Documentos

Julho, 2011

Fotos: Mariangela Hungria

Manual de Curadores de
Germoplasma Micro-organismos:
Rizbios e Bactrias Promotoras do
Crescimento Vegetal

Julho, 2011
Empresa Brasileira de Pesquisa Agropecuria
Embrapa Recursos Genticos e Biotecnologia
Ministrio da Agricultura, Pecuria e Abastecimento

Documentos
333
332

Embrapa Recursos Genticos e

Biotecnologia
ISSN 0102-0110
Embrapa Soja
ISSN 2176-2937

Manual de Curadores de
Germoplasma Micro-organismos:
Rizbios e Bactrias Promotoras do
Crescimento Vegetal
Mariangela Hungria
Krisle da Silva

Embrapa Recursos Genticos e Biotecnologia

Braslia, DF
2011

Exemplares desta publicao podem ser adquiridos na:

Embrapa Recursos Genticos e Biotecnologia
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Fotos da capa/Montagem: Mariangela Hungria/Rafaela Marcondes Oliveira
1 edio (online)

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A reproduo no autorizada desta publicao, no todo ou em parte,
constitui violao dos direitos autorais (Lei n 9.610).
Dados Internacionais de Catalogao na Publicao (CIP)
Embrapa Recursos Genticos e Biotecnologia

Hungria, Mariangela.
Manual de Curadores de Germoplasma Micro-organismos: Rizbios e Bactrias
Promotoras do Crescimento Vegetal. / Mariangela Hungria e Krisle da Silva. Braslia, DF:
Embrapa Recursos Genticos e Biotecnologia, 2011.
21 p. (Documentos / Embrapa Recursos Genticos e Biotecnologia, 333;
Documentos / Embrapa Soja, 332).

1. Recursos Genticos Micro-organismos. 2. Conservao. 3. Rizbios. 4. Bactrias

5. Crescimento Vegetal. I. Silva, Krisle da. II. Ttulo. III. Srie.

579 - CDD
Embrapa 2011

Autores

Mariangela Hungria
Ph.D. em Agronomia (Cincias do Solo), Pesquisadora da Embrapa
Soja
mariangela.hungria@embrapa.br
Krisle da Silva
Ph.D. em Microbiologia Agrcola, Pesquisadora da Embrapa Roraima
krisle.silva@embrapa.br

Apresentao

Desde o incio da dcada de 1970, h uma crescente conscientizao mundial sobre a

necessidade de preservao dos recursos genticos, que so essenciais para o
atendimento das demandas de variabilidade gentica dos programas de melhoramento,
principalmente aqueles voltados para alimentao.
No Brasil, essa necessidade especialmente importante, uma vez que a maioria dos
cultivos que compem a base alimentar do pas de origem extica. Observa-se, por
exemplo, que cerca de 95% dos acessos de cereais conservados em colees do Sistema
Nacional de Pesquisa Agropecuria (SNPA) so de espcies exticas. Portanto, a
manuteno e o enriquecimento contnuo da variabilidade gentica dessas colees so
prioritrios e estratgicos, considerando, ainda, as atuais restries internacionais ao
intercmbio de germoplasma.
Na dcada de 1970, a Food and Agriculture Organization (FAO), rgo das Naes Unidas,
estimulou o estabelecimento de uma rede mundial de centros para a conservao de
recursos genticos situados em regies consideradas de alta variabilidade gentica. Em
1974, o Consultative Group for International Agricultural Research (CGIAR) criou o
International Board for Plant Genetic Resources (IBPGR), hoje transformado no Bioversity
International. No mesmo ano, a Embrapa reconheceu a importncia estratgica dos
recursos genticos com a criao do Centro Nacional de Recursos Genticos (CENARGEN),
que mais recentemente adotou a assinatura-sntese Embrapa Recursos Genticos e
Biotecnologia.
A criao da Embrapa Recursos Genticos e Biotecnologia e a consolidao do SNPA
estabeleceram ambiente propcio para a formatao da Rede Nacional de Recursos
Genticos. A partir de ento, paulatinamente, colees de germoplasma foram
estruturadas em diferentes Unidades Descentralizadas, predominantemente na rea
vegetal.
Em 1993, por intermdio de deliberao da Diretoria Executiva, a Embrapa formalizou,
como ferramenta de gesto das colees, o Sistema de Curadorias de Germoplasma e
definiu os papis e as responsabilidades para os diversos atores envolvidos nesse Sistema,
tais como: curadores de colees de germoplasma, chefes de Unidades Descentralizadas
que abrigavam as colees e a Superviso de Curadorias. Os projetos em rede foram
definidos como figuras programtica e operacional, possibilitando o custeio de atividades
de coleta, intercmbio, quarentena, caracterizao, avaliao, documentao, conservao
e utilizao de germoplasma, alm da manuteno das colees. De 1993 at a presente
data, muitas colees de germoplasma foram estabelecidas e, atualmente, o Sistema de
Curadorias da Embrapa rene 209 colees, incluindo Bancos Ativos de Germoplasma
Vegetal (BAGs), Ncleos de Conservao Animal, Colees Biolgicas de Microorganismos e Colees de Referncia, as quais abrangem espcies nativas e exticas. Nas

