UNIVERSIDADE ESTADUAL DE CAMPINAS

FACULDADE DE CIÊNCIAS APLICADAS

Efeito do exercício físico crônico sobre o metabolismo de

NAD+ e sobre a UPRmt no fígado de camundongos.

Saulo Gabriel do Nascimento Della Coleta

Projeto de Pesquisa apresentado

à Fundação de Amparo à Pesquisa

do Estado de São Paulo – FAPESP

Limeira – 2020
 1. Resumo
O acúmulo de gordura hepática é um fenômeno frequentemente observado em
pacientes obesos e pode desencadear desordens metabólicas como inflamação, disfunção
mitocondrial, resistência à insulina, podendo levar a esteatose hepática e cirrose. Estudos
pré-clínicos demonstraram que o tratamento oral a base de precursores de NAD+, é capaz
de estimular o mecanismo da UPRmt (mitochondrial unfolded protein response),
recuperando a função mitocondrial e hepática em modelo de doença hepática gordurosa
não alcoólica (NALFD) , demonstrando que o metabolismo de NAD+ e a ativação da
UPRmt podem ser promissores na prevenção e no tratamento do acúmulo de gordura no
fígado. Sabidamente, o exercício físico é um estimulador fisiológico para a síntese de
NAD+. Além disso, recentemente demonstramos que o exercício estimula diversos
marcadores da UPRmt e aumenta a função mitocondrial no músculo esquelético.
Portanto, o objetivo deste projeto será avaliar o efeito de exercício físico aeróbio sobre o
conteúdo de NAD+ e sobre os marcadores da UPRmt em no tecido hepático de
camundongos suscetíveis ao desenvolvimento de doença hepática gordurosa não
alcoólica (NALFD).
Palavras-chave: NAD+, UPRmt, Exercício, Fígado, Mitocôndria.
 2. Introdução
A doença esteatótica não alcoólica do fígado (NAFLD, do inglês nonalcoholic
fatty liver disease) é a causa mais comum de doenças crônicas no fígado de indivíduos
obesos e sua prevalência continua a crescer em todo o mundo1. A NAFLD, possui estreita
relação com a resistência à insulina, disfunção mitocondrial, inflamação, aumento da
gliconeogênese dentre outros 2. Nesse contexto, a lipotoxicidade hepática pode ser
considerada como um fenômeno crítico no desenvolvimento da NAFLD. A
lipotoxicidade é resultado do excesso de AGs no fígado, sobrecarregando as capacidades
hepáticas de oxidar, armazenar e exportar lipídeos, além de prejudicar as vias de
sinalização celular, causando disfunção celular, liberação de marcadores inflamatórios,
como o Tumor Necrosis Factor-α (TNF-α), e podendo levar a morte celular3,4. Portanto,
a NAFLD pode progredir até a esteato-hepatite não alcoólica (NASH, do inglês
nonalcoholic steatohepatitis), fibrose e finalmente cirrose5.
Dentre as causas da lipotoxicidade hepática, destaca-se a resistência à insulina. A
insulina atua no tecido adiposo branco (WAT) inibindo a lipólise e estimulando a
lipogênese, entre outras funções. Contudo, a resistência à insulina no WAT favorece a
lipólise e a liberação desordenada de ácidos graxos (AGs) não-esterificados na circulação.
Neste cenário, ocorre os AGs são, em grande parte, direcionados ao tecido hepático. Além
disso, a hiperinsulinemia relacionada com a resistência à insulina estimula a lipogênese
nesse órgão. Quadros de dislipidemia também possuem estreita relação com o
desenvolvimento da NAFLD. A presença de dislipidemia (hipertrigliceridemia,
hipercolesterolemia ou ambas) podem ser observadas em grande parte dos pacientes
diagnosticados com NAFLD6. A exposição crônica de células não adiposas a altas
concentrações de triacilglicerol ou colesterol causa efeitos tóxicos que contribuem para o
desenvolvimento de resistência à insulina hepática e NAFLD 7. O conteúdo de gordura
no fígado reflete o desequilíbrio entre o fluxo de AGL através da lipólise, oxidação de
ácidos graxos, lipogênese de novo e secreção de lipopoliproteínas de muito baixa
densidade (VLDL). Cabe destacar que a Apolipoproteína (Apo) E, é uma proteína que é
encontrada na maioria das lipoproteínas. Ela funciona como um ligante para receptores
que identificam quilomícrons e VLDL, o que possibilita a captação específica dessas
moléculas pelo fígado.
Camundongos com deficiência na produção dessa proteína (ApoE-/-) desenvolvem
hipercolesterolemia espontânea e aterosclerose8 e são mais suscetíveis a apresentar dano
hepático, pois apresentam elevado estresse oxidativo no fígado, aumento na expressão de
fatores pró-inflamatórios e pró-fibrogênicos, aumento da deposição de lipídeos e aumento
do dano hepatocelular9. Além disso, esses animais podem ser utilizados como modelo de
NAFLD quando alimentados com dieta ocidental (rica em gordura e açúcar), de modo
que apresentam alterações hepáticas severas como: esteatose macro e micro vesicular,
proliferação de macrófagos e nódulos inflamatórios10. Além disso, outro estudo
demonstrou que esses animais apresentaram esteatose e aumento dos níveis de ALT
(marcador de dano hepático) após serem alimentados durante 3 semanas com dieta rica
em gordura e açúcar1.

