Doseamento de uma proteína e estudo cinético

da fosfatase alcalina
Relatório de atividade experimental

Mestrado Integrado em Medicina Veterinária

UC: Bioquímica II

Ano letivo 2018/2019

Índice
1. Objetivos da Atividade Experimental…………………………………………..3
2. Procedimento Experimental………………………………….…………………3
3. Discussão e Resultados………………………………........…....………………8
4. Bibliografia……………...……………………………………………………..24

1. Objetivos da Atividade experimental

2
 O objetivo desta atividade é proceder ao doseamento de uma proteína de um extrato
animal, determinando a concentração da mesma num extrato de mucosa intestinal e realizar o
estudo da fosfatase alcalina da mucosa intestinal de rato, caracterizando-a através dos seus
parâmetros cinéticos.

2. Procedimento Experimental
O procedimento experimental realizado foi realizado segundo o protocolo das aulas
práticas laboratoriais facultado pela docente da unidade curricular.

3
 Doseamento da proteína de um extrato animal
Tomar 0.5 cm3 do reagente B
(Sulfato de cobre) e 0.5cm3 de
reagente C (Tartarato de sódio e
Diluir 5cm3 de reagente de
potássio) para um balão de 50cm3. Folin Ciocalteau com 5cm3 Diluir a mucosa com NaOH
de água destilada (reagente 0.5M
Preencher o restante volume do
balão com a solução A (Reagente de Folin Ciocalteau diluído)
de Lowry)

Agitar no vortex Preparar uma série de tubos Agitar no vortex

Ler e registar a absorvância a

Aguardar 30 minutos
720 nm

Preparação dos tubos

Tubo "0" Colocar 1,00cm3 de NaOH

Adicionar 5,0 cm3 de reagente de Lowry

Colocar 0,100 cm3 de BSA (albumina do soro bovino)

Tubo "50" 0,900 NaOH
5,0 cm3 de reagente de Lowry

Colocar 0,150 cm3 de BSA

Tubo "75" 0,850 cm3 de NaOH
5,0 cm3 de reagente de Lowry

colocar 0,200 cm3 de BSA

Tubo "100" 0,800 cm3de NaOH
5,0 cm3 de reagente de Lowry

Figura 1:Reagente Figura 2:NaOH Figura 3:Reagente de Figura 4:BSA

de Lowry Lowry diluído (albumina do soro
bovino)

4
Ensaios da caracterização cinética da fosfatase
alcalina
Efeito da temperatura
Adicionar a células de 1cm3 o que consta no quadro seguinte:

Ensaio nº 1 2 3
Temperatura 25 30 37
Tris-HCl 0,5 pH 8,5 0.1 0.1 0.1
pNPp 6mM 0.2 0.2 0.2
H2O destilada 0.6 0.6 0.6
Extrato de mucosa 0.1 0.1 0.1
Tabela 1

Registar a variação da Abs a 405 nm durante 60 segundos.

Efeito da concentração de enzima

Ensaio nº 1 2 3
Tris-HCl 0,5 pH 8,5 0.1 0.1 0.1
pNPP 6mM 0.2 0.2 0.2
H2O destilada 0.6 0.5 0.4
Extrato de mucosa 0.1 0.2 0.3
Adicionar a células de 1cm3 o que consta no quadro seguinte:

Tabela 2

Registar a variação da Abs a 405 nm a 37ºC durante 60 segundos.

5
Efeito do pH
Adicionar a células de 1cm3 o que consta no quadro seguinte:

Ensaio nº 1 2 3 4 5
Glicina-NaOH 0,1
0,5M pH (,1
Glicina-NaOH 0.1
0,5M pH8,5
Glicina-NaOH 0.1
0,5M pH9,0
Glicina-NaOH 0.1
0,5M pH9,5
Glicina-NaOH 0.1
0,5M pH10
pNPP (6mM) 0.2 0.2 0.2 0.2 0.2
H2O destilada 0.6 0.6 0.6 0.6 0.6
Extrato de 0.1 0.1 0.1 0.1 0.1
mucosa
Tabela 3

Registar a variação da Abs a 405 nm a 37ºC durante 60 segundos.