demais Instituies do SNPA, estima-se que so mantidos pelo menos outros 243 Bancos
Ativos de Germoplasma Vegetal.
Como duplicata de segurana dos acessos mantidos nos BAGs, a Embrapa Cenargen
abriga a Coleo de Base (COLBASE) de germoplasma vegetal, projetada para conservar
sementes temperatura de -20C por longo perodo de tempo.
Como consequncia desses 30 anos de atividades relacionadas ao manejo dos recursos
genticos, os curadores adquiriram uma bagagem de conhecimentos prticos na rea,
conhecimentos estes que foram, em parte, sistematizados e disponibilizados para a
sociedade por intermdio da presente obra: Manual de Curadores de Germoplasma.
Esperamos que esta publicao em srie torne-se um guia para curadores de germoplasma
no Brasil e no exterior, e que contribua efetivamente para o aprimoramento da gesto dos
recursos genticos deste pas.

Mauro Carneiro
Chefe Geral
Embrapa Recursos Genticos e Biotecnologia

Sumrio

Introduo

08

Coleta de amostras

08

Isolamento

09

Identificao e caracterizao

09

Caracterizao fenotpica

09

Caracterizao genotpica

13

Anlise do gene ribossomal 16S e outros genes housekeeping

13

Fingerprinting de bactrias

14

Preservao

16

Valorao das bactrias

16

Armazenamento dos dados da coleo

17

Transferncia de material gentico

18

Segurana e controle de qualidade

18

Referncias

19

Rizbios e Bactrias Promotoras

do Crescimento Vegetal
Mariangela Hungria
Krisle da Silva

Introduo
Existe uma demanda crescente por produtos agrcolas, resultante do incremento na
populao; entretanto, as terras disponveis para o cultivo so cada vez mais limitadas,
quadro este agravado pela degradao resultante do mau manejo do solo, acompanhada
pela eroso da fertilidade, que acentuada em vrios pases, como o Brasil, pelo preo
elevado dos fertilizantes qumicos. Nesse contexto, diversas bactrias do solo podem
contribuir substancialmente, a baixo custo, no s para a nutrio de plantas, mas
tambm para a melhoria das propriedades fsicas e qumicas do solo, resultando em maior
produo de alimentos e melhoria na qualidade dos solos.
O objetivo deste manual fornecer informaes bsicas de procedimentos a serem
adotados para a criao e manuteno de coleo de bactrias capazes de realizar o
processo de fixao biolgica do nitrognio (diazotrficas) e de bactrias promotoras do
crescimento de planta para curadores de colees de culturas. A preservao adequada
dessas bactrias de grande interesse para o agronegcio brasileiro e tambm para o meio
ambiente, podendo, ainda, representar uma fonte importante de genes com grande
potencial biotecnolgico.

Coleta de amostras
As bactrias esto presentes em praticamente todos os ambientes. A coleta dever ser
realizada de acordo com os grupos de interesse que se deseja ter na coleo. Como
exemplo, se a coleo de interesse para bactrias que promovam o crescimento vegetal,
estas devem ser coletadas em reas onde esses grupos so abundantes e/ou esto
presentes (ex.: rizosfera); caso a coleo seja de bactrias diazotrficas simbiticas,
devem ser coletados ndulos de diversas leguminosas hospedeiras.
A expedio para a coleta deve ser planejada com antecedncia. Questes sobre
autorizao para coleta em determinada rea segundo a legislao vigente, equipe que
realizar a coleta, material a ser levado, acondicionamento do material coletado, anotaes
sobre a coleta e a recepo no laboratrio devem estar definidas antes de se iniciar a
coleta.
As amostras coletadas para isolamento de bactrias devem ser acondicionadas em
material adequado e estril at a chegada ao laboratrio. Todo o material para coleta
dever ser esterilizado. As informaes mnimas referentes a cada amostra coletada

