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UNIVERSIDADE FEDERAL DE SANTA MARIA

CENTRO DE CIÊNCIAS RURAIS
CURSO DE MEDICINA VETERINÁRIA

RELATÓRIO DO ESTÁGIO CURRICULAR

SUPERVISIONADO EM MEDICINA VETERINÁRIA

ÁREA: SANIDADE ANIMAL

SUPERVISOR: DR. ALESSANDRO PELEGRINE MINHO
ORIENTADOR: PROF. DR. ALEXANDRE KRAUSE

Suelen Mendonça Soares

Santa Maria, novembro de 2014.

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AGRADECIMENTOS

Agradeço aos meus pais, José e Virgínia, por acima de tudo, sempre me
ajudarem no possível. Muito obrigada por serem além de pais, amigos. Agradeço por
cada momento de aflição e alegria compartilhado com vocês e pelos conselhos e
puxões de orelha. Não consigo imaginar minha vida sem vocês, meus pilares,
minhas fortalezas.
Ao meu namorado José Luiz, pessoa que acompanhou meus passos na reta
final do curso dando todo o carinho, amor e apoio possível e sempre fazendo com
que eu ficasse bem, assim como a sua família, que mesmo de longe sempre
desejou o melhor para mim.
Às minhas amigas – e colegas por toda a vida – Anieli Luize Pohl, Alice
Bogoni Demori, Caiane Tasca, Elisiane Camana, Taiara da Silva Muller e
Alessandra Bridi que, além de me ajudar no curso, me ajudaram na vida. Meninas, o
que vivenciei com vocês ficará na minha memória e no meu coração.
A todo Lab Cris, que ao longo de três anos me adotou como uma filha/irmã
mais nova, sempre ajudando nos experimentos e estudos. Em especial agradeço à
professora Cristina Wayne Nogueira, pessoa que tenho enorme admiração e carinho
e também ao César Augusto Bruning, pela paciência e dedicação em me explicar e
ensinar o que sei hoje.
Ao professor e orientador Alexandre Krause, por ter me escutado e me
ajudado quando precisei, sempre passando tranquilidade. Professor, muito obrigada
por ter aceitado a proposta de ser meu orientador. É um ótimo profissional, além de
ser uma pessoa exemplar e ter um coração imenso.
À equipe da Embrapa Pecuária Sul, que me acolheu com todo carinho e
compreensão, se esforçando para repassar todos os conhecimentos possíveis e
ajudando ao máximo. Agradeço ao meu supervisor, Alessandro Minho, pelo exemplo
de excelente profissional, pela compreensão, apoio, calma e por nunca,
independente do que acontecer, perder o bom humor.
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RELATÓRIO DO ESTÁGIO CURRICULAR SUPERVISIONADO EM

MEDICINA VETERINÁRIA – ÁREA DE SANIDADE ANIMAL

Suelen Mendonça Soares

RESUMO

O Estágio Curricular Supervisionado em Medicina Veterinária (ECSMV) ocorreu

no Laboratório de Helmintologia (LabHel) do setor de Sanidade Animal da Empresa
Brasileira de Pesquisa Agropecuária (Embrapa) Pecuária Sul, sob a orientação do Prof.
Dr. Alexandre Krause e supervisão do pesquisador Dr. Alessandro Pelegrine Minho.
Durante o período compreendido entre 04 de agosto a 12 de novembro de 2014,
perfazendo um total de 584 horas, se realizaram atividades de práticas laboratoriais na
área de helmintologia, se participou em um curso técnico oferecido pela Embrapa e
também em um projeto paralelo, na coleta de sangue de um grupo de animais.
Também se executaram experimentos in vitro relativos ao projeto de avaliação do
efeito antiparasitário e mitigação de metano de compostos bioativos do bioma pampa.
Esses testes in vitro têm como objetivo a detecção da resistência de helmintos às
drogas antiparasitárias, problema amplamente relatado na produção de ruminantes em
âmbito mundial. Devido à preocupação em relação à resistência antiparasitária, o
surgimento de pesquisas no campo da fitoterapia cresceu muito e um dos compostos
mais estudados atualmente são os taninos condensados, por seus efeitos diretos e
indiretos como anti-helmíntico. Neste relatório são apresentadas as atividades
executadas e acompanhadas, seguidas de discussão sobre testes in vitro e in vivo
para a detecção de resistência parasitária e sobre a questão da fitoterapia como
alternativa anti-helmíntica, assuntos que foram abordados durante o ECSMV.
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SUMÁRIO
1 INTRODUÇÃO.................................................................................................. 10
2 ATIVIDADES DESENVOLVIDAS.................................................................... 12
2.1 Projeto biopam – prospecção de compostos bioativos do bioma
pampa: efeito antiparasitário e mitigação de metano.................................... 14
2.1.1 Questões técnico-científicas....................................................................... 15
2.2 Teste de inibição da migração larvar (Larval Migration Inhibition Test
– LMIT).................................................................................................................. 16
2.3 Ensaio de Inibição do Desembainhamento Larvar (Larval
Exsheathment Inhibition Assay – LEIA).......................................................... 17
2.4 Ensaio de Inibição de Alimentação Larvar (Larval Feeding Inhibition
Assay – LFIA)...................................................................................................... 18
2.5 Teste de Ovos por Grama de Fezes (OPG)............................................... 20
2.6 Coprocultura................................................................................................. 21
2.7 Preparo dos extratos vegetais (extrato bruto e suas frações:
metanólica e hexânica)...................................................................................... 22
3 RESULTADOS.................................................................................................. 24
4 DISCUSSÃO..................................................................................................... 25
4.1 Métodos convencionais in vitro................................................................. 26
4.1.1 Teste de eclodibilidade (EggHatch Test – EHT)......................................... 27
4.1.2 Teste de desenvolvimento larvar (Larval Development Test – LDT)......... 28
4.1.3 Teste de inibição da migração larvar (Larval Migration Inhibition Test –
LMIT)..................................................................................................................... 29
4.1.4 Ensaio de inibição do desembainhamento larvar (Larval Exsheathment
Inhibition Assay – LEIA)........................................................................................ 30
4.1.5 Ensaio de inibição da alimentação larvar (Larval Feeding Inhibition
Assay – LFIA)....................................................................................................... 31
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4.2 Métodos convencionais in vivo.................................................................. 33

4.3 Efeito anti-helmíntico de plantas................................................................ 34
4.3.1 Taninos condensados................................................................................. 36
5 CONCLUSÃO.................................................................................................... 39
6 BIBLIOGRAFIA................................................................................................. 41
ANEXOS .............................................................................................................. 44
 6

LISTA DE TABELAS

TABELA 1 – Atividades desenvolvidas e/ ou acompanhadas durante o

ECSMV no Laboratório de Helmintologia, no setor de Sanidade Animal da
Embrapa Pecuária Sul no período de 04 de agosto a 12 de novembro de
2014.............................................................................................................................. 13
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LISTA DE FIGURAS

FIGURA 1 − Embrapa Pecuária Sul. A – Setor de sanidade animal; B –

Laboratório de helmintologia. Bagé – RS,
2014............................................................................................................................... 11

FIGURA 2 − Animais doadores da cabanha. A – Cordeiro portando a bolsa; B –

Baia dos doadores. Bagé – RS,
2014........................................................................................................................ 13

FIGURA 3 − Teste de inibição da migração larvar. A – Peneira utilizada para

prévia limpeza das larvas; B – Placa com extrato e larvas a ser incubada; C –
Placa com extrato sendo pipetado sobre as peneiras; D – Leitura das placas.
Bagé – RS, 2014.......................................................................................................... 17

FIGURA 4 – Processo de desembainhamento larvar. A – Solução larvar limpa e

ajustada; B – L3 em processo de desembainhamento; C – Larvas L3 em
processo de desemainhamento (acima) e desembainhada (abaixo); D – L3
desembainhada ao lado de uma bainha. Bagé – RS,
2014............................................................................................................................... 18

FIGURA 5 – Recuperação de ovos das fezes. A – Peneiras utilizadas na

recuperação de ovos; B – Primeira peneira utilizada para recuperação de ovos;
C – Adição de água na mistura de fezes já amolecida; D – Método de utilização
das peneiras, através de leves batidas nas laterais; E – solução restante das
fezes centrifugada com solução saturada de sal; E – Visualização dos ovos em
meio a sujidades. Bagé – RS,
2014............................................................................................................................... 19
 8

FIGURA 6 – Teste de contagem de ovos por grama de fezes. A – Fezes já

homogeneizadas em peneiras com gaze; B – Adição de 29 mL de solução
saturada de sal no recipiente de vidro; C – Pipetagem da mistura de fezes na
câmara de McMaster; D – Leitura da câmara de McMaster. Bagé – RS,
2014............................................................................................................................... 21

