ROTEIROS DAS AULAS PRÁTICAS DE BIOQUÍMICA,

BIOFÍSICA E BIOLOGIA MOLECULAR

Dept.de Bioquímica e Biologia Molecular / Centro de
Aulas Práticas / UFG

Goiânia, 2024.
 SUMÁRIO

AULAS PRÁTICAS PÁGINAS

AULA PRÁTICA 1: Pipetagem e Diluição de Soluções.........................................03

AULA PRÁTICA 2: pH e Tampão..........................................................................04

AULA PRÁTICA 3: Determinação do Espectro de Absorção de Corantes e

Construção de Curva Padrão..............................................07

AULA PRÁTICA 4: Titulação da Glicina com uma Base.......................................09

AULA PRÁTICA 5: Determinação Colorimétrica pela Reação de Biureto............11

AULA PRÁTICA 6: Dosagem de Açúcar Redutor pelo Método de ADNS (ácido

3,5-dinitrossalicílico)............................................................13

AULA PRÁTICA 7: Reações de Precipitação de Proteínas..................................15

AULA PRÁTICA 8: Ação enzimática: Efeito de Concentração da Enzima...........17

AULA PRÁTICA 9: Ação enzimática: Efeito do Tempo de Incubação..................19

AULA PRÁTICA 10: Ação enzimática: Efeito do pH.............................................20

AULA PRÁTICA 11: Ação enzimática: Efeito da Temperatura.............................22

AULA PRÁTICA 12: Ação enzimática: Efeito da Concentração do Substrato......24

AULA PRÁTICA 13: Extração e Caracterização de Lipídeos................................26

AULA PRÁTICA 14: Análise Eletroforética de Proteínas......................................28

AULA PRÁTICA 15: Extração e Caracterização de Ácidos Nucléicos do

Morango..................................................................................................................29

AULA PRÁTICA 16: Preparação de DNA plasmídeal......................................31

AULA PRÁTICA 17: Reação em cadeia da polimerase
(PCR).................................................................................................................33
AULA PRÁTICA 18: Gel de proteínas SDS-
PAGE................................................................................................................32
AULA PRÁTICA 19: Reação de saponificação................................................34
AULA PRÁTICA 20: Atividade enzimática da peroxidase................................35
AULA PRÁTICA 21: Efeito da lipase sobre as gorduras..................................40

2
 AULA PRÁTICA 1:
PIPETAGEM E DILUIÇÃO DE SOLUÇÕES

1. MATERIAL
 4 Tubos de ensaio
 Erlenmeyer de 250 mL
 1 Proveta de 100 mL
 1 Bastão de vidro
 Vermelho de Metila (corante)
 Ácido clorídrico 2,0 M.
 Pipetas graduadas 5 mL;
 Pipetas automáticas de 1000 µL;
 Caixa com ponteiras de 1000 µL;
 Balança Analítica;
 Banho-maria à 60 °C.

2. OBJETIVO
Aprender práticas rotineiras de laboratório tais como pesagem de reagentes,
manuseio de pipetas graduadas e automáticas, e também fazer diluições com
os materiais disponíveis no laboratório.

3. PROCEDIMENTO
Preparar uma solução de vermelho de metila (solução-mãe):
Pesar 20 mg de vermelho de metila em papel alumínio e solubilizar em 100 mL
de água destilada dentro de um béquer / erlenmeyer, com o auxílio de um
bastão de vidro. Para melhor solubilização colocar 10 mL de HCl 2,0 M e
aquecer por 5 minutos em banho-maria.
As impurezas do corante não solubilizam.
Fazer uma diluição seriada utilizando 4 tubos de ensaio:
Pipetar 1 mL da solução-mãe, colocar em um tubo de ensaio e completar o
volume com água destilada para 5 mL. Pipetar 1mL da primeira diluição e
colocar em outro tubo, completando-se o volume com água destilada para 5 mL.
Faça da mesma maneira com os próximos 2 tubos lembrando que se retira 1
mL do tubo que acabou de ser diluído. Observe a diferença de cor entre os
tubos.

3
 AULA PRÁTICA 2:
pH E TAMPÃO

1. MATERIAL
 11 Tubos de ensaio;
 Pipetas graduadas 10 mL;
 Pipetas Pasteur descartável;
 Tampões de pH 4; 5; 6; 7; 8; 9 e 10;
 Indicador Universal;
 Hidróxido de Sódio (NaOH) 0,1 M (mol/L);
 Ácido Clorídrico (HCl) 0,1 M (mol/L);
 Agitador de tubos (vórtex);
 Água destilada;
 Pipetas automáticas de 1000 µL;
 Caixa com ponteiras de 1000 µL;

2. OBJETIVO
 Conceituar pH
 Determinar o pH de soluções pelo método colorimétrico
 Analisar a variação de pH de uma solução tamponada e uma solução
não tamponada

3. PROCEDIMENTO

1. Preparar uma bateria de 7 tubos de ensaio. Adicionar ao primeiro tubo 1

ml de solução tampão pH 4, no segundo tampão pH 5, e assim
sucessivamente até o tampão pH 10. Adicionar a cada tubo 9 ml de
água destilada e 5 gotas do indicador universal. Esta bateria irá
constituir a escala padrão de pH.
pH 4 5 6 7 8 9 10

Cor

2. Preparar outra bateria de 4 tubos de ensaio e numerá- los de 1 a 4.

Adicionar 5 gotas do indicador universal a cada tubo.

4
 3. Aos tubos 1 e 3 adicionar 10 ml de água destilada.

4. Aos tubos 2 e 4 adicionar 1 ml de solução tampão pH 7 e mais 9 ml de

água destilada.
5. Determinar o pH de cada solução, transferindo os resultados para o
quadro abaixo em anexo. Proceder da mesma maneira para cada etapa do
experimento.

6. Adicionar 1 gota de NaOH 0,1 M aos tubos 1 e 2. Observar.

7. Por meio de uma pipeta, soprar o ar expirado dentro da solução do tubo

1 Durante 15 segundos. Notar a mudança de cor da solução. Determinar o
pH.

8. Soprar no tubo 2 durante 1 minuto. Observar.

9. Adicionar aos tubos 3 e 4 duas gotas de HCI 0,1 M. Observar a

mudança de coloração e determinar o pH.

