AULA PRÁTICA 1

DOSAGEM DE AÇÚCAR REDUTOR PELO MÉTODO DE ADNS (ÁCIDO 3,5-

DINITROSSALICÍLICO)
1. MATERIAL
 Solução Padrão (glicose – 5 mM);
 Solução Problema (glicose – 100 mM);
 Reativo: ADNS (ácido 3,5-dinitrossalicílico);
 Água Destilada;
 Pipetas graduadas de 1 e 10 mL;
 7 Tubos de ensaio;
 Espectrofotômetro;
 Banho Maria a 100°C;
 Agitador de tubos (vórtex).

2. OBJETIVO
Dosagem de açúcares redutores por espectrofotometria na faixa do
visível.

3. PROCEDIMENTO
Construção da Curva padrão de glicídios redutores
Sensibilidade do método químico: glicose – 1 mM a 20 mM
Seguir o protocolo abaixo utilizando a solução padrão de glicose (5 mM)
T Solução Água ADNS Abs 540 nm Concentração
U de glicose destilada (mL) (mM)
B (mL) (mL)
O
B -- 1,0 1,0
SP 0,1 0,9 1,0
1 0,2 0,8 1,0
2 0,4 0,6 1,0
3 0,6 0,4 1,0
4 0,8 0,2 1,0
5 1,0 -- 1,0
SP – Solução Problema
Nos tubos de 1 a 5 colocar Solução Padrão de Glicose.
Após a adição dos reagentes:
1. Agitar e aquecer a 100°C por 5 minutos;
2. Resfriar os tubos em bacia contendo gelo;
3. Completar o volume para 15 mL com água destilada;
4. Ler as absorbâncias no espectrofotômetro em 540 nm.
 AULA PRÁTICA 2
LIPÍDEOS

I. REAÇÃO DE SAPONIFICAÇÃO

a) Fundamentação teórica:

Os lipídios podem ser caracterizados pelas suas características físico-

químicas. Em geral são insolúveis na água e solúveis em solventes apolares.
Os triacilgliceróis, na presença de bases, podem ser hidrolisados liberando
glicerol e sais de ácidos graxos (sabões), de acordo com a reação:

Os sais de ácidos graxos apresentam uma característica anfipática onde

em solução aquosa diminuem a tensão superficial da água formando espuma
sob agitação.

b) Objetivos: realizar a hidrólise alcalina dos triacilglicerídeos presentes no

óleo.

c) Materiais:

Vidrarias:
•4 pipeta de vidro de 5 mL
•2 pipetas de vidro de 1 mL
•3 Tubos de ensaio

Reagentes:
•Óleo de soja ou de girassol
•Solução etanólica de hidróxido de potássio 5%
•Solução de Cloreto de cálcio 10%

Equipamentos:
•Banho-Maria
Acessórios:
•Estante para tubos de ensaio
•Pêra de borracha
•Pinça
•Termômetro
•Cronômetro
•Papel Toalha
•Descarte para pipetas
•Frasco com água destilada

d) Procedimento:

1) Pipetar para um tubo de ensaio rotulado (solução de sabão) 2 mL de óleo e

5 mL da solução de potassa alcóolica. Aquecer no banho-maria fervente
durante cinco minutos. A reação de hidrólise alcalina estará completa quando o
tubo de ensaio apresentar uma fase.

2) Pipetar para o tubo de ensaio rotulado (tubo 1) 1 mL de água e 2 mL da

solução de sabão. Agitar vigorosamente e observar.

3) Pipetar para outro tubo de ensaio rotulado (tubo 2) 2 mL da solução de

sabão. Adicionar 5 gotas da solução de cloreto de cálcio. Agitar bem e
observar.

e) Resultado esperado:

Tubo 1: Formação de espuma indica a presença de sais de ácidos graxos

Tubo 2: formação de precipitado indica a presença de sabões de cálcio que

não formam espuma

f) Resultado obtido:

Tubo 1: _________________________________________

Tubo 2: _________________________________________

II- Teste do Iodo

a) Fundamentação teórica:

Os ácidos graxos (AG) insaturados podem fixar oxigênio, hidrogênio e

halogênios nas suas duplas ligações, através de uma reação de adição,
conforme demonstra o esquema abaixo:
 Hidrogena
ção

Halogenaç
ão

b) Objetivos: Identificar a presença de insaturações nos ácidos graxos

c) Materiais:

Vidrarias:
•4 pipeta de vidro de 1 mL
•pipeta pasteur
•2 Tubos de ensaio

Reagentes:
•Óleo de soja ou de girassol
•Solução de lugol

Equipamentos:
•Banho-Maria

Acessórios:
•Estante para tubos de ensaio
•Pêra de borracha

d) Procedimento:

Em um tubo de ensaio, colocar 1 mL de óleo vegetal, adicionado de 3

gotas do corante lugol e em seguida aquecer o tubo, anotar os resultados.