Figura 7 – Frascos com fezes e água emborcados em placas de Petri. Bagé –

RS,2014.............................................................................................................................. 22

Figura 8 – Preparação de extratos vegetais com solventes orgânicos em balões

com condensadores, colocados em mantas térmicas. Bagé – RS, 2014................. 23

Figura 9 – Testes in vitro: vantagens e desvantagens (MINHO, 2014)...................... 33

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LISTA DE ANEXOS
ANEXO A – Protocolo do Teste de Inibição da Migração Larvar (Larval
Migration Inhbition Test – LMIT) – Embrapa Pecuária
Sul................................................................................................................................. 45

ANEXO B – Comunicado Técnico sobre Ensaio de Inibição do

Desembainhamento Larvar (Larval Exsheathment Inhibition Assay – LEIA) –
Embrapa Pecuária
Sul................................................................................................................................. 49

ANEXO C – Protocolo do Ensaio de Inibição da Alimentação Larvar (Larval

Feeding Inhibition Assay – LFIA) – Embrapa Pecuária
Sul................................................................................................................................. 57

ANEXO D – Protocolo do teste da Contagem de Ovos por Grama de fezes –

Embrapa Pecuária
Sul.................................................................................................................................. 59

ANEXO E – Protocolo da técnica de Coprocultura – Embrapa Pecuária

Sul.................................................................................................................................. 60

ANEXO F – Certificado do curso Atualização em técnicas laboratoriais e de

campo para realização de ensaios experimentais com parasitologia
veterinária: foco em helmintos gastrintestinais de ruminantes – Embrapa
Pecuária Sul................................................................................................................. 61

ANEXO G – Certificado do Estágio Curricular Supervisionado em Medicina

Veterinária, no setor de Sanidade Animal da Embrapa Pecuária
Sul.................................................................................................................................. 63
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1. INTRODUÇÃO

O Estágio Curricular Supervisionado em Medicina Veterinária (ECSMV) é uma

atividade obrigatória presente no currículo do curso de Medicina Veterinária da
Universidade Federal de Santa Maria (UFSM) e sua função é complementar o ensino
teórico-prático ministrado aos estudantes durante o curso. Nessa atividade, os alunos
têm a oportunidade de presenciar e colocar em prática ensinamentos adquiridos
durante a formação acadêmica, além de conhecer a realidade da profissão e seu
mercado de trabalho.
Considerando a grande importância da atuação do Médico Veterinário em
sanidade animal, que envolve, além das enfermidades dos animais, questões de saúde
pública, e o interesse particular no tema,essa área foi escolhida para a realização das
atividades pertinentes ao período do ECSMV.
O estágio foi desenvolvido no Laboratório de Helmintologia (LabHel),
pertencente ao setor de Sanidade Animal da Embrapa Pecuária Sul, localizada no
município de Bagé, Rio Grande do Sul. A supervisão ficou a cargo do pesquisador
Doutor Alessandro Minho, enquanto a orientação foi sob a responsabilidade do
professor Alexandre Krause. O ECSMV foi realizado no período de 04 de agosto a 12
de novembro de 2014, totalizando 584 horas. Para a confecção do relatório de estágio
somaram-se 120 horas, totalizando 704 horas.
A Embrapa Pecuária Sul (CPPSul) teve origem em 1937 e sua missão é
viabilizar soluções de pesquisa, desenvolvimento e inovação para a sustentabilidade
do agronegócio nos Campos Sul-Brasileiros, com foco em bovinos e ovinos.
Atualmente, ocupa uma área de 1300 hectares,distribuída em sete setores (áreas de
pesquisa) e composta por uma equipe de mais de 120 funcionários, que desenvolvem
aproximadamente 20 projetos de pesquisa em andamento. Este local foi escolhido
 11

para a realização do estágio, pois é uma empresa amplamente conhecida e que

consegue aplicar os resultados das pesquisas na realidade do público alvo, através de
parcerias, palestras, cursos ou de comunicados técnicos.
Dentre os setores da CPPSul está o de Sanidade Animal(Figura 1 - A), que é
composto por três laboratórios: Laboratório de Helmintologia(Figura 1 - B), Laboratório
de Ectoparasitologia e Laboratório de Imunologia, nos quais atuam pesquisadores,
técnicos, analista de pesquisa e desenvolvimento e estagiários. O laboratório onde
foram desenvolvidas as atividades foi o Laboratório de Helmintologia (LabHel),
coordenado pelo pesquisador Doutor Alessandro Minho que conta com o auxílio de
dois técnicos e de 5 estagiários.

Figura 1 – Embrapa Pecuária Sul. A – Setor de sanidade animal; B – Laboratório de helmintologia.

Bagé – RS, 2014.

O LabHel desempenha um papel importante para o setor pecuário da região,

em especial, na criação de ruminantes, pois oferece testes parasitológicos de rotina
que auxiliam no diagnóstico de doenças, tanto do animal em questão individual, quanto
do rebanho.
Além das atividades de rotina desenvolvidas no LabHel, foram realizados testes
que faziam parte do projeto de pesquisa Biopam, que será posteriormente descrito.
 12

2. ATIVIDADES DESENVOLVIDAS

Durante o período de estágio foram acompanhadas atividades tanto de rotina

como também de pesquisa do LabHel. As atividades de rotina consistiram na
realização de coleta de fezes, técnicas de contagem de Ovos Por Grama de fezes
(OPG) e coprocultura com identificação larvar.
Foram acompanhadas a extração de princípios das plantas estudadas no
projeto acima citado com diferentes solventes, a colheita de sangue de animais de
outro projeto paralelo, bem como o curso sobre técnicas parasitológicas, ministrado
pelo pesquisador Doutor Alessandro Minho.
Em relação à pesquisa, os principais ensaios executados no LabHel
relacionados ao projeto Biopam foram os testes in vitro: Teste de Inibição da Migração
Larvar (Larval Migration Inhibition Test - LMIT); Ensaio de Inibição de
Desembainhamento Larvar (Larval Exsheathment Inhibition Assay – LEIA) e o Ensaio
de Inibição da Alimentação Larvar (Larval Feeding Inhibition Assay – LFIA). Como
estes testes necessitam de grande número de larvas, fezes de ovinos doadores eram
coletadas duas vezes ao dia com o auxílio de bolsas fixadas na região pélvica dos
animais (Figura 2 – A e B). A infecção dos animais doadores é monoespecífica,
composta por Haemonchus contortus. Todas as atividades desenvolvidas durante o
estágio estão representadas na Tabela 1.
 13

Figura 2 – Animais doadores da cabanha. A – Cordeiro portando a bolsa; B – Baia dos doadores.
Bagé – RS, 2014.

TABELA 1 – Atividades desenvolvidas e/ ou acompanhadas durante o ECSMV no Laboratório de

Helmintologia, no setor de Sanidade Animal da Embrapa Pecuária Sul no período de 04 de agosto
a 12 de novembro de 2014.
Atividades Nº %
Coleta de fezes – coprocultura 60 25,42%
Coleta de fezes – OPG 13 5,51%
Coleta de sangue 2 0,84%
Confecção do relatório do ECSMV 20 8,48%
Coprocultura 55 23,31%
Extração de plantas 10 4,24%
LEIA 5 2,12%
LFIA 10 4,24%
LMIT 36 15,25%
OPG 14 5,93%
Participação no curso de técnicas 5 2,12%
parasitológicas
Recuperação de ovos 6 2,54%