10. Continuar a adição de HCI ao tubo 4, gota a gota. Determinar quantas

gotas de HCI devem ser adicionadas até que se obtenha a mesma
coloração do tubo 3.

a) pela adição de base (álcali):

TUBO 1 TUBO 2
(ÁGUA DESTILADA) (TAMPÃO)

pH= --------------- pH= ---------------

+ 1gota de NaOH 0,1mol/L + 1gota de NaOH 0,1mol/L

pH= --------------- pH= ---------------

+ Ar expirado por 15 seg + Ar expirado por 1 min

pH= --------------- pH= ---------------

5
Complete o quadro acima e interprete os resultados.

b) pela adição de ácido:

TUBO 3 TUBO 4
(ÁGUA DESTILADA) (TAMPÃO)

pH= --------------- pH= ---------------

+ 2 gotas de HCl 0,1mol/L + 2 gotas de HCl 0,1mol/L

pH= --------------- pH= ---------------

Complete o quadro acima:

Foram necessárias ________ gotas de HCI 0,1 mol/L no tubo 4 para se obter o
mesmo pH (coloração) do tubo 3.
Interprete os resultados.

6
 AULA PRÁTICA 3:
DETERMINAÇÃO DO ESPECTRO DE ABSORÇÃO DE CORANTES E
CONSTRUÇÃO DA CURVA PADRÃO

1. MATERIAL
 6 Tubos de Ensaio;
 Solução de Azul de Bromofenol 0,01mg/mL;
 Solução de Metilorange 0,01mg /mL;
 Água destilada;
 Espectrofotômetro;
 Agitador de tubos (vórtex).
 Pipetas automáticas de 1000 µL;
 Caixas com ponteiras de 1000 µL;

2. OBJETIVO
 Determinar o espectro de absorção de soluções de azul de bromofenol
(ABF) e de metilorange (MO).
 Caracterizar o comprimento de onda onde ocorre absorção máxima.
 Construir uma curva padrão para cada um dos corantes nos
comprimentos de onda (λ) adequados.

7
3. PROCEDIMENTO

Determine o espectro de absorção da solução de ABF e da solução de

MO, procedendo às leituras nos comprimentos de onda abaixo indicados.
Utilize água destilada como branco para calibrar o aparelho em absorbância
igual a zero.

λ 415 445 460 490 520 535 550 580 610 640
(nm)
ABF

MO

Com os dados obtidos, construir um gráfico de Absorbância (Abs) x

comprimento de onda λ (nm).
Construa uma curva padrão com a solução de ABF ou MO, escolhendo
o comprimento de onda mais indicado.

Tubo ABF ou MO H2O (mL) Abs (_____nm) Concentração

B -- 5,0

1 1,0 4,0

2 2,0 3,0

3 3,0 2,0

4 4,0 1,0

5 5,0 --

Com os dados obtidos construa outro gráfico de Absorbância (Abs) x

concentração do corante (CC) e analise os resultados obtidos.

8
 AULA PRÁTICA 4:
TITULAÇÃO DA GLICINA COM UMA BASE

1. MATERIAL
o Glicina 0,05 M;
o Hidróxido de Sódio (NaOH) 0,1 M;
o pHmetro;
o 1 Béquer 100 mL;
o 2 Béqueres 50 mL;
o 1 Proveta de 50 mL;
o 1 bastão de vidro;
o Pipeta automática de 1000 µL;
o Caixa com ponteiras de 1000 µL;
o Papel Toalha.

2. OBJETIVO
Construir a curva padrão da titulação de aminoácidos, fazendo a medição do
pH pelo método eletrométrico.

3. PROCEDIMENTO
Em um Becker adicionar 30 mL de solução de glicina 0,05 M. Medir o pH
inicial. Acrescentar a esta solução 2 mL de NaOH 0,1 M e medir o pH. Repetir
este procedimento até que 60 mL de NaOH tenham sido adicionados a
mistura, ou seja, adicionar NaOH 30 vezes.

OBS.:
1- A ponta do eletrodo deve estar totalmente mergulhada na solução.
2- Cuidado ao adicionar o NaOH à solução, pois este não pode atingir o
eletrodo.
3- Não há necessidade de retirar o eletrodo da solução cada vez que for
adicionar NaOH.

Traçar um gráfico (curva de titulação) colocando na abscissa (x) o

Etapa do Glicina 0,05 M NaOH (0,1 M) pH

volume de NaOH e na ordenada (y) o pH da solução.

9
experimento (mL) (mL)
1 30,0 --
2 -- 2,0
3 -- 2,0
4 -- 2,0
5 -- 2,0
6 -- 2,0
7 -- 2,0
8 -- 2,0
9 -- 2,0
10 -- 2,0
11 -- 2,0
12 -- 2,0
13 -- 2,0
14 -- 2,0
15 -- 2,0
16 -- 2,0
17 -- 2,0
18 -- 2,0
19 -- 2,0
20 -- 2,0
21 -- 2,0
22 -- 2,0
23 -- 2,0
24 -- 2,0
25 -- 2,0
26 -- 2,0
27 -- 2,0
28 -- 2,0
29 -- 2,0
30 -- 2,0
31 -- 2,0
TOTAL 60 mL de NaOH

10
 AULA PRÁTICA 5:
DETERMINAÇÃO COLORIMÉTRICA PELA REAÇÃO DE BIURETO

1. MATERIAL
 5 Tubos de Ensaio pequenos;
 Caseína 1%;
 Glicina 1%;
 NaOH 1,0 mol/L;
 Água destilada;
 Reativo de Biureto (sulfato de cobre 0,5%);
 Espectrofotômetro;
 Agitador de tubos (vórtex);
 Pipetas automáticas de 1000 µL;
 Caixa de ponteiras de 1000 µL;
 Pipetas graduadas de 5 mL.

2. OBJETIVO
Quantificar colorimetricamente a proteína presente em uma amostra de
concentração desconhecida, usando os conhecimentos adquiridos nas aulas
de espectrofotometria.