Manual de Curadores de Germoplasma Micro-organismos: Rizbios e Bactrias Promotoras do Crescimento Vegetal

devero incluir: data, local (com as coordenadas geogrficas latitude, longitude,

elevao), tipo de amostra coletada (ex.: tecido vegetal, solo, gua, etc.), responsvel pela
coleta e caractersticas do local onde foi realizada a coleta. A quantidade de amostra
coletada dever ser suficiente para permitir o isolamento, deve representar a rea coletada
e, tambm, ser suficiente para outras anlises no microbiolgicas. Como exemplo, para
amostras de solo coletadas para isolamento de bactrias, tambm devem ser realizadas
anlises qumicas e fsicas do solo.
A coleta um ponto crucial para o isolamento de grupos de bactrias de interesse. Uma
coleta mal realizada ou a falta de informaes sobre a rea onde foi realizada a coleta
podem comprometer todo o trabalho posterior.

Isolamento
O tempo entre a coleta da amostra e o isolamento dever ser o menor possvel, a fim de
minimizar qualquer alterao nas amostras coletadas. O isolamento dever ser realizado de
acordo com o grupo que se deseja estudar. Como exemplo, para o isolamento de bactrias
simbiticas fixadoras de nitrognio, pode-se utilizar o protocolo descrito por Hungria
(1994); para bactrias fixadoras de nitrognio associadas a no leguminosas, recomendase o protocolo de Videira et al. (1997). A descrio de meios de cultura prprios para
esses e outros micro-organismos, como os promotores de crescimento vegetal, tambm
pode ser encontrada na publicao de Campo e Hungria (2006).
Cada amostra que for enviada para a coleo do laboratrio dever vir acompanhada de
um formulrio especfico de envio, contendo informaes sobre o isolado ou a estirpe
depositada.

Identificao e caracterizao
Caracterizar significa atribuir caractersticas, que podem ser fenotpicas ou genotpicas. As
caractersticas fenotpicas podem sofrer alteraes com o meio ambiente e podem diferir
em cada meio de cultivo em que a bactria for cultivada. J as caractersticas genotpicas
so estveis e no sofrem alterao do ambiente. A caracterizao uma ferramenta
importante para a identificao das bactrias.

Caracterizao fenotpica
A caracterizao fenotpica, realizada por meio da caracterizao morfo-fisiolgica cultural
das colnias isoladas em meio de cultivo, uma tcnica fcil e que pode ser empregada
em qualquer laboratrio. Permite uma caracterizao inicial das estirpes e importante
para efeito de comparao de estirpes que sejam cultivadas nas mesmas condies, isto ,
mesmo meio de cultivo, temperatura e perodo de crescimento. A caracterizao sempre
realizada a partir de colnias isoladas.
Para as bactrias simbiticas fixadoras de nitrognio, coletivamente denominadas de
rizbios, a caracterizao inicial realizada em meio YMA Yeast Manitol Agar (VINCENT,
1970), tambm conhecido como meio ELMA (extrato de levedura, manitol, gar) ou meio
79, em que so utilizados dois corantes: vermelho Congo, para auxiliar na identificao de
contaminantes, que em geral absorvem a cor vermelha; e azul de bromotimol, para

09

10

Manual de Curadores de Germoplasma Micro-organismos: Rizbios e Bactrias Promotoras do Crescimento Vegetal