TOTAL 236 100%

OPG: Ovos por grama de fezes; LMIT: Larval Migration Inhibition Test; LEIA: Larval Exsheathment
Inhibition Assay; LFIA: Larval Feeding Inhibition Assay.
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2.1 Projeto biopam - prospecção de compostos bioativos do bioma pampa:

efeito antiparasitário e mitigação de metano

Dentre os fatores que interferem no desenvolvimento pleno da atividade

pecuária, as helmintoses gastrintestinais ocupam lugar de destaque (MACRAE,1993
apud MINHO, 2012). A infecção por nematódeos gastrintestinais é uma das principais
limitações ao desenvolvimento dos ovinos em sistema de produção baseados no
pastoreio (URIARTE & VALDERRÁBANO, 1990 apud MINHO, 2012). Doenças
causadas por parasitos gastrointestinais em ruminantes acarretam prejuízos de
milhões de dólares ao mercado agropecuário mundial, a cada ano (MINHO, 2012). O
aumento dos relatos de isolados de nematoides multirresistentes aos anti-helmínticos
convencionais, incluindo multirresistência as três principais classes de produtos
mundialmente disponíveis (KAMINSKY et al., 2008 apud MINHO, 2012), gera sérias
consequências à criação ovina, e até mesmo, inviabiliza sua produção comercial
(SARGISON et al., 2010 apud MINHO, 2012).
Este problema de manejo de doenças parasitárias, aliado ao interesse pelo
desenvolvimento de sistemas de produção orgânicos, desencadeou um intenso
movimento científico pela busca e caracterização de metabólitos secundários de
plantas (MSP) com potencial antiparasitário, os quais possam ser utilizados no controle
alternativo dos nematóides parasitas de ruminantes (ATHANASIADOU et al.,2000
apud MINHO, 2012).
A adoção de estratégias de controle alternativas integradas, como a
incorporação do uso de compostos bioativos vegetais na criação animal, pode reduzir a
frequência de uso e dependência de acaricidas no sistema de produção. Além disso,
auxiliam na desaceleração do processo de instalação da resistência aos fármacos,
assim como fundamentam a produção com sustentabilidade e segurança alimentar
que se exige atualmente no setor agropecuário (MINHO, 2012).
Agregada de forma irreversível ao tema sustentabilidade dos sistemas de
produção de ruminantes no Brasil e no mundo, a produção de gases originada pela
peculiaridade na digestão da celulose no trato digestório desses animais, tornou-se um
fator primordial no comércio exterior e na aceitação desses produtos por parte da
população. Como efeito na nutrição animal, a produção de gases originada pela
microbiota ruminal acarreta perda de energia disponível oriunda da alimentação
 15

(MINHO, 2012). Entre esses gases, encontramos o metano (CH4), o qual interfere
diretamente no ambiente, sendo considerado responsável por 14,3% do potencial de
aquecimento global (IPCC, 2007 apud MINHO, 2012).
Estima-se que o setor agropecuário seja responsável pela emissão de 50% do
gás metano proveniente de atividades humanas, sendo a pecuária responsável por 7%
desse somatório, ou seja, 3,5% da emissão total do metano gerado pelo homem
(Watson et al., 1996 apud MINHO, 2012). Segundo relato do Painel
Intergovernamental sobre Mudanças Climáticas (IPCC) da Organização Mundial de
Meteorologia (WMO) pode-se chegar a uma redução de 21% na emissão global de
metano apenas com a melhora no manejo de ruminantes, onde os principais entraves
são as baixas digestibilidade e qualidade dos alimentos, bem como o balanço
nutricional inadequado (Watson et al., 1996 apud MINHO, 2012). Devido a essas
questões, o desenvolvimento de estudos sobre alternativas que diminuam a emissão
de gases poluentes pelos animais torna-se necessário.

2.1.1. Questões técnico-científicas

O bioma Pampa possui uma diversidade enorme de plantas arbustivas e

forrageiras com enorme potencial de utilização na alimentação de ruminantes e como
fontes de fitoterápicos e/ou nutracêuticos (MINHO, 2012).
Com foco nas metas e objetivos propostos, foi formada uma equipe
multidisciplinar composta por várias instituições de ensino e pesquisa do Brasil, as
quais disponibilizaram especialistas em: parasitologia animal; produção de gases
entéricos; mitigação de metano; nutrição animal; bioquímica e produção de extratos
vegetais; identificação de espécies vegetais; toxicologia e clínica de grandes animais;
estatística e microscopia eletrônica (MINHO, 2012).
O primeiro passo do projeto Biopam na Embrapa Pecuária Sul foi a coleta do
solo da região e das plantas selecionadas para a realização do extrato. Regiões
dessas plantas foram dessecadas e trituradas, embaladas em sacos plásticos e
amostras de cada espécie foram enviadas para análises bromatológicas. O solo
também foi enviado para avaliação. A extração das plantas foi realizada tanto em água,
como nos solventes hexano e metanol.
Após a seleção dos extratos nos testes in vitro, serão avaliados a toxicidade da
planta in natura, assim como a melhor forma de fornecimento ou aplicação nos
 16

animais. Dessa forma, objetiva-se viabilizar a utilização das fontes vegetais e aumentar
sua biodisponibilidade nos testes in vivo (MINHO, 2012).
A etapa que estava em andamento durante o período de estágio na CPPSul foi
a dos experimentos in vitro, que testam o efeito de diferentes extratos vegetais na
viabilidade e desenvolvimento de larvas de Haemonchus contortus (alimentação,
motilidade e desembainhamento), além da realização da extração das plantas.

2.2 Teste de Inibição da Migração Larvar (LMIT)

Este teste foi modificado do padrão (DEMELER et al., 2010a) pela CPPSul
(anexo A).Durante o período de estágio, foram realizados 36 LMITs, com extratos
brutos de 11 plantas diferentes, sendo que foram do número total de ensaios, 33 foram
reprodutíveis. Inicialmente, um dia antes da realização do teste, as larvas no estágio
L3, obtidas através de coprocultura, foram limpas através de peneiras, para a
separação de larvas limpas e viáveis, de sujidades e de larvas inviáveis(Figura 3 – A).
No dia do teste, o primeiro passo foi o desembainhamento das larvas, obtido
pelo uso de solução de hipoclorito de sódio a 2% por aproximadamente uma hora.
Após a verificação do desembainhamento, a solução larvar foi lavada três vezes e
quantificada, sendo ajustada para 150 larvas a cada 100 µL. Concomitante ao preparo
da solução larvar, preparou-se o extrato e suas respectivas diluições (100, 50, 25 e
12,5 mg/mL).
Com a solução larvar e extrato já prontos, placas de poliestireno de 24 poços5
foram organizadas, sendo uma para o extrato e suas diluições, e outra para o controle
negativo (água) (Figura 3 - B). Em cada poço foram pipetadas a solução larvar e a
solução a ser testada (extrato ou água). As placas foram para a estufa com BOD
(demanda bioquímica de oxigênio) a 28ºC e ficaram incubadas por 24 horas.
Transcorrido o tempo, as placas foram retiradas e todos os seus conteúdos
foram transferidos para outras placas, sendo cada poço retirado e pipetado no poço
correspondente sobre peneiras de 25 µm. Durante as próximas 24 horas, em
incubação, ocorreu o processo de migração (Figura 3 - C).

2
Ripercol L, Fort Dodge Saúde Animal Ltda, Campinas,São Paulo.
3
Ivermectan, Uzinas Chimicas Brasileira S. A., Jaboticabal, São Paulo.
4
Zolvix, Novartis Brasil, São Paulo, São Paulo.
5
TPP Techno PlasticProducts AG, Trasadingen,Switzerland
 17

No dia seguinte, houve a separação das larvas que migraram das que não
migraram e posterior contagem das mesmas (Figura 3 – D). Em ocasiões onde o
extrato era muito escuro, foram realizadas centrifugações dos poços, com descarte do
sobrenadante e diluição dos sedimentos para uma melhor leitura.
Em relação ao controle positivo, foi realizado o LMIT com diferentes produtos
comerciais para verificar qual seria o controle positivo melhor para o isolado da
CPPSul. Os medicamentos utilizados foram o levamisole2, a ivermectina3 e o
monepantel4.

Figura 3 – Teste de inibição da migração larvar. A – Peneira utilizada para prévia limpeza das
larvas; B – Placa com extrato e larvas a ser incubada; C – Placa com extrato sendo pipetado
sobre as peneiras; D – Leitura das placas. Bagé – RS, 2014.

2.3 Ensaio de Inibição do Desembainhamento Larvar (LEIA)

Este teste foi recentemente padronizado e publicado pela CPPSul em um

comunicado técnico (anexo B). No total de cinco LEIAs, foram testados extratos brutos
de duas plantas. Obteve-se sucesso em quatro ensaios. Seguindo os procedimentos
iniciais do LMIT, foram realizadas as concentrações de extrato e limpeza, quantificação
e ajuste das larvas L3 (Figura 4 – A).
 18

Após diluições do extrato e larvas estarem prontos, os mesmos foram pipetados

juntos em tubos de polipropileno6 graduado de 15mL e incubados por três horas, a
28ºC na BOD. Lavou-se as larvas três vezes, seguidas por centrifugações e os
sobrenadantes foram retirados, pegando somente o sedimento larvar e colocando em
cada respectivo poço, em placas de 24 poços. Adicionou-se às larvas uma solução de
desembainhamento, pipetada ao menor tempo possível.
Após colocar a solução de desembainhamento, o tempo foi cronometrado de 10
em 10 minutos para a colocação de lugol, para o bloqueio da reação. Resumindo, nos
tempos 0, 10, 20, 30, 40, 50 e 60 minutos foi pingado o lugol em cada coluna da placa.
Foram contados o número de larvas com bainha e desembainhadas em cada
poço (Figura 4 – B, C e D).