3. PROCEDIMENTO

1. Identificar 5 tubos de ensaio: o primeiro é o branco, o segundo a glicina e os

restantes enumerar de 1 a 3;

2. Adicionar 1 mL de água destilada no tubo denominado de branco;

3. No tubo glicina colocar 1 mL de solução de glicina;

4. Adicionar 0,2 mL de caseína no tubo 1; 0,6 mL no tubo 2 e 1 mL no tubo 3;

5. Nos tubos 1 a 2 completar o volume para 1 mL com água destilada;

6. Adicionar 3 mL de NaOH 1,0 mol/L em todos os tubos;

7. Adicionar 0,4 mL de Biureto em todos os tubos;

11
8. Aguardar 15 minutos enquanto a reação se processa;

9. No espectrofotômetro todas as soluções devem ser lidas a 530 nm;

10. Anotar as leituras das absorbâncias de cada tubo de ensaio.

Tubos
Reativos
B G 1 2 3
Água destilada (mL) 1,0 -- -- -- --

Solução de glicina (mL) -- 1,0 -- -- --

Solução de caseína 1% -- -- 0,2 0,6 1,0

(mL)
Água destilada (mL) -- -- 0,8 0,4 --

NaOH 1,0 mol/L 3,0 3,0 3,0 3,0 3,0

Reativo de 0,4 0,4 0,4 0,4 0,4

Biureto
Agitar e aguardar 15 minutos

RESULTADO
(Absorbância)
OBS.: As soluções devem ser lidas a 530nm.

12
 AULA PRÁTICA 6:
DOSAGEM DE AÇÚCAR REDUTOR PELO MÉTODO DE ADNS
(ÁCIDO 3,5-DINITROSSALICÍLICO)

1. MATERIAL
 Solução Padrão (glicose – 5 mM);
 Solução Problema (glicose – 100 mM);
 Reativo: ADNS (ácido 3,5-dinitrossalicílico);
 Água Destilada;
 Pipetas graduadas 10 mL;
 7 Tubos de ensaio;
 Espectrofotômetro;
 Banho Maria a 100°C;
 Agitador de tubos (vórtex);
 Pipeta automática de 1000 µL;
 Caixa de ponteiras de 1000 µL.

2. OBJETIVO
Dosagem de açúcares redutores por espectrofotometria na faixa do
visível.

13
3. PROCEDIMENTO
Construção da Curva padrão de glicídios redutores
Sensibilidade do método químico: glicose – 1 mM a 20 mM
Seguir o protocolo abaixo utilizando a solução padrão de glicose (5 mM)
T Solução Solução Água ADNS Abs 540 nm Concentração
U Padrão de Problema destilada (mL) (mM)
B Glicose (mL) (mL)
O (mL)
B -- -- 1,0 1,0
SP -- 0,1 0.9 1,0
1 0,2 -- 0,8 1,0
2 0,4 -- 0,6 1,0
3 0,6 -- 0,4 1,0
4 0,8 -- 0,2 1,0
5 1,0 -- -- 1,0

SP – Solução Problema
Nos tubos de 1 a 5 colocar Solução Padrão de Glicose.
Após a adição dos reagentes:
1. Agitar e aquecer a 100°C por 5 minutos;
2. Resfriar os tubos em bacia contendo gelo;
3. Completar o volume para 15 mL com água destilada;
4. Ler as absorbâncias no espectrofotômetro em 540 nm.

14
 AULA PRÁTICA 7:
REAÇÕES DE PRECIPITAÇÃO DE PROTEÍNAS

1. MATERIAL
 Pipetas de 5mL;
 6 Tubos de ensaio;
 Banho-maria 100°C;
 Agitador de tubos (vórtex);
 Água destilada;
 Clara de ovo diluída 4 vezes em NaCl 0,1%;
 Ácido tricloroacético a 10%;
 Acetato de chumbo a 10%;
 Álcool etílico absoluto;
 Cloreto de sódio 1,0 mol/L;
 Solução saturada de sulfato de amônio (60%);
 Pipetas automáticas de 1000 µL;
 Caixa de ponteiras de 1000 µL.

2. OBJETIVO
Ao final desta aula o aluno deverá estar apto a observar a perda de
solubilidade da proteína (precipitação), passando ou não pelo processo de
desnaturação.

3. PROCEDIMENTO
3.1. Reações de precipitação com desnaturação

3.1.1. Desnaturação pelo calor

Em um tubo de ensaio colocar 2mL da solução de clara de ovo e aquecer
em banho- maria (2 a 3 minutos). Observar o resultado e anotar.

15
3.1.2. Reação com acetato de chumbo
Em um tubo de ensaio colocar 1 mL de solução de clara de ovo e 1mL de
acetato de chumbo a 5%. Observar o resultado e anotar.

3.1.3. Reação com álcool absoluto

Em um tubo de ensaio colocar 1mL de solução de clara de ovo e álcool
etílico absoluto até que se forme um precipitado. Observar o resultado e
anotar.

3.1.4. Reação com ácido tricloroacético (reagente dos alcalóides)

Em um tubo de ensaio colocar 1mL da solução de clara de ovo e 1mL de
ácido tricloroacético a 10%. Observar o resultado e anotar.

3.2. Reação de precipitação sem desnaturação:

3.2.1. "Salting- in"
Em um tubo de ensaio colocar 3mL da solução de clara de ovo e
acrescentar água destilada até que ocorra o aparecimento de um precipitado
de globulinas. A seguir, acrescentar cloreto de sódio 1,0 mol/L até que ocorra
a redissolução da proteína não desnaturada. Observar o resultado e anotar.

3.2.2. "Salting- out"

Em um tubo de ensaio colocar 5mL da solução de clara de ovo obtida no
experimento anterior. Acrescentar 5mL de solução saturada de sulfato de
amônio e observar a formação de precipitado. Acrescentar agora um pouco de
água destilada para redissolver a proteína não desnaturada. Observar o
resultado e anotar.

16
 AULA PRÁTICA 8:
AÇÃO ENZIMÁTICA: EFEITO DE CONCENTRAÇÃO DA ENZIMA

1. MATERIAL
 Enzima invertase (0,1 mg proteína/mL). Observação: manter no gelo
depois de descongelada.
 Tampão acetato 0,05 M pH 4,7;
 Sacarose 0,2 M;
 Reativo: ADNS (ácido 3,5-dinitrossalicílico);
 Pipetas graduadas 10mL;
 Tubos de ensaio;
 Banho Maria.
 Espectrofotômetro;
 Pipetas automáticas de 1000 µL;
 Caixa de ponteiras de 1000 µL.

