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UNIVERSIDADE FEDERAL DO
CEARÁ CENTRO DE CIÊ NCIAS
DEPARTAMENTO DE BIOQUÍMICA
E BIOLOGIA MOLECULAR
RELATÓ RIO DE AU...
Gabriela Valentim

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 UNIVERSIDADE FEDERAL DO CEARÁ
CENTRO DE CIÊNCIAS
DEPARTAMENTO DE BIOQUÍMICA E BIOLOGIA MOLECULAR
RELATÓRIO DE AULAS PRÁTICAS DE BIOFÍSICA

PRÁTICA III - ESPECTROFOTOMETRIA

GABRIELA ALVES VALENTIM

FORTALEZA
DEZEMBRO DE 2017
 1. INTRODUÇÃO

A espectroscopia é a ciência que estuda as interações entre a radiação e a

matéria. Os métodos espectroscópicos baseiam-se na medição da quantidade de radiação
produzida ou absorvida por uma substância de interesse. Um dos métodos espectroscópicos
mais utilizados e acessíveis para análises químicas hoje é a espectrofotometria na faixa
ultravioleta e da luz visível (SKOOG et al., 2006).

A espectrofotometria consiste em um método onde um espectro de luz é utilizado

para inspecionar soluções. O procedimento mais básico atravessa a solução com um feixe de
energia e a medida quantitativa da luz absorvida permite identificar e quantificar biomoléculas
em uma solução (DÍAZ et al., 2006; HENEIDE, 2010).

A radiação eletromagnética pode ser descrita como uma onda com propriedades
como comprimento, frequência, velocidade e amplitude, não requerendo nenhum meio para
sua transmissão, passando facilmente pelo vácuo. O comprimento de onda, λ, é a
distância linear entre dois máximos ou dois mínimos sucessivos de uma onda, e é
expresso em nanômetros (nm) (SKOOG et al., 2006). A parcela do espectro magnético que é
visível ao olho humano é bastante pequena, sendo estas as radiações eletromagnéticas com
comprimentos de onda entre 400 e 750nm. A zona do espectro com comprimento de onda
abaixo de 400nm é denominada ultravioleta (UV), e aquela zona acima de 750nm
corresponde a zona infravermelha (HENEIDE, 2010).

A medição da quantidade de luz absorvida na espectrofotometria é realizada por

um equipamento chamado espectrofotômetro. O espectrofotômetro é um aparelho capaz de
produzir luz monocromática e medir a quantidade de luz absorvida pelas soluções. Ele é
composto por uma fonte de luz, que possui seu feixe focalizado por um colimador sobre um
prisma de quartzo. O prisma decompõe a luz em ultravioleta, violeta, azul, verde, amarelo,
laranja, vermelho e infravermelho. Uma fenda seletora ajuda a selecionar qual comprimento
de onda (λ) será utilizado para realizar a absorção. A luz monocromática, então, atravessa a
cubeta com solução e parte da luz é transmitida, enquanto outra parte é absorvida. Um
galvanômetro com uma fotocélula capta e mensura a luz transmitida. A diferença entre a
luz emitida
pelo equipamento e a luz transmitida é a luz absorvida (HENEIDE, 2010). As cubetas
utilizadas para conter a solução podem ter vários formatos e tamanhos, mas a padrão tem um
trajeto óptico de 1cm. Quando desejamos estudar uma solução utilizando comprimento de
onda entre 400 e 750nm (luz visível), a cubeta pode ser de vidro ou plástico. No entanto,
quando estudamos uma solução utilizando comprimento de onda dentro do espectro do
ultravioleta, a cubeta utilizada deve ser de quartzo (DÍAZ et al., 2006).

Johann Heinrich Lambert e August Beer, independentemente, fizeram importantes

descobertas no campo da óptica. Suas descobertas hoje são conhecidas como a lei de
Lambert-Beer, que relaciona a absorbância de uma luz monocromática com a concentração de
uma solução (DÍAZ et al., 2006). Essa lei diz que quando a concentração da amostra não se
altera, a absorção depende do comprimento do trajeto óptico (lei de Lambert) e que quando o
trajeto óptico é constante, a absorção depende da concentração (lei de Beer). Combinando a
descoberta dos cientistas, é possível observar que a absorção é proporcional ao trajeto óptico e
a concentração (HENEIDE, 2010). A absorbância é influenciada também pela constante de
absortividade molar da substância, que é a capacidade de um mol da substância de atenuar a
luz incidida em um certo comprimento de onda. Essa relação é expressa na equação 𝐴 = s ×
𝑐 × 𝑙, onde A é a absorbância, ε é o coeficiente de absortividade, c é a concentração e l é o
caminho óptico.