Figura 4 – Processo de desembainhamento larvar. A – Solução larvar limpa e ajustada; B – L3 em

processo de desembainhamento; C – Larvas L3 em processo de desemainhamento (acima) e
desembainhada (abaixo); D – L3 desembainhada ao lado de uma bainha. Bagé – RS, 2014.

2.4 Ensaio de Inibição da Alimentação Larvar (LFIA)

Este teste também foi recentemente padronizado pela Embrapa com

adaptações de Chagas et al. (2011) (anexo C).Do total de 10 LFIAs, apenas dois dos
ensaios foram reproduzíveis. Para esse teste, como são necessárias larvas em estágio

6
Falcon®Corning Inc. Life Sciences, MA, USA.
 19

L1, a obtenção das mesmas é diferente das larvas L3, que são obtidas por
coprocultura. As larvas L1 são obtidas através da técnica da recuperação de ovos.
A técnica da recuperação de ovos se baseou em coletar fezes diretamente do
reto dos animais, separar uma parte dessas fezes, macerá-las e acrescentar água
morna. Esse conteúdo foi filtrado em quatro peneiras com as seguintes reticulações: 1
mm, 105 µm, 55 µm, e 25 µm (Figura 5 – A, B, C e D). Os ovos que ficaram retidos na
peneira de 25 µm foram lavados com água destilada e vertidos para um béquer.
O material obtido foi centrifugado e lavado três vezes, sendo as duas últimas
lavagens com sal (Figura 5 – E). Para retirar o excesso de sal, o conteúdo foi limpo
com água morna e colocado posteriormente em um copo de decantação. Após uma
hora, o sedimento do copo foi coletado, colocado em microtubos na BOD, por 28ºC até
completar 24 horas(Figura 5 – F).

Figura 5 – Recuperação de ovos das fezes. A – Peneiras utilizadas na recuperação de ovos; B –

Primeira peneira utilizada para recuperação de ovos; C – Adição de água na mistura de fezes já
amolecida; D – Método de utilização das peneiras, através de leves batidas nas laterais; E –
solução restante das fezes centrifugada com solução saturada de sal; E – Visualização dos ovos
em meio a sujidades. Bagé – RS, 2014.

Obtidas as larvas L1, as mesmas foram limpas em peneiras com 25 µm de

abertura, para separar larvas viáveis de inviáveis e sujidades, e quantificadas. O
 20

ensaio foi realizado em microtubos, que continham o extrato (ou controle negativo -
água) e a solução larvar. Após duas horas em temperatura ambiente, foi adicionada a
bactéria E. coli associada ao isotiocianato de fluoresceína (FITC) em cada microtubo e
o conteúdo, depois de ser agitado, foi incubado na BOD a 25ºC por aproximadamente
18 horas.
Decorrido o tempo, os microtubos foram centrifugados e retirou-se o sedimento.
O sedimento obtido foi colocado em lâminas para leitura e quantificação das larvas que
se alimentaram (intestino corado com fluoresceína) e que não se alimentaram (sem
coloração) no microscópio de epifluorescência.

2.5 Contagem de Ovos de helmintos Por Grama de fezes (OPG)

Além de ser o principal teste de rotina realizado pelo LabHel, o OPG tem como
principal função monitorar a infecção larvar dos animais doadores da cabanha (anexo
D).
As fezes utilizadas nos testes foram colhidas diretamente do reto dos animais,
para evitar a contaminação pelo ambiente. As amostras foram organizadas de modo
decrescente, quando identificadas, maceradas (no caso de fezes de ovinos) e
pesadas. Após pesadas, as fezes foram colocadas, seguindo a mesma ordem, em
recipientes de vidro e adicionou-se em cada recipiente solução saturada de sal.
Homogeneizou-se cada mistura e, em seguida, estas foram despejadas em
peneiras com gaze hidrófila (Figura 6 – A). Os recipientes foram lavados com o mesmo
volume já utilizado de solução saturada de sal e novamente os conteúdos foram
despejados nas peneiras, que estão sobre novos frascos (Figura 6 – B).
As suspensões foram homogeneizadas novamente e pipetadas em câmaras de
McMaster (Figura 6 – C). Realizou-se a contagem e identificação dos ovos (Figura 6 -
D).
 21

Figura 6 – Teste de contagem de ovos por grama de fezes. A – Fezes já homogeneizadas em

peneiras com gaze; B – Adição de 29 mL de solução saturada de sal no recipiente de vidro; C –
Pipetagem da mistura de fezes na câmara de McMaster; D – Leitura da câmara de McMaster. Bagé
– RS, 2014.

2.6 Coprocultura

Por fazer parte do modo de recuperação de larvas L3 que são utilizadas tanto
no LMIT como no LEIA, a coprocultura é outra técnica muito realizada no LabHel
(anexo E).
O ensaio consiste em coletar fezes dos animais, do mesmo modo que é feito
para o OPG. Após a coleta, as fezes foram acondicionadas na BOD a 26ºC em
frascos, levemente umedecidas e vedadas parcialmente, permitindo a entrada de ar.
Decorrido o tempo de sete dias, os frascos foram retirados da BOD,
completados com água corrente, tampados com placas de Petri e invertidos. Foi
colocada água corrente na placa de Petri e após 3-4 horas foi retirado esse volume
(Figura 7). A solução larvar obtida foi usada por até 15 dias após a coleta.
 22

Figura 7 – Frascos com fezes e água emborcados em placas de Petri. Bagé – RS, 2014.

2.7 Preparação dos extratos vegetais (extrato bruto e suas frações metanólica
e hexânica)

A preparação dos extratos vegetais foi realizada com três solventes: água
deionizada, metanol e hexano. As plantas foram colhidas do campo nativo da região
dos pampas, com prévia autorização do IBAMA (Instituto Brasileiro do Meio Ambiente
e dos Recursos Naturais Renováveis) e desidratadas antes da extração. Após a
desidratação, as plantas foram trituradas.Para a extração aquosa, o procedimento
ocorreu no mesmo dia dos testes, sendo a mistura aquecida a 40ºC e agitada por 30
minutos.
A extração com os solventes hexano e metanol envolvia duas etapas: o
procedimento de extração em si e a rotaevaporação, que era realizada no Laboratório
de Química Orgânica da UNIPAMPA (Universidade Federal do Pampa). O primeiro
procedimento foi padronizado pela CPPSul, e consistiu em pesar três alíquotas de 300
gramas da planta selecionada, colocar essas três alíquotas em balões volumétricos
juntamente com 1,3 litros do solvente escolhido, que poderia ser o metanol ou o
hexano.
Após solvente e planta terem sido homogeneizados, os balões foram colocados
em mantas térmicas com a temperatura de ebulição do solvente escolhido
(aproximadamente 65ºC para metanol e 68ºC para hexano). Ainda foram acoplados
condensadores aos balões, para tornar a extração mais eficiente (Figura 8).
O processo do primeiro dia ocorreu durante 4 horas, sendo que após esse
período, o conteúdo dos balões foi filtrado e acondicionado em frascos de vidro âmbar.
No segundo dia se acrescentou a cada balão o volume de 700 mL do mesmo solvente
 23

utilizado no dia anterior. As alíquotas da planta e o procedimento eram as mesmas do

dia anterior. Passadas 4 horas,se filtrou novamente o conteúdo, se acondicionou em
vidros âmbar e identificou-se os frascos para o processo de rotaevaporação a ser
realizado na UNIPAMPA.

