Fatores intrínsecos:

Atividade da água (Aa) - os microrganismos necessitam de água para sua

sobrevivência. Para o seu crescimento e metabolismo os microrganismos exigem a
presença de água numa forma disponível.
O valor absoluto de atividade de água fornece uma indicação segura do teor de água
livre do alimento, sendo esta a forma ideal de água usada pelos microrganismos. As
bactérias são usualmente mais exigentes quanto a disponibilidade de água livre,
seguida das leveduras e dos bolores. Algumas espécies de bolores destacam-se pela
elevada tolerância à baixa Aa.
A única forma utilizada pelos MOs é a água livre.

Atividade de Água (Aa; Wa):

Aa - (disponibilidade de H2O para reações) P/ Po.
Po - pressão parcial de vapor d’água contida no alimento *.
P - pressão parcial de vapor d’água pura *.

pH: É um dos principais fatores intrínsecos capaz de determinar o crescimento,

sobrevivência ou destruição dos microrganismos nele existente. Os microrganismos
têm valores de pH ótimo e máximo para sua multiplicação. Verifica-se que pH em
torno da neutralidade (6,5 – 7,5) é o mais favorável para a maioria dos
microrganismos.

Classificação dos alimentos em função do pH

1. Alimentos pouco ácidos → pH superior a 4,5 – nesta faixa de pH a microbiota do
alimento é bastante variada, havendo condições para o desenvolvimento da maioria
das bactérias inclusive as patogênicas, bolores e leveduras.
2. Alimentos ácidos → pH entre 4,0 – 4,5. Nesta faixa a microbiota já é bem mais
restrita, representada por bactérias láticas e algumas formas esporuladas do gênero
Bacillus e Clostridium
3. Alimentos muito ácidos → pH inferior a 4,5. Nesta faixa a microbiota capaz de se
desenvolver é restrita, praticamente, aos bolores e leveduras além de bactérias lácteas
e acéticas

Disponibilidade de Oxigênio ou Potencial de Oxirredução

O potencial de oxigênio (oxidante ou redutor) do alimento determina os tipos de

microrganismo que se desenvolverão.
A presença do oxigênio é o fator que mais contribui para o aumento do potencial
redox de um alimento.
De acordo com esse parâmetro, os Mos são classificados em:
– Aeróbicos: quando dependem da presença de oxigênio para se desenvolver;
– Anaeróbicos: quando só se desenvolvem na ausência de oxigênio;
– Microaerófilos: quando seu crescimento é melhor em pressões reduzidas de
oxigênio;
– Facultativos: quando podem se desenvolver tanto na presença quanto na ausência
de oxigênio.
Composição do alimento
Os microrganismos variam quanto às suas exigências aos fatores de crescimento e à
capacidade de utilizarem os diferentes substratos que compõem os alimentos. Para
que a multiplicação microbiana seja possível, os seguintes nutrientes devem estar
disponíveis: água, fonte de nitrogênio, fonte de carbono, vitaminas e sais minerais.
Assim, de acordo com o tipo de nutrientes que compõe o alimento, podemos
determinar qual o microrganismo que terá maiores possibilidades de se desenvolver.
A maior parte dos Mos é seletiva em relação a fonte de carbono e de nitrogênio.

Competição
Presença de grupo microbiano antagônico
Produtos fermentados
Competição pelos nutrientes – modificação do ambiente

Fatores extrínsecos

Temperatura: É provavelmente, o mais importante fator ambiental afetando o

crescimento. Microrganismos se desenvolvem em baixa, média e alta temperatura.

Umidade relativa do ambiente - A umidade relativa influencia diretamente a atividade

de água do alimento. Se estocarmos um alimento de baixa atividade de água em
ambiente com alta umidade relativa, a A a do alimento aumentará, podendo ocorrer
deterioração.

Luz e composição: Influenciam as condições do alimento.

Doenças Transmitidas por alimentos

São doenças causadas pela ingestão de alimento contaminado por microrganismos

patogênicos, toxinas ou seus metabólitos.
A ocorrência de DTA é uma das principais causas de problemas de saúde pública no
Brasil e no mundo, levando milhares de pessoas à internação hospitalar.
Considerando essa relevância, a análise microbiológica de alimentos é fundamental
para levar aos consumidores alimentos de qualidade e nas condições adequadas para
o consumo.