Em algumas analises, onde não é necessário possuir conhecimento sobre fatores

absolutos das amostras, podemos determinar a concentração de substâncias a partir de sua
absorbância, comparando sua absorbância com aquelas de amostras com concentrações
conhecidas. A curva padrão, também chamada de curva de calibração, é obtida a partir da
leitura de absorção de várias concentrações conhecidas da substância que desejamos analisar,
sempre em um mesmo comprimento de onda onde a substância apresenta maior absorbância
(HENEIDE, 2010). A partir da criação da curva padrão, podemos determinar a concentração
de uma substância a partir da leitura de sua absorbância, calculando o fator de calibração,
dado pela cotangente do ângulo formado pela curva, e aplicando na fórmula 𝐶 = 𝐹 × 𝐴 × 𝐷,
onde F é o fator de calibração, A é a absorbância média e D é a diluição da amostra.
 A espectrofotometria, principalmente a espectrofotometria de absorção no
infravermelho, é largamente por ser uma técnica simples e confiável para controle de
qualidade e outras análises dinâmicas. Esse método é utilizado para identificação de
compostos desconhecidos a partir da criação de curvas espectrais, identificação de
grupamentos químicos específicos que possuem curvas espectrais características,
identificação de impurezas em substâncias, determinação da concentração de um composto a
partir da criação de uma curva padrão e acompanhamento de reações catalisadas por enzimas,
possuindo grande importância para a indústria e pesquisa científica (HENEIDE, 2010;
SKOOG et al., 2006).

2. OBJETIVOS
 Montar e analisar o espectro de absorção e análise quantitativa por fotometria;
 Calcular a concentração de amostras desconhecidas;
 Identificar e operar um espectrofotômetro.

3. MATERIAIS E MÉTODOS

No dia 14 de novembro de 2017, a prática aqui relatada foi realizada no

Laboratório N1, localizado no bloco 907, Departamento de Bioquímica e Biologia Molecular,
na Universidade Federal do Ceará (UFC), durante as aulas da disciplina de Biofísica,
lecionadas pelo Prof. Dr. José Tadeu Abreu de Oliveira.

Os materiais utilizados na prática aqui relatada foram espectrofotômetro, cubeta

de plástico com caminho óptico de 1 cm, solução de 4,0mg/mL de azul de bromofenol,
solução com concentração de azul de bromofenol desconhecida, água destilada, tubos de
ensaio e pipeta automática.

A prática foi dividida em 3 etapas, sendo a primeira a definição do espectro de

absorção do azul de bromofenol. Nessa etapa, foi preparada uma solução diluída utilizando-se
2mL da solução mãe de azul de bromofenol (concentração = 4,0 mg/mL) e 2mL de água
destilada. O espectrofotômetro foi ligado e o comprimento de onda foi ajustado em 420nm.
A cubeta de plástico foi
preenchida com água destilada e utilizada para zerar a leitura de absorbância, descontando
dessa forma o valor da absorbância da água e da cubeta. Assim, aumentamos a precisão da
leitura, garantindo que o valor registrado pelo equipamento seja resultado do azul de
bromofenol. Em seguida, a cubeta plástica foi retirada do equipamento e a água foi substituída
pela solução diluída. A cubeta foi devolvida ao compartimento do aparelho e a leitura da
absorbância foi registrada. O mesmo procedimento foi repetido na faixa de comprimento de
onda que varia de 420 a 700nm, sempre aumentando de 40 em 40nm, e certificando-se de
zerar a leitura com a cubeta preenchida por água. Terminada a varredura dos comprimentos de
onda, foi criado um gráfico do espectro de absorção do comprimento de onda.

Na segunda etapa foi construída uma curva-padrão a partir de concentrações

conhecidas de azul de bromofenol. Após a definição do comprimento e onda de maior
absorção pelo corante através da etapa anterior, foram realizadas 06 diluições da solução mãe
de azul de bromofenol nos tubos de ensaio, como indicado na tabela 01. Em seguida, o
espectrofotômetro realizou a leitura da absorbância da água destilada na cubeta e, por fim,
foi zerado. A primeira diluição foi utilizada para preencher a cubeta plástica e sua
absorbância foi determinada. Utilizando-se o mesmo procedimento foram realizadas as
leituras da absorbância de todas as diluições preparadas. A concentração de cada diluição
preparada foi calculada e a partir dessas informações foi criada uma curva padrão
relacionando a absorbância com a concentração do corante. Foi calculado também o fator de
correção da curva-padrão.