Efeito da concentração de substrato

Adicionar a células de 1cm3 o que consta no quadro seguinte:

Ensaio nº 1 2 3 4 5
Tris-HCl 0,5 pH 8,5 0.1 0.1 0.1 0.1 0.1
pNPP 6mM 0.01 0.03 0.06 0.1 0.2
H2O destilada 0.79 0.77 0.74 0.7 0.6
Extrato de mucosa 0.1 0.1 0.1 0.1 0.1
Tabela 4

Registar a variação da Abs a 405 nm a 37ºC durante 60 segundos.

Efeito da concentração de fosfato inorgânico

Ensaio nº 1 2 3 4 5
Tris-HCl 0,5 pH 8,5 0.1 0.1 0.1 0.1 0.1
pNPP 6mM 0.01 0.03 0.06 0.1 0.2
H2O destilada 0.69 0.67 0.64 0.6 0.5
Na2HPO4 50mM 0.1 0.1 0.1 0.1 0.1
Extrato de mucosa 0.1 0.1 0.1 0.1 0.1
Adicionar a células de 1cm3 o que consta no quadro seguinte:

Tabela 5

Registar a variação da Abs a 405 nm a 37ºC durante 60 segundos.

6
7
 3. Discussão e Resultados
Os enzimas são proteínas especializadas em catalisar reações biológicas, isto é,
aumentam a velocidade de uma reação química sem interferir no processo. Estas moléculas
estão geralmente associadas a biomoléculas dada a sua extraordinária especificidade e poder
catalítico.

A fosfatase alcalina é um enzima presente nas membranas de revestimento dos

canalículos biliares e tem como uma das suas principais funções a desfosforilação, ou seja a
remoção de grupos fosfato de um grande número de moléculas diferentes, como proteínas,
nucleotídeos e alcaloides.

Fig. 5 – Estrutura da Fosfatase

Alcalina

É um enzima produzido por vários órgãos e tecidos, como o fígado, ossos, intestinos e
até placenta, sendo encontrada normalmente no sangue de animais saudáveis.

Os diagnósticos de algumas alterações patológicas no organismo fazem-se pela

contabilização da sua dosagem, sendo geralmente utilizada para o diagnóstico de doenças
hepáticas, pois o aumento de seus níveis pode indicar lesão hepática canalicular (colestase,
hepatite, etc). No entanto, a fosfatase alcalina também pode aumentar sempre que aumenta a
atividade das células ósseas (por exemplo, durante o período de crescimento ou depois de uma
fratura) ou como resultado de doenças ósseas, que incluem a osteomalacia, neoplasia óssea, e
a doença de Paget.

As isoenzimas produzidas pelo fígado e pelo osso podem ser separadas

por eletroforese para melhor perceber o motivo de um valor elevado nas análises. Contudo,
por exemplo, uma elevação simultânea da GGT (gama-glutamiltranspeptidase) sugere que é o
fígado a causa da hiperfosfatasemia.

A dosagem de fosfatase alcalina é feita no sangue. Possui duas isoenzimas: uma de

origem hepática que avalia de maneira significativa os casos de obstrução biliar e outra de
origem óssea que avalia as doenças que afetam a atividade osteoblástica.

8
Efeito da temperatura

Object 3

Gráfico 2
Gráfico 1

Object 5

Object 7

Gráfico 3
9
 Object 9

Gráfico 4

Na generalidade das reações químicas, incluindo as catalisadas por enzimas, a

velocidade de uma reação aumenta com a temperatura, mas a velocidade com que uma
proteína sofre desnaturação (o enzima inativa-se) também aumenta com a temperatura.

Tendo em conta que o número de enzimas capazes de resistir a temperaturas da ordem

dos 100°C durante alguns segundos é extremamente restrito, e considerando que a velocidade
a que ocorre a desnaturação de um enzima é muito elevada, pode acontecer que a atividade
enzimática se anule pouco tempo após o início do ensaio. Por isso é prudente escolher
temperaturas de ensaio que minimizem a velocidade de desnaturação do enzima.

Assim, a velocidade da reação aumenta até um máximo e após determinada

temperatura a velocidade declina rapidamente, mesmo aumentando a temperatura. Isso

10
ocorre porque a estrutura tridimensional dos enzimas é alterada, impossibilitando-a de formar
o complexo enzima-substrato.

Tal como observado no gráfico anterior (gráfico 4), há um aumento da velocidade da

reação com o aumento de temperatura, como se preconiza teoricamente. O facto de a 37ºC de
observar uma ligeira descida de velocidade, não se considera significativo, uma vez que pode
ter havido diversos fatores que poderão ter alterado esse resultado, dando essa margem de
erro.