verificar a reao cida ou bsica na presena de manitol suprido como fonte de carbono
(Figura 2). As bactrias so repicadas em placas de Petri contendo o meio YMA, por meio
de estrias para a obteno de colnias isoladas, que sero ento caracterizadas. As
caractersticas avaliadas so: manifestao do crescimento (rpido, lento, intermedirio e
muito lento); alterao do pH do meio (cido, neutro ou alcalino); tamanho (dimetro das
colnias); forma da colnia (circular, irregular, puntiforme); elevao da colnia (plana,
lenticular, convexa, pulvinada, umbonada, umbilicada); borda (inteira, ondulada, lobada,
denteada, filamentosa); superfcie (lisa, rugosa ou papilada); produo de muco (escassa,
pouca, moderada ou abundante); consistncia (seca, aquosa, gomosa, viscosa ou butrica);
detalhes pticos (transparente, translcida ou opaca); e cromognese em vermelho Congo
e em azul de bromotimol. Na Figura 1, so apresentadas as caractersticas morfolgicas
das colnias de bactrias encontradas nos meios de cultivo. Como exemplo, no Quadro 1
apresentado o formulrio de descrio morfo-fisiolgica das bactrias da coleo da
Embrapa Soja.
Nessa etapa inicial, vrios testes bioqumicos podem ser utilizados para a caracterizao
de propriedades especficas das bactrias. Para as bactrias promotoras do crescimento
vegetal, podem ser empregados testes para deteco de siderforos por meio de cromo
azurol S (CAS), produo de cido indol actico, deteco de quitinase, beta-1,3glucanase, 1-aminociclopropano-1-carboxylato (ACC) deaminase e capacidade de
solubilizar fosfatos. As metodologias para essas avaliaes podem ser consultadas na
publicao de Campo e Hungria (2006).

Figura 1. Morfologia de colnias de bactrias utilizadas para caracterizao cultural em meio de cultivo.

Fotos: Krisle da Silva

Manual de Curadores de Germoplasma Micro-organismos: Rizbios e Bactrias Promotoras do Crescimento Vegetal

Figura 2. Iniciando pela esquerda: placa de rizbios mostrando o esgotamento at a obteno de colnias puras;
crescimento de rizbios em meio YMA contendo azul de bromotimol como indicador; preservao em ampolas
liofilizadas; preservao em tubos com meio de cultura slido; nodulao de raz de leguminosa por rizbios; e
avaliao no campo da eficincia agronmica de rizbios.

11

12

Manual de Curadores de Germoplasma Micro-organismos: Rizbios e Bactrias Promotoras do Crescimento Vegetal

Quadro 1. Formulrio de avaliao morfo-fisiolgica das bactrias da coleo de culturas de microorganismos multifuncionais da Embrapa Soja.
Ensaio: ( ) recebimento ( ) peridico ( ) outro _____________________________
Estirpe:
Solues/Reagentes
Equipamentos/Vidrarias
utilizados
utilizados

As caractersticas dos itens 3 a 14 devem ser observadas na fase final de avaliao, a partir da
anotao do dimetro das colnias.
1.
Manifestao do Crescimento (colnias isoladas):
( ) rpida (at 3 dias)
( ) intermediria (4 a 5 dias)
( ) lenta (6 a 9 dias)
( ) muito lenta (acima de 10 dias)
2.

Tamanho (dimetro das colnias):

__ mm aos _ dias (na manifestao das colnias isoladas) rpido 5 dias intermedirio 8 dias
__ mm aos _ dias (no final da avaliao) lento 12 dias muito lento 15 dias

3.
Alterao do pH no meio YMA com o indicador Azul de Bromotimol:
( ) cido (amarelo)
( ) neutro (sem alterao de cor) ( ) alcalino (azul)
4.
Forma da colnia:
( ) puntiforme (at 1 mm)

( ) circular

5.
Elevao da colnia:
( ) plana
( ) lenticular
6.
Borda da colnia:
( ) inteira
( ) ondulada

( ) irregular

( ) convexa

( ) lobada

( ) pulvinada (drop-like)

( ) denteada ( ) filamentosa

7.
Superfcie da colnia:
( ) lisa
( ) rugosa

( ) papilada

8.
Produo de muco:
( ) escassa
( ) pouca

( ) moderada

9.
Consistncia da massa de crescimento:
( ) seca
( ) aquosa
( ) gomosa (creme)
(manteiga)
10.
Detalhes pticos:
( ) transparente

( ) translcido

( ) abundante

( ) viscosa (elstica)

( ) opaco

11.
Cromognese da colnia em meio YMA com indicador Azul de Bromotimol:
( ) incolor (lupa)
( ) branco (olho nu)
( ) creme
( ) amarelo
12.
Cromognese da colnia em meio YMA com corante Vermelho Congo:
( ) incolor (lupa)
( ) branco
( ) rosado (levemente) ( ) rosa (beb)
( ) avermelhado (centro) ( ) vermelho
13. Colorao de Gram:
( ) Gram-positiva cor violeta ( ) Gram-negativa cor vermelha
14.