Tabela 1 - Volumes de solução de azul de bromofenol (4 mg/mL) e água utilizados para realização de 06
diluições empregadas na construção da curva padrão do azul de bromofenol. O tubo denominado branco
continha apenas água e foi utilizado para zerar a absorbância no comprimento de onda estabelecido para análise.

Volume de solução mãe de azul Volume (mL) de água

Tubo [Azul de bromofenol]
de bromofenol (4 mg/mL) destilada
Branco 0,0 mL 4,0 mL 0 mg/mL
1 0,5 mL 3,5 mL 0,5 mg/mL
2 1,0 mL 3,0 mL 1,0 mg/mL
3 1,5 mL 2,5 mL 1,5 mg/mL
4 2,0 mL 2,0 mL 2,0 mg/mL
5 3,0 mL 1,0 mL 3,0 mg/mL
6 4,0 mL 0,0 mL 4,0 mg/mL
 Na terceira etapa, a amostra com concentração de azul de bromofenol
desconhecida foi utilizada para preencher a cubeta plástica três vezes, derramando- se a
amostra ao final de cada leitura de absorbância e preenchendo a cubeta novamente. Cada uma
das três alíquotas teve sua absorbância analisada e a partir da leitura foi calculada a
absorbância média da amostra. Esse valor foi utilizado para, de posse do fator de calibração,
realizar o cálculo da concentração da amostra.

4. RESULTADOS

Os valores de absorbância determinados para a solução diluída, contendo 2mL de

solução mãe de azul de bromofenol (concentração = 4,0 mg/mL) e 2mL de água destilada, em
uma faixa de comprimento de onda de 420 a 700nm podem ser encontrados na tabela 02. Os
valores desta tabela foram plotados na figura 01 para construção do espectro de absorção do
azul de bromofenol.

Tabela 2 - Variação das absorbâncias da solução de azul de bromofenol na

concentração de 2,0mg/mL em comprimentos de onda que variam na faixa de 420 a
700nm, variando de 40 em 40nm. A absorbância do branco também foi especificada
para comparação.

Comprimento de Absorbância do branco Absorbância da

onda (λ) (cubeta + água) amostra diluída
420 nm 0,026 0,000
460 nm 0,072 0,010
500 nm 0,092 0,035
540 nm 0,087 0,108
580 nm 0,085 0,253
620 nm 0,080 0,048
660 nm 0,072 0,003
700 nm 0,075 0,003
 Figura 1 – Curva espectral do azul de bromofenol construída a partir da variação das
absorbâncias de uma solução de azul de bromofenol na concentração de 2,0mg/mL em
comprimentos de onda que variam na faixa de 420 a 700nm, variando de 40 em 40nm.

0,3

0,25

0,2
Absorbânc

0,15

0,1

0,05

420 460500 540 580 620660 700

Comprimento de onda (λ) em nm

O comprimento de onda de 580nm foi utilizado para determinação da curva

padrão do corante. Na tabela 03 podem ser observados os valores de absorbância obtidos a
partir da leitura de diferentes concentrações de azul de bromofenol neste comprimento de
onda. Os valores presentes na tabela 03 foram utilizados para construção da curva padrão
observada na figura 02.

Tabela 3 - Medidas de absorbância de diferentes concentrações da solução de azul de bromofenol,

com concentrações variando entre 0,5 e 4,0mg/mL. O tubo denominado branco continha apenas
água e foi utilizado para zerar a absorbância no comprimento de onda estabelecido para análise.
** A absorbância do tubo demoninado D, com concentração de azul de bromofenol desconhecida,
foi obtida a partir da média de leituras realizadas em triplicata.

Tubo [Azul de bromofenol] Absorbância

Branco 0 mg/mL 0,087
1 0,5 mg/mL 0,070
2 1,0 mg/mL 0,143
3 1,5 mg/mL 0,213
4 2,0 mg/mL 0,280
5 3,0 mg/mL 0,418
6 4,0 mg/mL 0,540
D - 0,267 **
 Figura 2 - Curva padrão do azul de bromofenol criada a partir dos valores de absorbância
encontrados em diferentes concentrações do corante.

0,6
y = 0,1357x + 0,0051
0,5 R² = 0,9992

0,4
Absorbân

0,3

0,2

0,1

0
0 1 2 3 4 5
Concentração de Azul de Bromofenol (mg/mL)

5. DISCUSSÃO

Como observado na figura 01, o pico máximo de absorção da solução de azul de

bromofenol com concentração de 2mg/mL foi do comprimento de onda de 580nm. Assim,
este comprimento foi utilizado para determinação da curva padrão do corante, já que o
comprimento de onda utilizado para uma dosagem colorimétrica deve ser aquele onde há
maior absorção e menor transmissão de luz (DÍAZ et al., 2006).

