UNIVERSIDADE FEDERAL DE VIÇOSA - CAMPUS FLORESTAL

Instituto de Ciências Exatas e Tecnológicas

QMF 210 - Laboratório de Química Analítica III
Docente: Profa. Dra. Juliana Cristina Tristão

PRÁTICA 7

ABSORÇÃO MOLECULAR: DETERMINAÇÃO DO COMPRIMENTO DE ONDA

MÁXIMO DE ABSORÇÃO E DA CONCENTRAÇÃO DE UMA SOLUÇÃO

Guilherme Martins - 3638

Jéssica Caroline - 3340
Jheneffer Ferreira - 3350
Letícia Souza - 3365
Maria Luíza Silva - 3338

Florestal - MG
Junho/2022
SUMÁRIO

INTRODUÇÃO 3
OBJETIVOS 5
MATERIAIS E MÉTODOS 6
3.1. MATERIAIS E REAGENTES 6
3.2. MÉTODOS 6
RESULTADOS E DISCUSSÃO 7
CONCLUSÃO 13
REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS 14

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 1. INTRODUÇÃO

A Espectroscopia de Absorção Molecular na região do ultravioleta e visível (UV-Vis)

estuda o comportamento da matéria quando essa é exposta a radiação eletromagnética na
faixa de 160 a 380 nm (ultravioleta) e 380 a 780 nm (visível). A técnica se baseia nas
medidas de transmitância ou absorbância apresentada pela solução contendo o composto de
interesse e possuem grande aplicação em determinações quantitativas de diversas espécies
orgânicas e inorgânicas.
Na presença de radiação UV-Vis, os elétrons de valência das espécies atômicas ou
moleculares absorvem a energia eletromagnética e como resultado, os elétrons mudam do
estado fundamental, que é o de menor energia, para o estado excitado, que é o de maior
energia. Sendo que, a radiação eletromagnética absorvida tem a energia exatamente igual à
diferença de energia entre os níveis eletrônicos excitado e fundamental. Porém, esses elétrons
são influenciados pelos núcleos ao qual estão ligados que modificam o espaçamento de
energia entre os estados fundamental e excitado. Desta forma, o comprimento de onda da
radiação absorvida é uma propriedade de um grupo de átomos e não apenas dos elétrons
individuais, esses conjuntos de átomos são chamados de cromóforos.
Os cromóforos são formados por vários compostos orgânicos com funções como:
álcoois, éteres, aminas, alcenos, alcinos, compostos carbonílicos, de enxofre e com anéis
aromáticos, e esses absorvem radiação ultravioleta e visível. Alguns compostos de uma certa
classe apresentam as faixas de absorção muito semelhantes, possibilitando apenas distinguir a
natureza do grupo cromóforo de uma amostra desconhecida, sendo necessário o uso em
conjunto com outras técnicas como ressonância magnética nuclear e infravermelho para uma
caracterização.
As curvas de intensidade de absorção (absorbância) em função do comprimento de
onda, obtidas através de um espectrofotômetro, servem como complemento na identificação
de uma substância, desde que essa possua em sua estrutura, grupos e ou ligações que sejam
absorventes dentro da faixa de varredura do comprimento de onda.
A lei de Lambert-Beer, mostra que a absorbância de uma solução, em um determinado
comprimento de onda, é diretamente proporcional à concentração da espécie absorvente
quando o comprimento do percurso é fixo. A lei é aplicável em um intervalo grande de
concentração quando a estrutura da espécie colorida em solução, não se altera com a

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concentração. E não é aplicável, quando o analito colorido forma complexos, cuja
composição depende da concentração.

A=ɛbc

Onde:
A = absorbância
ɛ = constante de absortividade molar da espécie (cm.mol/L)
b = caminho ótimo ou largura da cubeta (cm)
c = concentração da solução (mol/L)

Para a determinação das concentrações de soluções de espécies absorventes, é obtido

a curva de calibração, que é a absorbância em função da concentração.

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2. OBJETIVOS

- Determinação do λmáx da calceína.

- Determinação da concentração de uma solução de calceína por espectrofotometria na
região visível.

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3. MATERIAIS E MÉTODOS

3.1. MATERIAIS E REAGENTES

● Solução estoque de calceína 100 ● Espectrofotômetro;

μg/mL ● Béquer;
● Pipeta; ● Balão volumétrico;
● Pisseta com água destilada;

3.2. MÉTODOS

● Etapa 1: Determinação do Comprimento de Onda Máximo de Absorção (λmáx.)

a) A partir da solução estoque, preparou-se uma solução intermediária de 50 μg/mL.

b) Com a solução preparada, mediu-se as absorbâncias da solução de calceína (50
μg/mL) em comprimentos de onda compreendidos entre 420-530 nm com intervalos
de no máximo 5 nm como mostrado na tabela 1, assim como os dados obtidos. E a
cada comprimento de onda foi feita a leitura do branco.