2. OBJETIVO
Verificar a influencia do fator concentração da enzima na atividade
enzimática.

17
 3. PROCEDIMENTO
Seguir o protocolo abaixo:
Tubos
Reativos
1 2 3 4 5 6
Tampão acetato 0,05 M pH 4,7 (mL) 1,0 1,0 1,0 1,0 1,0 1,0

Água destilada (mL) 1,0 0,9 0,8 0,6 0,2 ---

Sacarose 0,2 M (mL) 0,5 0,5 0,5 0,5 0,5 0,5

Invertase 0,1 mg/mL (mL) -- 0,1 0,2 0,4 0,8 1,0

Incubação: 25°C (temperatura ambiente) durante 5 minutos
ADNS (mL) 1,0 1,0 1,0 1,0 1,0 1,0
Aquecer a 100°C durante 5 minutos

Água destilada (mL) 6,5 6,5 6,5 6,5 6,5 6,5

RESULTADOS (Absorbância)

Resfriar os tubos em bacia contendo gelo.

Homogeneizar.
Ler as absorbâncias a 540nm.

18
 AULA PRÁTICA 9:
AÇÃO ENZIMÁTICA: EFEITO DO TEMPO DE INCUBAÇÃO
1. MATERIAL
 Enzima invertase (0,1 mg proteína/mL). Observação: manter no
gelo depois de descongelada.
 Tampão acetato 0,05 M; pH 4,7
 Sacarose 0,2 M
 Reativo: ADNS (ácido 3,5-dinitrossalicílico)
 Pipetas graduadas de 1 e 10mL
 Tubos de ensaio
 Banho Maria.
 Espectrofotômetro;
 Pipetas automáticas de 1000 µL;
 Caixa de ponteiras de 1000 µL.

2. OBJETIVO
Verificar a influência do tempo de incubação da reação na atividade
enzimática
3. PROCEDIMENTO
Seguir o protocolo abaixo
Tubos
Reativos
1 2 3 4 5
Tampão acetato 0,05 M pH 4,7 (mL) 1,0 1,0 1,0 1,0 1,0

Água destilada (mL) 1,0 0,8 0,8 0,8 0,8

Sacarose 0,2 M (mL) 0,5 0,5 0,5 0,5 0,5

Invertase 0,1 mg/mL (mL) -- 0,2 0,2 0,2 0,2

Incubação: 25°C (temperatura ambiente) -- zero 5 min. 10 min. 15 min.

ADNS (ácido 3,5-dinitrossalicílico) (mL) 1,0 1,0 1,0 1,0 1,0

Aquecer a 100°C durante 5 minutos

Água destilada (mL) 6,5 6,5 6,5 6,5 6,5

RESULTADOS (Absorbância)

Resfriar os tubos em gelo. Homogeneizar. Ler as absorbâncias a 540 nm.

19
 AULA PRÁTICA 10:
AÇÃO ENZIMÁTICA: EFEITO DO PH

1. MATERIAL
 Enzima invertase (0,1 mg proteína/mL). Observação: manter no gelo
depois de descongelada;
 Tampão citrato-fosfato 0,05 M pH 2,0;
 Tampão acetato 0,05 M; pH 4,0;
 Tampão acetato 0,05 M; pH 5,0;
 Tampão fosfato 0,05 M pH 6,0;
 Tampão fosfato 0,05 M pH 7,0;
 Tampão fosfato 0,05 M pH 8,0;
 Tampão bicarbonato 0,05 M pH 9,0;
 Sacarose 0,2 M;
 Reativo: ADNS (ácido 3,5-dinitrossalicílico);
 Pipetas graduadas de 10mL;
 8 tubos de ensaio;
 Banho Maria;
 Espectrofotômetro;
 Pipetas automáticas de 1000 µL;
 Caixa de ponteiras de 1000 µL.

2. OBJETIVO
Verificar a influencia do pH na atividade enzimática

20
 3. PROCEDIMENTO
Seguir o protocolo abaixo
Tubos
Reativos
1 2 3 4 5 6 7 8
Tampão citrato-fosfato 0,05M pH 2,0 1,0 1,0 -- -- -- -- -- --

Tampão acetato 0,05M; pH 4,0 -- -- 1,0 -- -- -- -- --

Tampão acetato 0,05M; pH 5,0 -- -- -- 1,0 -- -- -- --

Tampão fosfato 0,05M pH 6,0 -- -- -- -- 1,0 -- -- --

Tampão fosfato 0,05M pH 7,0 -- -- -- -- -- 1,0 -- --

Tampão fosfato 0,05M pH 8,0 -- -- -- -- -- -- 1,0 --

Tampão bicarbonato 0,05M pH 9,0 -- -- -- -- -- -- -- 1,0

Água destilada (mL) 1,0 0,8 0,8 0,8 0,8 0,8 0,8 0,8

Sacarose 0,2 M (mL) 0,5 0,5 0,5 0,5 0,5 0,5 0,5 0,5

Invertase 0,1 mg/mL (mL) -- 0,2 0,2 0,2 0,2 0,2 0,2 0,2

Incubação: 25°C (temperatura ambiente) durante 5 minutos

ADNS (mL) 1,0 1,0 1,0 1,0 1,0 1,0 1,0 1,0

Aquecer a 100°C durante 5 minutos

Água destilada (mL) 6,5 6,5 6,5 6,5 6,5 6,5 6,5 6,5

Resfriar os tubos em bacia contendo gelo. Homogeneizar. Ler as absorbâncias

a 540nm.

Tubos

1 2 3 4 5 6 7 8
RESULTADOS
(Absorbância)

21
 AULA PRÁTICA 11:
AÇÃO ENZIMÁTICA: EFEITO DA TEMPERATURA

1. MATERIAL
 Enzima invertase (0,1 mg proteína/mL). Observação: manter no gelo
depois de descongelada;
 Tampão acetato 0,05 M pH 4,7;
 Sacarose 0,2 M;
 Reativo: ADNS (ácido 3,5-dinitrossalicílico);
 Pipetas graduadas de 10mL;
 5 tubos de ensaio;
 4 Banhos Maria;
 Espectrofotômetro;
 Pipetas automáticas de 1000 µL;
 Caixa de ponteiras de 1000 µL.

