UNIVERSIDADE CEUMA

CARLOS EDUARDO CAMPOS MARAMALDO

DETECÇÃO DE STREPTOCOCCUS PNEUMONIAE EM CRIANÇAS COM

PNEUMONIA ADQUIRIDA NA COMUNIDADE

SÃO LUIS
2017
 UNIVERSIDADE CEUMA

CARLOS EDUARDO CAMPOS MARAMALDO

DETECÇÃO DE STREPTOCOCCUS PNEUMONIAE EM CRIANÇAS COM

PNEUMONIA ADQUIRIDA NA COMUNIDADE

Projeto de Trabalho de Conclusão de

Curso apresentado ao Curso de Farmácia
da Universidade CEUMA, como requisito
parcial para obtenção do Título de
Bacharel em Farmácia.

Orientador: Lídio Lima Gonçalves Neto.

São Luís
2017
 A Comissão julgadora da Defesa do Projeto de monografia de graduação em
Farmácia, em sessão pública realizada no dia ##/##/##, considerou o(a) candidato(a)

( ) APROVADA ( ) REPROVADA

1) Examinadora: _______________________________________________

2) Examinadora: _______________________________________________

3) Examinadora: _______________________________________________

4) Presidente (Orientadora): _____________________________________

 RESUMO

MARAMALDO, C. E. C. “DETECÇÃO DE STREPTOCOCCUS PNEUMONIAE EM

CRIANÇAS COM PNEUMONIA ADQUIRIDA NA COMUNIDADE”

A pneumonia adquirida na comunidade (PAC) é uma das principais causas de

morbimortalidade infantil. Diante deste contexto, a Streptococcus pneumoniae é a
bactéria primária, associada a pneumonia em criança. Portanto o objetivo deste
trabalho foi detecta-la por meio de PCR real-time. Para isso foram selecionadas 150
crianças com idade entre duas semanas até cinco anos, de ambos os sexos, com
diagnóstico de PAC, após isso foi coletada amostra da nasofaringe, extraído o DNA
por meio do QIAamp DNA Mini Kit e realizada a identificação e quantificação do por
meio de PCR Real Time. Foi detectado 42,6% positivos para S. pneumoniae, destes
53,8% eram do sexo masculino e 23% apresentando vacinação incompleta. De
acordo com a análise quantitativa a média de pacientes positivos foi de 0,426 e
utilizando a ponte de corte de 5xlog10, encontrou-se 13,4% acima disso. Estes
resultados poderão servi para a propor uma melhor estratégia de planejamento e
prevenção das pneumonias causadas por S. pneumoniae.

Palavras-chave: pneumonia; pneumococcus; PCR; swab; diagnóstico. .

 SUMÁRIO
1 INTRODUÇÃO...................................................................................................6
1.1 Assitencia Farmaceutica.................................................................................6
1.1.1 Atencao básica...............................................................................................6
2 JUSTIFICATIVA.................................................................................................7
3 OBJETIVOS.......................................................................................................8
3.1 OBJETIVO GERAL............................................................................................8
3.2 OBJETIVOS ESPECÍFICOS..............................................................................8
4 METODOLOGIA................................................................................................9
5 ORÇAMENTO..................................................................................................10
6 CRONOGRAMA...............................................................................................11
REFERÊNCIAS...........................................................................................................12
1 INTRODUÇÃO