O coeficiente de absortividade molar, também conhecido como coeficiente de

extinção molar, pode ser calculado através da lei de Lambert-Beer, 𝐴 = s × 𝑐 × 𝑙, onde ε é o
coeficiente de absortividade molar, A é absorbância da amostra, c é a concentração molar e l é
o caminho óptico. Considerando que na concentração de 1,0mg/mL a absorbância foi de
0,143 e que a massa molar do azul de bromofenol é 669,96Da, podemos encontrar a o
coeficiente de extinção molar do corante azul de bromofenol.

669,96𝑔 1𝑚o𝑙
0,001𝑔 𝑥

𝑥 = 1,49 × 10−6 𝑚o𝑙

 1,49 × 10−6 𝑚o𝑙 1𝑚𝐿
𝑥 1000𝑚𝐿

𝑦 = 0,00149 𝑚o𝑙/𝐿

0,143 = s × 0,00149𝑚o𝑙. 𝐿−1 × 1𝑐𝑚

0,143
s=
0,00149𝑚o𝑙. 𝐿−1 × 1𝑐𝑚

0,143
s=
0,00149𝑚o𝑙. 𝑐𝑚. 𝐿−1

s = 95,973 𝐿. 𝑚o𝑙−1. 𝑐𝑚−1

Com o auxílio da curva padrão o fator de calibração pode ser calculado, dado pela
cotangente do ângulo formado na reta ou o inverso da inclinação da reta. A curva padrão
apresentou um R² de 0,992, o que indica um nível de confiança de 99,2%.

𝐶𝑎𝑡e𝑡o 𝑎𝑑j𝑎𝑐e𝑛𝑡e
𝐹 = 𝐶o𝑡𝑔 𝜑 = 𝐶𝑎𝑡e𝑡o o𝑝o𝑠𝑡o .

3,65 − 2,17
𝐹=
0,5 − 0,3

1,48
𝐹=
0,2

𝐹 = 7,4

De posse do fator de calibração, podemos calcular a concentração de azul de

bromofenol na amostra com concentração desconhecida desse corante. Para isso, utilizamos a
equação 𝐶 = 𝐹 × 𝐴 × 𝐷, onde F é o fator de calibração, A é a absorbância média e D é a
diluição da amostra.

𝐶 = 7,4 × 0,267 × 1

𝐶 = 1,97 𝑚𝑔. 𝑚𝐿−1

 A diluição é dada pela razão entre a concentração da solução mãe de azul de
bromofenol e da solução desconhecida. Dessa forma, é possível descobrir que a solução de
concentração desconhecida foi obtida a partir da diluição da solução mãe em 2,03 vezes.

[𝑆o𝑙𝑢ção 𝑚ãe]
𝐷=
[𝑆o𝑙𝑢ção 𝐷]

4 𝑚𝑔. 𝑚𝐿−1
𝐷=
1,97 𝑚𝑔. 𝑚𝐿−1

𝐷 = 2,03

6. CONCLUSÃO

A partir da leitura de uma amostra de concentração conhecida em vários

comprimentos de onda foi possível estabelecer o espectro de absorção do azul de bromofenol
e determinar o comprimento de onda de 580nm como aquele que apresenta maior absorbância
no corante. Além de ensinar aos alunos como operar um espectrofotômetro, a prática permitiu
também o cálculo da concentração de amostras desconhecidas a partir da determinação da
curva padrão, demonstrando a eficiência da prática.

REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS

DÍAZ, N. A., RUIZ, A. B., REYES, E. F., CEJUDO, A. G., NOVO, J. J., PEINADO, J. P.,
MELÉNDEZ-VALDÉS, F. T., FIÑANA, I. T. 2006. Espectrofotometría:
Espectros de absorción y cuantificación colorimétrica de biomoléculas.
Disponível em: http://www.uco.es/organiza/departamentos/bioquimica-biol-mol/pdfs/
08_ESPECTROFOTOMETRIA.pdf. Acesso em: 04. dez. 2017.

HENEIDE, I. F. Biofísica básica. São Paulo: Editora Atheneu, 2010.

SKOOG, D. A., WEST, D. M., HOLLER, F. J., CROUCH, S. R. Fundamentos de

Química Analítica. Tradução da 8ª edição norte-americana. São Paulo: Editora Thomson,
2006.