2. OBJETIVO
Verificar a influencia da temperatura na atividade enzimática.

22
 3. PROCEDIMENTO
Seguir o protocolo abaixo:

Tubos
Reativos
1 2 3 4 5
Tampão acetato 0,05 M pH 4,7 (mL) 1,0 1,0 1,0 1,0 1,0
Água destilada (mL) 1,0 0,8 0,8 0,8 0,8

Sacarose 0,2 M (mL) 0,5 0,5 0,5 0,5 0,5

Invertase 0,1 mg/mL (mL) -- 0,2 0,2 0,2 0,2

Pré-incubar os tubos nos seguintes banhos --- 25°C 37°C 55°C 100°C
durante 5 minutos
ADNS (ácido 3,5-dinitrossalicílico) (mL) 1,0 1,0 1,0 1,0 1,0
Aquecer a 100°C durante 5 minutos

Água destilada (mL) 6,5 6,5 6,5 6,5 6,5

RESULTADOS (Absorbância)

Resfriar os tubos em gelo. Homogeneizar. Ler as absorbâncias a 540 nm.

23
 AULA PRÁTICA 12:
EFEITO DA CONCENTRAÇÃO DO SUBSTRATO

1. MATERIAL
 Enzima invertase (0,1 mg proteína/mL). Observação: manter no gelo
depois de descongelada;
 Tampão acetato 0,05 M; pH 4,7;
 Sacarose 0,01 M; 0,02 M; 0,05 M; 0,1 M; 0,2 M;
 Reativo: ADNS (ácido 3,5-dinitrossalicílico);
 Pipetas graduadas de 10 mL;
 Tubos de ensaio;
 Banho Maria;
 Espectrofotômetro;
 Pipetas automáticas de 1000 µL;
 Caixa de ponteiras de 1000 µL.

2. OBJETIVO
o Verificar a influencia da concentração de substrato na atividade
enzimática.
o Determinar o valor de Km.

24
 3. PROCEDIMENTO
Seguir o protocolo abaixo:
Tubos
Reativos
1 2 3 4 5 6
Tampão acetato 0,05M pH 4,7 (mL) 1,0 1,0 1,0 1,0 1,0 1,0
Água destilada (mL) 1,3 0,3 0,3 0,3 0,3 0,3
Sacarose 0,01 M (4 mM) (mL) -- 1,0 -- -- -- --
Sacarose 0,02 M (8 mM) (mL) -- -- 1,0 -- -- --
Sacarose 0,05 M (20 mM) (mL) -- -- -- 1,0 -- --
Sacarose 0,1 M (40 mM) (mL) -- -- -- -- 1,0 --
Sacarose 0,2 M (80 mM) (mL) -- -- -- -- -- 1,0
Invertase 0,1 mg/mL (mL) 0,2 0,2 0,2 0,2 0,2 0,2
Incubação: 25°C (temperatura ambiente) durante 5 minutos.
ADNS (ácido 3,5-dinitrossalicílico) (mL) 1,0 1,0 1,0 1,0 1,0 1,0
Aquecer a 100°C durante 5 minutos
Água destilada (mL) 6,5 6,5 6,5 6,5 6,5 6,5
RESULTADOS (Absorbância)
Resfriar os tubos. Homogeneizar. Ler as absorbâncias a 540 nm.

25
 AULA PRÁTICA 13:
EXTRAÇÃO E CARACTERIZAÇÃO DE LIPÍDEOS

1. MATERIAL
 Ovo (1 para cada grupo);
 Óleo de cozinha (1,0 mL para cada grupo – 10mL para a turma toda)
 Papel de Filtro.
 3 Béquer de 50 mL cada;
 1 Placa de petri;
 1 funil;
 Pipeta Pasteur descartável;
 1 Bastão de vidro;
 Banho-maria a 100°C.
 Ácido. Acético concentrado 5,0 mol/L
 1 Tubo de ensaio com 12 mL de acetona - Tubo A;
 1 Tubo de ensaio com 3 mL de hidróxido de potássio alcoólico (KOH
alcoólico) – Tubo B;
 1 Tubo de ensaio vazio – Tubo C.
 Pipetas automáticas de 1000 µL;
 Caixa de ponteiras de 1000 µL.

2. OBJETIVO
 Compreender as propriedades dos triacilgliceróis e como elas
influenciam sua solubilização;
 Analisar a composição desses lipídios através de reações de
saponificação e precipitação.

3. PROCEDIMENTO
3.1. Extração de lipídios:

1. Abrir o ovo separando o seu conteúdo em dois Béquer (clara Béquer 1;

gema Béquer 2) sem romper a membrana que envolve a gema;

2. Ao recipiente contendo Gema adicionar 8,0 ml de acetona;

26
 3. Com o bastão de vidro homogeneizar a solução até a aglutinação do

material;

4. Acomodar o papel de filtro no béquer 3 de modo a permitir a filtragem do

material do béquer 2;

5. Passar mais 4 mL de acetona pelo filtro;

6. Transferir todo o material filtrado para a placa de petri;

7. Colocar a placa, já com o material no banho-maria até a evaporação da

acetona;

8. Registrar o ocorrido ao material em cada uma das etapas do processo.

3.2. Saponificação:

1. Despejar o conteúdo do tubo B (KOH alcoólico) na placa de Petri;

2. Retornar ao tubo B os lipídios extraídos na etapa anterior (para melhor

resultado, utilizar 1 mL de óleo de cozinha). Utilizar um funil para tal

transferência;

3. Aqueça o tubo a aproximadamente 90oC por 30 minutos;

4. Registrar os resultados observados.

3.3. Análise de características de sabões:

1. Adicionar 2 mL de água destilada ao Tubo B;

2. Transferir 3 mL da solução do Tubo B para o Tubo C;

3. Agitar o Tubo B em vórtex;

4. Registrar o ocorrido;

5. Adicionar 2 mL de ácido acético concentrado ao Tubo C, gota a gota;

6. Registrar o ocorrido.

27
 AULA PRÁTICA 14:
ANÁLISE ELETROFORÉTICA DE PROTEÍNAS

1. MATERIAIS
 Gel de poliacrilamida;
 Tampão de amostra
 Tampão Glicina 1X
 Tubos “eppendorf”;
 Cuba de eletroforese;
 Fonte de eletroforese
 Pipetas automáticas de 20 µL;
 Caixas com ponteiras de 200 µL.

2. OBJETIVO
Analisar o perfil de moléculas de proteínas de uma amostra pela
metodologia da eletroforese em gel de acrilamida.