Parâmetros das análises microbiológicas de alimentos

Os padrões para análise microbiológica de alimentos devem seguir as resoluções da
Anvisa, que estabelecem os critérios e parâmetros para todos os passos da análise e
visam os seguintes fatores:

Características organolépticas:
• Aspecto
• Cor
• Odor
 Parâmetros Microbiológicos:
• Bactérias mesófilas totais
• Bactérias do grupo coliforme
• Coliformes de origem fecal
• Salmonella sp
• Clostrídio sulfito redutor
• Staphylococcus aureus
• Bolores e Leveduras
• Bacillus cereus

Contagem de Aeróbios Mesófilos: Este método envolve a contagem de bactérias que

crescem em condições aeróbias e a temperaturas moderadas, geralmente entre 30-
37°C. É usado como indicador da higiene geral do processo de fabricação e do estado
de conservação dos alimentos.
Contagem de Coliformes Totais e Termotolerantes: Os coliformes são um grupo de
bactérias que inclui E. coli e são indicadores de contaminação fecal e higiene
inadequada. A contagem de coliformes totais e termotolerantes é feita em meios de
cultura seletivos e diferenciais, e os resultados são expressos em UFC/g ou mL.
Pesquisa de Salmonella spp.: Salmonella é uma bactéria patogênica comum em
alimentos, especialmente em alimentos de origem animal. O método envolve a pré-
enriquecimento, enriquecimento seletivo em meios como Caldo Rappaport-Vassiliadis
(RV) e subsequente semeadura em meios seletivos como Ágar XLD (Xylose Lysine
Desoxycholate) ou Ágar SS (Salmonella Shigella).

Pesquisa de Listeria spp.: Listeria monocytogenes é uma bactéria patogênica que pode
causar doenças graves em humanos. A análise envolve a pré-enriquecimento em caldo
seletivo, seguido de enriquecimento em caldos específicos como Caldo Fraser e
detecção em placas seletivas como Ágar PALCAM ou Ágar Oxford.
Pesquisa de Staphylococcus aureus: Staphylococcus aureus é uma bactéria associada à
intoxicação alimentar devido à produção de toxinas. O método inclui pré-
enriquecimento em caldo seletivo, seguido de semeadura em Ágar Baird-Parker e
identificação de colônias típicas.
Pesquisa de Clostridium perfringens: Clostridium perfringens é uma bactéria que pode
causar intoxicação alimentar em alimentos preparados e mantidos a temperaturas
inadequadas. O método envolve a contagem de esporos de Clostridium perfringens
após pré-enriquecimento em meio seletivo como TSC (sulfito de tioglicolato) e
subcultivo em meio seletivo.
Detecção de Bolores e Leveduras: Bolores e leveduras podem causar deterioração em
alimentos e são detectados por meio da semeadura em meios seletivos como Ágar
Sabouraud Dextrose e incubação a uma temperatura adequada por um período de
tempo determinado.

As análises microbiológicas dos alimentos são realizadas para:

1. Presença ou ausência de microrganismos no alimento;
2. Quantificação de microrganismos presentes no alimento;
3. Identificação e caracterização de espécies.

O que é necessário para uma análise microbiológica?

• Amostragem: obtenção correta das amostras e para o laboratório;

• Preparação da amostra para análise: técnicas assépticas em todas as etapas,
homogeneização (quando possível), coleta de unidade analítica, diluições
seriadas;
• Métodos de contagem, isolamento e identificação e microrganismos.

Com relação aos métodos existem os tradicionais ou convencionais que foram

desenvolvidos há muitos anos e vêm sendo empregados como métodos oficias na
maioria dos laboratórios brasileiros e outros países.
Esses métodos estão descritos em publicações consideradas de referência,
internacionalmente aceitas. Embora sejam muito utilizados esses métodos possuem
algumas desvantagens importantes, tais como:
•Trabalhosos;
• Demorados;
• Muito material de laboratório;
• Requer pessoal treinado;
• Sujeito a falhas humanas;
• Sensibilidade insuficiente: capacidade de detectar o que o
método propõe;
• Especificidade: detecta só microrganismos procurados?
• Repetitividade: se o operador fizer 50 vezes ele obtém o
mesmo resultado?
• Reprodutibilidade: gera resultados estatisticamente iguais?

