi vista no encaixe do XP
não foi vista no MD, mas uma nova interação com LEU796, ASP668 foi
formada na simulação MD.
Depois de comparar o gráfico RMSD para ambos os ligantes,
concluímos que o gráfico RMSD para o complexo mangifer-LRP6 foi mais
estável com menos flutuação indicando a ligação forte e boa ao longo da
duração da simulação.
Em interações LRP6 com aminoácidos GLU663, ILE681, TYR708,
ASP748, SER749, ARG751, TRP767, GLY769, ARG792, ASN794,
LEU810, ASP811, ASP830, TRP850 e MET877 são importantes. No
entanto, a ocorrência das interações com esses resíduos estava
faltando para ambos os ligantes na simulação atual de MD.
Análise de simulação de MD para moléculas top hit para
proteína DKK1
O complexo 3A foi estável por 22–28 ns, 31–36 ns, 38–41 ns, Portanto, os achados deste estudo indicam que o complexo 3B é e 46–49 ns, e a
deriva foi observada por 0–22 ns, 28–31 mais estável em comparação com o complexo 3A, como
ns. Os valores
encontrado para ser 10,5 Å e 7,5 Å, para proteína e ligante,
respectivamente. No complexo 3A, as interações polares foram retidas
com HIS223 e THR221 e perdidas com HIS229, SER192 e GLU235. A
formação de novas ligações de H foi observada com
HIS223, CYS237 e CYS239, retidos com THR221 e perdidos com
SER192, CYS201, LYS208 e HIS229.
As interações hidrofóbicas foram mantidas com TYR238 e CYS237,
enquanto perdidas com outros aminoácidos. Nova interação hidrofóbica
foi observada com CYS239 e interação do tipo ponte de água com
CYS237 e CYS239.
A interação positiva carregada foi perdida com ARG191, ARG203,
LYS208, LYS222 e ARG236, em comparação com as interações do
ligante XP. O complexo 3B foi estável por 5–15 ns e a deriva foi
observada por 0–5 ns e 15–50 ns. Proteína e
o ligante apresentou valores de RMSD de 14 Å e 10 Å, respectivamente.
Durante a simulação de MD, novos tipos de interações hidrofóbicas
e de ponte de água foram formados com ILE247 e perderam outras
interações hidrofóbicas em comparação com o encaixe XP.
Da mesma forma, novas interações polares foram formadas com
HIS261 e perderam outras interações polares. Novas interações de ligação hidrofóbica foram retidas com LEU188, PRO136, VAL135 e
cátions ÿ–ÿ foram observadas com ARG246 e ARG224 em comparação com ILE62 e perdidas com CYS199, VAL110, ALA83, LEU132, TYR134 e
Interações de encaixe do ligante XP. carregado negativo
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Diversidade Molecular
a interação foi perdida com ARG236, e interações ativas
negativas recém-carregadas foram observadas com LYS249,
ARG224, ARG259, LYS222 e ARG246. Além disso, foram
observadas interações do tipo ponte de água com os resíduos de
aminoácidos ARG259, HIS261, LYS222 e ILE247. O tipo de interação
da ponte salina com LYS222 é retido na simulação de MD em
comparação com as interações de encaixe do ligante XP.
Com base em relatórios anteriores, os resíduos de aminoácidos CYS217-
ARG237 e CYS233-CYS253 comprometem o domínio rico em
cisteína e é importante para a inibição da via de sinalização Wnt [45]. A
partir desta região no complexo 3B, HIS223, THR221, CYS237, THR238
e THR239 estavam presentes na simulação de MD. Interação com
outros aminoácidos como
como GLN235, ARG236, CYS245, CYS220, LYS222 e LYS229
foi perdido nas interações de ligante da simulação MD em comparação
com o encaixe do XP. No complexo 3B, os resíduos de aminoácidos
ARG2224, LYS222, LYS249, ARG246 e ILE247 estavam presentes na
simulação de MD, enquanto alguns resíduos de aminoácidos, como
CYS220, ARG236, GLN235, HIS229, HIS223, LYS222, THR221, CYS237,
e LYS245 com
TYR238, LYS239 estavam perdido na simulação MD em ,comparação
o encaixe XP. Em nosso estudo, o complexo 3A mostrou interação com
THR221 em ambas as interações de ligantes de XP docking e simulação
MD, enquanto LYS222 e ARG236 estavam presentes apenas no XP
docking e perdidos na simulação MD. No complexo 3B, o aminoácido
LYS222 esteve presente em interações ligantes de XP docking e simulação
MD, enquanto ARG224 e ARG259 foram encontrados apenas em
interações ligantes de simulação MD.
a maioria
de RMSD foramdos ns, 36–38 ns, 41–46 ns e 49–50
aminoácidos cruciais estão presentes no complexo 3B.