Efeito da Concentração da Enzima:

 Object 11 0,1 cm3

Tempo (s) Absorvência (405 nm)
0,0 0,
0
0
8

11
10,0 0,027
20,0 0,044
30,0 0,055
40,0 0,079
50,0 0,092
60,0 0,105
Tabela 6

Gráfico 5


Object 13 0,2 cm3

Gráfico 6
Tempo (s) Absorvência (405
nm)
0,0 0
,
0
1
1
10,0 0,028
20,0 0,046
30,0 0,064
40,0 0,087
50,0 0,104
60,0 0,125
Tabela 7

12
  Object 15 0,3 cm3
Tempo (s) Absorvência (405
nm)
0,0 0
,
0
1
9
10,0 0,048
20,0 0,073
30,0 0,094
40,0 0,123
50,0 0,158
60,0 0,176
Tabela 8
Gráfico 7

Concentração de proteína na mucosa intestinal em 1000 cm3: 76,35 mmol

Concentração de Enzima:

 Em 0,1 cm3
C=76,35x0,1= 7,635 mM
 Em 0,2 cm3
C=76,35x0,2= 15,27 mM
 Em 0,3 cm3

13
 Object 17 C=76,35x0,3=
22,905 mM
Concentração da V0 (m/s)
Enzima (mM)
7,635 0,0016286

15,27 0,0019107

22,905 0,0026464

Tabela 9

Gráfico 8

Através da análise do gráfico, podemos perceber que a velocidade inicial aumenta com
o aumento da concentração de enzima, porém esta relação não é linear.

14
 Object 20

Object 23

Gráfico 11 Gráfico 12

Gráfico 13 Gráfico 14

15
Gráfico 9 Gráfico 10

Efeito do pH

16
 A fosfatase alcalina, tal como o próprio nome indica, é mais ativa em mais alcalinos, daí
se ter usado pH mais altos (superiores a 7) para estudar o efeito do pH no efeito da fosfatase
alcalina.

Sendo uma enzima, esta tem um pH óptimo de funcionamento, que se encontra

próximo de 10 (cerca de 9,9).

No entanto, através da análise do gráfico 14, é possível deduzir que o pH óptimo de

atividade da fosfatase alcalina neste ensaio é de 9.

Isto pode dever-se a erros na medição dos reagentes.

Efeito da concentração de substrato

O P-nitrofenilfosfato (pNPP) é um substrato da fosfatase alcalina que é normalmente
utilizado para a sua deteção. Sendo inicialmente incolor, ao reagir com esta enzima forma um
composto amarelo, P-nitrofenol, que pode ser detetado por absorvência a 405nm.

Figura 5 – Reação catalisadora do pNPP pela fosfatase alcalina.

Os gráficos seguintes foram obtidos a partir dos valores de absorvência lidos no

espetrofotómetro. Representam o desenvolvimento da reação catalisada pela enzima ao longo
do tempo para cada ensaio.

17
 Object 34

Gráfico 15- Gráfico do ensaio 1 para a determinação do efeito do substrato na atividade

enzimática.

18
 Object 36

Gráfico 16 - Gráfico do ensaio 2 para a determinação do efeito do substrato na atividade

enzimática.

Object 38

Gráfico 17- Gráfico do ensaio 3 para a determinação do efeito do substrato na atividade

enzimática.

19
 Object 40

Gráfico 18- Gráfico do ensaio 4 para a determinação do efeito do substrato na atividade

enzimática.

Object 42

20
Gráfico 19- Gráfico do ensaio 5 para a determinação do efeito do substrato na atividade
enzimática.

Para o estudo do efeito da concentração de substrato e do efeito da concentração de

fosfato inorgânico é necessário formular os gráficos de Michaelis-Menten e de Lineweaver-
Burk, para os quais necessitamos de determinar a concentração de substrato na solução final
de cada ensaio.

Tendo em conta que o volume da solução inicial adicionado em cada ensaio é igual para os
dois testes (por exemplo, em ambos os ensaios 1 foi adicionado 0,01cm 3 de pNPP) a
concentração final C2 de cada ensaio também será igual nas duas experiências.