Outras informaes (registrar no verso)

Data: __/__/___

( ) butrica

Responsvel: ____________________

( ) rosa

Manual de Curadores de Germoplasma Micro-organismos: Rizbios e Bactrias Promotoras do Crescimento Vegetal

Caracterizao genotpica
Anlise do gene ribossomal 16S e outros genes housekeeping
A caracterizao genotpica, ao contrrio da caracterizao fenotpica, no sofre alteraes
devido ao ambiente. Pela definio atual de taxonomia, a sequncia completa do gene 16S
RNA ribossomal (RNAr) consegue definir a classificao das bactrias ao nvel de gnero e,
em alguns casos, de espcie. Desse modo, os genes 16S RNAr devem ser
preferencialmente utilizados em estudos de taxonomia e filogenia, havendo um esforo em
depositar um grande nmero dessas sequncias, por exemplo, no Ribosomal Database
Project (http://rdp.cme.msu.edu/). Alm disso, tem aumentado o depsito de sequncias
referentes a outros genes ribossomais, como o 23S DNAr e o espao intergnico 16S-23S
RNAr (IGS, regio intergnica), que apresentam maior divergncia entre as espcies,
diferem quanto taxa de evoluo e no caso do 23S RNAr apresentam maior nmero
de bases. Para a obteno do gene 16S RNAr completo, podem ser necessrias vrias
reaes de amplificao, como exemplificado no estudo conduzido por Menna et al.
(2009) e visualizado no Quadro 2, com a utilizao de cinco primers.
Outra metodologia mais recente que vem sendo cada vez mais empregada, o Multilocus
Sequence Typing MLST (caracterizao por sequenciamento de lcus mltiplos) consiste
no sequenciamento, em geral de cinco genes, e na anlise conjunta, como uma nica
sequncia concatenada, de genes conservados, tambm denominados de housekeeping.
Os genes utilizados como marcadores filogenticos alternativos, alm de serem
conservados para o grupo em estudo, precisam obedecer a alguns critrios: i) distribuio
no genoma com uma distncia mnima entre os genes de 100 kb; ii) presena no genoma
em uma nica cpia; iii) extenso nucleotdica suficiente que permita o sequenciamento;
iv) conter informaes suficientes para as anlises; e v) que os dados obtidos com o uso
desses genes sejam correlacionados com os dados obtidos com o gene ribossomal 16S e
com os percentuais de similaridade obtidos por hibridizao DNA-DNA. Aplicando-se o
mesmo princpio do MLST taxonomia e filogenia, desenvolveu-se a metodologia de
Multilocus Sequence Analysis (MLSA), com propsitos especficos que permitem sua
utilizao para a definio de espcies e a elucidao de relaes taxonmicas e
filogenticas entre espcies bacterianas.
Atualmente, vrios laboratrios dispem de sequenciadores, e a identificao de bactrias
por meio do emprego de genes ribossomais e outros genes housekeeping rotina no
Laboratrio de Biotecnologia do Solo da Embrapa Soja, com a utilizao dos primers
especificados no Quadro 2, que foram utilizados nos trabalhos de Menna et al. (2009) e
Ribeiro et al. (2009).

13

14

Manual de Curadores de Germoplasma Micro-organismos: Rizbios e Bactrias Promotoras do Crescimento Vegetal

Quadro 2. Primers e condies de amplificao utilizadas em anlises de MLSA com rizbios por
Menna et al. (2009), Ribeiro et al. (2009) e neste volume.
Gene (bp) Primer

Sequncia (5 - 3)

Fragmento

Ciclos de amplificao

(pb)
16S RNAr
(1,500)

fD1*

ccgaattcgtcgacaacAGAGTTTGATCCTGGCT
CAG

Y2(r)
362f
786f

CCCACTGCTGCCTCCCGTAGGAGT
CTCCTACGGGAGGCAGCAGTGGGG
CGAAAGCGTGGGGAGCAAACAGG

1203f
rD1*

GAGGTGGGGATGACGTCAAGTCCTC
cccgggatccaagcttAAGGAGGTGATCCAGCC

dnaK
(1,900)

dnaK1466F

AAGGARCANCAGATCCGCATCCA

dnaK1777R

TASATSGCCTSRCCRAGCTTCAT

recA
(1,090)

recA6F

CGKCTSGTAGAGGAYAAATCGGTGGA

recA555R

CGRATCTGGTTGATGAAGATCACCAT

gltA
(1,290)

gltA428F

CSGCCTTCTAYCAYGACTC

gltA1111R

GGGAAGCCSAKCGCCTTCAG

~1,500 pb
(para fD1rD1)