A pneumonia adquirida na comunidade (PAC) é uma infecção aguda do trato

respiratório inferior resultante da inflamação do parênquima pulmonar de pessoas
que adquiriram esta doença na comunidade. A estimativa mundial da incidência da
PAC em crianças com idade abaixo de cinco anos nos países em desenvolvimento é
por volta de 0,29 episódios por criança ao ano. Isto equivale a uma incidência anual
de 151,8 milhões de novos casos, dos quais aproximadamente 13,1 (8,7%) milhões
necessitam de internação hospitalar devido ao agravamento da doença (RUDAN et
al. 2008). Segundo o Boletim da Organização Mundial de Saúde (OMS), o Brasil
ocupa a décima quinta posição entre os países com maior incidência de pneumonia
com uma estimativa de incidência de 0,11 casos por crianças ao ano (RUDAN, et al.
2008). A etiologia da PAC é diversa e complexa. No entanto, a identificação
contínua dos principais patógenos relacionados à PAC se faz necessária como
forma de controle, através da criação de estratégias de prevenção e auxílio para um
tratamento adequado. Diante deste contexto, diversas bactérias e vírus estão
associados com a causa da pneumonia em crianças, sendo o Streptococcus
pneumoniae umas das principais bactérias causadoras da PAC em crianças. Esta é
uma espécie de bactéria Grampositiva encapsulada, diplococo, podendo está
relacionada a outras infecções clínicas graves. No entanto, sua maior importância
clínica está associada a pneumonia adquirida na comunidade, sendo relacionada a
pneumonia grave em crianças. Por este motivo, houve a implementação da vacina
de infecções por pneumococos no Programa Nacional de Imunização, para menores
de 2 anos, e esta contribuiu para a redução do número de casos (KUPEK, et al.
2016). Entretanto, ainda não existem estudos sobre a prevalência da doença
causada por S. pneumoniae em crianças mesmo após a vacinação, com isso este
estudo tem como objetivo a identificação de S. pneumoniae em amostras
respiratórias de crianças com PAC.
2 JUSTIFICATIVA

A pneumonia é a doença que mais causa mortes em crianças no mundo,

sendo o S. pneumoniae a principal bactéria relacionada à PAC, apesar da
implementação da vacina pelo Programa Nacional de Imunização. A falta de um
diagnóstico etiológico precoce pode justificar os altos índices de mortalidade por
PAC. Com isso a implementação de um diagnóstico rápido, especifico e sensível
para identificar o S. pneumoniae pode auxiliar na identificação e avaliação do
número de casos. Portanto, a implementação de uma técnica de qPCR, poderá
auxiliar em uma melhor identificação da real incidência de paciente com PAC
causada por S. pneumoniae, pois a cultura microbiológica utilizada como método
padrão possui baixa sensibilidade, especificidade e demora na identificação
dificultando o seu diagnóstico precoce.
3 OBJETIVOS

3.1 OBJETIVO GERAL

Avaliar a incidência de pneumonia adquirida na comunidade causada por

Streptococcus pneumoniae em crianças do Estado do Maranhão.

3.2 OBJETIVOS ESPECÍFICOS

Padronizar a utilização da PCR em tempo real como forma de identificar

Streptococcus pneumoniae.
Identificar o número de crianças com PAC colonizadas ou infectadas por
Streptococcus pneumoniae.
Quantificar carga bacteriana em pacientes com PAC e indivíduos
assintomáticos, positivos para Streptococcus pneumoniae.
4 METODOLOGIA

Casuística

Selecionar 150 crianças com idade entre duas semanas até cinco anos, de
ambos os sexos, com diagnóstico de PAC de acordo com os critérios da
Organização Mundial de Saúde (LEE, P. I., et al., 2007), entre os quais serão
atendidas nos Hospitais: Dr. Odorico Amaral de Matos “Hospital da Crianças” e no
Complexo Hospitalar Materno-Infantil (maternidade Benedito Leite e Hospital
Juvêncio Mattos). Além disso, serão coletadas amostras de 120 crianças controles
sem evidências de qualquer infecção respiratória aguda e sem histórico de PAC.

Amostras biológicas

A coleta do swab nasofaríngeo, secreção traqueal e lavado bronco-alveolar

serão coletadas no momento do diagnóstico da criança na enfermaria ou na UTI
pediátrica dos hospitais como previamente descrito (CARIOLANO, M.S. 2017).

Identificação da Cpn pela qPCR

Obtenção da cepa padrão A cepa da S. pneumoniae (ATCC® 49619™) já

obtida da ATCC (American Type Culture Collection, EUA).