A NAFLD e a disfunção mitocondrial: O metabolismo do NAD e a

UPRmt
As mitocôndrias são organelas especializadas nos processos de respiração celular
e produção de energia. Isso acontece principalmente na cadeia transportadora de elétrons
(CTE). A baixa capacidade oxidativa por parte das mitocôndrias nos hepatócitos pode
contribuir de maneira significativa para o excesso de gordura no fígado. Um consistente
acumulado de estudos destaca a disfunção mitocondrial hepática como um fenômeno
intracelular crítico para o desenvolvimento da NAFLD. A capacidade respiratória de
mitocôndrias obtidas a partir de amostras de fígado de camundongos em modelo
experimental de NAFLD induzida pelo consumo de dieta rica em gordura e açúcar1. Além
disso, o desenvolvimento da NAFLD estimula a formação excessiva das espécies reativas
de oxigênio (ERO), reduz do conteúdo de algumas proteínas dos complexos da cadeia
respiratória e promove até mesmo anormalidades na morfologia das mitocôndrias dos
hepatócitos11–13.
Recentemente, o metabolismo de NAD+ (do inglês, nicotinamide adenine
dinucleotide) tem sido investigado na etiopatogenia da NAFLD. Inicialmente vejamos em
detalhes os mecanismos endógenos envolvidos na biossíntese de NAD + e em seguida
entenderemos a sua relação com a NAFLD.
A molécula de NAD+ é um cofator que atua em reações metabólicas distintas e
serve como substrato para diversas enzimas, como por exemplo as enzimas dependentes
de NAD, com destaque para as sirtuínas, as poli ADP-ribose polimerases (PARP) e as
ADP-ribose sintase cíclicas (cADPR), como CD38 e CD137. As moléculas de NAD+
intracelular podem ser produzidas a partir do aminoácido triptofano ou por meio de
moléculas precursoras como: nicotinamida (NAM), ácido nicotínico (NA), e ribosídeo de
nicotinamida (NR). Vejamos como ocorre cada uma das vias de síntese de NAD+.
A síntese de NAD+, através da molécula precursora NAM, ocorre em uma via que
contém apenas duas etapas: primeiro a NAM é convertida em NMN (mononucleotídeo),
pela ação da nicotinamida fosforribosiltransferase (NAMPRT), e depois é convertida em
NAD+ numa reação catalisada pela nicotinamida mononucleotídeo adenililtransferase
(NMNAT)14. Existem três isoformas diferentes de NMNAT, podendo ser encontradas em
diferentes compartimentos celulares. A NMNAT1 é uma enzima nuclear, a NMNAT2
localiza-se no complexo de Golgi e no citosol e a NMNAT3 pode ser encontrada na
mitocôndria e no citosol. A biossíntese de NAD+ também ocorre pela conversão de NR
em NMN pela nicotinamida ribose quinase (NRK). Outra via, também conhecida como
via Preiss-Handler, mostra a síntese de NAD+ a partir da NA. Nela, o NA é convertido
em NA mononucleotídeo (NAMN), que pela ação da NMNAT, é convertido em NA
adenina dinucleotídeo (NAAD), a qual forma o NAD+ em uma reação catalisada pela
NAD sintase (NADS) 14,15.
A síntese de NAD+ a partir do triptofano é uma via composta de oito etapas.
Primeiro o triptofano é convertido em N-formilquinurenina, reação que, em mamíferos,
pode ser catalisada por duas enzimas: triptofano-2,3-dioxigenase (TDO) e indoleamina-
2,3-dioxigenase (IDO). Depois, a N-formilquinurenina é convertida pela formamidase
(KFase) em quinurenina, que forma a 3-OH quinurenina pela ação da enzima quinurenina
3-hidroxilase. Então, a quinureninase (Kyase) forma 3-hidroxiantranilato, que é
transformado em a-amino-b-carboximuconato-e-semialdeído (ACSM) pela 3-
hidroxiantranilato 3,4-dioxigenase (3HAO). A ACSM, por sua vez, é convertida em ácido
quinolínico (QA) o qual forma NAMN numa reação catalisada pela quinolinato
fosforibosiltranferase (QPRT). A NAMN então entra na via Preiss-Handler, que continua
até formar NAD+14,15.
 Figura 1. Figura ilustrativa das vias de síntese de NAD+