Análise de simulação de MD para moléculas top hit para
proteína GSKÿ3ÿ
No complexo 4A, a flutuação inicial foi observada por 0-15 ns, o
complexo se estabilizou por 15-27 ns, e a deriva posterior foi observada
por 27-50 ns. No complexo 4A, a interação H-bond foi retida com ASP133
e perdida com LYS183, ASN186 e ASP200. A nova interação da ligação
H foi
encontrado com VAL135 em comparação com o encaixe do XP. As
interações hidrofóbicas foram retidas com VAL70, ALA83, LEU188 e
VAL135 e perdidas com outros aminoácidos. Todas as interações positivas
carregadas foram perdidas na simulação MD em comparação com o
encaixe XP. As interações negativas carregadas foram perdidas com
ASP181 e ASP200 e retidas com ASP133.
O complexo 4B possui o valor RMSD 2 Å e 1,50 Å.
No complexo 4B, a diferença entre os valores de RMSD não foi
superior a 3 Å, o que indica que o complexo 4B é estável.
Em comparação com o encaixe de XP, as interações de
VAL70. Resíduos de aminoácidos PRO136 e
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Diversidade Molecular
VAL135 também mostrou o tipo de ponte de água e interações de
ligação de hidrogênio. As interações positivas carregadas com ASP200
são retidas, e novas interações de ligação de hidrogênio e ponte de
água foram observadas com ASP200 em comparação com interações
de encaixe de ligante XP. A interação polar foi perdida com o THR138
em comparação com o encaixe do XP, e novas interações polares e de
ligação de hidrogênio foram observadas com o ASN64.
A interação negativa com carga semelhante foi mantida com
ARG141 na simulação MD, e o resíduo de aminoácido ARG141
também mostrou interação de ligação de hidrogênio em comparação
com o encaixe XP.
Na proteína GSK-3ÿ, o inibidor cocristalizado mostrou
que inibe a região de dobradiça do bolso junto com o ATP
através da formação de três ligações de hidrogênio com o resíduo
VAL135 [46]. Em nosso estudo, o complexo 4A mostrou interações
com VAL135 e LEU188 em interações de ligantes de simulação MD
em comparação com XP docking. Da mesma forma, para o complexo
4B, as interações com os resíduos chave VAL135, LEU188 e ASP200
foram retidas na simulação MD. Além disso, o gráfico RMSD foi mais
estável com menos flutuações para o complexo 4B em comparação
com o complexo 4A.
Análise de simulação de MD para moléculas top hit para
proteína WIF1
O gráfico RMSD de diferentes proteínas e mangiferina é mostrado
na Fig. 2. O complexo 5A mostrou-se estável por 6 ns e um desvio
posterior foi observado por 6 a 50 ns no complexo ligante-proteína. O
valor de RMSD da proteína foi de 5,2 Å e o ligante foi de 2,0 Å. Durante
a simulação MD de 50 ns do complexo 5A, a interação polar com THR167
foi mantida em comparação com as interações ligante-proteína de XP.
As interações H-bond foram mantidas com THR167 e perdidas com
PRO078.
Da mesma forma, interações ÿ–ÿ com PHE173 foram retidas e
perdidas com PHE89. As interações de ligações hidrofóbicas foram
retidas com PHE89, MET63 e LEU48 e perdidas com outros aminoácidos.
Além disso, interações de ponte de hidrogênio e água foram observadas
com MET63. Para o complexo 5B inicialmente, a proteína não era
estável até 15 ns após ter estabilizado até o final da simulação. O ligante
RMSD que 4 Å ao longo da simulação mostrando que não mudou muito
ao longo da simulação. A interação da ligação de hidrogênio com o
PHE173 foi mantida tanto na docking XP quanto na simulação MD.
Novas interações com PRO173, PHE174, PHE66 e VAL154 foram
observadas em simulações de MD. Em WIF1
proteína, MET77 é um importante resíduo de aminoácido. O
envolvimento do domínio WIF (38-177 resíduos de aminoácidos) e
do domínio EGF foi observado na ligação de proteínas Wnt. Em nosso
estudo, tanto no complexo 5A quanto no complexo 5B não foram
observadas interações com MET77.
No entanto, o gráfico RMSD para o complexo 5B mostrou
menos desvio em RMSD entre ligante e proteína durante a simulação
em comparação com o complexo 5A Fig. 3.
Conclusão
A sinalização Wnt desempenha um papel importante no processo
de crescimento celular, proliferação, embriogênese e organogênese.
O banco de dados fitoquímicos foi considerado para triagem de seu
potencial para modular marcadores da via de sinalização Wnt.
Diferentes proteínas (a saber, LRP6, DKK1, WIF1, GSK-3ÿ) ligadas
à via de sinalização Wnt e AChE foram selecionadas para explorar a
afinidade de ligação, interações das fitomoléculas selecionadas e
virtualmente seu potencial para regular a sinalização Wnt. O ligante
de entrada foi considerado para a geração da grade para simulação
de docking no caso das proteínas GSK-3ÿ e AChE, enquanto um
possível bolso de ligação de drogas previsto pela ferramenta sitemap foi
escolhido para geração de grade para as proteínas LRP6, DKK1 e WIF1.
