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Bioqumica Analtica
Resumo
No presente trabalho experimental procedeu-se ao isolamento,
purificao e caracterizao do citocromo c de uma estirpe Saccharomyces
cerevisiae, tendo-se obtido 10,747 mg de citocromo c, de peso molecular
12,2 kDa. A quantidade total de protena obtida no ltimo passo de
purificao foi 20,865 mg. O rendimento do ltimo passo de purificao foi
14,7% e o coeficiente de pureza foi 0,9758. O nmero de hemos obtido foi
1,29.
De modo a proceder ao isolamento do citocromo c, foi necessrio lisar
as clulas atravs da suspenso de fermento de padeiro, previamente
desfeito, em acetato de etilo e cloreto de sdio. Posteriormente, de modo a
purificar o citocromo c, efectuou-se uma cromatografia em batch, adicionouse sulfato de amnio para precipitar as protenas contaminantes (salting
out) e, para finalizar, efectuou-se uma cromatografia HPLC. Aps a
cromatografia em batch, efectuou-se uma dilise e foi retirada uma
pequena amostra para anlise espectroscpica, assim como, aps a
precipitao com sulfato de amnio.
Posteriormente, recorreu-se ao mtodo de Lowry para determinar a
quantidade total de protena e foram efectuadas uma electroforese em gel
de poliacrilamida em condies desnaturantes, para determinar o peso
molecular do citocromo c, e uma electroforese em gel de poliacrilamida
corado para deteco de hemos. De modo a determinar o contedo em
hemos por molcula de protena, recorreu-se ao mtodo da piridina
hemocromo.
Introduo
Os citocromos so hemoprotenas, ou seja, contm um grupo
prosttico designado por grupo hemo que consiste num tomo de ferro no
centro de um anel de porfirina. O tomo de ferro tem um nmero de
coordenao 6. Os quatro ligandos do plano equatorial so tomos de azoto
do anel de porfirina e as posies de coordenao axiais so asseguradas
por resduos laterais de aminocidos da cadeia polipeptdica da protena. A
quinta posio de coordenao ocupada por um resduo de histidina e a
sexta posio preenchida por uma metionina. O ferro hmico possui spin
baixo e o estado de oxidao do ferro varia entre o estado reduzido (Fe 2+) e
o estado oxidado (Fe3+).
Os citocromos distinguem-se pelo tipo de hemo, natureza da cadeia
polipeptdica e propriedades espectroscpicas. Das quatro classes distintas
de citocromos (a, b, c e d), apenas foi estudado o citocromo c.
O citocromo c distingue-se dos restantes por possuir um grupo hemo
ligado covalentemente cadeia polipeptdica atravs de uma ligao tioter
com dois resduos de cistena da sequncia de aminocidos e por ser uma
protena solvel.
Resultados
Os resultados obtidos permitem verificar a eficincia das diversas
tcnicas utilizadas no isolamento, purificao e caracterizao do citocromo
c. Como tal, aps cada passo de purificao foi retirada uma alquota para
posterior anlise espectroscpica da sua pureza. A alquota 1 corresponde
amostra retirada aps a cromatografia em batch, a alquota 2 corresponde
amostra retirada aps a precipitao com sulfato de amnio e a fraco B
corresponde fraco mais pura obtida aps a cromatografia HPLC.
Aps a cromatografia em batch e dilise do eludo, obteve-se uma
amostra de colorao avermelhada, com volume total de 34 ml e qual foi
retirada uma alquota de 1 ml para posterior estudo espectroscpico.
2.000
1.000
0.000
200.0
400.0
600.0
800.0
Forma reduzida
2.000
1.000
0.000
200.0
400.0
600.0
800.0
Forma reduzida
| 280nm|
|570 nm|
| 550nm|
(1)
Coeficiente de pureza=
Tabela 1 Valores de absorvncia dos tubos a 280 nm e 410 nm, no estado oxidado,
e a 550 nm e 570 nm, no estado reduzido, razo entre as absorvncias a 410 nm e
a 280 nm e coeficiente de pureza.