Postula-se que o metabolismo de NAD+ exerça papel de destaque no

desenvolvimento da NALFD. Gariani e colaboradores observaram uma queda
significativa dos níveis intracelulares de NAD+ no fígado de camundongos obesos com
NAFLD1. Para determinar se a recuperação dos níveis de NAD+ poderia exercer algum
efeito no desenvolvimento da NAFLD, os autores realizaram a suplementação oral com
um precursor de NAD+, um derivado da vitamina B3, o ribosídeo de nicotinamida (NR)
durante 8 semanas. De maneira interessante, o NR recuperou os níveis de NAD+, a função
mitocondrial e o metabolismo hepático em camundongos 1. Resultados similares foram
observados quando os níveis de NAD+ hepático foram restaurados pelo uso de um
inibidor farmacológico da PARP116,17. Mecanisticamente, o aumento dos níveis de NAD+
no tecido hepático estimulou a atividade da SIRT1 e desencadeou diversos marcadores
da UPRmt (do inglês mitochondrial unfolded protein response). Esse efeito foi
acompanhado do aumento da β-oxidação hepática, conteúdo de proteínas que compõem
os complexos mitocondriais, aumento da capacidade respiratória das mitocôndrias e
redução de diversos marcadores inflamatórios como: TNFα, Mcp, Vcam, IL-6 e IL-1β1.
A família das sirtuínas é constituída por sete moléculas deacetilases que podem
atuar no núcleo (SIRT1, SIRT6 e SIRT7), no citoplasma (SIRT2) e na mitocôndria
(SIRT3 a SIRT5). A atividade dessas moléculas é diretamente afetada pela quantidade de
NAD+ disponível na célula, permitindo uma fina regulação do metabolismo através da
desacetilação de diversos reguladores metabólicos relacionados com a homeostase
mitocondrial18. Portanto, a atuação das sirtuínas, em particular a SIRT1, é determinante
para a ativação no processo de UPRmt, uma vez que camundongos obesos com ausência
de SIRT1 especificamente no fígado (Sirt1hep-/-), não apresentaram qualquer benefício no
metabolismo hepático em resposta ao aumento do conteúdo de NAD + decorrente do
tratamento com inibidor da PARP116. A seguir descreveremos a importância da UPRmt
para o funcionamento das mitocôndrias.