Métodos tradicionais ou convencionais

• ANÁLISE QUANTITATIVA – contagem de microrganismos
a) Por plaqueamento: contagem de colônias em placas de Petri
Nesta técnica, uma amostra do alimento é espalhada sobre a superfície de um meio de
cultura sólido em placa de Petri. Após a incubação, as colônias microbianas que
crescem na superfície do meio podem ser contadas e identificadas.
- Técnica de inoculação por profundidade “pour – plate”
É uma técnica microbiológica utilizada para semear uma amostra em um meio de
cultura sólido de forma a garantir que os microorganismos se distribuam
uniformemente através de várias camadas do meio.
- Técnica de inoculação por superfície
É um método microbiológico usado para semear uma amostra em uma superfície de
meio de cultura sólido, geralmente uma placa de Petri, de forma a permitir o
crescimento e a contagem de microorganismos presentes na amostra
- Técnica de inoculação por sobrecamada
É um método microbiológico usado para distribuir uniformemente microorganismos
presentes em uma amostra em um meio de cultura sólido.
b) Por Determinação do Número Mais Provável (NMP): estimativa
Esta técnica é usada para estimar a concentração de microrganismos em amostras de
alimentos que podem conter baixas contagens. Envolve a inoculação de múltiplos
tubos de caldo de cultura com diferentes diluições da amostra e a observação do
crescimento microbiano após incubação. Com base no número de tubos positivos em
cada diluição, o número mais provável de microrganismos na amostra pode ser
determinado usando tabelas estatísticas.
Análise qualitativa
- Pesquisa de presença/ausência de microrganismos
- Confirmação de gênero / espécie (séries bioquímicas)
Estes testes são usados para identificar e caracterizar os microrganismos presentes em
uma amostra de alimentos. Eles envolvem a realização de reações bioquímicas
específicas que são características de determinados grupos de microrganismos, como
testes de fermentação de açúcares, produção de enzimas específicas, entre outros.
Exemplos de teste:
Teste de catalase
Detectar a presença da enzima catalase na bactéria e com base no resultado obtido
auxiliar na identificação de gêneros e espécies bacterianas. Classicamente utilizado na
diferenciação de estafilococos (catalase positiva) e estreptococos (catalase negativa).
Teste de coagulase
A presença Staphylococcus coagulase positiva indica falhas de higiene na manipulação
durante a elaboração do alimento, tornando o produto uma possível causa de
intoxicações alimentares.
Teste bioquímico IMViC
O teste bioquímico IMViC, normalmente é utilizado para identificação de
enterobactérias a partir da capacidade de produção de indol, gás sulfídrico, acetoína;
da capacidade de utilizar o citrato como única fonte de carbono e da motilidade.

Métodos rápidos e alternativos

Para atender à demanda crescente por análises microbiológicas rápidas e
alternativas, foram desenvolvidos vários métodos que oferecem resultados mais
rápidos do que os métodos tradicionais.
As principais vantagens são:
• Melhorar a eficiência dos laboratórios, simplificando trabalhos, reduzindo o custo;
• Aumentar confiabilidade dos resultados (kits prontos para uso);
• Aumentar a precisão dos resultados.
De acordo com a RDC Nº 331, DE 23 DE DEZEMBRO DE 2019
Parágrafo único. Métodos alternativos podem ser utilizados desde que validados de
forma a garantir que os resultados obtidos por seu uso sejam equivalentes aos das
metodologias descritas no caput ou certificados por organismos independentes, de
acordo com o protocolo estabelecido na norma ISO 16140 ou outros protocolos
similares aceitos internacionalmente.
Entre esses métodos podemos citar:
- Método de plaqueamento automatizado
É uma abordagem moderna para a contagem de microrganismos em amostras,
substituindo em grande parte a contagem manual tradicional em placas de Petri.
Contagem direta- membrana filtrante
É uma técnica microbiológica usada para estimar a densidade de microrganismos em
uma amostra líquida. Utilizada para análise de água, sucos e refrigerantes.
Contagem direta- meios cromogenicos
É uma técnica microbiológica, os microrganismos presentes na amostra são contados
diretamente em uma placa de Petri contendo um meio cromogênico. Os meios
cromogênicos são meios de cultura que contem substratos cromogênicos que liberam
cor quando metabolizados por microrganismos específicos.
Contagem direta- petrifilme
É uma técnica microbiológica que permite a contagem rápida e direta de
microrganismos presentes em superfícies sólidas, utilizando filmes de contato (como o
Pretifilme)
Contagem direta- número mais provável
Técnicas fluorogênicas: Baseiam-se na propriedade do metabolismo microbiano
pesquisado emitir fluorescência, sob luz ultra-violeta.
Identificação de microrganismos
Técnicas Bioquímicas Miniaturizadas
Permitem a realização de análises bioquímicas em uma escala reduzida, geralmente
em volumes muito menores do que os métodos tradicionais.
Técnicas imunológicas para isolamento e/ou identificação de microrganismos

Técnicas imunoenzimáticas: ligação do antígeno com o anticorpo específico

(geralmente com enzimas cromogênicas).
Ex: ELISA (Enzyme-Linked Immunosorbent Assay Ensaio de imunoabsorção enzimática).
Técnicas moleculares para isolamento / identificação de microrganismos
PCR em Tempo Real (qPCR): PCR em tempo real é uma técnica molecular que
amplifica e detecta DNA alvo em tempo real.