** Preparo do reagente de lugol: 5 g de iodo + 10 g de iodeto de

potássio (KI). Completar o volume para 100 mL com água destilada. Diluir 1:10
no momento da utilização.

e) Resultados esperados: Gradativa redução na cor característica do iodo na

amostra aquecida

f) Resultados obtidos:

Tubo 1: _________________________________________

Tubo 2: _________________________________________
 AULA PRÁTICA 3
DETERMINAÇÃO COLORIMÉTRICA PELA REAÇÃO DE BIURETO

1. MATERIAL
 5 Tubos de Ensaio pequenos;
 Caseína 1%;
 Glicina 1%;
 NaOH 1,0 mol/L;
 Reativo de Biureto (sulfato de cobre 0,5%);
 Espectrofotômetro;
 Agitador de tubos (vórtex).

2. OBJETIVO
Quantificar colorimetricamente a proteína presente em uma amostra de
concentração desconhecida, usando os conhecimentos adquiridos nas aulas
de espectrofotometria.

3. PROCEDIMENTO

1. Identificar 5 tubos de ensaio: o primeiro é o branco, o segundo a glicina e os

restantes enumerar de 1 a 3;

2. Adicionar 1 mL de água destilada no tubo denominado de branco;

3. No tubo glicina colocar 1 mL de solução de glicina;

4. Adicionar 0,2 mL de caseína no tubo 1; 0,6 mL no tubo 2 e 1 mL no tubo 3;

5. Nos tubos 1 a 2 completar o volume para 1 mL com água destilada;

6. Adicionar 3 mL de NaOH 1,0 mol/L em todos os tubos;

7. Adicionar 0,4 mL de Biureto em todos os tubos;

8. Aguardar 15 minutos enquanto a reação se processa;

9. No espectrofotômetro todas as soluções devem ser lidas a 530 nm;

10. Anotar as leituras das absorbâncias de cada tubo de ensaio.

Tubos
Reativos
B G 1 2 3
Água destilada (mL) 1,0 -- -- -- --

Solução de glicina (mL) -- 1,0 -- -- --

Solução de caseína 1% -- -- 0,2 0,6 1,0

(mL)
Água destilada (mL) -- -- 0,8 0,4 --

NaOH 1,0 mol/L 3,0 3,0 3,0 3,0 3,0

Reativo de 0,4 0,4 0,4 0,4 0,4

Biureto
Agitar e aguardar 15 minutos

RESULTADO
(Absorbância)
OBS.: As soluções devem ser lidas a 530 nm.
 AULA PRÁTICA 4
AÇÃO ENZIMÁTICA: EFEITO DO TEMPO DE INCUBAÇÃO

1. MATERIAL
 Enzima invertase (0,1 mg proteína/mL). Observação: manter no gelo
depois de descongelada.
 Tampão acetato 0,05 M; pH 4,7
 Sacarose 0,2 M
 Reativo: ADNS (ácido 3,5-dinitrossalicílico)
 Pipetas graduadas de 1 e 10mL
 Tubos de ensaio
 Banho Maria.
 Espectrofotômetro

2. OBJETIVO
Verificar a influência do tempo de incubação da reação na atividade
enzimática

3. PROCEDIMENTO
Seguir o protocolo abaixo
Tubos
Reativos
1 2 3 4 5
Tampão acetato 0,05 M pH 4,7 (mL) 1,0 1,0 1,0 1,0 1,0

Água destilada (mL) 1,0 0,8 0,8 0,8 0,8

Sacarose 0,2 M (mL) 0,5 0,5 0,5 0,5 0,5

Invertase 0,1 mg/mL (mL) -- 0,2 0,2 0,2 0,2

Incubação: 25°C (temperatura ambiente) -- Zero 5 min. 10 min. 15 min.