A UPRmt e o metabolismo mitocondrial

Cerca de 1500 proteínas mitocondriais são codificadas pelo DNA nuclear
(DNAn), enquanto o DNA mitocondrial (DNAmt) codifica apenas 13 delas. Portanto, a
proteostase mitocondrial necessita de complexos e sofisticados mecanismos de
comunicação e transporte entre as mitocôndrias e o DNAn 19. Como exemplo, podemos
citar a cadeia transportadora de elétrons, que é formada por cinco complexos proteicos,
cujas proteínas são codificadas, na sua maioria, pelo DNAn, portanto o equilíbrio na
produção dessas proteínas tanto pelo DNAn como pelo DNAmt é fundamental para a
formação desses complexos e consequentemente para a produção de energia 19.
Contudo, em situações de estresse, a proteostase mitocondrial pode ser
prejudicada. Dependendo da magnitude, o estresse pode impor danos significativos às
proteínas mitocondriais, principalmente por induzir o acúmulo de proteínas mal
20
formadas, e, portanto, pouco funcionais. . Em situações como essa, a UPRmt
desempenha papel fundamental para reestabelecer a proteostase, garantindo a
funcionalidade das mitocôndrias21. Esse desequilíbrio entre proteínas codificadas pelo
DNAn e proteínas codificadas pelo DNAmt, que pode ser demonstrado pela razão
SDHA/MTCO1, é fundamental para a ativação da UPRmt. Moléculas como a ATFS1 em
c. elegans e a ATF5 em mamíferos desempenham o papel de identificar o desequilíbrio
da proteostase mitocondrial e sinalizar por meio de fatores de transcrição o DNAn. Em
seguida, genes que codificam proteases e chaperonas são ativados a partir do DNAn.
Assim, chaperonas como as proteínas de choque térmico (heat shock protein - HSP)
HSP10 e HSP60 e proteases como a ClpP (Caseinolytic Mitochondrial Matrix Peptidase
Proteolytic Subunit), a LONP1 (Lon protease homolog, mitochondrial), entre outras, são
importadas do citosol para o interior das mitocôndrias para que ocorra o reparo de
proteínas mal-formadas por ação das chaperonas ou a completa degradação dessas
proteínas por ação das proteases 22,23. Portanto, é notório que a manutenção da capacidade
de ativação da UPRmt é fundamental para a manutenção da homeostase mitocondrial.
Estudos demonstram que a capacidade de ativação da UPRmt é altamente conservada
entre diferentes espécies, sendo que a estimulação forçada da UPRmt é capaz de aumentar
inclusive a longevidade em nematóides20 e em camundongos 24
. A figura 2 ilustra
didaticamente a ativação da UPRmt através do aumento dos níveis de NAD+ (Figura 1).
O mecanismo pelo qual o aumento dos níveis de NAD+ e a estimulação da SIRT1
induz os marcadores da UPRmt ainda não é completamente conhecido, mas alguns
estudos mostram essa relação. Mouchiroud e colaboradores descreveram que a presença
do gene sir2.1 (SIRT1 em c. elegans) é necessária para a ativação da UPRmt em resposta
ao aumento dos níveis de NAD+20, assim como observado em camundongos16. Outro
estudo mostra que a UPRmt induzida pelo aumento nos níveis de NAD+ é dependente de
SIRT1. Camundongos Sirt1L2/L2 (deficientes para Sirt1 especificamente em hepatócitos),
não apresentaram alteração na razão SDHB/MTCO1 em resposta ao aumento dos níveis
de NAD+ após o tratamento com NR, diferente do grupo controle, que apresentou uma
redução na razão SDHB/MTCO1 e um aumento de marcadores da UPRmt (HSP10,
HSP60 E CLPP). Portanto, fica claro que a atuação da SIRT1 é fundamental para induzir
o desequilíbrio mitocondrial e, consequentemente, ativar o mecanismo de UPRmt no
tecido hepático1

Figura 2. Figura esquemática do mecanismo de UPRmt. 1. O aumento nos níveis de NAD+