Reação em cadeia pela polimerase em tempo real (qPCR)

O conjunto de reagentes da QIAamp DNA Mini Kit (QIAGEN, GmbH,

Alemanha) será utilizado para a extração do DNA da S. pneumoniae presentes nas
amostras e da cepa padrão. A identificação da S. pneumoniae será realizada pela
qPCR através da amplificação do gene 16S ribossomal segundo o protocolo
previamente descrito (LIMA NETO, et al., 2011), utilizando o sistema de sondas de
detecção Taqman® (Life Technologies, Foster City, CA, EUA). Amostras de DNA
extraído serão amplificadas pela qPCR juntamente com o plasmídeo recombinante
(controle interno). O ensaio da qPCR será otimizado utilizando iniciadores 200-900
nmol/L, PCR Master Mix 1x (Promega, Brasil) e 10 a 50ng de DNA, em volume final
de 25 µL. Os ensaios de qPCR serão realizados no aparelho QuantStudio™ 6 Flex
(Life Technologies, EUA), utilizando o seguinte programa: um ciclo de 95ºC por 10
min; e 40 ciclos de 95ºC por 10 segundos e 60ºC por 1min.
 Aspectos Éticos

O presente estudo obedeceu aos aspectos ético-legais da Resolução n.º 196,

de 10 de outubro de 1996, do Conselho Nacional de Saúde – Ministério da Saúde e
recebeu o parecer de aprovação do Comitê de Ética em Pesquisa da Universidade
CEUMA, protocolo nº 467.131. Os indivíduos e parentescos próximos (Pai, Mãe,
Avós e outros) dos grupos PAC e controle foram informados de maneira clara sobre
os objetivos e importância da pesquisa desenvolvida neste trabalho. Os que
concordaram em participar, no dia da entrevista, assinaram o Termo de
Consentimento Livre e Esclarecido.

Análise estatística

Os resultados obtidos serão analisados utilizando os programas SigmaStat

v.2.0 (SPSS Inc., Chicago, EUA) e organizadas em tabelas no programa Microsoft
Office Excel 2013. O nível de significância será de p < 0,05.
5 ORÇAMENTO

Orçamento Quant. Valor

Primers (iniciadores) Sense e Antisense 1 R$ 360,00
Conjunto de reagentes para extração de
1 R$ 3.996,00
DNA
Sonda de hidrólise 1 R$ 800,00
PCR Master Mix 1 R$ 4.000,00
Placas de 96 poços e adesive covers 1 R$ 1.000,00
Plásticos e acessórios 1 R$ 6.200,00
Total R$ 16.356,00
6 CRONOGRAMA

Fe Ab No
Atividades Jan Mar Mai Jun Jul Ago Set Out Dez
v r v
Definição do Tema X
Levantamento Bibliográfico x x x x x x x x x
Montagem do Projeto x x x
Coleta, Organização dos
Dados e Análises x x x x x x
Estatísticas
Redação do Artigo Científico x x
Deposito do Artigo x
Defesa do TCC x
REFERÊNCIAS

KUPEK, E.; VIEIRA, L. O impacto da vacina pneumocócica PCV10 na

redução da mortalidade por pneumonia em crianças menores de um ano em Santa
Catarina, Brasil. Cad. Saúde Pública, Rio de Janeiro, 32(3):e00131414, mar, 2016.
RUDAN, I. et al. Epidemiology and etiology of childhood pneumonia. Bull
World Health Organ, v. 86, n. 5, p. 408-16, May 2008.
LEE, P. I., et al. “Guidelines for the management of commnuity-acquired
pneumonia in children.” Acta Paetriatr Taiwan, 48, no 4, 167-180, 2007.
LIMA NETO, L. G., et al. “Chlamydophila pneumonia and increased TRL4
gene expression. In leukocytes are associated with acute myocardial infarction.” J
Bio Regul H. A., 28, no 3, 449-460, São Luis, BR.
CARIOLANO, M.S. Identificação de Chlamydia pneumoniae e Staphylococcus
aureus em crianças com pneumonia adquirida na comunidade: estudo de caso-
controle. 71. Dissertação (Mestrado) – Universidade Ceuma, São Luís, 2017.
KNOLL, M.D. “Evaluation of Pneumococcal Load in Blood by Polymerase
Chain Reaction for the Diagnosis of Pneumococcal Pneumonia in Young Children in
the PERCH Study” Clinical Infectious Diseases® 2017;64(S3):S357–67.