ADNS (ácido 3,5-dinitrossalicílico) (mL) 1,0 1,0 1,0 1,0 1,0

Aquecer a 100°C durante 5 minutos

Água destilada (mL) 6,5 6,5 6,5 6,5 6,5

RESULTADOS (Absorbância)

Resfriar os tubos em gelo. Homogeneizar. Ler as absorbâncias a 540 nm.

AULA PRÁTICA 5
AÇÃO ENZIMÁTICA: EFEITO DA TEMPERATURA

1. MATERIAL
 Enzima invertase (0,1 mg proteína/mL). Observação: manter no gelo
depois de descongelada.
 Tampão acetato 0,05 M pH 4,7
 Sacarose 0,2 M
 Reativo: ADNS (ácido 3,5-dinitrossalicílico)
 Pipetas graduadas de 1 e 10mL
 Tubos de ensaio
 Banho Maria
 Espectrofotômetro

2. OBJETIVO
Verificar a influência da temperatura na atividade enzimática.

3. PROCEDIMENTO
Seguir o protocolo abaixo
Tubos
Reativos
1 2 3 4 5
Tampão acetato 0,05 M pH 4,7 (mL) 1,0 1,0 1,0 1,0 1,0
Água destilada (mL) 1,0 0,8 0,8 0,8 0,8

Sacarose 0,2 M (mL) 0,5 0,5 0,5 0,5 0,5

Invertase 0,1 mg/mL (mL) -- 0,2 0,2 0,2 0,2

Pré-incubar os tubos nos seguintes banhos --- 25°C 37°C 55°C 100°C
durante 5 minutos
ADNS (ácido 3,5-dinitrossalicílico) (mL) 1,0 1,0 1,0 1,0 1,0
 Aquecer a 100°C durante 5 minutos

Água destilada (mL) 6,5 6,5 6,5 6,5 6,5

RESULTADOS (Absorbância)

Resfriar os tubos em gelo. Homogeneizar. Ler as absorbâncias a 540 nm.

 AULA PRÁTICA 6
AÇÃO ENZIMÁTICA: EFEITO DO pH

1. MATERIAL
 Enzima invertase (0,1 mg proteína/mL). Observação: manter no gelo
depois de descongelada.
 Tampão citrato-fosfato 0,05 M pH 2,0
 Tampão acetato 0,05 M; pH 4,0
 Tampão acetato 0,05 M; pH 5,0
 Tampão fosfato 0,05 M pH 6,0
 Tampão fosfato 0,05 M pH 7,0
 Tampão fosfato 0,05 M pH 8,0
 Tampão bicarbonato 0,05 M pH 9,0
 Sacarose 0,2 M
 Reativo: ADNS (ácido 3,5-dinitrossalicílico)
 Pipetas graduadas de 1 e 10mL
 Tubos de ensaio
 Banho Maria
 Espectrofotômetro

2. OBJETIVO
Verificar a influência do pH na atividade enzimática
 3. PROCEDIMENTO
Seguir o protocolo abaixo
Tubos
Reativos
1 2 3 4 5 6 7 8
Tampão citrato-fosfato 0,05M pH 2,0 1,0 1,0 -- -- -- -- -- --

