ORGANISMOS

GENETICAMENTE
MODIFICADOS (OGM),
VACINAS DE DNA E TERAPIA
GÊNICA

Prof. Dr. Uderlei Covizzi

Organismos Geneticamente Modificados
(OGM)

Organismos que recebem um gene

exógeno (transgênicos)
 Microrganismos (bactérias e leveduras)

 Plantas

 Animais

Organismos alterados para fins

terapêuticos ou econômicos
Microrganismos
 Biotecnologia – história

 Fermentação (vinho e cerveja)→ 4.000

anos a.C. – Egito e Babilônia
 Fermentação (leite)→ 2.500 a.C. – Suméria

 Pasteurização→ 1861 - Louis Pasteur (França)

 Penicilina→ 1928 – Alexander Fleming

 Penicillim expostos a raio X → aumento na

produção de penicilina em 1.000X

Biotecnologia moderna
 Modificação de organismos que serão
utilizados na indústria para a produção de
agentes terapêuticos, vacinas e proteção
ambiental
 Ex: várias doenças podem ser tratadas
fornecendo ao paciente uma proteína que não
está sendo produzida de maneira correta
(hormônios, enzimas, fator de coagulação,
etc)
Microrganismos geneticamente modificados

 Somatostatina → primeira proteína humana

recombinante - 1976
 Insulina → primeiro produto comercial – 1984

 A biotecnologia industrial está reinventando a

forma de produzir produtos com maior

qualidade e com um menor custo
Sistemas de expressão

 1º) Isolamento do gene ou obtenção do cDNA

que codifica a proteína de interesse
 2º) Clonagem em um vetor de expressão com
sequências promotoras para alto nível de
transcrição e síntese protéica
 3º) Introdução da molécula recombinante em
uma célula hospedeira
 4º) Purificação do produto final
Sistema de expressão para Escherichia coli

 Sistema mais utilizado

 Sistema simples e barato
 Bactéria cultivada em larga escala e período
de tempo curto
 Genética e fisiologia dessa bactéria é bem
conhecida
 Sistema que utiliza uma proteína de fusão
para proteger a proteína de interesse contra
degradação (retirado depois)
Sistema de expressão para Escherichia coli

 Sistema para excreção da proteína para o

meio externo (não necessita romper a célula
para extrair a proteína)
 Não existe uma receita única para a máxima
produção
 Por ser procarioto, pode existir problemas
referentes a “folding”
 Problemas com modificações pós-traducionais
Produção de insulina humana em E. coli
Sistema de expressão em levedura

 Saccharomyces cerevisiae
 Eucarioto mais simples e bem conhecido
 Secreta poucas proteínas, facilitando a
purificação
 Por ser utilizada a muito tempo pelo homem
(fabricação de pão, vinho, etc) é considerado
um organismo de uso seguro
Sistema de expressão em plantas

 Brasil→maior produtor mundial de plantas

transgênicas (soja e milho principalmente)
 Transferido por um plamídeo de
Agrobacterium tumefaciens (plasmídeo Ti),
capaz de inserir-se no genoma da planta.
 Sistema de expressão em
plantas
 Ti = indutor de tumor
Sistema de expressão em células de inseto

 Baculovírus infecta células de invertebrados

(não causa preocupação para o homem)
 Substituem um gene relacionado com
infecção do inseto pelo gene da proteína
heteróloga
 O sistema de modificações pós-tradução de
mamíferos e dos insetos são muito parecidos
 Sistema de expressão em células de
mamíferos

 Sistema ideal para expressão de uma

proteína humana (semelhantes),
principalmente se for uma proteína complexa
 Garantem as modificações pós-tradução
necessárias
 Manutenção dessas células em cultura é cara
e difícil
 Nível de expressão é baixo, encarecendo a
produção
 Sistema de expressão em células de
mamíferos

Ciclo de vida do retrovírus Retrovírus como vetor

 Engenharia de proteínas
 Modificação na sequência de aminoácidos da
proteína para melhorar o seu desempenho e a sua
purificação industrial
 Insulina –
 Humalin – formato convencional, igual ao produzido
endogenamente da insulina, demora para ser absorvido;
 Humalog – formato mais eficaz, absorvido rapidamente.

 Proteína de fusão: associação do gene com

sequências protetoras ou peptídeo sinal
 Mutagênese sítio dirigida→ alteração induzida em
um único ponto (troca de um aminoácido)
Produtos de uso terapêutico
 Somatostatina: Hormônio produzido pelo
pâncreas que auxilia no crescimento. Composto
por 14 aminoácidos, produzido em bactérias
 Insulina: Anteriormente produzida a partir de
pâncreas bovino ou suíno (diferente da
humana).
 Produzida inicialmente em bactérias com as
duas subunidades separadas. Hoje,
expressadas por leveduras.
 Produtos de uso terapêutico
 Hormônio de crescimento: Produzido por
engenharia genética desde 1985. Era extraído de
cadáveres. Contém 191 aminoácidos. Atualmente
produzido em bactérias.
 Ativador do plasminogênio tecidual (TPA): Enzima

presente em pequena quantidade no sangue, que

participa na dissolução de coágulos. Produzida por
células de mamíferos (sistema mais caro).
Produtos de uso terapêutico
 Eritropoetina (EPO): Fator de crescimento
produzido pelos rins. Ativa divisão celular na
medula óssea, induzindo produção de
hemáceas. A produção de EPO diminui em
casos de doenças renais graves. Produzida
em células de mamíferos
 Interferon (IFN): Tratamento de infecção viral
(hepatite C). Evita que um mesmo vírus
cresça na mesma célula. Produzido em
células de insetos utilizando baculovírus
 Produção de vacinas
 Vacinas inativadas
→Agente infeccioso é morto antes de ser injetado para transmitir o
patógeno
 Vacinas atenuadas