Forma Oxidada
Forma Reduzida
Tubo
Aborvnci
a280nm
Absorvnc
ia410nm
Absorvnc
ia550nm
Absorvnc
ia570nm
3
5
7
9
11
13
15
17
0,031
0,167
0,042
0,076
0,070
0,031
0,316
0,262
0,092
0,690
0,181
0,314
0,250
0,132
0,799
0,358
0,018
0,163
0,048
0,081
0,062
0,040
0,170
0,040
-0,003
0,002
0,004
0,005
0,003
0,006
-0,001
-0,006
| 280nm|
| 410nm|
2,985
4,142
4,270
4,129
3,559
4,206
2,530
1,365
Coefici
ente
de
pureza
0,675
0,968
1,019
1,002
0,845
1,086
0,543
0,178
1.2
3.5
1.0
0.8
2.5
A410/A280
1.5
0.5
0.2
-0.5 0
10 20 0.0
Tubos
A410/A280
Coeficiente de pureza
2.000
1.000
0.000
200.0
400.0
600.0
800.0
Forma reduzida
Amostra
Alquota 1
Alquota 2
Fraco B
Forma Nativa
Absorvncia
(nm)
414
0,503
520
0,063
549
0,100
411
0,629
520
0,075
549
0,098
411
0,305
521
0,038
549
0,052
Forma Reduzida
Absorvncia
(nm)
415
0,553
520
0,069
549
0,118
415
0,748
520
0,094
549
0,164
415
0,359
520
0,043
549
0,073
Amostra
Forma
Forma Reduzida
Coeficiente
Aborvncia550
de pureza
Aborvncia570
nm
nm
nm
0,317
0,248
0,071
0,115
0,158
0,073
0,008
0,010
0,005
0,338
0,597
0,958
A=bc , em que
Passo de
purifica
o
Cromato
grafia
CMC-52
Precipita
o com
(NH4)2SO
Volum
e (ml)
Quanti
dade
de
citocro
mo c
(mol)
Quanti
dade
de
citocro
mo c
(mg)
Rendim
ento
(%)
3,9521
0-5
34
1,344
10-6
16,930
100
1,0861
0-5
102
1,108
10-6
13,956
82,4
10
2,5091
0-5
34
8,529
10-7
10,747
63,5
Amost
ra
Factor
de
dilui
o
Concent
rao de
citocrom
o c (M)
Alquot
a1
10
Alquot
a2
Frac
oB
HPLC
Ensaio
Volume de
padro (l)
Volume de
H2O (l)
Absorvncia6
80 nm (uA)
Concentra
o final de
10
1
1
2
2
3
3
4
4
5
5
0
0
20
20
40
40
60
60
80
80
200
200
180
180
160
160
140
140
120
120
0,089
0,078
0,150
0,167
0,238
0,260
0,338
0,331
0,488
0,501
padro
(mg/ml)
0
0
0,0546
0,0546
0,1092
0,1092
0,1638
0,1638
0,2184
0,2184
0.400
Absorvncia (uA) 0.300
0.200
0.100
0.000
0
Concentrao (mg/ml)
Volume de
alquota 1
(l)
Absorvncia6
80nm (uA)
Factor de
diluio
Concentra
o total de
protena na
alquota 1
(mg/ml)
Concentra
o total de
protena na
alquota 1
(mdia)
(mg/ml)
11
0,116
0,095
0,150
0,159
0,163
0,134
0,186
0,210
20
20
10
10
20:3
20:3
5
5
5,435
3,082
4,623
5,127
3,568
2,484
3,320
3,992
4,164
Volume de
alquota 1
(l)
Absorvncia6
80nm (uA)
Factor de
diluio
Concentra
o total de
protena na
alquota 2
(mg/ml)
7
7
14
14
21
21
28
28
0,104
0,076
0,138
0,125
0,185
0,183
0,229
0,219
100:7
100:7
100:7
100:7
200:21
200:21
50:7
50:7
0,292
0,068
0,564
0,460
0,627
0,616
0,646
0,606
Concentra
o total de
protena na
alquota 2
(mdia)
(mg/ml)
0,587
Volume de
alquota 1
(l)
Absorvncia6
80nm (uA)
Factor de
diluio
Concentra
o total de
protena na
fraco B
(mg/ml)
10
10
20
20
25
25
30
30
0,114
0,125
0,187
0,181
0,170
0,222
0,219
0,219
20
20
10
10
8
8
20:3
20:3
0,521
0,644
0,670
0,636