Sabendo que a concentração de pNPP na solução inicial foi C 1=6 mM, o volume da solução
final foi 1cm3 e que numa diluição o número de moles na solução diluída (n 2) é igual ao
número de moles na solução concentrada (n 1), tal que n1=n2 C1V1=C2V2  C2=(C1V1)/V2
calculamos a concentração final de pNPP de cada ensaio (C 2).

Volume
inicial (V1) [pNPP] (C2)
Ensaio (cm3) (mM)
1 0,01 0,06
2 0,03 0,18
3 0,06 0,36
4 0,1 0,6
5 0,2 1,2

Tabela 10- Concentração final e volume inicial dos ensaios. Os valores são iguais para a
experiência do efeito da concentração de substrato e do fosfato inorgânico.

A partir dos declives das retas dos graficos 15, 16, 17, 18 e 19 (v 0) e dos valores de C2
calculados para cada ensaio conseguimos formular o gráfico de Michaelis-Menten e com os
inversos desses valores o gráfico de Lineweaver-Burk para estudar o efeito da concentração do
substrato na reação enzimática.

Ensaio C2(mM) V0
1 0,06 0,0007107
2 0,18 0,0009857
3 0,36 0,0012714
4 0,6 0,0014536
5 1,2 0,0017643

Tabela 11 - Valores de C2 e v0 para o gráfico Tabela 12 - Parâmetros da reação obtidos21

20 por analise do gráfico 20
 Parâmetros da reação
Vmax 0,0017643
Vmax/2 0,00088215
Km 0,14

Vmax

Vmax/2

Km

Object 44

Grafico 20- Gráfico de Michaelis-Menten para a determinação do efeito do substrato na

atividade enzimática.

Ensaio 1/C2 (mM) 1/Vmax 6201/v0

1 16,66666667 Vmax 1407,063459
0,001612903
2 5,555555556 -1/Km 1014,507457
-12,5
3 2,777777778 Km 786,5345289
0,08
4 1,666666667 Tabela 14 - Parâmetros da reação obtidos
687,9471657
5 Valores inversos de C0,833333333 por analise do gráfico 21
566,79703
Tabela 13- 2 e v0 para

o gráfico 21

Gráfico 21 - Gráfico de Lineweaver-Burk para a determinação do efeito do substrato na

atividade enzimática.
22
 Object 46

No que toca ao efeito da concentração de substrato na atividade enzimática verifica-se

que, até ao valor de Km, por observação do gráfico Michaelis-Menten (graf 20), o aumento da
concentração do substrato provoca um aumento quase linear da velocidade inicial da reação.
Isto deve-se ao facto dos centros ativos da enzima não estarem todos ligados a substrato, ou
seja, a enzima tem capacidade de catalisar mais substrato em simultâneo.

No entanto quanto se ultrapassa a constante de Michaelis-Menten, o declive da reta

começa a diminuir estabilizando na velocidade máxima da enzima (Vmax). No momento de
estabilização diz-se que a enzima está saturada, ou seja, todos os seus centros ativos estão
ocupados com substrato. A partir desse ponto a velocidade da reação mantem-se constante
(Vmax) devido á incapacidade da enzima catalisar mais substrato em simultâneo.

Os parâmetros de reação calculados para a catalisação do pNPP pela fosfatase alcalina

foram Km=0,14 e Vmax=0,0017643, pelo gráfico de Michalis-Menten (gráfico 20), e Km=0,08 e
Vmax=0,001612903, pelo gráfico de Lineweaver-Burk (gráfico 21).

Efeito da concentração de fosfato

De seguida apresentamos os gráficos referentes à variação da absorvência com o
decorrer do tempo com a presença da mesma concentração de difosfato sódico.

Gráfico 22- Gráfico do ensaio 1 para a determinação do efeito da concentração de fosfato

na atividade enzimática.

23
 Object 48

Object 50

Gráfico 23- Gráfico do ensaio 2 para a determinação do efeito da concentração de fosfato

na atividade enzimática.

Gráfico 24- Gráfico do ensaio 3 para a determinação do efeito da concentração de fosfato

na atividade enzimática.

24
 Object 52

Object 54

Gráfico 25- Gráfico do ensaio 4 para a determinação do efeito da concentração de fosfato

na atividade enzimática.