3. PROCEDIMENTO

1. Distribuir 20 L da amostra de proteínas em um tubo “eppendorf” e adicionar

20  L de tampão de amostra, homogeneizar no vortex e centrifugar por 2

minutos a 2.000 rpm na micro centrífuga.

2. Preparar o gel de acrilamida e posicioná-lo na cuba de eletroforese

(esquema em anexo). Preencher a cuba de eletroforese com o Tampão de

Corrida. Conectar a cuba de eletroforese a fonte de alta voltagem.

3. Aplicar 20 L da amostra de proteínas (item 1) em cada poço do gel. Ligar a

fonte de eletroforese.

4. Parar a corrida eletroforética quando o azul de bromofenol chegar ao final do

gel.

5. Incubar o gel na solução corante por 18 h sob agitação.

6. Incubar o gel na solução descorante até visualizar as bandas de proteínas.

28
 AULA PRÁTICA 15:
EXTRAÇÃO E CARACTERIZAÇÃO DE ÁCIDOS NUCLÉICOS DO
MORANGO

1. MATERIAL
 Papel de filtro ou gaze
 Bastão de vidro;
 Bisturi;
 Funil;
 Almofariz e pistilo;
 Proveta graduada;
 Béquers de 250 mL;
 Cloreto de sódio (10 g - aprox. 2 colheres peq.);
 Detergente (10 mL)
 Álcool etílico (100 mL, gelado);
 Água destilada (100 mL)
 Banho-maria (à 60°C);
 Cuba com gelo;

2. OBJETIVO
 Entender como pode ser feita a separação de ácidos nucléicos com
base nas suas características
 Verificar o comportamento de diferentes grupos de biomoléculas em
diferentes soluções

3. PROCEDIMENTO

Os passos de 1 a 6 serão executados pelo professor, em conjunto para

todas as equipes.

1. Pique o morango em pedaços pequenos.

2. Coloque em um béquer o detergente, a água e o cloreto de sódio,

mexendo a mistura até que os seus elementos se dissolvam

completamente.

29
3. Adicione a esta solução ao morango picado;

4. Coloque o béquer no banho-maria a 60°C por 15 minutos, mexendo de

vez em quando.

5. Findado esse tempo dê um choque térmico na solução colocando o

béquer no gelo por 5 minutos.

6. 6.Triture o morango com a solução por 45 seg. e coloque no gelo por 15

minutos

7. Filtre a mistura em gaze, sem deixar passar a espuma e recolhendo o

filtrado em um béquer limpo.

8. Adicione ao filtrado álcool etílico gelado, deixando-o escorrer pela

parede do béquer;

9. Verifique a formação de duas fases e o surgimento de fios viscosos de

DNA.

10. Mergulhe o bastão de vidro e, com movimento circular em um único

sentido, entre as duas fases e enrole os filamentos obtidos.

11. Registre o ocorrido.

30
 AULA PRÁTICA 16:

Preparação de DNA plasmídial

1. MATERIAL
 Centrífuga;
 Tubos eppendorfs;
 Racks de eppendorf;
 Cultura bacteriana;
 Tampão TE (Tris-HCl pH 7,5 - 10 mM e EDTA 1,0 mM);
 Etanol absoluto;
 Etanol 75 %;
 Isopropanol;
 Acetato de sódio 3,0 M;
 Acetato de amônia 7,5 M;
 Solução II (NaOH 0,2 M e SDS 1,0% (p/v);
 Solução III (Acetato de potássio 3,0 M, Ácido acético 2,0 M – pH 4,8);
 Banho de gelo (em escama);
 Pipetas automáticas de 100-1000 µL e 20-200 µL;
 Caixa de ponteiras (P1000 e P200);

2. OBJETIVOS
Extração de DNA plasmídial da bactéria Escherichia coli.

3. PROCEDIMENTO EXPERIMENTAL

1. Coletar 3 mL da cultura bacteriana e submeter a centrifugação (3.000 rpm por 5

min, temperatura ambiente).
2. Descartar o sobrenadante e ressuspender o precipitado em 200 µL de Tampão
TE.
3. Manter a solução a 4ºC por 5 min.
4. Adicionar 360 µL de Solução II, homogeneizar com a ponteira e manter a
solução a 4ºC por 5 min.

31
5. Adicionar 300 µL de Solução III, homogeneizar com a ponteira e manter a
solução a 4ºC por 5 min.
6. Centrifugar a solução (10.000 rpm, 5 min a 4ºC) e coletar o sobrenadante.
7. Adicionar 750 µL de isopropanol, homogeneizar com a ponteira e manter a
solução por 5 min a temperatura ambiente.
8. Centrifugar a solução (10.000 rpm, 5 min a 4ºC) e descartar o sobrenadante.
9. Ressuspender o precipitado em 200 µL de Tampão TE.
10.Adicionar 110 µL de Acetato de amônia 7,5 M e submeter a centrifugação a
12.000 rpm por 15 min.
11.Coletar o sobrenadante e homogeneizar com 750 µL de etanol 100%.
12.Centrifugar a solução (12.000 rpm, 10 min a 4ºC) e descartar o sobrenadante.
13. Ressuspender o precipitado em 200 µL de Tampão TE.
14. Precipitar o DNA adicionando 3 M de acetato de sódio e 2,5 vol de etanol 100%.
15. Descartar o sobrenadante e adicionar etanol 75%, e centrifugar como no item
anterior.
16.Manter o eppendorf aberto para a secagem do DNA.
17.Ressuspender o DNA em 50 µL de Tampão TE.

32
 AULA PRÁTICA 17:

Reação em Cadeia da Polimerase (PCR)

1) Coloque os reagentes para degelar no banho de gelo e realize todo o preparo das
amostras no gelo para evitar que as reações se iniciem prematuramente.

2) Em um tubo de 0,2 mL, prepare a reação conforme discriminado na tabela a seguir.

Pipete os reagentes na mesma sequência em que eles aparecem na tabela abaixo:

Reação PCR – Aula Prática

Reagente [ ]i [ ]f Volume
DNA 100 µg/µL 500 µg/µL
Primer S 10 µM 1,0 µM
Primer AS 10 µM 1,0 µM
dNTPs 2 mM 200 µM
MgCl2 25 mM 2,5 mM
Tampão 10x 1x
H2O - Qsq 50 µL
Taq DNA Polimerase 0,2 µg/µL 1 µg/µL
Volume final 50 µL
Observação: Trocar a ponteira entre cada pipetagem.