Figura 8 – Preparação de extratos vegetais com solventes orgânicos em balões com

condensadores, colocados em mantas térmicas. Bagé – RS, 2014.
 24

3. RESULTADOS

Os resultados referentes ao projeto acompanhado só poderão ser publicados

quando o projeto for concluído, uma vez que fazem parte das atividades
desenvolvidas na CPPSul, pelo fato de a mesma ser uma empresa pública federal
de pesquisa, em que os dados são confidenciais, protegidos por sigilo profissional.
Com relação às técnicas acompanhadas (LMIT, LFIA, LEIA, coprocultura,
OPG e extração de plantas), foi possível obter treinamento satisfatório para
desenvolver a capacidade de executá-las de forma confiável e reprodutível.
 25

4. DISCUSSÃO

As doenças parasitárias em animais representam um dos principais fatores de

limitação à produção animal e, mesmo recorrendo ao uso em larga escala, de
compostos químicos antiparasitários, a pecuária nacional continua carente de medidas
efetivas de controle sanitário. Nos anos 1950, as estratégias de controle sanitário
animal indicavam a utilização de produtos químicos apenas como medida preventiva.
Entretanto, ao longo dos anos, essa prática foi a única utilizada na eliminação ou na
erradicação dos parasitas e levou ao aparecimento de populações resistentes
(CHAGAS et al., 2011).
Segundo Molento, et al. (2011), embora seja crescente o desenvolvimento e a
adoção de programas alternativos de controle parasitário visando à redução da
aplicação de compostos químicos, as atuais medidas de controle ainda dependem
fortemente do uso de anti-helmínticos. Sabe-se que o processo de seleção de
parasitos resistentes após sua exposição aos produtos químicos é inevitável e, além
disso, o desenvolvimento/comercialização de novas drogas é lento e excessivamente
caro (GEARY 2013 apud FORTES; MOLENTO, 2013).
O país que mais possui registros de resistência anti-helmíntica (RA) no
continente americano é o Brasil (TORRES-ACOSTA et al., 2012).O aumento de relatos
de resistência múltipla a drogas (RMD) em vários locais, como as regiões Sul,Sudeste
e Centro-Oeste, evidencia a gravidade desse problema (CEZAR et al. 2010;
VERÍSSIMO et al. 2010 e SCZESNY-MORAES et al. 2010 apud FORTES; MOLENTO,
2013).
Segundo Torres-Acosta et al. (2012), altos níveis de RA às principais classes de
anti-helmínticos já são reportados a várias espécies de vermes. Há evidências de que
a severidade da RA múltipla atingiu níveis extremos em algumas propriedades do
Brasil. Um exemplo disso foi encontrado em uma fazenda criadora de ovinos do sul do
 26

país, onde populações de Haemonchus spp.,Thichostrongylus spp.e Ostertagia spp.

mostraram resistência aos seguintes anti-helmínticos: levamisole (22%), moxidectina
(1%), albendazole (10%), ivermectina (1%), nitroxinil (34%), disofenol (20%), triclorfon
(10%) e closantel (10%). Essas populações de helmintos também foram resistentes à
tripla combinação de produtos com ivermectina, levamisole e albendazole(CEZAR et
al., 2010 apud TORRES-ACOSTA et al., 2012).
Buscando retardar o avanço da resistência, o uso de testes sensíveis para
determinar o grau de eficácia de uma determinada droga, em uma população
específica de parasitos, pode auxiliar o planejamento de estratégias de controle
(TAYLOR et al. 2002apud FORTES; MOLENTO, 2013). Muito embora a resistência
possa ser avaliada por meio de testes in vivo e in vitro, a disponibilidade de testes in
vitro validados para o diagnóstico da resistência ainda é muito limitada, com poucos
laboratórios que oferecem esse tipo de serviço (FORTES; MOLENTO, 2013).
Segundo Chagas et al. (2011), a variação em protocolos experimentais para a
execução dos testes de diagnóstico da resistência, os métodos de análise e a
interpretação dos dados, podem gerar resultados de qualidade muito variável. Assim, o
desenvolvimento de novos métodos e a padronização e validação dos já existentes
são essenciais para permitir a comparação de dados obtidos em diferentes
laboratórios, além de sua inclusão na rotina laboratorial (MOLENTO et al. 2012).
Segundo Demeler et al. (2012), como alternativa aos métodos in vivo, um
crescente número de testes in vitro para a detecção de resistência anti-helmíntica vem
sendo desenvolvido e adaptado para diferentes grupos de drogas, pois os mesmos
são, na maioria das vezes, mais rápidos, mais econômicos e menos trabalhosos do
que os in vivo. Os métodos in vitro ainda anulam os efeitos causados pela interferência
do hospedeiro no estabelecimento da infecção parasitária e pela variação na
farmacodinâmica das drogas no animal (CHAGAS et al., 2011).

4.1 Métodos convencionais in vitro

De acordo com Varady et al. (1999 apud BORGES, 2013), os testes in vitro têm
mostrado eficiência para detecção do desenvolvimento de resistência anti-helmíntica,
sendo isso devido à não interferência do hospedeiro no estabelecimento da infecção
 27

pelo parasita.Testes in vitro são geralmente menos onerosos do que aqueles in vivo
(LACEY et al., 1990 apud DEMELER et al.,2012).
De um modo geral, esses testes envolvem a incubação de estágios de vida livre
dos parasitas em uma gama de concentrações do fármaco escolhido, seguido por
medição da vitalidade na forma de desenvolvimento, motilidade ou migração.
Atualmente, quatro principais ensaios envolvendo estágios de vida livre de um parasita
são utilizados, medindo: taxa de eclosão (por exemplo, teste de eclodibilidade de
ovos), taxas de desenvolvimento (por exemplo, teste de desenvolvimento larval),
motilidade / migração (por exemplo, teste de motilidade das larvas, teste de inibição da
migração das larvas) e alimentar (por exemplo, ensaio de alimentação das larvas)
(DEMELER et al., 2012).

4.1.1 Teste de eclodibilidade de ovos (Egg Hatch Test - EHT)

O ensaio de viabilidade de ovos foi descrita pela primeira vez por Le Jambre
(1979). Mais de 30 relatórios foram publicados utilizando várias modificações do teste
para a detecção de resistência contra os benzimidazóis e / ou levamisole (DEMELER
et al., 2012). A utilidade do teste para a detecção de resistência aos benzimidazóis foi
avaliada numa série de estudos de campo. A maioria dos estudos revelou uma boa
concordância entre os resultados obtidos por FECRT (Faecal Egg Count Reduction
Test) - e o ensaio de eclosão dos ovos em ovelhas no campo, indicando que o teste é
uma alternativa precisa, confiável e de boa relação custo-benefício para a FECRT
(MAINGI et al., 1998; ALVAREZ-SÁNCHEZ et al., 2006; VÁRADY et al., 2006;
VÁRADY et al., 2007; DIEZ-BANOS et al., 2008 apud DEMELER et al., 2012).
Alguns fatores em investigação e que podem influenciar os resultados obtidos
com o EHT, incluem: diferentes fontes de água utilizada; grau de limpeza dos ovos; e o
método de dissolução da amostra (COLES et al., 2006 apud FORTES; MOLENTO,
2013).Como os ovos são muito frágeis e sensíveis à variação de temperatura, a
detecção de tais fatores é essencial para que diferentes laboratórios possam obter
resultados igualmente eficazes (FORTES; MOLENTO, 2013).
 28

4.1.2 Teste de desenvolvimento larvar (Larval Development Test – LDT)

Os efeitos sobre o desenvolvimento larval avaliados neste teste são planejados

para ser relacionados com a alimentação e, portanto, a mensuração da atividade de
músculos da faringe dos parasitas (DEMELER et al., 2010b). O LDT foi relatado
primeiramente por Coles et al. (1988 apud FORTES; MOLENTO, 2013) para a de-
tecção de resistência a benzimidazois e levamisole.
Um teste comercial (DrenchRite1®) foi desenvolvido na Austrália para
determinar a resistência contra benzimidazois, levamisole e lactonas macrocíclicas em
nematoides de ovinos e caprinos, porém é pouco utilizado e expressivamente caro
para o uso em rotina (FORTES; MOLENTO, 2013).
Borges (2014) retrata que o LDT talvez seja o teste mais abrangente pois uma
vez que, em organismos complexos como os nematoides, o equilíbrio dinâmico entre
seus diversos sistemas orgânicos é imprescindível ao seu desenvolvimento, é
possível identificar compostos que tenham a capacidade de comprometer
prejudicialmente qualquer ponto crítico para a homeostase desses sistemas, em
detrimento a outros testes que se detêm a análises mais restritas.
Segundo Demeler et al., (2012), a principal vantagem do LDT em comparação
com o EHT é a possibilidade para a avaliação de resistência ao benzimidazole,
levamisole e às lactonas macrocíclicas ocorrer simultaneamente na mesma placa.
Semelhante ao EHT, foi demonstrado que os resultados obtidos no LDT estavam em
boa concordância com os resultados obtidos por meio FECRT no campo (ANCHETA et
al., 2004, VÁRADY et al., 2006 e LEATHWICK et al., 2006 apud DEMELER et al.,
2012).Ao contrário do EHT, para o LDT a idade dos ovos utilizados não importa e as
larvas são obtidas para a diferenciação de espécies (FORTES; MOLENTO, 2013).
Enquanto a maioria dos LDTs utilizados para nematoides de ovinos são
realizados em placas de 96 poços, a troca para uma placa de 48 poços combinada
com temperaturas mais elevadas resultaram em resultados positivos no
desenvolvimento das espécies. Em contraste, pouco tem sido publicado a respeito da
utilização desta técnica em nematoides de bovinos devido a problemas com a
confiabilidade e reprodutibilidade da mesma. Particularmente, o desenvolvimento bem
sucedido das larvas parece ser o fator limitante para o sucesso do teste. Além disso,
essa prova é considerada relativamente frágil, pois requer fezes frescas (enviadas ao
laboratório em sistema anaeróbio), sendo as condições de armazenamento as que
 29

mais afetam o desenvolvimento dos ovos e o boa eficácia do teste (DEMELER et al.
2010b).
Embora o LDT funcione para o diagnóstico de resistência aos benzimidazois,
parece não ser tão satisfatório quanto o EHT (COLES et al. 2006 apud FORTES;
MOLENTO, 2013). Chagas (2008) também afirma que o LDT tem demonstrado
problemas com relação à contaminação do meio ou obtenção de baixas taxas de
desenvolvimento de L1 para L3.