● Etapa 2: Determinação da Concentração de uma Solução de Calceína

a) A partir de uma solução estoque de calceína 100 μg/mL, preparou-se uma solução
padrão intermediária de 50 μg/mL.
b) Preparou-se uma série de soluções padrão de calceína, em duplicata, com
concentrações variando entre 2,00 e 20,00 μg/mL.
c) Com o comprimento de onda máximo (λmáx), determinado na etapa 1, realizou-se
leituras de absorbância para cada solução padrão preparada.
d) Em seguida, realizou-se as leituras das amostras. Algumas amostras foram diluídas,
para a realização da leitura. Foi pipetado 20 mL da amostra 1 e diluída no balão
volumétrico de 50 mL, já a amostra 2, foi pipetado 20 mL da mesma e diluída no
balão volumétrico de 100 mL. Os dados obtidos foram anotados na tabela 2.

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 4. RESULTADOS E DISCUSSÃO

● Etapa 1

A primeira etapa do procedimento consistia em realizar, a partir de uma solução

intermediária, medidas de absorbância da solução de calceína em diversos comprimentos de
onda, como mostrados na tabela 1.
A transmitância (radiação emitida) das soluções intermediárias de calceína pode ser
encontrada através da expressão matemática que a relaciona com a absorbância (absorção da
solução) da mesma, como é mostrada abaixo:
A = - log T
Onde:
A corresponde à absorbância;
T à transmitância.

Para o comprimento de onda de 420 nm, a absorbância foi igual a -1,6767 e a

transmitância pode ser dada por:
A = - log T
T = 10-A
T = 10- (-1,6767) = 47,50 %
Assim como o cálculo executado acima, os outros valores de transmitância podem ser
calculados de forma análoga ao que já foi mostrado.

Tabela 1 - Transmitância e absorbância para uma solução de calceína em função do

comprimento de onda (λ/nm).

λ (nm) T(%) Abs λ (nm) T(%) Abs

420 47,5 - 1,6767 480 0,24 0,6198

425 39,9 - 1,6009 485 0,21 0,6777

430 32,2 - 1,5078 490 0,20 0,6989

435 24,0 - 1,3802 495 0,26 0,5850

440 19,1 - 1,2810 500 0,18 0,7447

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 445 11,3 - 1,0530 505 0,17 0,7695

450 6,12 - 0,7867 510 0,20 0,6989

455 2,69 - 0,4297 515 1,16 - 0,0644

460 1,14 - 0,0569 520 7,22 - 0,8585

465 0,64 0,1938 525 23,70 - 1,3747

470 0,40 0,3979 530 51,20 - 1,7092

475 0,30 0,5229

Através dos dados fornecidos na tabela 1, plotamos um gráfico que analisa o

comportamento do comprimento de onda em relação a absorbância da solução de calceína 50
μg/mL, conforme é mostrado no gráfico 1.

Gráfico 1: Curva de Absorbância versus Comprimento de Onda (nm)

Para realização de uma análise espectrométrica com máxima exatidão é necessário

realizar diversos cuidados, e um deles é utilizar um adequado comprimento de onda, no qual
a substância contida na amostra seja mais sensível, isto é, exiba uma maior absorbância
quando o comprimento de onda é incidido sobre a amostra. O comprimento de onda que

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 proporciona uma maior absorbância de um determinado composto é chamado de
comprimento de onda máximo (λmax), no qual foi encontrado nesta primeira parte do
experimento o valor de 505 nm.
Quando trabalhamos com o comprimento de onda máximo de uma determinada
substância, garantimos a maior sensibilidade do método analítico, onde o sinal analítico passa
a ser proporcional à concentração da substância.

● Etapa 2

Com a finalidade de traçar uma curva analítica mais precisa e que se comporta como
equação da reta (y = ax + b), colhemos em duplicata (série A e B) os valores de concentração
e absorbância da solução das diluições da solução estoque, como é mostrado da tabela 2.
Após a coleta dos dados, traçamos os valores da série A e B em função da
concentração de calceína e encontramos o coeficiente angular (a) e o coeficiente linear da
equação da reta (b), como é mostrado no gráfico 2.

Tabela 2 - Absorbância da calceína em função da concentração: Curva de Calibração.