Para sequenciamento
2 min 95C, 30 X (10s
95C, 4s 50C, 4 min
60C), manuteno a 4C
~310

~550

~680

glnII (1,040) TSglnIIf

TSglnIIr

AAGCTCGAGTACATCTGGCTCGACGG
SGAGCCGTTCCAGTCGGTGTCG

~670

rpoA
(1,010)

RRrpoAf

GGAAATCGCCATCAAGATGG

~730

RRrpoAr

ACGCTTGGCGAGATCTTC

TSatpDf

TCTGGTCCGYGGCCAGGAAG

TSatpDr

CGACACTTCCGARCCSGCCTG

atpD
(1,460)

Para amplificao
2 min 95C, 30 X (10s
95C, 4s 50C, 4 min
60C), ciclo final de
extenso de 5 min 72C,
manuteno a 4C

~615

1 min 94C, 35 X (1 min

94C, 1 min 64C, 40s
72C), ciclo final de
extenso de 5 min 72C
2 min 95C, 35 X (45s
95C, 30s 58C, 1,5 min
72C), ciclo final de
extenso de 7 min 72C
5 min 95C, 3 X (2 min
94C, 2 min 53C, 1 min
72C), 30 X (30s 94C, 1
min 53C, 1 min 72C),
ciclo final de extenso de 5
min 72C
2 min 95C, 35 X (45s
95C, 30s 58C, 1,5 min
72C), ciclo final de
extenso de 7 min 72C
2 min 95C, 35 X (45s
94C, 45s 55C, 2 min
72C), ciclo final de
extenso de 5 min 72C
2 min 95C, 35 X (45s
95C, 30s 58C, 1,5 min
72C), ciclo final de
extenso de 7 min 72C.

*Letras minsculas indicam grampos que so utilizados para clonagem, mas que tambm conferem maior estabilidade amplificao.

Fingerprinting de bactrias
A anlise de genes ribossomais e outros genes housekeeping, porm, no consegue
diferenciar estirpes. Desse modo, outros mtodos genticos de fingerprinting devem ser
utilizados para o controle de qualidade das bactrias, tanto na rotina de manuteno das
colees de culturas quanto na etapa de distribuio das estirpes. Em geral, essas tcnicas
permitem verificar a diversidade intraespecfica, ou seja, a subdiviso de espcies em um
nmero distinto de tipos, fornecendo um suporte para bactrias similares.
O fingerprinting de DNA pode basear-se na restrio do genoma total ou em amplificaes
especficas do genoma bacteriano por meio de PCR (Polymerase Chain Reaction), ou seja,
reao em cadeia da polimerase. Entre as diversas tcnicas de fingerprinting, podem ser
citadas: Restriction Fragment Length Polymorphism (RFLP), ou polimorfismo de
comprimento de fragmentos de restrio; Amplified Fragment Length Polymorphism

Manual de Curadores de Germoplasma Micro-organismos: Rizbios e Bactrias Promotoras do Crescimento Vegetal

(AFLP), ou polimorfismo de comprimento de fragmentos amplificados (VOS et al., 1995);

Random Amplified Polymorphic DNA (RAPD), ou DNA polimrfico amplificado ao acaso
(WELSH; MCCLELLAND, 1990; WILLIAMS et al., 1990); e amplificao com primers
relacionados a regies repetidas e conservadas do DNA bacteriano, conhecida por rep-PCR
(repetitive-sequence-based-PCR) (VERSALOVIC et al., 1994; de BRUIJN, 1992).
Para bactrias diazotrficas e promotoras do crescimento de plantas recomenda-se a
obteno de perfis de rep-PCR (Quadro 3), com nfase no BOX-PCR para a utilizao no
controle de qualidade para checagem da autenticidade para a distribuio das estirpes para
outros laboratrios e para as indstrias de inoculantes. A metodologia detalhada para a
obteno desses perfis foi descrita por Hungria et al. (2008). Em 2010, essa tcnica
passou a ser reconhecida como a metodologia oficial do MAPA (Ministrio da Agricultura,
Pecuria e Abastecimento) para a identificao de rizbios e bactrias promotoras do
crescimento vegetal visando produo de inoculantes comercializados no Brasil.
A coleo de culturas da Embrapa Soja utiliza regularmente esta tcnica para checar a
autenticidade de suas estirpes. Na Figura 3, so apresentados os perfis de BOX, REP e
ERIC para a estirpe CPAC 15 (=SEMIA 5079) de Bradyrhizobium japonicum.
Quadro 3. Primers e condies de amplificao utilizadas em anlises de rep-PCR, segundo Hungria
et al. (2008).
Primer