0,459
0,693
0,566
0,566
Concentra
o total de
protena na
fraco B
(mdia)
(mg/ml)
0,614
Passo de
Amostra
Concentr
Volume
Quantida
Coeficie
Rendime
12
(ml)
de de
protena
(mg)
nte de
pureza
nto (%)
Alquota
1
4,164
34
141,574
0,338
100
Alquota
2
0,587
102
59,855
0,597
42,3
Fraco
B
0,614
34
20,865
0,9758
14,7
purifica
o
Cromato
grafia
CMC-52
Precipita
o com
(NH4)2SO
4
HPLC
Electroforese em gel de
desnaturantes (SDS-PAGE)
poliacrilamida
em
condies
13
Protenas
padro
Myosin
Galactosidas
e
BSA
Ovalbumin
Carbonic
Anhydrase
Soybean
Trypsin
Inhibitor
Lysozyme
Aprotinin
Distncia
percorrida
(cm)
0,3
0,058
Massa
molecular
(Da)
198844
Logaritmo da
massa
molecular
5,299
0,7
0,135
115700
5,063
1,35
2,05
0,260
0,394
96743
53541
4,986
4,729
2,6
0,500
37134
4,570
0,577
29134
4,464
3,5
4,5
0,673
0,865
19540
6905
4,291
3,839
Mobilidade
relativa (Rf)
Logaritmo da massa molecular em funo da mobilidade relativa (Rf) para as protenas padro - Colorao com Azul Coomassie
5.5
5
Log MM
4.5
4
3.5
0 0.1 0.2 0.3 0.4 0.5 0.6 0.7 0.8 0.9 1
Rf
Fraco
Distncia
percorrida
Mobilidade
relativa (Rf)
Massa
molecular
Logaritmo da
massa
14
(Da)
molecular
3,95
0,760
12679,9
4,103
0,769
12214,8
4,087
Forma
Reduzida
Leitura
1
2
3
Aborvnci
a550nm (uA)
0,040
0,050
0,047
Factor de
diluio
Concentra
o de
hemos
(mM)
Concentra
o de
hemos
(mdia)
(mM)
Concentra
o de
hemos
(mg/ml)
40
40
40
0,055
0,069
0,065
0,063
0,791
15
Concentrao de hemos
Concentrao de protena
0,791
0,614
Discusso
O grfico de espectroscopia UV/Vis permite verificar os diferentes
comprimentos de onda a que a amostra absorve, quer na forma oxidada
quer na forma reduzida. Em todos os espectros obtidos possvel observar
elevada absorvncia a 280 nm, caracterstica de anis aromticos de
protenas, um pico a 420 nm, referente ao grupo hemo (banda de Soret) e
um outro a 550 nm, especfico de uma banda menos intensa denominada
banda Q. A banda de Soret apresenta um mximo de absorvncia a 410 nm
na forma oxidada, que deslocada para 420 nm na forma reduzida.
16
17
18
Concluso
19
Bibliografia
[1] Moura I., Pereira A.; Isolamento, purificao e caracterizao do
citocromo c de uma estirpe de Saccharomyces cerevisiae; Bioqumica
Analtica I, Ano lectivo 2009/2010
[2] Moura I., Pereira A.; Acetatos de Bioqumica Analtica; Faculdade de
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[3] Berg, J. M., Tymoczko, J. L. e Stryer, L.; Biochemistry, 5 th. Ed. International
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[4] Wilson, K., Walker, J.; Principles and Techniques of Biochemistry and
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[6] http://metallo.scripps.edu/PROMISE/CYTC.html
[7] http://www3.bio-rad.com Protein Standards for Blotting