estimula a proteína SIRT-1, responsável por desencadear o desequilíbrio mitonuclear, representado pela
redução da razão SDHA/MTCO1. 2. O desequilíbrio mitonuclear gera sinais intracelulares que ativam o
mecanismo de UPRmt. 3. A UPRmt gera adaptações na mitocôndria as quais causam uma melhora em sua
função, o que contribui para uma melhora global do metabolismo e, consequentemente, da saúde. 4. No
processo de UPRmt, são ativadas chaperonas (HSP10/60) e proteases (ClpP e LONP1) que são responsáveis
por redobrar proteínas malformadas ou degradá-las, respectivamente. 5. As proteínas, antes malformadas,
que não foram degradadas e puderam ser redobradas pelas chaperonas, podem agora entrar na mitocôndria
e exercer suas funções.
 O efeito do exercício físico sobre o mecanismo da UPRmt
Os efeitos do exercício sobre a função e especialmente sobre a biogênese
mitocondrial, são amplamente descritos na literatura 25,26. Contudo os efeitos do exercício
sobre a capacidade de ativação da UPRmt não são muito bem estabelecidos. Sabidamente,
o exercício é um potente estimulador das vias de síntese de NAD + em humanos27 e em
animais28. Memme e colaboradores descreveram que a contração da musculatura
esquelética induzida por estimulação elétrica aumentou a expressão gênica de Hsp10,
Hsp60, Clpp e Lonp1 em ratos29. Recentemente, descrevemos que tanto o exercício físico
de intensidade moderada, como o exercício de alta intensidade foram capazes de estimular
a UPRmt no músculo esquelético de camundongos idosos, aumentando o conteúdo
proteico de HSP60, Lonp1, e Yme1L1, recuperando a proteostase e melhorando diversos
aspectos relacionados à mitocôndria30,31.
Adicionalmente, descobrimos que a suplementação oral com o precursor de
NAD+, o NR, aumenta a performance aeróbia em camundongos 28. Coletivamente, esses
dados apontam que a estimulação da UPRmt parece ser importante para a melhora do
metabolismo muscular e que o exercício possui capacidade de estimular a UPRmt, pelo
menos na musculatura esquelética. Contudo, os efeitos do exercício físico sobre a
capacidade de ativação da UPRmt no tecido hepático ainda são completamente
desconhecidos.

3. Hipótese
Mediante os dados apresentados, aventamos a hipótese de que o exercício físico
crônico poderia estimular um aumento dos níveis de NAD+, ativando a UPRmt no tecido
hepático, sendo capaz de prevenir a NAFLD em camundongos hipercolesterolêmicos
(Apo E-/-), alimentados com dieta hiperlipídica.

4. Justificativa
Estudos anteriores mostram que a elevação dos níveis de NAD +, por
suplementação com NR por exemplo, pode ser muito eficiente na prevenção e no
tratamento de doenças hepáticas, o que ocorre devido à ativação do mecanismo de UPRmt
mediado pela atividade das sirtuínas. Portanto, com a realização desse projeto, buscamos
avaliar se o exercício físico é eficiente em aumentar a síntese de NAD +, além de ser um
fator estressante para o organismo de modo a desencadear a UPRmt e, com isso,
contribuir para uma melhora do metabolismo hepático em condições de susceptibilidade
ao desenvolvimento da NAFLD em modelo pré-clínico.

5. Objetivos
5.1. Objetivo geral
Avaliar os efeitos do treinamento físico aeróbio sobre o metabolismo de NAD+ e
sobre os marcadores da UPRmt no tecido hepático de camundongos Apo E-/- alimentados
com dieta hiperlipídica.

5.2. Objetivos específicos

• Avaliar os efeitos do treinamento físico aeróbio sobre o metabolismo de NAD+
observando marcadores da sua via de síntese (NAMPT, NMNAT1, NMNAT3) e
proteínas consumidoras de NAD+ (SIRT1, PARP1, CD38) no fígado de
camundongos Apo E-/- alimentados com dieta hiperlipídica.
• Avaliar os efeitos do treinamento físico aeróbio sobre o conteúdo proteico de
marcadores da UPRmt (HSP60, LONP1, Yme1L1 e ClpP) no fígado de
camundongos Apo E-/- alimentados com dieta hiperlipídica.
• Investigar os efeitos do treinamento físico aeróbio sobre a biogênese mitocondrial,
avaliando o conteúdo de marcadores Pgc1a, Tfam e Nrf1 no fígado de
camundongos Apo E-/-.
• Investigar os efeitos do treinamento físico aeróbio sobre o desequilíbrio
mitonuclear, avaliando a razão SDHA/MTCO1 e Atp5a/MTCO1.
• Avaliar o efeito terapêutico do exercício sobre a expressão de Alt e Ast e sobre a
morfologia do tecido hepático em camundongos Apo E-/- alimentados com dieta
hiperlipídica.