25
 Gráfico 26- Gráfico do ensaio 5 para a determinação do efeito da concentração de fosfato
na atividade enzimática.

Object 56

Na semelhança do estudo do efeito da concentração de substrato, obtiveram-se os

gráficos de Michaelis-Menten e Lineweaver-Burk através dos valores de C2, calculados
inicialmente, e dos declives das retas dos gráficos 22, 23, 24, 25 e 26 (v0).

Os pontos referentes aos valores dos ensaios 1 e 4 foram descartados por se

afastarem muito dos restantes valores.

Ensaio [S] v0
Parâmetros da reação
*1 0,06 -0,0000036
Vmax 0,0002036
2 0,18 0,000075
Vmax/2 0,0001018
3 0,36 0,0001429
Km 0,24
*4 0,6 0,0003786
5 1,2 0,0002036 Tabela 15- Parâmetros da reação
obtidos por analise do gráfico 27

Tabela 14 - Valores de C2 e v0 para o gráfico

27 *Os pontos dos ensaios 1 e 4 foram
descartados.

26
 Gráfico 27 - Gráfico de Michaelis-Menten para a determinação do efeito da concentração de
fosfato na atividade enzimática.

Km

Object 58

Ensaio 1/[S] 1/v0

*1 16,66666667 -2,78E+05 Parâmetros da reação
2 5,555555556 1,33E+04 1/Vmax 2,80E+03
3 2,777777778 7,00E+03 Vmax 3,57E-04
*4 1,666666667 2,64E+03 «-1/km -1,6
5 0,833333333 4,91E+03 Km 0,625

Tabela
Tabela 16 -17- Parâmetros
Valores inversosdadereação
C2 e vobtidos
0 para o

por analise
gráfico 28 *Os do gráfico
pontos dos28ensaios 1 e 4
foram descartados.

Object 60

27
 Gráfico 28 - Gráfico de Lineweaver-Burk para a determinação do efeito da
concentração de fosfato na atividade enzimática.

Recorrendo à figura 5 verifica-se que um dos produtos da catalisação do pNPP pela

fosfatase alcalina é um grupo fosfato, que foi o inibidor estudado nesta atividade. Assim é
possível verificar que a inibição estudada é uma inibição pelo produto ou um caso de feedback
negativo.

Para determinar o efeito do fosfato inorgânico na atividade enzimática da fosfatase

alcalina é necessário fazer uma comparação entres os parâmetros da cinética enzimática com e
sem este reagente.

Os parâmetros da reação calculados foram Km=0,24e Vmax=0,0002036, pelo de gráfico

de Michaelis-Menten, e Km=0,625 e Vmax=0,000357, pelo gráfico de Lineweaver-Burk.

Por analise de ambos os gráficos de Michaelis-Menten (gráficos 20 e 27) é possível

verificar que, ao se adicionar difosfato sódico à solução, ocorreu uma diminuição acentuada da
velocidade máxima da reação (sem o inibidor Vmax=0,0017643 e com inibidor
Vmax=0,0002036) e a constante de Michaelis-Menten manteve-se praticamente constante
(sem inibidor Km=0,14 e com inibidor Km=0,24, estão no mesmo nível de grandeza).

Assim é possível concluir que o fosfato inorgânico é um inibidor não competitivo ao

substrato, pelo que não compete diretamente com o substrato, mas interfere com a reação do
complexo enzima-substrato.

Pela comparação dos gráficos de Lineweaver-Burk (gráficos 21 e 28), com a adição do

inibidor à solução, observa-se também essa diminuição da velocidade máxima (sem inibidor
Vmax=0,001612903 e com inibidor Vmax=0,000357), no entanto verifica-se um aumento da
constante de Michaelis-Menten (sem inibidor Km=0,08 e com inibidor Km=0,625). Como
nenhuma inibição descreve estas alterações dos parâmetros, não é possível tirar conclusões
sobre o tipo de inibição que ocorre com base nestes dados.

28
 4. Bibliografia
DEVLIN, T. et al (2006) – Textbook of Biochemistry with clinical correlations, 6th
edition, USA.

Sites consultados:

http://w3.ualg.pt/~pmartel/cadeiras/enzimologia/aula13.pdf

https://prezi.com/3pf2rbqe6mip/determinacao-da-actividade-enzimatica-da-fosfatase-
alcalina/

https://www.bbc.com/bitesize/guides/zwxv6yc/revision/1

29