4.1.3 Teste de inibição da migração larvar (Larval Migration Inhibition Test – LMIT)

O teste de inibição da migração larvar (DEMELER et al., 2010a) visa avaliar a

resistência a anti-helmínticos que possuam como sítio de atuação a musculatura
somática. Baseia-se na avaliação da capacidade migratória de larvas de terceiro
estágio, após período de incubação com a solução tratamento (BORGES, 2014).
Segundo Demeler (2010a), como larvas de nematoides de terceira fase não se
alimentam, os efeitos medidos em testes de migração são planejados para ser
relacionados à paralisia da musculatura do corpo. Comprovou-se, ainda, que testes de
migração são úteis para a detecção de resistência às lactonas macrocíclicas e
levamisole (ROTHWELL; SANGSTER, 1993 apud DEMELER et al., 2010a).Os
resultados foram altamente reprodutíveis, porém o campo de aplicabilidade do ensaio
não foi suficientemente estudado e o problema potencial do ensaio para distinguir entre
as espécies em infecções mistas adquiridas naturalmente precisa ainda de ser
resolvido (KOTZE et al., 2006; KLEINSCHMIDT, 2009 apud DEMELER et al., 2012).
Um estudo mostrou uma boa concordância dos resultados obtidos a partir do
LMIT com o FECRT em bovinos, demonstrando o potencial uso do LMIT (DEMELER et
al. 2012). Em comparação ao LDT, o LMIT é um exame fácil e simples, possível de ser
realizado na maioria dos laboratórios. Além disso, o LMIT requer larvas de terceiro
estágio, que podem ser facilmente obtidas a partir de coproculturas, e mantidas em
geladeira até o seu uso (DEMELER et al. 2010a).
A partir do que foi acompanhado na CPPSul, observou-se que apesar de ser um
teste demorado, é fácil de se realizar e não necessita de alta tecnologia, sendo o
microscópio invertido o utensílio de maior custo. As maiores dificuldades quanto ao
desenvolvimento do ensaio foram em relação à quantificação de larvas (nem sempre
 30

se conseguia a alíquota necessária por ser um teste que necessita de grande

quantidade larvar) e à leitura dos poços, que por conta de extratos muito escuros,
muitas vezes se tornava difícil. O cuidado é necessário também com a solução de
desembainhamento, que pode perder efeito com o tempo e tornar mais lento esse
processo, que para o LMIT necessita ser relativamente rápido.

4.1.4 Ensaio de inibição do desembainhamento larvar (Larval Exsheathment

Inhibition Assay – LEIA)

O ensaio de inibição do desembainhamento larvar é um ensaio in vitro que

foca no processo de ecdise que ocorre de L3 para L4, conhecido também como
desembainhamento (GOMES, 2013). Para nematódeos tricostrongilídeos, o
desembainhamento do estágio larvar L3 é processo chave no ciclo de vida, pois é o
marco da transição a partir da vida livre para a fase parasitária (ROGERS;
SOMERVILLE, 1968 apud BRUNET; HOSTE, 2006). Uma vez que este processo
desempenha um papel importante no ciclo de vida dos nematóides
tricostrongilídeos, a interferência nele por compostos químicos ou extratos de
plantas pode contribuir para as propriedades anti-helmínticas frente à esses
parasitas (HERTZBERG et al., 2002 apud GOMES, 2013). Estudos sobre a cinética
do desembainhamento larvar têm enfatizado que o fenômeno necessita ocorrer
dentro de um prazo restrito e que qualquer fator que possa interferir no processo
pode reduzir o estabelecimento do parasita no hospedeiro (DAKKAK et al., 1981
apud BRUNET; HOSTE, 2006).
O desembainhamento é a fase inicial da infecção parasitária, sem o qual o H.
contortus torna-se incapaz de se estabelecer e se multiplicar no hospedeiro (MINHO
et al., 2014). Dentre diversos fatores, o microclima do rúmen (pH e temperatura) e as
concentrações de dióxido de carbono diluído ativam as células neurosecretoras das
L3, desencadeando a liberação de enzimas e o início do processo de
desembainhamento. Componentes presentes no abomaso, como o bicarbonato
(sistema tampão de ácido carbônico), também são descritos como importantes
nesse processo (PETRONIJEVIC; ROGERS, 1983; SOMMERVILLE, 1957 apud
MINHO et al., 2014).Segundo Minho et al., (2014), o teste de inibição do
 31

desembainhamento larvar também é uma ferramenta para seleção de fontes

vegetais com potencial anti-helmíntico.
O LEIA é um ensaio relativamente rápido, pois pode ser realizado em um dia.
Através do acompanhamento deste teste na CPPSul, pôde-se notar que é um teste
que utiliza basicamente os mesmos materiais do LMIT, sendo também um teste
relativamente barato. A leitura e contagem de larvas são fáceis, pelo fato de as
mesmas sofrerem várias lavagens. O cuidado com a solução de desembainhamento
deverá ser o mesmo utilizado para o LMIT, tendo esse conteúdo que ser
acondicionado em uma geladeira e protegido da luz.

4.1.5 Ensaio de inibição da alimentação larvar (Larval Feeding Inhibition Assay –

LFIA)

Efeitos de anti-helmínticos sobre alimentação foram avaliados por meio de

ensaios de alimentação com fases larvares ou adultas de parasitas (GEARY et al.,
1993, JACKSON e COOP, 2000 KOTZE e MCCLURE, 2001, SHERIFF et al., 2002 e
O'GRADY e KOTZE , 2004 apud DEMELER et al., 2012). Alvarez-Sanchez et al.
(2005) relataram um LFIA adequado para distinguir os isolados resistentes e
susceptíveis de ivermectina de nematóides de espécies diferentes. Este ensaio foi
ajustado para a avaliação da eficácia anti-helmíntico no campo (DIEZ-BANOS et al.,
2008).
A resistência às lactonas macrocíclicas, como indicado pelo FECRT, foi
confirmada em todas as explorações, utilizando o LFIA, indicando que este ensaio in
vitro tem o potencial de detectar a resistência a uma das classes de drogas mais
comumente usadas (DEMELER et al., 2012). Entretanto, OGrady; Kotze (2004 apud
ALVAREZ-SANCHEZ et al., 2005) afirmam que houve algumas limitações no teste
devido a um aumento significativo na alimentação no verme adulto, ao mesmo tempo
que este apresentava a motilidade reduzida, quando em contato com alguns fármacos.
Apesar das limitações, segundo Alvarez-sanchez et al., (2005), os resultados
mostram que o LFIA pode ser um bioensaio alternativo para a detecção e
caracterização da resistência em populações de nematoides aos anti-helmínticos.
Segundo Chagas (2008), o LFIA também tem sido utilizado para a realização de
 32

screenings de extratos vegetais ativos, visto que esse é um teste mais sensível por
utilizar a fase larvar L1.
Pode-se considerar o LFIA, pelo que foi realizado na CPPSul, um teste sensível
em todos os sentidos. Este ensaio que detecta a RA com sensibilidade, também é
frágil no seu desenvolvimento. Quantias mínimas de luz já podem alterar a fluoresceína
presente no conteúdo a ser lido, o que pode afetar o resultado do experimento.
Outro problema quanto à técnica da inibição da alimentação larvar foi a
obtenção das bactérias marcadas com FITC. Inicialmente, E. coli marcadas eram
disponibilizadas comercialmente,entretanto, atualmente esse produto não se encontra
mais no mercado. O procedimento de marcação de bactérias teve que ser padronizado
pela CPPSul e, após várias tentativas obteve-se sucesso, através do cultivo de
bactérias, marcação com FITC e conservação deste conteúdo com máxima proteção
da luz e em um refrigerador.
Deve-se considerar importante o processo de pré-seleção de larvas realizada
com peneiras de 25µm, pois os resultados diferem com amostras de L1 não
selecionadas (no conteúdo larvar pode-se ter vermes viáveis e inviáveis) e
selecionadas (haverá somente vermes viáveis no conteúdo larvar).
O fato de este ensaio necessitar de um microscópio de epifluorescência o torna
mais caro em relação aos testes citados anteriormente.
Minho (2014) resumiu os principais testes para avaliar a RA de uma forma
simples, apresentada na Figura 9.
 33