Concentração Série A Série B

(μg/mL) T% A T% A

2 0,122 0,9136 0,144 0,8416

5 0,392 0,4067 0,433 0,3635

10 0,923 0,0348 0,951 0,0218

15 1,474 - 0,1685 1,415 - 0,1507

20 1,777 - 0,2497 1,929 - 0,2853

Amostra T% A

1 0,996 0,0017

2 1,917 -0,2826

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Gráfico 2: Concentração (μg/mL) versus Absorbância

Partindo da equação da reta temos que, y é a absorbância da amostra e x a

concentração de caseína. Calculamos a concentração da seguinte forma:
y = ax +b
y = - 0,0599x + 0,795

- Amostra 1:
0,0017 = - 0,0599x + 0,795
x = 0,0017 - 0,795 / - 0,0599
x = 13,2437 x (fator de diluição 2,5)
x = 33,11 μg/mL
- Amostra 2:
- 0,2826 = - 0,0599x + 0,795
x = - 0,2826 - 0,795 / - 0,0599
x = 17,9899 x (fator de diluição 5)
x = 89,95 μg/mL

Para calcular a concentração da amostra pelo método do gráfico, construímos um

novo gráfico (gráfico 3) de concentração (μg/mL) versus absorbância de forma quadriculada,
no qual nos auxiliaria a encontrar o valor da contração relativo à absorbância pelas
coordenadas cartesianas.

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Gráfico 3: Concentração (μg/mL) versus Absorbância

Como a variação de cada quadrinho do eixo das abscissas é de 0,04 e a absorbância da

amostra 1 é de 0,0017, consideramos que a absorbância é aproximadamente zero. Já o eixo
das ordenadas varia de 1 em 1 (μg/mL), logo, o eixo y cruza a reta aproximadamente na
região de 13,2 (μg/mL) do eixo x.
Realizando o mesmo raciocínio para analisar a amostra 2, cuja absorbância é igual a
-0,2826, assumiu aproximadamente a posição do eixo das abscissas próximo a -0,28. Este
valor de absorbância cruza com a reta aproximadamente na região de 18,0 (μg/mL)
Como as amostras foram previamente diluídas podemos calcular a concentração real
das mesmas utilizando a expressão matemática Ci . Vi = Cf . Vf, como é mostrado abaixo:

Concentração da amostra 1 Concentração da amostra 2

Ci . Vi = Cf . Vf Ci . Vi = Cf . Vf
Ci . 20 mL = 13,2 μg/mL. 50 mL Ci . 20 mL = 18,0 μg/mL. 50 mL
Ci = 33 μg/mL Ci = 45 μg/mL

Através dos valores encontrados acima, calculamos a absortividade e absortividade

molar das amostras 1 e 2, seguindo como princípio a equação de Lambert Beer.

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Absortividade

A = a b c → a = A / bc

Amostra 1 Amostra 2
c = 13,24 x 10-6 / 10-3 L = 0,01324 g/L c = 17,99 x 10-6g / 10-3 L = 0,01799 g/L
A = 0,0017 A = - 0,2826
b = 1 cm b = 1 cm

a = 0,0017 / 1 cm x 0,01324 g/L a = - 0,2826 / 1 cm x 0,01799 g/L

a = 0,19 L/g.cm a = - 15.71 L/g.cm

Absortividade molar

A=𝜺bc→𝜺=A/bc

Amostra 1 Amostra 2
cmolar = (0,01324 g/L) / 622,50 g/mol Massa molar da calceína = 622,50 g/mol
cmolar = 2,13 x 10-5 mol/L cmolar = (0,01799 g/L) / 622,50 g/mol
A = 0,0017 cmolar = 2,89 x 10-5 mol/L
b = 1 cm A = - 0,2826
b = 1 cm
𝜺 = 0,0017 / 1 cm x 2,13 x 10-5
𝜺 = 79,81 L/mol.cm 𝜺 = - 0,2826 / 1 cm x 2,89 x 10-5
𝜺 = - 9,779 x 104 L/mol.cm

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 5. CONCLUSÃO

De acordo com os resultados obtidos, constatamos que foi possível encontrar o valor
do comprimento de onda máximo, no qual foi de 505 nm, que foi importante para que
pudéssemos realizar as etapas seguintes do experimento.
Na construção da curva analítica, obtivemos um valor de linearidade dos dados (R2)
igual a 0,879 o que não torna nossos resultados tão exatos e precisos quanto queremos.
Através da curva analítica e os valores de absorbância das amostras 1 e 2, conseguimos
calcular os valores da concentração de cada amostra e da absortividade de ambas. No entanto,
nos deparamos com valores de absortividade muito diferentes uns dos outros, no qual
acreditamos que estes são resultados muito duvidosos, onde acreditávamos que amostras de
caseínas deveriam apresentar valores próximos de absortividade pela característica da
substância. Dependendo dos componentes presentes em uma determinada amostra os valores
podem distinguir um dos outros, no entanto, os valores encontrados foram muito
discrepantes. Com base nisso, aguardaremos a próxima aula para discutir mais a respeito dos
resultados encontrados no experimento com a professora da disciplina.

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6. REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS

● D. Skoog, D. West, J. Holler e S. Crouch, Fundamentos de Química Analítica,

tradução da 8a ed. norte americana, Thomson, Brasil, 2005.
● D.C. Harris, Análise Química Quantitativa, 7a ed., LTC editora, Brasil, 2008.
● VOGEL. Análise Inorgânica Quantitativa. Editora Guanabara dois S.A., Rio de
Janeiro, 1981.

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