→ Agente infeccioso é enfraquecido

 Vacinas de subunidades

→Expressão de um gene viral e utilização da proteína recombinante (ex

anti-HBV)
 Vacinas sintéticas

→Síntese de oligopeptídio
Produção de vacinas
Imunização pelo DNA “terceira geração”
→ O(s) gene(s) que codifica para a proteína
antigênica é clonado em um plasmídeo e esse
é injetado diretamente no músculo ou são
depositados em micropartículas de ouro que
serão bombardeadas em camadas
superficiais da pele.
O plasmídeo atingirá o núcleo das células e o
gene será transcrito e traduzido e liberado na
corrente sanguínea
Produção de vacinas
Produção de vacinas
 Produção de vacinas
Multivacina – uma
única vacina que é
eficaz contra três tipos
de doenças diferentes
Produção de vacinas
Vantagens da vacina de DNA
→Dispensa o cultivo de organismos patogênicos
→Produção é barata
→Não requer refrigeração (DNA é estável)
→Pode expressar mais de um antígeno (multivacina)
→Dose única
Produção de vacinas
Dificuldades para produção de vacinas de
DNA
→Pesquisa é muito cara
→A aprovação de uma vacina demora, em média 15
anos
→Programas de vacinação são gerenciados pelos
governos (não visa lucro)
→ Um indivíduo usará uma ou poucas doses da
vacina
Produção de vacina
Terapia Gênica
 Ainda não evoluiu como o esperado
 Consiste na introdução de um gene no

organismo
in vivo→ Injeção de um gene exógeno diretamente no
paciente
ex-vivo → As células do paciente são retiradas,
transfectadas com o gene e transfundidas
novamente para o paciente
 Terapia Gênica

Terapia in vivo
e ex-vivo
Terapia Gênica
Métodos para transferência Gênica
→ Microinjeção
→ eletroporação
→ lipossomos
→vírus (retrovírus, adenovírus, lentivírus e
herpes vírus)
→ bombardeamento
 Terapia Gênica

 Microinjeção
 Terapia Gênica

 Adenovírus
 Deficiência da enzima desaminase de
adenosina (ADA)

ADA→Doença genética autossômica recessiva

pertencente ao grupo das imunodeficiências
combinadas graves. Sistema imunológico falho que
indivíduo tem que viver em uma bolha de plástico
→Falta dessa enzima diminui o número de linfócitos T
→Tratamento: transplante de medula (75% dos casos),
entretanto só 1/3 dos casos são encontrados
doadores compatíveis
Deficiência da enzima desaminase de
adenosina (ADA)
 →Primeiro protocolo para terapia gênica
 → Coletaram linfócitos T de duas pacientes (duas
meninas de 4 e 9 anos) e mantiveram em cultura
 → O gene da ADA é pequeno
 → Usaram um retrovírus como vetor
 →Observaram uma melhora significativa na saúde
das meninas (principalmente a mais nova)
 → O tratamento não permitiu a cura (linfócitos T
tem vida curta)
Terapia Gênica
Terapia Gênica no Brasil
 o grupo do cirurgião cardíaco Renato Karam
Kalil, do Instituto de Cardiologia do Rio
Grande do Sul revelou os resultados do
tratamento de 15 pessoas por terapia gênica
 Injetaram um fragmento de DNA que contém a
informação para produzir o VEGF- 165 (fator
de crescimento de endotélio vascular),
estimulando o crescimento de vasos
sanguíneos em pacientes terminais
 Resultados promissores.
Aedes aegypti tansgênico
 A linhagem OX513A de Aedes aegypti usa o
sistema onde o aumento dos níveis de tTA
promove mortalidade nas células, pois tetO
funciona em retroalimentação positiva
(feedback positivo). Desta forma, machos
homozigotos que são liberados copulam com
fêmeas selvagens e toda a prole será
portadora do transgene e morrerá por
toxicidade causada pelos altos níveis de tTA
nas células.
 Aedes aegypti tansgênico

Figura 01. Sistema tTA - tetO repressível apresentado pela linhagem OX513A de
Aedes aegypti. (A) ausência de tetraciclina permite o sistema de retroalimentação e
causa a morte do inseto; (B) presença de tetraciclina bloqueia o sistema por
afinidade entre as moléculas.
CRISPR – Cas9
 Sistema de Edição do DNA
 Curtas Repetições Palindrômicas
Regularmente Interespaçadas”, ou CRISPR,
na sigla em inglês.
 Jennifer Doudna at the University of California
(UC), Berkeley, and Emmanuelle Charpentier,
now at the Max Planck Institute for Infection
Biology in Berlin
 2012 -
CRISPR