3) Coloque o tubo no termociclador nas seguintes condições:

Programação Máquina PCR

Temperatura Tempo
Desnaturação 94°C 2 min.
inicial
Desnaturação 94°C 45 min.
Anelamento 55°C 50 min. 30 ciclos
Extensão 72°C 2 min.
Extensão Final 72°C 7 min.
4°C 4ever

4) Verificar a amplificação do gene através da eletroforese em gel de agarose 1%.

33
 AULA PRÁTICA 18:

Gel de proteínas SDS-PAGE

Objetivo: Visualizar proteínas em gel desnaturante SDS-PAGE; visualizar técnica de

hibridização (Western-blot); consolidar conhecimento acerca dos princípios da biologia
molecular associados a estas técnicas.

1º passo: Confeccionar gel SDS-PAGE

Gel de separação 12% (v/v)
Bis –Acrilamida 2,3 mL
Tris-HCl 2,0 M pH 8,8 1,5 mL
H20 bidestilada (q.s.p.) 3,4 mL
SDS 20% 195 µL
Persulfato de amônio 10% 30 µL
TEMED 6 µL

Gel de concentração 4% (v/v)

Bis –Acrilamida 0,6 mL
Tris-HCl 1,0 M pH 6,8 510 µL
H20 bidestilada (q.s.p.) 4,2 mL
SDS 20% 120 µL
Persulfato de amônio 10% 60 µL
TEMED 9 µL

2º passo: Aplicar amostras em Gel SDS-PAGE.

Adicionar no relatório os princípios da metodologia
Por que adicionar SDS
Porque adicionar beta-mercaptoetanol
Corrida em tampão contendo TRIS-GLICINA

3º passo: Visualização do gel SDS-PAGE corado com Comassie blue

Adicionar no relatório o resultado visualizado

4º passo: Finalização da técnica de Western blot em membrana de nitrocelulose

Os alunos receberão uma membrana contendo extrato protéico reagido com
anticorpos primário e secundário.
Lavar a membrana com tampão de fosfatase alcalina
Tratar a membrana com solução reveladora (BCIP/NBT)
Parar a reação com solução de parada
Descrever os resultados apresentados

34
 AULA PRÁTICA 19:

Reação de Saponificação e Teste do Iodo

A) Reação de Saponificação - Fundamentação teórica

Os lipídios podem ser caracterizados pelas suas características físico-químicas.

Em geral são insolúveis na água e solúveis em solventes apolares. Os triacilgliceróis,
na presença de bases, podem ser hidrolisados liberando glicerol e sais de ácidos
graxos (sabões), de acordo com a reação:

Os sais de ácidos graxos apresentam uma característica anfipática onde em

solução aquosa diminuem a tensão superficial da água formando espuma sob
agitação.

1. MATERIAIS:

•4 pipeta de vidro de 5 mL;

•2 pipetas de vidro de 1 mL;
•3 Tubos de ensaio;
•Óleo de soja ou de girassol;
•Solução etanólica de hidróxido de potássio 5%;
•Solução de Cloreto de cálcio 10%;
•Banho-Maria;
•Estante para tubos de ensaio;
•Pipetador;
•Termômetro;
•Cronômetro;
•Papel Toalha;
•Descarte para pipetas;
•Frasco com água destilada;

35
2. OBJETIVOS

Realizar a hidrólise alcalina dos triacilglicerídeos presentes no óleo.

3. PROCEDIMENTO EXPERIMENTAL

1) Pipetar para um tubo de ensaio rotulado (solução de sabão) 2 mL de óleo e 5 mL da

solução de potassa alcóolica. Aquecer no banho-maria fervente durante cinco minutos.
A reação de hidrólise alcalina estará completa quando o tubo de ensaio apresentar
uma fase.

2) Pipetar para o tubo de ensaio rotulado (tubo 1) 1 mL de água e 2 mL da solução de

sabão. Agitar vigorosamente e observar.

3) Pipetar para outro tubo de ensaio rotulado (tubo 2) 2 mL da solução de sabão.

Adicionar 5 gotas da solução de cloreto de cálcio. Agitar bem e observar.

e) Resultado esperado:

Tubo 1: Formação de espuma indica a presença de sais de ácidos graxos

Tubo 2: formação de precipitado indica a presença de sabões de cálcio que não

formam espuma

f) Resultado obtido:

Tubo 1: _________________________________________

Tubo 2: _________________________________________

36
B) Teste do Iodo - Fundamentação teórica:

Os ácidos graxos (AG) insaturados podem fixar oxigênio, hidrogênio e

halogênios nas suas duplas ligações, através de uma reação de adição, conforme
demonstra o esquema abaixo:

Hidrogenação

Halogenação

1. MATERIAIS

• Pipeta automática de 100-1000 µL;

• Pipeta pasteur;
• 2 Tubos de ensaio;
• Óleo de soja ou de girassol;
• Solução de lugol;
• Banho-Maria;
• Estante para tubos de ensaio;

2. OBJETIVOS

Identificar a presença de insaturações nos ácidos graxos.

3. PROCEDIMENTO EXPERIMENTAL

a) Em um tubo de ensaio, colocar 1 mL de óleo vegetal, adicionado 3 gotas do corante

lugol e em seguida aquecer o tubo, anotar os resultados.

** Preparo do reagente de lugol: 5 g de iodo + 10 g de iodeto de potássio

(KI). Completar o volume para 100 ml com água destilada. Diluir 1:10 no momento da
utilização.

b) Resultados esperados: Gradativa redução na cor característica do iodo na

amostra aquecida

c) Resultados obtidos:

Tubo 1: _________________________________________

Tubo 2: _________________________________________

37
 AULA PRÁTICA 20:
Atividade Enzimática da Peroxidase

Introdução

A maioria dos organismos vivos possui mecanismos de defesa enzimáticos e

não-enzimáticos na célula, os quais neutralizam a formação endógena das espécies
reativas oriundas do oxigênio. Tais mecanismos envolvem: caroteno, tocoferóis, ácido
ascórbico e as enzimas superóxido dismutase, catalase e glutationa peroxidase. A
capacidade do sistema de proteção diminui gradualmente com a idade, resultando em
distúrbios no funcionamento das células e, como conseqüência, no mau
funcionamento dos órgãos vitais.
As enzimas superóxido dismutase, catalase e glutationa peroxidase atuam
como antioxidantes, prevenindo a formação de radicais, assim como convertendo o
radical peroxil em oxigênio e água oxigenada e evitando o efeito destrutivo desses
intermediários na célula. A enzima superóxido dismutase converte o radical O2- em
H2O2 e O2 e funciona em conjunto com a catalase e a glutationa peroxidase, as quais
removem a água oxigenada da célula.

