Aula 2 e 3

1
ARA0484
Biotecnologia e
Bioinformática
Aula 02 – Tecnologia do DNA
recombinante
• Alice Ornelas @ornelas_alicem
• Biomédica (UFF)
• Mestre em Imunologia Básica e Aplicada (USP- FMRP)
• Doutora em Genética (UFRJ)
2
Seleção de clones recombinantes
3
Passos para a clonagem molecular
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https://kasvi.com.br/clonagem-molecular-dna-recombinante/
Isolamento do fragmento de interesse
❑ A primeira etapa para a execução da técnica de DNA recombinante

corresponde ao isolamento do fragmento de DNA a ser clonado, ou do gene
de interesse.
5
https://www.verdict.co.uk/gene-editing-roadblock-emerges-as-crispr-cas9-genome-damage-found/
Vetor
❑ Após o isolamento do DNA executado na etapa anterior, é necessário

escolher a molécula receptora desse fragmento, conhecida como vetor de
clonagem;
❑ Os plasmídeos costumam ser utilizados porque constituem moléculas de
DNA dupla-fita, de fácil manipulação e de ocorrência natural em procariotos;
6
https://edisciplinas.usp.br/pluginfile.php/4096411/mod_resource/content/1/Aula%203%20-%20Profa.%20Carolina%20e%20Prof.%20Labate.pdf
Plasmídeos
❑ Além disso, a conformação circular dos plasmídeos é excelente para que

aceitem, e mantenham íntegro, o DNA exógeno que será incorporado a eles;
❑ Podem se replicar rapidamente, uma vez que apresentam uma origem de
replicação própria, independente dos cromossomos;
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https://pt.khanacademy.org/science/biology/biotech-dna-technology/dna-cloning-tutorial/a/overview-dna-cloning
Plasmídeo
Plasmídeo: tamanho do inserto: 0,1 – 10kb (100 – 10.000 pares de base)

8
Enzimas de restrição
❑ As enzimas de restrição funcionam

como tesouras moleculares,
capazes de clivar o DNA em sítios
definidos.
❑ Isto é, cada enzima ou

endonuclease de restrição possui
especificidade para determinadas
sequências nucleotídicas, cortando
de forma padronizada o molde de
DNA;
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https://moodle.ufsc.br/pluginfile.php/1391255/mod_resource/content/1/Clonagem_molecular.pdf
Tipos de enzimas de restrição
10
(blunt)
http://bmg.fc.ul.pt/Disciplinas/FundBiolMolec/3ModRestrClonDNA.pdf
(cohesive)
Enzimas de restrição
❑ Em outras palavras, é como se cada uma dessas endonucleases tivesse uma

assinatura própria, clivando o DNA de forma única e reprodutível, em
fragmentos pré-determinados.
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Palíndromo
❑ Em biologia molecular, palíndromo corresponde a uma determinada

sequência nucleotídicas, cujas bases nitrogenadas no sentido 5´->3´ são
encontradas espelhadas entre as fitas do DNA. Sendo assim, ambas as fitas
complementares apresentam a mesma sequência nucleotídicas se lidas no
mesmo sentido. Imagine, então, essas regiões palindrômicas sendo cortadas
por enzimas de restrição?
12
Enzimas de restrição x Palíndromo
❑ Quando enzimas de restrição atuam em regiões palindrômicas, elas são

capazes de gerar fragmentos ou produtos de DNA com extremidades coesivas,
isto é, com a tendência a se ligarem novamente, em função da
complementariedade das bases;
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Enzimas de restrição x Palíndromo
❑ O que os pesquisadores fizeram foi aproveitar essa interessante característica

para tratar tanto o DNA de interesse quanto o plasmídeo receptor com a
mesma enzima de restrição. Isso faz com que o plasmídeo e DNA alvo
apresentem capacidade de ligação entre si, por passarem a ter extremidades
disponíveis para ligação, as quais são complementares entre si.
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Ligação no Vetor
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Transformação
❑ Agora que os plasmídeos recombinantes estão prontos, ou seja, com o novo

fragmento de DNA exógeno já incorporado, basta transferi-los de volta para
os organismos procariotos através de mecanismos conhecidos como
transformação. Para que a transformação possa ocorrer, dizemos que as
bactérias precisam estar competentes, isto é, aptas ao recebimento de um
DNA externo;
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Competência
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Transformação
❑ Existem dois mecanismos principais de transformação, os quais viabilizam a

competência, isto é, as condições de membrana necessárias para o transporte
do ácido nucleico:
1. Eletroporação;
2. Choque térmico.
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Eletroporação
❑ Na eletroporação, um pulso elétrico é aplicado às células bacterianas, o que