6. Materiais e Métodos
6.1. Animais
Serão utilizados camundongos C57BL/6J machos, com 2 meses de idade,
provenientes do Centro de Bioterismo da UNICAMP (CEMIB) para o grupo controle
wild type, para os grupos controle APOE-/- e treinados APOE-/-, serão utilizados
camundongos C57BL/6J -Apo E -/- provenientes do Biotério do Laboratório de Biologia
Molecular e Hemostasia, Hemocentro/UNICAMP. Os animais serão previamente
pesados e alocados em gaiolas com cinco animais cada, expostos a ciclos de 12 horas
claro e 12 horas escuro, com temperatura entre 20ºC e 22ºC, onde receberão água e ração
padrão para roedores (da marca Nuvilab) (grupo wild type) ad libitum. Os animais APOE-
/-
serão alimentados com hiperlipídica, conforme descrito32, de modo que após 8 semanas
de consumo da dieta, o grupo treinado iniciará o protocolo de exercício. Antes de ser
iniciado, o projeto será submetido à avaliação do comitê de ética da UNICAMP.

6.2. Protocolo de Exercício físico

Para o protocolo de exercício, os camundongos do grupo Exercício serão

submetidos a quatro semanas de treinamento em esteira ergométrica, exercitados em
intensidade correspondente à máxima fase estável de lactato, conforme proposto por
Ferreira e colaboradores33. Previamente, os camundongos serão adaptados ao ergômetro,
visando minimizar o possível estresse induzido pelo equipamento.
Serão realizados um teste de potência máxima e um teste de exaustão antes e após
o protocolo de exercício, visando avaliar a eficácia do mesmo.

6.3.Reagentes e Anticorpos

Os reagentes e os aparelhos utilizados para o gel Sódio Dodecil Sulfato

(SDSPAGE) serão provenientes da Bio-Rad (Richmond, CA). Os compostos Tris
Hidroximetil Aminometano (TRIS), Fenilmetil Sulfonil Fluorido (PMSF), Aprotinina e
Ditiotreitol (DTT) serão provenientes da empresa Sigma Chemical Co. (St. Louis, MO).
A membrana de nitrocelulose (BA85, 0,2m) usada será proveniente da empresa Biorad.
Serão utilizados os anticorpos anti-OXPHOS (coquetel de subunidades mitocondriais),
antiNMNAT1, antiNMNAT3 e antiClpP, provenientes da empresa ABCAM; anti-Hsp60
e anti-PBEF1 (NAMPT), provenientes da empresa Santa Cruz Biotechnology (Santa
Cruz, CA, USA); anti-Lonp1 e anti-CD38, provenientes da empresa BIOSS (Boston,
MA); anti-SIRT1 e anti-PARP1, provenientes da empresa Cell Signaling Technology e
anti-Yme1L1 da empresa PROTEINTECH.
 6.4. Procedimentos de Extração

Serão extraídas amostras do fígado dos animais, que serão posteriormente

homogeneizadas em tampão de extração (contendo 1% de Triton X 100, 100 mM de Tris
- pH 7,4, 100 mM de pirofosfato de sódio, 100 mM de fluoreto de sódio, 10 mM de
EDTA, 10 mM de ortovanadato de sódio, 2 mM de PMSF e 0,1 mg/mL de aprotinina a 4
ºC, reagentes da marca Sigma-Aldrich). Após os experimentos, os animais serão
sacrificados por aprofundamento de anestesia, seguido de deslocamento cervical. O
homogenato será centrifugado a 11.000 RPM por 30 minutos. Será determinada a
concentração de proteína na porção sobrenadante da amostra, utilizando o método de
Bradford. Em seguida, será acrescido o tampão de Laemmli a cada uma das amostras, que
serão fervidas por 5 minutos e armazenadas a -80° C para as análises de Western blotting.