Tampão acetato 0,05M; pH 4,0 -- -- 1,0 -- -- -- -- --

Tampão acetato 0,05M; pH 5,0 -- -- -- 1,0 -- -- -- --

Tampão fosfato 0,05M pH 6,0 -- -- -- -- 1,0 -- -- --

Tampão fosfato 0,05M pH 7,0 -- -- -- -- -- 1,0 -- --

Tampão fosfato 0,05M pH 8,0 -- -- -- -- -- -- 1,0 --

Tampão bicarbonato 0,05M pH 9,0 -- -- -- -- -- -- -- 1,0

Água destilada (mL) 1,0 0,8 0,8 0,8 0,8 0,8 0,8 0,8

Sacarose 0,2 M (mL) 0,5 0,5 0,5 0,5 0,5 0,5 0,5 0,5

Invertase 0,1 mg/mL (mL) -- 0,2 0,2 0,2 0,2 0,2 0,2 0,2

Incubação: 25°C (temperatura ambiente) durante 5 minutos

ADNS (mL) 1,0 1,0 1,0 1,0 1,0 1,0 1,0 1,0
Aquecer a 100°C durante 5 minutos

Água destilada (mL) 6,5 6,5 6,5 6,5 6,5 6,5 6,5 6,5

Resfriar os tubos em bacia contendo gelo. Homogeneizar. Ler as absorbâncias

a 540nm.
Tubos

1 2 3 4 5 6 7 8
RESULTADOS
(Absorbância)
 AULA PRÁTICA 7
AÇÃO ENZIMÁTICA: EFEITO DA CONCENTRAÇÃO DO SUBSTRATO
1. MATERIAL
 Enzima invertase (0,1 mg proteína/mL). Observação: manter no gelo
depois de descongelada.
 Tampão acetato 0,05 M; pH 4,7
 Sacarose 0,01 M; 0,02 M; 0,05 M; 0,1 M; 0,2 M.
 Reativo: ADNS (ácido 3,5-dinitrossalicílico)
 Pipetas graduadas de 1 e 10 mL
 Tubos de ensaio
 Banho Maria
 Espectrofotômetro

2. OBJETIVO
Verificar a influência da concentração de substrato na atividade
enzimática.

3. PROCEDIMENTO
Seguir o protocolo abaixo:
Tubos
Reativos
1 2 3 4 5 6
Tampão acetato 0,05M pH 4,7 (mL) 1,0 1,0 1,0 1,0 1,0 1,0
Água destilada (mL) 1,3 0,3 0,3 0,3 0,3 0,3
Sacarose 0,01 M (4 mM) (mL) -- 1,0 -- -- -- --
Sacarose 0,02 M (8 mM) (mL) -- -- 1,0 -- -- --
Sacarose 0,05 M (20 mM) (mL) -- -- -- 1,0 -- --
Sacarose 0,1 M (40 mM) (mL) -- -- -- -- 1,0 --
Sacarose 0,2 M (80 mM) (mL) -- -- -- -- -- 1,0
Invertase 0,1 mg/mL (mL) 0,2 0,2 0,2 0,2 0,2 0,2
Incubação: 25°C (temperatura ambiente) durante 5 minutos.
ADNS (ácido 3,5-dinitrossalicílico) (mL) 1,0 1,0 1,0 1,0 1,0 1,0
Aquecer a 100°C durante 5 minutos
Água destilada (mL) 6,5 6,5 6,5 6,5 6,5 6,5
RESULTADOS (Absorbância)
Resfriar os tubos. Homogeneizar. Ler as absorbâncias a 540 nm.
 AULA PRÁTICA 8
AÇÃO ENZIMÁTICA: EFEITO DE CONCENTRAÇÃO DA ENZIMA
1. MATERIAL
 Enzima invertase (0,1 mg proteína/mL). Observação: manter no gelo
depois de descongelada.
 Tampão acetato 0,05 M pH 4,7;
 Sacarose 0,2 M;
 Reativo: ADNS (ácido 3,5-dinitrossalicílico);
 Pipetas graduadas de 1 e 10 mL;
 Tubos de ensaio;
 Banho Maria.
 Espectrofotômetro

2. OBJETIVO
Verificar a influência do fator concentração da enzima na atividade
enzimática.

3. PROCEDIMENTO
Seguir o protocolo abaixo:
Tubos
Reativos
1 2 3 4 5 6
Tampão acetato 0,05 M pH 4,7 (mL) 1,0 1,0 1,0 1,0 1,0 1,0
Água destilada (mL) 1,0 0,9 0,8 0,6 0,2 ---

Sacarose 0,2 M (mL) 0,5 0,5 0,5 0,5 0,5 0,5

Invertase 0,1 mg/mL (mL) -- 0,1 0,2 0,4 0,8 1,0
Incubação: 25°C (temperatura ambiente) durante 5 minutos
ADNS (mL) 1,0 1,0 1,0 1,0 1,0 1,0
Aquecer a 100°C durante 5 minutos

Água destilada (mL) 6,5 6,5 6,5 6,5 6,5 6,5

RESULTADOS (Absorbância)

Resfriar os tubos em bacia contendo gelo.

Homogeneizar.
Ler as absorbâncias a 540 nm.