promove o aumento temporário da permeabilidade das suas membranas,
através da formação de poros, os quais facilitam a introdução de
macromoléculas, como o plasmídeo. Ou seja, através de um processo físico,
você promove a competência.
19
Transformação por choque térmico
❑ Comumente chamado de transformação com cloreto de cálcio, é um método
fácil e relativamente barato de transformação. Consiste na preparação das
células, para torná-las competentes
❑ Na transformação química, as células bacterianas são incubadas com uma
solução de cloreto de cálcio (CaCl) em baixas temperaturas, na tentativa de
inibir a repulsão eletrostática entre o plasmídeo e a membrana celular. Em
seguida, as bactérias são submetidas ao choque térmico. Ao final desse
processo, as bactérias tornam-se receptoras ao vetor.
20
Choque Térmico
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❑ Para garantir que apenas os clones recombinantes irão crescer no meio de

cultura, é comum utilizarmos um meio seletivo, isto é, um meio de cultura ao
qual foi adicionado algum antibiótico. Você saberia o porquê?
23
https://edisciplinas.usp.br/pluginfile.php/4096423/mod_resource/content/1/Aula%204%20-%20TECNOLOGIA%20DO%20DNA%20RECOMBINANTE%20TRANSFORMA%C3%87%C3%83O%20BACTERIANA%20E%20PCR%20%282%29.pdf
❑ Lembra que no tópico sobre vetor nós falamos que
plasmídeos possuem genes que conferem resistência a
antimicrobianos?
❑ Isso significa que apenas as bactérias que receberem o

plasmídeo recombinante, contendo o gene que confere uma
dada resistência, terão condições de sobreviver e se replicar
nesse meio de cultura seletivo.
24
25
27
❑ Isso é o que acontece quando utilizamos um substrato cromogênico,
conhecido como X-Gal (5-bromo-4-cloro-3-indoxil-β-D-galactopiranosídeo),
no meio de cultura. As bactérias sem inserto, portanto, com os genes da
enzima β-galactosidase ativos, são capazes de hidrolisar X-Gal, produzindo
colônias azuis. Em contrapartida, colônias brancas denotam células que
receberam o plasmídeo recombinante, incapazes de metabolizar X-Gal.
28
30
Multiplicação dos clones recombinantes
❑ Agora que você é capaz de discernir
os clones recombinantes dos não
recombinantes através dos
marcadores de seleção descritos no
tópico anterior, você pode isolar
apenas aqueles contendo o inserto e
colocá-los para crescer;
❑ À medida que as bactérias se
replicam, os fragmentos de DNA
clonados em vetor também serão
multiplicados. Dessa forma, você
será capaz de produzir in vivo
diversas cópias do seu inserto. 31
Considerações finais
❑ Conforme discutido nesta aula, a técnica de clonagem molecular serve para
a produção em massa de cópias geneticamente idênticas de um fragmento
de DNA. Entretanto, a clonagem molecular pode ir além da produção de
clones. Ela também pode servir para a expressão de uma proteína por um
organismo.
❑ Em 1982, o gene que codifica a insulina humana foi clonado e expresso em
bactérias Escherichia coli, tornando possível o tratamento da diabetes
mellitus por meio desse produto da engenharia genética. Além disso, a
produção de hormônios e vacinas também é viabilizada por técnicas de
manipulação genética.
32
Obrigada
https://djalmasantos.wordpress.com/2011/07/30/testes-de-biotecnologia-45/
33

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❑ A primeira etapa para a execução da técnica de DNA recombinante

❑ Após o isolamento do DNA executado na etapa anterior, é necessário

❑ Além disso, a conformação circular dos plasmídeos é excelente para que

Plasmídeo: tamanho do inserto: 0,1 – 10kb (100 – 10.000 pares de base)

❑ As enzimas de restrição funcionam

❑ Isto é, cada enzima ou

❑ Em outras palavras, é como se cada uma dessas endonucleases tivesse uma

❑ Em biologia molecular, palíndromo corresponde a uma determinada

❑ Quando enzimas de restrição atuam em regiões palindrômicas, elas são

❑ O que os pesquisadores fizeram foi aproveitar essa interessante característica

❑ Agora que os plasmídeos recombinantes estão prontos, ou seja, com o novo

❑ Existem dois mecanismos principais de transformação, os quais viabilizam a

❑ Na eletroporação, um pulso elétrico é aplicado às células bacterianas, o que

fácil e relativamente barato de transformação. Consiste na preparação das

células, para torná-las competentes

❑ Na transformação química, as células bacterianas são incubadas com uma

solução de cloreto de cálcio (CaCl) em baixas temperaturas, na tentativa de

inibir a repulsão eletrostática entre o plasmídeo e a membrana celular. Em

seguida, as bactérias são submetidas ao choque térmico. Ao final desse

processo, as bactérias tornam-se receptoras ao vetor.

❑ Para garantir que apenas os clones recombinantes irão crescer no meio de

❑ Isso significa que apenas as bactérias que receberem o

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