Sequncia (5 - 3)

BOX A1R

CTACGGCAAGGCGACGCTGACG

REP 1R

IIIICGICGICATCIGGC

REP 2I

ICGICTTATCIGGCCTAC

ERIC 1R

ATGTAAGCTCCTGGGGATTCAC

ERIC 2

AAGTAAGTGACTGGGGTGAGCG

Ciclos de amplificao
7 min 95C, 30 a 35 X (1min
94C, 1min 53C, 8min 65C),
ciclo final de extenso de 16min
65C
7min 95C, 30 a 35 X (1min
94C, 1min 45C, 8 min 65C por
8 min.), ciclo final de extenso de
16 min 65C
7 min 95C, 30 a 35 X (1min
94C, 1min 52C, 8min 65C por
8 min), ciclo final de extenso de
16 min 65C

Figura 3. Perfis de REP-, ERIC- e BOX-PCR obtidos para a estirpe CPAC 15 de Bradyrhizobium japonicum.

15

16

Manual de Curadores de Germoplasma Micro-organismos: Rizbios e Bactrias Promotoras do Crescimento Vegetal

Preservao
A preservao assegura a manuteno de formas viveis das bactrias sem a manipulao
frequente. Quando estirpes so isoladas, identificadas ou armazenada em uma coleo,
deve-se manter suas caractersticas culturais, morfolgicas e genticas. Para bactrias
comum a preservao por longos perodos. Diversos mtodos de preservao por longo
perodos so empregados, com nfase na criopreservao e na liofilizao. A preservao
deve assegurar a viabilidade das clulas, ausncia de contaminantes e ausncia de
alteraes nas caractersticas fenotpicas e genotpicas (autenticidade). Assim, devero ser
realizadas checagens peridicas do material preservado.
Os mtodos de preservao so divididos em mtodos envolvendo o congelamento e
mtodos de secagem a vcuo (DAY; STACEY, 2007). A criopreservao a manuteno
biolgica de organismos vivos sob baixa temperatura, de forma que eles possam
sobreviver aps descongelamento. Em geral, a criopreservao se refere manuteno
temperatura de -80C, mas novos ultrafreezers com temperaturas inferiores a -140C j
so encontrados no mercado. As bactrias tambm podem ser acondicionadas em
nitrognio lquido.
A liofilizao um processo em que a amostra congelada e, posteriormente, seca por
meio de sublimao (estado slido para gasoso). O principal objetivo desses processos
preservar organismos sem alteraes morfolgicas, fisiolgicas, bioqumicas e genticas.
Diversos crioprotetores tm sido empregados para micro-organismos, como
dimetilsulfxido, glicerol, albulmina, leite desnatado e peptona, entre outros (HUBLEK,
2003).
Em colees de cultura, devem ser mantidas amostras de estirpes criopreservadas e
liofilizadas com repeties (Figura 2). Aps a criopreservao e a liofilizao de um lote,
deve-se checar a viabilidade das clulas, para garantir que no houve morte celular durante
o processo de preservao. Deve-se tambm checar a viabilidade das estirpes bacterianas
ao longo do tempo, o que deve ser realizado por amostragem de cada lote criopreservado
e liofilizado, para checagem da viabilidade e autenticidade (caractersticas morfolgicas e
genotpicas), alm de possveis contaminantes.
Alm de um nmero adequado de cpias de estirpes mantidas por pelo menos dois
mtodos, prioritariamente criopreservao e liofilizao, tambm necessrio providenciar
uma cpia (backup) das estirpes, de preferncia armazenadas em outro edifcio.

Valorao das bactrias

O potencial de uso de uma determinada estirpe dever ser verificado em condies de
laboratrio, casa de vegetao e, nas etapas finais, no campo. Devem ser includos
tratamentos controle que permitam a confirmao desse potencial. Como exemplo, para a
verificao da capacidade de fixao de nitrognio em leguminosas de gros (Figura 2), os
tratamentos mnimos devem ser: 1) tratamento sem inoculao; 2) tratamento sem
inoculao, com nitrognio qumico fornecido na concentrao recomendada para a
cultura; 3) tratamentos com inoculao das estirpes j recomendadas para a cultura,
quando existentes, testadas separadamente ou em conjunto, quando essa for a tecnologia
recomendada; e 4) tratamentos com inoculao das estirpes a serem testadas,
separadamente ou em conjunto, quando essa for a tecnologia testada. Como exemplo de
quantidades de N a serem adicionadas por vaso, tem-se: para a soja (Glycine max) 700