Figura 9 – Testes in vitro: vantagens e desvantagens (MINHO, 2014)

4.2 Métodos convencionais in vivo

Um método muito utilizado in vivo é o teste controlado, em que a eficácia do

anti-helmíntico é determinada pela comparação da população de parasitos no grupo
tratado com a do grupo não tratado. Animais parasitados são aleatoriamente
separados em medicados e não medicados. Após a dosificação dos animais do grupo
medicado é dado um intervalo entre o tratamento e o sacrifício dos animais. Estes por
sua vez, são necropsiados e a carga parasitária é identificada e contada (COELHO,
2009). Este método é muito trabalhoso, de grande custo e, devido à necessidade de
exame post mortem, não tem a aceitação nas propriedades (DEMELER et al.,2012).
Segundo Alencar et al., (2009), uma forma de se atestar a eficácia dos produtos
anti-helmínticos é a aplicação do teste de redução da contagem de ovos nas fezes
(FECRT). O FECRT é de grande aplicabilidade prática para os profissionais atuantes
na criação de ovinos, podendo ser também extrapolado para a realização de pesquisas
sobre a eficácia dos produtos anti-helmínticos em rebanhos ovinos. O FECRT é
simples, relativamente fácil de executar e, atualmente, o método mais utilizado para a
avaliação da eficácia anti-helmíntico.
 34

De acordo com Coelho (2009), animais parasitados são distribuídos

aleatoriamente em dois grupos, sendo que um grupo sofrerá a ação de anti-helmíntico
(tratado) e outro não (controle). As contagens de ovos de nematódeos nas fezes
seriam avaliadas tanto antes como depois do tratamento o qual se compara o
percentual de redução na eliminação de ovos nas fezes nos dois grupos.
O diagnóstico será positivo para “resistência” quando uma determinada droga
que apresentava redução acima de 99% da carga parasitária apresentar redução
menor do que 95% contra determinado princípio ativo após certo período de tempo
(MOLENTO, 2004). No entanto, os dados obtidos por FECRT têm sido relatados por
não ser altamente reprodutíveis (MILLER et al., 2006 apud DEMELER et al., 2012).
Coelho (2009), também relata que apesar de ser largamente utilizado para monitorar
resistência em nematódeos, o FECRT caracteriza-se por baixa qualidade, pois nem
sempre existe uma boa correlação entre a ovoposição e o número de parasitos adultos
no hospedeiro.

4.3 Efeito anti-helmíntico em extratos de plantas

Nos últimos anos a sociedade tem priorizado aspectos ambientais, direcionando

muitas pesquisas para a descoberta de novas substâncias bioativas que possam ser
empregadas no manejo integrado de doenças, com menos efeitos negativos sobre o
meio ambiente (CASTRO, 1989 apud NERY et al., 2009).
Segundo Yoshihara (2011), além dos fatores ambientais, o aparecimento de
isolados de parasitos resistentes às drogas anti-helmínticas e o fato de as mesmas
possuírem algumas limitações, tais como alto custo e resíduos nos alimentos, têm
estimulado a procura de estratégias alternativas de controle. Dentre estas, anti-
helmínticos produzidos a partir de plantas podem oferecer uma alternativa para
minimizar alguns destes problemas.
A utilização de plantas no tratamento de diversas enfermidades infecciosas ou
não, é uma prática que foi bastante usada por nossos antepassados, principalmente
em épocas de inexistência de produtos farmacêuticos mais avançados (CAMURÇA-
VASCONCELOS et al., 2005). A fitoterapia é utilizada há milhares de anos em
diferentes regiões do mundo. Apesar disso, existe uma carência de estudos
demonstrando a indicação, eficácia e segurança dos medicamentos fitoterápicos,
 35

especialmente na medicina veterinária. Na produção de pequenos ruminantes, o

controle da verminose gastrintestinal baseado na utilização sistemática de vermífugos
tem apresentado altos índices de resistência, inviabilizando a produção (WOLUPECK
et al., 2009).
Em todo mundo, é crescente o número de pesquisas com fitoterápicos que
apresentam atividade contra vários microorganismos, não sendo diferente na medicina
veterinária, na qual pesquisas com plantas medicinais objetivam a redução de
problemas sanitários no controle de várias doenças, dentre elas as verminoses
(NIEZEN et al., 1996 apud YOSHIHARA, 2011).A fitoterapia pode ser uma alternativa
ao controle químico tradicional, pois normalmente há uma grande diversidade de
moléculas encontradas em um mesmo medicamento, tornando a seleção de parasitos
resistentes em um uso prolongado mais improvável, além de ser uma opção para os
criadores que adotam o sistema orgânico de produção (WOLUPECK et al., 2009).
Diversos estudos confirmam que plantas têm sido utilizadas para o controle de
nematódeos gastrintestinais (NGI) em pequenos ruminantes, fazendo uso de extratos,
folhas,frutos, ou sementes oriundas de diferentes regiões (latitudes) do mundo e
obtidas com diferentes técnicas (MAKKAR; FRANCIS; BECKER, 2007 apud
YOSHIHARA et al., 2013). Segundo Nery et al., (2009), a validação científica dos
fitoterápicos é uma etapa inicial obrigatória para a utilização correta de plantas
medicinais ou de seus compostos ativos.
Os primeiros ensaios visando a validação de um fitoterápico se baseiam em
avaliações in vitro dos extratos das plantas, nas quais se consideram apenas a droga
candidata e o parasito livres de condições externas, ambiente e hospedeiro. Além
disso, os testes in vitro constituem uma etapa preliminar à caracterização de novos
compostos ativos presentes nos vegetais, possibilitando a criação de novas
alternativas para o controle das parasitoses (COSTA et al., 2002).
Alonso Díaz et al. (2010 apud YOSHIHARA, 2011) relatam que é necessária a
definição de muitos aspectos envolvidos tais como a parte da planta, idade e estado
fisiológico da planta, aspectos relacionados à extração e dose adequada. Fatores
ligados ao animal também devem ser considerados para que o mesmo possa ser
utilizado no controle de nematódeos.
 36

4.3.1 Taninos condensados

Os taninos compreendem um grupo de compostos fenólicos encontrados

principalmente em frutos verdes e plantas da família Leguminosae. Esses compostos
fenólicos são classificados conforme sua estrutura molecular em taninos hidrolisáveis
(TH) ou taninos condensados (TC), sendo os condensados também conhecidos como
proantocianidinas (MINHO, 2006). Os TC são os taninos mais comumente encontrados
em plantas forrageiras, arvores e arbustos (BARRY e MCNABB, 1999 apud
YOSHIHARA, 2011). O papel biológico dos taninos nas plantas tem sido investigado e
acredita-se que esteja envolvido na defesa química das plantas contra o ataque de
herbívoros vertebrados ou invertebrados e contra microrganismos patogênicos
(TAKECHI et al., 1985; TEMMINK et al., 1989 apud COSTA et al., 2008). Os modos de
ação propostos contra os predadores seriam: diminuição da palatabilidade pelo sabor
adstringente, dificuldades na digestão pela formação de complexos dos taninos com
enzimas digestivas e/ou com proteínas da planta e, por último, produtos tóxicos
formados no trato digestivo a partir da hidrólise dos taninos (ZUANAZZI, 2000 apud
COSTA et al., 2008).
Plantas ricas em taninos sejam eles condensados ou hidrolisáveis, são
empregadas na medicina tradicional como remédios para o tratamento de diversas
moléstias e processos inflamatórios em geral (HASLAM, 1996 apud COSTA et al.,
2008). Segundo Minho (2006), fontes de TC (forrageiras ou extratos de plantas),
quando fornecidas a ruminantes, melhoram a absorção protéica desses animais.
Atribui-se à maior absorção protéica: maior produção de lã, carne e leite, assim como
melhora na taxa de ovulação das fêmeas. Os prováveis mecanismos responsáveis
pela atividade farmacológica dos taninos seriam: a capacidade de formar complexos
com outras moléculas incluindo polissacarídeos e proteínas; formar complexos com
íons metálicos e exercer a atividade antioxidante e sequestradora de radicais livres
(OKUDA, 2005 apud COSTA et al., 2008).
Há aproximadamente 40 anos, Taylor e Murant (1966 apud IQBAL et al., 2007)
relataram o uso de TC para reduzir populações de nematoides do solo. Por isso, se
supôs que os TC podem ser capazes de afetar os nematódeos no trato gastrintestinal
de ovinos. Essa ação sobre os nematódeos gastrintestinais fornece subsídios para
estudos de exploração científico-comercial destes compostos químicos na criação de
 37