6.5. Análise proteica por Western blotting

As amostras serão tratadas com tampão de Laemmli 34 contendo DTT 100 mM

(Sigma-Aldrich) e aquecidas em água fervente por 4 minutos. Em seguida, serão
aplicadas em gel de poliacrilamida (SDS-PAGE a 6%) no aparelho para minigel (Mini-
Protean®). Será utilizado como padrão um marcador de peso molecular com valores
estabelecidos em miosina (205-195 kDa), ß-galactosidase (116 kDa), albumina de soro
bovino (80 kDa) e ovalbumina (49,5 kDa).
A transferência das proteínas separadas no gel será feita eletricamente para uma
membrana de nitrocelulose, utilizando-se cubas de eletroforese da empresa Bio-Rad por
aproximadamente 2 horas, a 120 volts, como descrito por Towbin et al 197935. No
tampão, será acrescido 0,1% de SDS para melhorar a eluição das proteínas de alto peso
molecular. A ligação inespecífica de proteínas na membrana de nitrocelulose será
diminuída pela incubação destas com uma solução bloqueadora (leite desnatado 5%, Tris
10mM, NaCl 150 mM e Tween 20 0,02%, reagentes da marca Sigma Aldrich) à 4° C
overnight. As membranas serão posteriormente incubadas com 2 µL de anticorpo
secundário e, posteriormente incubadas com 2 mL de solução de quimioluminescência
(Pierce, CA). A reação do anticorpo secundário com a solução quimioluminescente será
detectada e visualizada com o uso de autorradiografias e/ou fotodocumentador. A
intensidade das bandas será quantificada por densitometria óptica através do programa
Uniscan®.
 6.6 Extração de RNA e qPCR
O RNA total será extraído utilizando o reagente Trizol. O cDNA será sintetizado
através do kit High-Capacity cDNA Reverse Transcription (Applied Biosystems), de
acordo com o protocolo do fabricante. A quantificação da PCR em tempo-real será
realizada utilizando PowerUp™ SYBR® Green Master Mix (Applied Biosystems) na
máquina de leitura Applied Biosystems™ 7500 Real- Time PCR Systems. A expressão
relativa de mRNA das enzimas relacionadas a disfunção hepática, Alt e Ast e de
marcadores da biogênese mitocondrial Pgc1a, Tfam e Nrf1 será determinada através do
método ΔΔCt e normalizados pelo endógeno Gapdh.

6.7 Análise Histológica

Imediatamente após o sacrifício, serão retiradas amostras do fígado e serão
imersas em paraformaldeído a 4%, permanecendo lá até a adequada fixação tecidual. Em
seguida os fragmentos de tecidos serão gradativamente desidratados em soluções com
concentrações crescentes de etanol, que serão trocadas a cada 60 minutos (água:etanol
(v:v) 30:70, 20:80, 10:90, 5:95 e 3 sequências de etanol absoluto. Em seguida, os tecidos
serão diafanizados com xilol, em 2 sequências de 60 minutos cada. O processo
deparafinização terá início subsequente à diafanização, com 2 banhos de 60 minutos cada
com parafina líquida. E como última instância, os fragmentos serão imergidos em
pequenas peças plásticas (cassetes), contendo parafina, e lá ficarão até sua total
solidificação juntamente com essa parafina. Posteriormente os blocos formados serão
cortados em micrótomo, na espessura de 4 mm, e serão fixados em lâminas próprias, onde
posteriormente serão corados ou submetidos à processos de imuno-histoquímica. Os
fragmentos corados com hematoxilina e eosina serão analisados quanto a sua composição
estrutural e/ou incorporação lipídica.

6.8 Análise estatística

Os dados serão analisados através do teste t de Student ou análise de variância

(ANOVA), seguida por análise de significância (Bonferroni), quando apropriado, para
comparação dos grupos experimentais. A significância estatística adotada é de p < 0,05.
O programa STATISTICA 6.0 será empregado para efetuar as análises. O processamento
e análise dos dados será feita com o auxílio do software GraphPad Prism 6.0 (GraphPad
Software, San Diego, CA).
 7. Cronograma

8. Disseminação e Avaliação
Os resultados do projeto de pesquisa serão disseminados no congresso de Iniciação
Científica da UNICAMP. Caso os resultados demonstrem potencial, eles serão utilizados
para a elaboração de um manuscrito que será submetido para publicação em periódico
internacional. A avaliação do presente projeto será realizada através da execução das
etapas de acordo com o cronograma apresentado anteriormente.

9. Referências Bibliográficas

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