Nas frutas e verduras (e também em alguns alimentos de origem animal, como

o leite), a formação de radicais livres está associada principalmente à enzima
lipoxigenase, que atua durante o armazenamento e o processamento, como
conseqüência da destruição dos tecidos, pudendo afetar a qualidade dos produtos
vegetais. Conseqüentemente, os vegetais e algumas frutas, para serem preservados
por enlatamento, congelamento ou desidratação, são em sua maioria, branqueados
para inativar as enzimas.
As enzimas catalase e peroxidase são utilizadas para testar a eficiência do
branqueamento de frutas e vegetais antes do processamento. Ambas possuem o
grupo prostético ferriprotoporfirina (Fe3+): um grupo em peroxidase e quatro em
catalase. A atividade da peroxidase também pode levar à destruição da vitamina C e
descoloração de carotenóides e antocianinas, além de catalizar (grupo heme) a
degradação não-enzimática de ácidos graxos insaturados, com a conseqüente
formação de compostos voláteis (sabor e cheiro rançosos).

Controle: A peroxidase é considerada uma das enzimas mais termorresistentes,

de forma que, quando inativada, certamente as demais enzimas e os microrganismos
patogênicos serão destruídos. Na maioria dos casos, o branqueamento entre 90 – 100
o
C durante 3 min. é suficiente para destruí-la.
A atividade da peroxidase diminui em pH baixo e elevado. A perda da atividade
observada com a acidificação é atribuída a mudanças do estado nativo para a
condição desnaturada, ocasionada pela liberação do grupo heme da proteína. Valores
de pH entre 5,0 – 8,0 recuperam sua atividade. A enzima também pode ser inibida
com CO2 ou sulfitos. A ação do sulfito se verifica na destruição da água oxigenada ,
bloqueando a atividade da enzima, pela manutenção do substrato (doador de
hidrogênio) na sua forma reduzida.

A peroxidase é capaz de oxidar compostos fenólicos somente na presença de

H2O2. Sua detecção é baseada no desenvolvimento da cor na presença do substrato:
guaiacol – água oxigenada. O complexo peroxidase – peróxido formado oxida o
guaiacol (incolor), transformando-o em um produto final colorido (vermelho).

38
1. MATERIAIS

 Vagem (5 g);
 Água oxigenada 0,3% (10 mL);
 Guaiacol 0,5% (10 mL):
 Água destilada gelada;
 Béquers 250 mL (10 unid.);
 Placas de Petri (5 unid.)
 Tubos de ensaio (2 unid.)
 Almofariz e pistilo;
 Papel de filtro;
 Funil;
 Chapa de aquecimento;
 Espectrofotômetro;

2. PROCEDIMENTO EXPERIMENTAL

Teste para peroxidase em vagem. Efeito do tratamento térmico.

1- Pesar cinco amostras de vagem (5 g cada) e aquecer quatro delas em água

fervente, durante 2, 4, 6 e 8 minutos, respectivamente. A quinta amostra serve
como controle, sem tratamento térmico.
2- Resfriar rapidamente as amostras em Placas de Petri, com água gelada durante 2
min.
3- Amassar cada amostra em mortar, junto com 30 mL de água fria.
4- Transferir para o béquer previamente rotulado. Adicionar 1 mL de guaiacol 0,5% e
0,5 mL de água oxigenada.
5- Agitar, deixar em repouso durante 3 minutos e filtrar.
6- Fazer a leitura em espectrofotômetro a 420 nm.
7- Reproduzir graficamente os resultados obtidos (absorvância x tempo de
aquecimento) e observar o tempo de aquecimento para a inativação da enzima.

3. Questionário:

1- Descrever a reação química que acontece entre o guaiacol, a água oxigenada e a

peroxidase.
2- Qual o pigmento responsável pela absorção e como é formado?
3- Por que ocorre a diminuição da absorvância com o aquecimento?
Bibliografia:
1- Araújo, J.M.A.: Química dos Alimentos: Teoria e Prática. UFV, Impr. Univ. Viçosa
(1995) pp 41 – 44, 247 – 251.

39
 AULA PRÁTICA 21:

Efeito da lipase sobre gorduras

1. MATERIAIS

 Solução de lipase 1% (50 mL);

 Tubos de ensaio (3 mL);
 Óleo de soja ou girassol (5 mL);
 Água destilada (5 mL);
 Pipetas de 5 mL (3 unid.);
 Fenolftaleína;
 Bicarbonato de sódio;
 Papel indicador de pH;
 Agitador de tubos “vortex”;
 Banho 40 ºC;
 Placa aquecedora;
 Bequer (50 mL);

2. PROCEDIMENTO

1- Misturar 3 mL de óleo com 3 mL de água em um tubo de ensaio.

2- Adicionar 2 –3 gotas de fenolftaleína e 1 – 2 gotas de bicarbonato de sódio, até
atingir uma coloração levemente rosada (pH levemente alcalino).
3- Em outro tubo de ensaio, colocar 5 mL de lipase 1% e adicionar 1 – 2 gotas de
bicarbonato de sódio, até atingir um pH levemente alcalino. Este caso, não usar
fenolftaleína, mas papel indicador.
4- Dividir a amostra de lipase, transferindo a metade do conteúdo para outro tubo e
ferver uma das partes durante 10 minutos.
5- Rotular o tubo que contém lipase não fervida com a letra A e adicionar 3 mL da
emulsão óleo/água preparada anteriormente.
6- Rotular o tubo que contém lipase fervida com a letra B e adicionar os outros 3 mL
da emulsão.
7- Colocar os dois tubos no banho de água a 40 ºC até observar qualquer mudança
na coloração das soluções. Agitar os tubos cada 2 – 3 minutos, durante a
incubação.

3. Questionário:

1- Em qual dos tubos a solução muda a cor e a que é devido essa mudança?

40