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mg; para o feijo (Phaseolus vulgaris) e para o caupi (Vigna unguiculata) 350 mg, sempre
parcelados semanalmente.
Em casa de vegetao, os ensaios podem ser conduzidos em substrato estril e, em uma
etapa seguinte, em vasos com solo, para verificar a capacidade competitiva das estirpes.
Se uma estirpe elite for identificada, ela deve ento ser levada a um ensaio de campo.
Os parmetros mnimos a serem avaliados no caso de bactrias fixadoras de nitrognio so
nodulao nmero e massa de ndulos (Figura 2) , massa da parte area seca,
concentrao e nitrognio total nos tecidos, aos 25-30 dias aps a emergncia, se for
desejvel verificar o efeito do inoculante em solo com populao elevada de bactrias
semelhantes, ou no florescimento pleno, se o interesse for verificar o desempenho no
desenvolvimento das plantas. No caso de ensaios de campo, verificar o rendimento de
gros e o teor e N total acumulado nos gros no final do ciclo.
No caso de bactrias promotoras do crescimento de plantas, os parmetros avaliados
devem ser considerados conforme as propriedades desejadas. Como exemplo, no caso de
promoo no crescimento das razes, parmetros de avaliao de massa, rea e volume de
razes podem ser avaliados; para aumento na absoro de nutrientes, os teores de macro e
micronutrientes nos tecidos devem ser avaliados, preferencialmente no florescimento, e
assim para cada caso especfico.
O nmero mnimo de repeties em ensaios de campo deve ser de quatro, mas resultados
melhores so obtidos com seis repeties, por causa da variabilidade elevada de
parmetros microbiolgicos. No caso de avaliao da fixao biolgica do nitrognio com a
cultura da soja, Souza et al. (2008) determinaram os coeficientes de variao aceitveis
para diversos parmetros, os quais no devem diferir substancialmente em estudos com
outras leguminosas.

Armazenamento dos dados da coleo

Dados de cada estirpe da coleo devero ser armazenados, incluindo informaes sobre:
local de isolamento, substrato ou hospedeiro de isolamento, nome da pessoa responsvel
pelo isolamento, nome do responsvel pelo depsito, nome do responsvel pela
identificao, procedimento para preservao, nmero de cpias preservadas, meio de
cultivo apropriado, caractersticas de crescimento, propriedades morfo-fisiolgicas das
colnias e caracterizaes genotpicas disponveis, grupo de risco, disponibilidade para
distribuio. As informaes devero estar computadorizadas, com cpias de segurana e,
quando possvel, disponibilizadas via homepage institucional. Informaes sobre a
manuteno de cada estirpe tambm devero ser digitalizadas, como checagem da
viabilidade e autenticidade.
Mais uma vez, cabe salientar a importncia das informaes que devem estar disponveis
sobre cada estirpe, conforme estabelecidos pela OECD (2007) para bactrias e que podem
ser visualizadas no Quadro 4.

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Quadro 4. Conjunto mnimo e recomendado de dados sobre as estirpes de bactrias de uma coleo
de culturas, segundo a OECD (2007).
Conjunto mnimo de dados
(Minimum Data Set, MDS)
Nmero de acesso
Nmeros em outras colees
Nome
Nome infra-subespecfico
Tipo de organismo
Restries na distribuio
Situao
Histrico
Origem geogrfica
Condies de crescimento
Forma de suprimento

Conjunto recomendado de dados

(Recommended Data Set, RDS)
Serovar
Outros nomes
Forma isolada
Mutante
Gentipo
Literatura

Transferncia de material gentico

Todo o material transferido deve apresentar os respectivos Termo de Transferncia de
Material, ou Material Transfer Agreement, obedecendo legislao vigente.

Segurana e controle de qualidade

Todas as operaes realizadas em laboratrios de colees bacterianas devem ser
conduzidas com normas de segurana e seguindo metodologias padres que assegurem a
qualidade do servio realizado. As operaes devem seguir normas de boas prticas de
laboratrio e respeitar a legislao ambiental quanto ao descarte de qualquer material.

Manual de Curadores de Germoplasma Micro-organismos: Rizbios e Bactrias Promotoras do Crescimento Vegetal

Referncias

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