ovinos no Brasil e no mundo (MINHO, 2006). Portanto, o efeito da utilização de TC

como anti-helmíntico em animais tem sido amplamente pesquisado durante os últimos
10-15 anos. Há inúmeros relatos que indicam os efeitos diretos ou indiretos do uso dos
TC como anti-helmíntico (IQBAL et al., 2007).
Com relação aos parasitos gastrintestinais há evidências, por meio de testes in
vitro e in vivo, de que os taninos condensados são eficazes no combate às helmintoses
(COSTA et al., 2008).Segundo Hoste et al. (2006 apud YOSHIHARA et al., 2013)
taninos podem afetar os processos biológicos dos nematódeos dependendo de onde e
como os taninos se ligam com várias estruturas dos nematódeos tais como a bainha,
cutícula, sistema digestivo ou reprodutivo.
Duas hipóteses têm sido sugeridas para explicar o efeito anti-helmíntico dos TC
contra uma população de nematódeos gastrintestinais. A primeira é o efeito direto,
definido como a capacidade que os taninos têm de agir no parasito, afetando
severamente os processos biológicos dos nematódeos (HOSTE et al., 2006).
A segunda hipótese poderia ser o efeito indireto, no qual os taninos poderiam
atuar indiretamente, melhorando a utilização proteica pelo hospedeiro e,
consequentemente, a melhor resposta imunológica deste aos parasitos (BUTTER et
al., 2000; STRAIN; STEAR, 2001 apud YOSHIHARA et al., 2013). Entretanto, o exato
mecanismo de ação é incerto e pode diferir dependendo do parasito e estágio
dedesenvolvimento da planta (MIN; HART, 2003 apud YOSHIHARA et al., 2013).
Segundo Iqbal (2007), os efeitos diretos dos TC como anti-helmíntico parecem
ser limitados à fase de desenvolvimento, não sendo efetivos em nematóides adultos.
Apesar disso, ambos os efeitos diretos e indiretos dos TC são benéficos na diminuição
da contaminação de pastagens, reduzindo a eclodibilidade de ovos e redução do
FECRT em ovinos.
A diminuição do OPG em animais que receberam fontes de TC pode provir de
duas origens: pela diminuição da carga parasitária, ou por redução da fecundidade das
fêmeas de nematódeos. Os TC agem nas duas fases de desenvolvimento dos
nematódeos: reduzindo a carga parasitária do animal, diminuindo a fecundidade das
fêmeas e com isso a eliminação de ovos pelo hospedeiro (fase 1); ou diminuindo a
porcentagem de eclosão dos ovos e ainda podendo diminuir a viabilidade das L1 e
com isso gerando um menor número de L3 (fase 2). Portanto, o uso dos TC é de
grande valor no controle das parasitoses na ovinocultura, sendo importante ferramenta,
já que age na epidemiologia das helmintoses em todas as suas fases (MINHO, 2006).
 38

Oliveira et al. (2011) comentam que na maioria dos testes in vivo, o efeito dos
TC é determinado a partir da comparação da eficácia de plantas taniníferas com
plantas que não contêm esses compostos em hospedeiros natural ou
experimentalmente infectados com nematoides gastrintestinais.
É importante salientar que tanto os efeitos benéficos quanto os efeitos deletérios
acarretados pelos taninos dependem de muitos fatores, sobretudo da concentração e
da estrutura desses compostos (HOSTE et al., 2006).
Segundo Minho (2006), dois produtos ricos em TC e descritos como
potencialmente anti-helmínticos são o extrato de quebracho (Schinopsis brasiliensis)
e o extrato de acácia negra (Acacia mearnsii). Este autor relatou em suas pesquisas
que com a administração de extrato de acácia, houve uma diminuição do OPG e na
carga parasitária significativa dos animais infectados naturalmente por H. contortus e
T. colubriformis. Em outro estudo utilizando também o extrato de A. mearnsii, Minho
et al. (2008) avaliaram os efeitos inibitórios do extrato sobre a alimentação de larvas
de primeiro estágio (L1) de H. contortus, T.colubriformis e T. circumcincta. Neste
experimento foi relatado que uma determinada dose do extrato acarretou efeitos
deletérios em L1 de todos os nematódeos avaliados, sendo que a partir dessa
concentração, aproximadamente, 100% das larvas apresentaram-se inviáveis. A
dose descrita sugere a potencial utilização dessa fonte de TC no controle alternativo
de parasitos. A ação anti-helmíntica da A. Mearnsii também foi avaliada por
Yoshihara (2012 apud YOSHIHARA, 2013), utilizando-se o teste de inibição da
eclosão de ovos e inibição da migração larval. De acordo com o autor, o extrato de
acácia reduziu a eclosão de ovos e a migração das L3, demonstrando que o extrato
tem ação ovicida e larvicida.
Além da possibilidade da utilização em sistemas de produção onde os
quimioterápicos são restringidos ou proibidos, os TC podem ainda ser utilizados no
controle alternativo, concomitantemente ao controle parasitário tradicional, com a
finalidade de diminuir e espaçar as administrações das drogas anti-helmínticas
convencionais (YOSHIHARA et al., 2013).
É necessário enfatizar que, em qualquer estudo farmacológico é necessária a
avaliação da toxicidade das substâncias avaliadas e, na fitoterapia, deve se considerar
ainda mais o estudo dessa questão, pois nos extratos de plantas, tanto princípios
ativos como produtos tóxicos podem estar presentes.
 39

5. CONCLUSÃO

O ECSMV foi um período de aprendizado complementar às disciplinas

ministradas durante a graduação, que possibilitou entender melhor a relação entre a
teoria e a prática e a realidade a campo.
A escolha da área de sanidade animal proporcionou uma visão interessante,
ao se perceber que, na região do local de estágio, o maior problema relacionado
nessa área é com parasitas de forma geral, ao contrário do que se vê durante o
ensino acadêmico, em que doenças bacterianas e víricas são prioridades quando a
esse assunto está em pauta.
Relativo ao local de estágio, pôde-se ver como são o funcionamento, os
procedimentos e a estruturação de uma empresa de caráter público e reconhecida
nacional e internacionalmente. Além disso, fatores que chamam a atenção são os
valores da empresa, que visam principalmente à sustentabilidade e aplicabilidade de
seus estudos e também a relação com seu público-alvo: os agropecuaristas. O papel
exercido pela Embrapa Pecuária Sul é de suma importância, pois esta consegue
transmitir os resultados de seus trabalhos de uma forma que os produtores
consigam compreendê-los e aplicá-los em suas propriedades.
Durante o período do ECSMV no Laboratório de Helmintologia foi possível
acompanhar e executar técnicas que tanto serviram de revisão ao que foi aprendido
durante a vida acadêmica, como acrescentaram novos conhecimentos, mais
específicos na área. Um fator relevante ao aprendizado foi a autonomia para a
realização de procedimentos laboratoriais concedida pelo supervisor durante o
período de estágio.
Além da aquisição de experiência nas práticas laboratoriais, também se teve
condições de entender o quanto é importante a resistência dos parasitas aos
 40

antiparasitários na atualidade e quão necessário é criar novos princípios e formas

para controlá-la. Pôde-se perceber que a fitoterapia já demonstrou eficácia
antiparasitária, pois plantas que possuem taninos condensados têm se mostrado
promissoras contra os vermes, e por ser uma terapia mais barata, ecológica e
sustentável, vêm ganhando espaço no mundo da pesquisa da medicina veterinária.
 41

6. BIBLIOGRAFIA

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 44

ANEXOS
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Anexo A – Protocolo do Teste de Inibição da Migração Larvar (Larval Migration

Inhbition Test – LMIT) – Embrapa Pecuária Sul
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ANEXO B – Comunicado Técnico sobre Ensaio de Inibição do

Desembainhamento Larvar (Larval Exsheathment Inhibition Assay – LEIA) –
Embrapa Pecuária Sul
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ANEXO C – Protocolo do Ensaio de Inibição da Alimentação Larvar (Larval

Feeding Inhibition Assay– LFIA) – Embrapa Pecuária Sul
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ANEXO D – Protocolo do teste da Contagem de Ovos por Grama de fezes –

Embrapa Pecuária Sul
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ANEXO E – Protocolo da técnica de Coprocultura – Embrapa Pecuária Sul

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ANEXO F – Certificado do curso Atualização em técnicas laboratoriais e de

campo para realização de ensaios experimentais com parasitologia veterinária:
foco em helmintos gastrintestinais de ruminantes – Embrapa Pecuária Sul
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ANEXO G – Certificado do Estágio Curricular Supervisionado em Medicina

Veterinária, no setor de Sanidade Animal da Embrapa Pecuária Sul
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