Com base no encaixe molecular computacional, as cinco principais
moléculas foram selecionadas para cada proteína alvo. As duas principais
moléculas foram escolhidas para análise adicional de sua ligação e
estabilidade usando simulação MD.
Em todas as proteínas, verificou-se que a mangiferina tem o maior
acoplamento, bem como interações de ligação com os principais
resíduos de aminoácidos. Para a proteína AChE, embora a mangiferina
tenha mostrado uma alta pontuação de dock de ÿ14.205 kcal/mol com
o anel de xantona formando interação de empilhamento ÿ–ÿ com o
principal resíduo de interação TRP286, a 2ª molécula de hit baicalina
com uma pontuação de dock de ÿ13.224 kcal/ mol mostrou um RMSD
estável ao longo da simulação e exibiu interações de empilhamento ÿ–
ÿ com TRP286 e TRR341 durante todo o período de simulação MD.
Isso mostra a possibilidade de Baicalin ser uma molécula potente com
ligação forte e estável do que a mangiferina para a proteína AChE.
Com a proteína DKK1, man giferin mostrou a pontuação mais alta de
ÿ11.155 kcal/
mol, mas o ácido chebulic mostrou interações estáveis em simulações
MD com interações importantes com os principais resíduos ARG224,
LYS222 e ARG259. Com a proteína WIF, o desvio no RMSD do
ligante e da proteína foi maior para mangiferina e menor para
ZINC103539689 indicando ligação mais estável na simulação de MD3
para ZINC10539689.
Para a proteína GSK-3ÿ morina, com uma pontuação de ÿ9,42 kcal/
mol mostrou RMSD estável ao longo da simulação de MD em
comparação com a mangiferina, embora tivesse uma pontuação de
doca de ÿ10.344 kcal/mol. No caso da proteína LRP6, a mangiferina
mostrou a pontuação de ancoragem mais alta, bem como RMSD
estável e interações com os principais resíduos durante a simulação
de MD em comparação com a calistegina da molécula de 2º hit.
A partir deste estudo in silico, relatamos que a mangiferina pode
ser uma molécula potencial visando a via de sinalização Wnt
modulando a atividade de LRP6, baicalina para atividade de AChE,
ácido chebulic para DKK1, ZINC103539689 para WIF1 e morina para
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proteína GSk-3ÿ. No entanto, a validação adicional da atividade é
garantida com base em experimentos in vivo e in vitro para melhor
compreensão e forte afirmação.
Informações Complementares A versão online contém material complementar
disponível em https://doi.org/10.1007/s11030-022-10395-8.
Agradecimentos Este trabalho foi apoiado por Grant 8-35/RIFD/
RPS-NDF/POLICY-1/2018-2019 do All India Council for Technical
Education, Nova Delhi, sob o esquema de Bolsa Nacional de Doutorado e
Financiamento Intramural da Manipal Academy of Higher Education, Manipal.
Os autores agradecem ao Manipal-Schrödinger Center for Molecular Simulations e
Manipal College of Pharmaceutical Sciences, Manipal Academy of Higher Education,
Manipal, Índia, por fornecer a facilidade para realizar este trabalho de pesquisa.
Contribuições dos Autores SM envolvido na conceituação, modelagem in silico,
análise, interpretação dos dados e preparação do rascunho original.
RS participou da redação e edição do manuscrito. KP participou da curadoria,
revisão e edição de dados. GH envolvido na edição e revisão. HKB participou da
revisão e edição. CHM envolvido na modelagem in silico.
UYN participou da geração e supervisão de dados silico. KSRP participou da supervisão,
revisão e edição.
Financiamento Financiamento de acesso aberto fornecido pela Manipal Academy of
Higher Education, Manipal. Este trabalho foi financiado pelo AICTE através da
concessão de bolsa RPS-NDF 8–35/RIFD/RPS-NDF/POLICY-1/2018–19 e bolsa sob
um esquema de National Doctoral Fellowship.
declarações
Conflito de interesse Os autores declaram não haver conflito de interesse potencial.
Consentimento para publicação Todos os autores forneceram consentimento
explícito para a publicação do artigo.
Acesso Aberto Este artigo está licenciado sob uma Licença Creative Commons
Atribuição 4.0 Internacional, que permite o uso, compartilhamento, adaptação,
distribuição e reprodução em qualquer meio ou formato, desde que você dê os
devidos créditos ao(s) autor(es) original(is) e à fonte, fornecer um link para a licença
Creative Commons e indicar se foram feitas alterações. As imagens ou outros
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licença, visite http://creativecommons.org/licenses/by/4.0/.
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Nota do editor Springer Nature permanece neutro em relação a reivindicações jurisdicionais em
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